JPWO2003063894A1 - インスリン抵抗性改善剤 - Google Patents

Abstract

アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とするインスリン抵抗性改善剤を提供するものである。また本発明は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とする２型糖尿病治療剤を提供するものである。本発明によれば、高脂肪食により誘発され、肥満を伴うインスリン抵抗性が改善され、糖尿病のほとんどを占める２型糖尿病が治療できる。

Description

技術分野
本発明は、肥満症、糖尿病、心血管系疾患の予防及び治療に有用なインスリン抵抗性改善剤及び２型糖尿病治療剤に関する。
背景技術
従来、脂肪組織は、単なる余剰エネルギーの貯蔵庫として知られていたが、最近の研究により各種の生理活性物質を産生し、分泌することが明らかになってきた。当該生理活性物質は一括してアディポサイトカインと呼ばれており、これにはレプチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、プラスミノーゲン活性化因子阻止因子１型（ＰＡＩ−１）、アディプシン、レジスチン等が知られている。これらのアディポサイトカインのうち、レプチン、ＴＮＦ−α、レジスチン等は脂肪細胞から分泌されてインスリン感受性を制御する可能性が示されている。
最近見出されたアディポサイトカインの一種にアディポネクチンがある。このアディポネクチンは、４つのグループにより、異なる方法で独立に同定されたものである。アディポネクチンｃＤＮＡは、３’−末端を揃えたヒト脂肪組織ｃＤＮＡライブラリーの大規模なランダムシークエンシングにより単離された。Ａｃｒｐ３０あるいはＡｄｉｐｏＱと名づけられたマウスアディポネクチンｃＤＮＡは、各々マウス３Ｔ３−Ｌ１及び３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の分化の前後で、ディファレンシャル・ディスプレイ法によりクローニングされたものである。更に、ヒトアディポネクチンは、ゼラチン結合タンパク２８として血漿から精製された。肥満／糖尿病マウス及びヒトでは、アディポネクチンのｍＲＮＡ発現とその血漿レベルは有意に低下している。Ｌｏｄｉｓｈらは最近、Ａｃｒｐ３０のタンパク分解産物がマウス筋の脂肪酸酸化を増大させ、体重減少を引き起こすことを報告した。
しかしながら、アディポネクチンが実際に糖尿病に有効か否かは全く知られていない。
高脂肪食により誘発され、肥満を伴うインスリン抵抗性は、糖尿病及び心血管系疾患の主要なリスクファクターであり、このインスリン抵抗性を改善するか否かが糖尿病治療薬として有用か否かを判断するうえで極めて重要である。
従って本発明の目的は、インスリン抵抗性を改善し、糖尿病治療に有用な新たな薬物を提供することにある。
発明の開示
そこで本発明者は、インスリン感受性を改変したマウスモデル、肥満と２型糖尿病のマウスモデル等を用いてアディポネクチンの作用を検討したところ、アディポネクチンの発現低下又は欠乏がインスリン抵抗性の発症原因であること、更にはアディポネクチン、その一部の投与又はそれらの遺伝子の導入がインスリン抵抗性及び２型糖尿病の治療に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明はアディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とするインスリン抵抗性改善剤を提供するものである。
また本発明は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とする２型糖尿病治療剤を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられるアディポネクチンは、既にクローニングされており［Ｍａｅｄａ，Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１，２８６−２９６（１９９６）、Ｎａｋａｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２０，８０２−８１２（１９９６）］、既知の手段により入手できる。配列番号１及び２にヒトアディポネクチンのアミノ酸配列及び塩基配列を示す。アディポネクチンは、Ｎ末端側のコラーゲン様配列（ｃＡｄ）とＣ末端側の球状領域（ｇＡｄ；配列番号１中、アミノ酸番号１１４〜２３９又は１１１〜２４２）から構成されているが、Ｃ末端側の球状領域（ｇＡｄ）は、完全長アディポネクチンよりも強力な高血糖及び高インスリン血症改善作用を有し、特に好ましい。また、マウスアディポネクチンのアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号３及び４に示す。マウスアディポネクチンのｃＡｄは４５〜１０９（アミノ酸番号）であり、ｇＡｄは１１０〜２４７（アミノ酸番号）である。また、本発明においては、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列及びｇＡｄ領域を示すアミノ酸配列を有する蛋白質だけでなく、これらのアミノ酸配列の一又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であってもアディポネクチンとしての作用を有するものであれば用いることができる。当該一又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列には、配列番号１と８０％以上、好ましくは９０％相同性のあるものが含まれる。
本発明で用いられる遺伝子としては、配列番号１に示されるアディポネクチンをコードする遺伝子及びｇＡｄをコードする遺伝子が挙げられる。また、これらの遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列を有する遺伝子も用いることができる。
アディポネクチン又はその一部のポリペプチドは、それが存在する細胞から分離することもできるが、アディポネクチンをコードする遺伝子がすでにクローニングされているので、ＤＮＡ組み換え技術、すなわち、当該遺伝子を用いて調製した発現ベクターを利用し、形質転換した細胞を用いて調製してもよい。
後記実施例に示すように、インスリン感受性を変化させたマウスモデルでは、アディポネクチン発現低下がインスリン抵抗性と同時に生じている。アディポネクチンは、肥満マウスの筋及び肝のトリグリセリド含量を低下させることによりインスリン抵抗性を低下させる。この作用は、筋での脂肪酸燃焼とエネルギー消費の両者に関与する分子の発現増加によるものである。また、脂肪組織萎縮マウスにおけるインスリン抵抗性は、アディポネクチン又はレプチンいずれか単独でも改善するがアディポネクチンとレプチンを併用することにより完全に改善された。肥満及び脂肪組織萎縮のいずれのマウスモデルにおいても、アディポネクチン低下がインスリン抵抗性の発現に関与している。従ってアディポネクチンの投与はインスリン抵抗性改善と２型糖尿病の新しい種類の治療剤となることが明らかになった。
本発明の医薬をヒトを含む哺乳類に投与するには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。かかる投与形態としては注射用製剤が好ましい。また薬学的に許容される担体としては、蒸留水、溶解補助剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、これら医薬の投与量は、疾患、性別、体重等により変化するが、アディポネクチン量として０．１μｇ〜１０ｍｇ／日程度であろう。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
Ａ．方法
（１）化学物質
ＰＰＡＲ−γアゴニスト ロジグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）ＰＰＡＲ−γ／ＲＸＲ阻害剤ＨＸ５３１は、文献に従って合成した（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）４７，１７７８−１７８６（１９９９）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７，１８４１−１８４７（１９９８））。
（２）動物
ＰＰＡＲ−γ^＋／−マウスはすでに報告した方法で作成した（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４，５９７−６０９（１９９９））。その他の全ての動物は日本クレアから購入した。６週齢のマウスに、記載のごとく粉状の餌を給餌し、薬剤は食餌に混ぜて与えた（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４，５９７−６０９（１９９９））。
（３）ＲＮＡ調製、ノーザンブロット解析及びイムノブロッティング
全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いて、製品のプロトコールに従って組織から調製した。各群５〜１０匹のマウスから得たＲＮＡをプールし、一部をラットＡＣＯ（Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏより）、マウスＣＤ３６、ＵＣＰ２、ＰＰＡＲ−α（Ｋ．Ｍｏｔｏｊｉｍａより）、又はマウスアディポネクチンｃＤＮＡプローブによるノーザンブロット解析に使用したＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１６７１０−１６７１４（１９９８）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７，１８４１−１４４７（１９９８）。各バンドの放射活性を定量し、２８ＳｒＲＮＡ量でロード量の差を補正したのち、各ｍＲＮＡの倍数変化を計算した。血清アディポネクチンレベルは、組換えアディポネクチンをスタンダードとして、ゼラチン結合タンパク質２８に対するポリクローナル抗体（ヒトアディポネクチンＣ端の２０アミノ酸のＮ端に余分のシステインを加えたペプチド、ＣＹＡＤＮＤＮＤＳＴＦＴＧＦＬＬＹＨＤＴＮに対する抗体として作成）（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２０，８０２−８１２（１９９６））を使用するイムノブロッティングで測定した。免疫沈降反応とイムノブロッティングに使用した手順はすでに報告した方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，３０７４−３０８４（１９９６））に従った。３回の独立した実験のうち１回のデータを代表として示す。
（４）血液サンプルアッセイ
血漿グルコース、血清ＦＦＡ及びトリグリセリドレベルは、それぞれグルコースＢ−ｔｅｓｔ、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）Ｃ−ｔｅｓｔ及びトリグリセリドＬ−ｔｙｐｅ（和光純薬）で測定した。血漿インスリンはインスリン免疫アッセイ（Ｍｏｒｉｎａｇａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７，１８４１−１８４７（１９９８））。レプチンはＥＬＩＳＡ−ｂａｓｅｄ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍマウスレプチン免疫アッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製品のプロトコールに従ってアッセイを行った。
（５）６ｘＨｉｓ−アディポネクチン融合タンバク質の生成
各々完全長のマウスアディポネクチンｃＡｄ又はｇＡｄをｐＱＥ−３０細菌発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）に導入した。ＪＭ−１０９における、ヒスチジンタグ付きアディポネクチン、ｃＡｄ及びｇＡｄの発現を、増殖培養液にイソプロピル β−チオガラクトピラノシドを加えて誘発した。標準法を用いて細菌抽出液を調製し、ニッケルイオンアガロースカラム（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７，１８４１−１８４７（１９９８））から溶出させることにより融合タンパク質を精製した。混在する可能性のあるエンドトキシンの除去には、ＡｃｔｉＣｌｅａｎ Ｅｔｏｘアフィニティカラム（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を使用した。
（６）アディポネクチン又はレプチン投与
文献（Ｎａｔｕｒｅ ４０１，７３−７６（１９９９））記載のごとく、腹腔内注入又は持続全身注入によりアディポネクチン又はレプチンをマウスに投与した。各マウスの背部皮下に１個のＡｌｚｅｔ微小浸透圧ポンプ（ｍｏｄｅｌ １００２，Ａｌｚａ社）を挿入した。各図に示した１日用量のマウス組換えレプチン（Ｓｉｇｍａ社）又はアディポネクチンを、総容量０．１ｍｌのＰＢＳに溶解して、このポンプで１２日間送達投与した。
（７）インスリン抵抗性指数
グルコース値（１ｍｇ／ｍｌ＝１ｃｍ）とインスリン値（１ｎｇ／ｍｌ＝１ｃｍ）各々の累積平均高さに時間（６０分＝１ｃｍ）を掛けて、グルコース曲線及びインスリン曲線の面積を算出した（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４０，Ｅ４８２−４８８（１９８１））。インスリン抵抗性指数は、グルコース負荷試験におけるグルコース及びインスリン面積×１０^−２の積から算出した（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４，５９７−６０９（１９９９））。結果は各対照値に対する割合で示した。
（８）脂質代謝とＡＣＯの酵素活性
［１−^１４Ｃ］パルミチン酸からの［^１４Ｃ］ＣＯ_２生成の測定は、肝と筋の切片を用いて文献（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７，１８４１−１８４７（１９９８））記載のごとく行った。肝と筋からホモジネートを作成し、抽出用液（ＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ＝２：１）を用いて組織トリグリセリド含量を測定した。肝と筋の残りはただちに液体窒素中で凍結し、ＡＣＯ活性の測定を実施するまで−８０℃で保存した。肝と筋の軽量ミトコンドリア分画中のＡＣＯ活性は、ロイコ−ジクロロフルオレセインのＨ_２Ｏ_２依存性酸化に基づくアッセイにより測定した（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７，１８４１−１８４７（１９９８））。
Ｂ．結果
（１）アディポネクチン発現とインスリン感受性の関係
肥満ではアディポネクチンが低下するとの報告があることから、肥満及びインスリン抵抗性における、アディポネクチン発現変化の役割について検討を行った。この目的のために、脂肪蓄積を促進するとともにインスリン抵抗性を低下させるＰＰＡＲ−γアゴニスト ロジグリタゾンを使用した。
結果を図１、図２及び図３に示す。図１には、高炭水化物食（ＨＣ）、高脂肪食のみ（ＨＦ）又は高脂肪食＋ロジグリタゾン（ＨＦ＋Ｒｏｓｉ）で処置したｄｂ／ｄｂマウスの、ＷＡＴアディポネクチンｍＲＮＡ量（図１ａ）及び血清アディポネクチンレベル（図１ｂ）を示す。
また図２には、高炭水化物食（ＨＣ）、高脂肪食のみ（ＨＦ）又は高脂肪食＋ロジグリタゾン（ＨＦ＋Ｒｏｓｉ）の処置を行ったｄｂ／ｄｂマウスのグルコース負荷試験時の、グルコース曲線下面積値（図２ａ）及びインスリン曲線下面積値（図２ｂ）を示す。結果は無投与ＨＣ食マウス値に対する割合で示した。無投与ＨＣ食ｄｂ／ｄｂマウスの基礎グルコースレベル（グルコース負荷試験のゼロタイム時）は２４４．８±２３．３ｍｇ／ｄｌだった（図２ａ）。各バーは平均値±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；無投与ＨＣ食マウスと比較。
また、図３には、１μＭロジグリタゾンで２４時間処理した（Ｒｏｓｉ）、又は処理しなかった（−）３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞中のアディポネクチンｍＲＮＡ量を示す。
これらの結果から、高脂肪食は、高血糖（図２ａ）と高インスリン血症（図２ｂ）を有するマウスの、アディポネクチンの白色脂肪組織（ＷＡＴ）におけるｍＲＮＡレベル（図１ａ）と血清レベル（図１ｂ）を低下させた。ロジグリタゾンはアディポネクチンのＷＡＴにおけるｍＲＮＡレベル（図１ａ）と血清レベル（図１ｂ）を有意に上昇させ、同時に高血糖（図２ａ）と高インスリン血症（図２ｂ）を改善した。しかしながら、ｄｂ／ｄｂマウスでは、脂肪組織容積（ビークル投与：２．７２±０．１１ｇ；Ｒｏｓｉ投与：２．８４±０．１６ｇ）と体重（ビークル投与：４６．５±０．７０ｇ；Ｒｏｓｉ投与：４７．９±１．０ｇ）のわずかな増加が見られた。野生型対照（Ｃ５７）でも同様の結果が得られた。ｉｎ ｖｉｔｒｏの分化３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞においても、ロジグリタゾンはアディポネクチン発現を増加させた（図３ｃ）。これらのデータより、アディポネクチンｍＲＮＡの発現はＰＰＡＲ−γ依存性経路により一部調節されており、肥満よりもインスリン感受性の調節に密接に関与していることがわかる。
（２）脂肪組織の欠乏とアディポネクチンの関係
アディポネクチン発現とインスリン感受性の因果関係を明らかにするために、脂肪組織の消失ひいてはアディポネクチンの枯渇を試みた。ＰＰＡＲ−γ／ＲＸＲ活性を高度に低下させることにより、脂肪組織を欠くマウスモデルを作成した（図４〜図８）。
すなわち、ＰＰＡＲ−γ^＋／−マウスにＨＸ５３１を６週間投与（＋）又は無投与（−）下で、組換え完全長アディポネクチン（Ａｄ）、ｇＡｄ又はレプチン（Ｌｅｐ）を所定の用量（μｇ／日）投与した。特に示さない限り、投与は持続全身注入（ｐｕｍｐ）にて実施し、６週間のＨＸ５３１投与期間の最後１２日間に、高脂肪食（ＨＦ）を与えながら併用投与した。
図４にはＷＡＴ中のＬＰＬ ｍＲＮＡ量を示す。図５には精巣上体ＷＡＴ重量を示す。図６にはＷＡＴ消失を示すマウス腹腔像を示す。図７には血清アディポネクチンレベルは、組換えアディポネクチンをスタンダードとして、抗アディポネクチン抗体によるイムノブロッティングで測定した結果を示した。図７中、５０μｇ Ａｄをマウスに腹腔内（ｉｐ）注入した場合の血清アディポネクチンレベルをレーン９に示す。図８には、インスリン抵抗性指数を示す。結果は、高脂肪食を与えられた無投与ＰＰＡＲ−γ^＋／−マウス値に対する割合として示した。高脂肪食を与えられた無投与ＰＰＡＲ−γ^＋／−マウスの基礎グルコースレベル（グルコース負荷試験のゼロタイム時）は１１０．７±１２．８ｍｇ／ｄｌだった。各バーは平均値±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；無投与ないしＨＸ５３１を６週間単独投与したＰＰＡＲ−γ^＋／−マウス又はレプチンとアディポネクチンを併用投与したＰＰＡＲ−γ^＋／−マウスと比較した。
その結果、ＲＸＲアンタゴニストＨＸ５３１のようなＰＰＡＲ−γ／ＲＸＲ阻害剤をＰＰＡＲ−γ^＋／−マウスに３週間投与したところ、リポタンパクリバーゼ（ＬＰＬ）をはじめとするＷＡＴ内ＰＰＡＲ−γ／ＲＸＲ応答性遺伝子の発現が著明に低下し（〜９０％以上；図４）、ＰＰＡＲ−γ／ＲＸＲ活性が高度に低下した。この処置を４週間継続することにより、観察可能なＷＡＴは消失した（図５と６）。このような脂肪組織の消失は、発現がＰＰＡＲ−γ／ＲＸＲ活性依存性である、ＷＡＴ内のトリグリセリド蓄積に関与する分子の発現低下によると考えられる。
アディポネクチンは脂肪組織萎縮マウスの血清から完全に消失したが、対照マウス血清では、アディポネクチンに対する抗体により、アディポネクチンが３５−ｋＤタンパク質として検出された（図７、レーン６と７）。
また、脂肪組織萎縮マウスにおける組織トリグリセリド含量及び血清遊離脂肪酸レベルを測定した。
すなわち、ＰＰＡＲ−γ^＋／−マウスにＨＸ５３１を６週間投与（＋）又は無投与（−）下で、ＰＰＡＲ−γ^＋／−マウスに組換え完全長アディポネクチン（Ａｄ）、ｇＡｄ又はレプチン（Ｌｅｐ）を所定の用量（μｇ／日）投与した。投与は持続全身注入にて実施し、６週間のＨＸ５３１投与期間（６週）の最後１２日間に、高脂肪食（ＨＦ）を与えながら併用投与した。
その結果、表１に示すように脂肪組織萎縮マウスでは、高インスリン血症と高血糖（図８）に加えて、血清遊離脂肪酸（ＦＦＡ）上昇、トリグリセリドレベル上昇、骨格筋と肝の組織トリグリセリド含量上昇も認められた。

（３）アディポネクチンによる脂肪組織萎縮マウスのインスリン抵抗性の改善。
脂肪組織萎縮マウスのインスリン抵抗性の発現におけるアディポネクチン欠乏の役割を検討するために、これらのマウスに対するアディポネクチンの投与を行った。生理的濃度の組換えアディポネクチンの持続全身注入（図７、レーン６−８）により、高血糖と高インスリン血症は有意に改善した（図８）。
（４）アディポネクチンの球状ドメインの作用
アディポネクチンは、Ｎ末端側のコラーゲン様配列（ｃＡｄ）とＣ末端側の球状領域（ｇＡｄ）から構成されている（配列番号１参照）。いずれのドメインがこれらの生理活性を発揮するのかについて解析した。その結果、ｇＡｄは、高血糖と高インスリン血症を、完全長のアディポネクチンよりも強力に改善した（図８）。アディポネクチンのＣ末端部に対する抗体により認識される２５−ｋＤタンパク質が非常に少量ながら血清中にも存在し、完全長アディポネクチンがタンパク分解処理を受けることが示唆された。
（５）アディポネクチン／レプチン欠乏によるインスリン抵抗性の改善
脂肪組織萎縮性糖尿病におけるインスリン抵抗性は、組織のインスリン感受性を増強させるアディポサイトカインの欠乏によると考えられる。上記の結果は、アディポネクチンがこのようなアディポサイトカインの１つであることを示す。生理的濃度のアディポネクチン投与では、脂肪組織を欠くマウスのインスリン抵抗性を完全には改善しなかった。レプチンも上記のアディポサイトカインの１つであることが知られている。これらのマウスでは血清レプチンレベルは検出不能だった（上限：０．２ｎｇ／ｍｌ）。これらのマウスに生理的濃度のレプチンを投与したところ、部分的ではあったがインスリン抵抗性の軽減が実際に認められた（図８）。そして、アディポネクチンとレプチンの生理的濃度での併用投与は、インスリン抵抗性を相乗的に、ほぼ完全に消失させた（図８）。
（６）アディポネクチンによるトリグリセリド含量低下
アディポネクチンが糖尿病治療効果を発揮するメカニズムを明らかにするために、個々の器官に対するアディポネクチンの作用を検討した。
すなわち、マウス骨格筋（図９）及び肝（図１０）における、脂肪酸転位酵素（ＦＡＴ）／ＣＤ３６、ＡＣＯ、ＵＣＰ２及びＰＰＡＲ−αの各ｍＲＮＡを示す。図１１には骨格筋における、インスリンリセプター（ＩＲ）とインスリンリセプター基質（ＩＲＳ）−１のインスリン誘発性のチロシンリン酸化及びインスリン刺激によるＡｋｔリン酸化を示す。ＨＸ５３１は０．１％となるように食餌に混ぜて投与した。マウスはインスリン１Ｕ／ｇ体重の投与／非投与下で２分間刺激した。細胞溶解液は、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，１０７４−３０８４（１９９６）記載の抗体により免疫沈降反応（ＩＰ）実施後、イムノブロッティングを行った。
その結果、骨格筋では、低濃度のｇＡｄ投与は、脂肪酸輸送、脂肪燃焼及びエネルギー消費にそれぞれ関与する、ＣＤ３６、アシルＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯ）及び脱共役タンパク質（ＵＣＰ）２などの分子の発現を増加させる（図９）。これらの過程は、続いて骨格筋中の組織トリグリセリド含量の低下をもたらす（表１）。これらの遺伝子の発現がＰＰＡＲによって正に制御されている事が知られているので、これらの遺伝子発現変化の基礎にあるメカニズムとして考えられるのは、ＰＰＡＲ−α／γの発現増加及び／又は内因性リガンドの増加などである。実際、ＰＰＡＲ−αの発現増加が見られた（図９）。骨格筋とは対照的に、肝では低濃度ｇＡｄ投与により、組織への脂肪酸輸送に関与するＣＤ３６などの分子の発現が低下したが（図１０）、これにより肝への脂肪酸流入が減少し、肝のトリグリセリド含量が低下したと考えられる（表１）。従って、筋と肝ではいずれもトリグリセリド含量が低下していたものの、これら２つの組織における低下のメカニズムは明らかに全く異なる。これらのデータは、アディポネクチンが主として骨格筋に作用してＦＦＡの流入と燃焼を増加させ、それにより筋のトリグリセリド含量を低下させることを示している。血清ＦＦＡとトリグリセリドのレベルが低下する結果として（表１）、肝のトリグリセリド含量は低下する。
（７）トリグリセリド含量の低下によるインスリン・シグナリングの改善
組織トリグリセリド含量が増加すると、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼのインスリン刺激による活性化、及びそれに続くグルコーストランスポータータンパク質４の細胞膜表面への移動とグルコースの取り込みが阻害され、インスリン抵抗性が生じると報告されている。従って、アディポネクチンを投与された脂肪組織萎縮マウスの、インスリン刺激による骨格筋Ａｋｔキナーゼのリン酸化の増強に加えて、インスリンリセプターとインスリンリセプター基質１のインスリン誘発性チロシンリン酸化の増強からも、筋のトリグリセリド含量の低下はインスリンシグナル伝達の改善に寄与すると考えられる（図１１）。
（８）アディポネクチンによる肥満マウスのインスリン抵抗性改善作用
次に、肥満、高脂血症、インスリン抵抗性及び高血糖を特徴とする、２つの異なるマウス２型糖尿病モデル、ｄｂ／ｄｂ及びＫＫＡ^ｙマウス（アグーチを過剰発現したＫＫマウス）のインスリン抵抗性と糖尿病をアディポネクチンが改善しうるかどうかについて検討を行った。
その結果を図１２〜１７に示す。すなわち、Ｃ５７ないしｄｂ／ｄｂマウス（図１２〜１４）あるいはＫＫないしＫＫＡ^ｙマウス（図１５〜１７）の、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）時の血清アディポネクチンレベル（図１２と１５）と、グルコース曲線下面積（図１３と１６）及びインスリン曲線下面積（図１４と図１７）の値を示す。マウスにはＨＣ又はＨＦ食が与えられ、無投与又は所定用量（μｇ／日）のＡｄないしｇＡｄを投与した。血清アディポネクチンレベルは、組換えアディポネクチンをスタンダードとして、抗アディポネクチン抗体によるイムノブロッティングで測定した（図１２と１５）。結果は、ＨＣ食を与えられた無投与野生型マウス値に対する割合として示す（図１３，１４，１６，１７）。ＨＣ食を与えられた無投与Ｃ５７マウスの基礎グルコースレベル（ＧＴＴのゼロタイム時）は６２．３±３．１ｍｇ／ｄｌ（図１３）、ＫＫマウスでは９３．０±６．１ｍｇ／ｄｌだった（図１６）。各バーは平均値±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；Ｃ５７対ｄｂ／ｄｂ、又はＫＫ対ＫＫＡ^ｙ、ＨＣ対ＨＦ、もしくは無投与マウスと比較した。
その結果、高脂肪食を与えた野生型マウス（図１２、レーン３）では、高炭水化物食を与えたマウス（図１２、レーン１）に比べて、血清アディポネクチンレベルは低下していた。ｄｂ／ｄｂマウス（図１２、レーン５と７）の血清アディポネクチンレベルも、高炭水化物食又は高脂肪食のいずれかを与えた野生型対照（図１２、レーン１と３）に比べて低下していた。高脂肪食の野生型マウスの血清アディポネクチンレベル低値は、低用量の組換えアディポネクチンの持続全身注入により、高炭水化物食を与えられた野生型対照（図１２、レーン１，３，４）のレベルまで部分的に回復し、高脂肪食（図１３、レーン１，３，４）で誘発された高インスリン血症（図１４、レーン１，３，４）と高血糖にも有意の改善が見られた。高炭水化物食又は高脂肪食のいずれかを与えられたｄｂ／ｄｂマウスの低い血清アディポネクチンレベルも、アディポネクチン補充により、対応する野生型対照のレベルまで部分的に回復し（図１２）、レプチンリセプター欠乏により誘発された高血糖（図１３）と高インスリン血症（図１４）にもやはり有意の改善が見られた。ＫＫＡ^ｙマウスとそれらの野生型対照を用いた際にも同様の結果が得られた（図１５〜１７）。これらの結果は、高脂肪食、レプチンリセプター欠乏又はアグーチ過剰発現が、一部アディポネクチン低下によりインスリン抵抗性をもたらし、アディポネクチンが抗糖尿病薬として有用であることを示すものである。
また、アディポネクチン投与による、ＫＫＡ^ｙマウスの骨格筋中の脂肪酸酸化に対する影響を検討した。
ＫＫＡ^ｙマウスについての骨格筋及び肝中のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯ）活性及び脂肪酸酸化、骨格筋及び肝中の組織トリグリセリド含量、並びに血清中の遊離脂肪酸及びトリグリセリドレベルを測定した。マウスには高脂肪食を与え、２週間表２記載の用量の完全長アディポネクチン（Ａｄ）又はアディポネクチンの球状ドメイン（ｇＡｄ）を投与した。
その結果を表２に示す。

（９）アディポネクチンによるβ酸化の促進
骨格筋では、アディポネクチン投与ＫＫＡ^ｙマウスは、β酸化関連酵素及びＵＣＰ２の発現増加を示した。アディポネクチン投与マウスのＡＣＯ活性と脂肪酸燃焼は、骨格筋では上昇していたが、肝では上昇していなかった（表２）。これらの変化により骨格筋内トリグリセリド含量は減少し、血清のＦＦＡ及びトリグリセリドレベルの低下も伴った（表２）。このような血清ＦＦＡとトリグリセリドレベルの低下は、続いて、肝組織内への脂肪酸輸送に関与する分子の発現低下をもたらすと考えられ、更に肝の組織トリグリセリド含量も低下させる（表２）。
これに対して、正常のＣ５７マウスにアディポネクチンを２週間投与した場合には、高脂肪食に伴うＷＡＴ重量（無投与マウス：０．５３±０．０３ｇ；ｇＡｄ投与：０．４８±０．０４ｇ）と体重の増加は、ビークル（ビークル投与：２２．８±２．０ｇ；ｇＡｄ投与：２０．６±２．１ｇ）に比べてわずかに低下したが、有意とはいえなかった。食餌摂取量は、いずれも高脂肪食を与えられたアディポネクチン投与マウスの方が対照に比べて多い傾向があり（ビークル投与：５．７１±０．５６ｇ／日；ｇＡｄ投与：６．２８±０．５１ｇ／日）、直腸体温もアディポネクチン投与マウスの方が有意に高く（表２）、筋及び褐色脂肪組織での脂肪酸燃焼とエネルギー消費に関与する分子の発現増加と矛盾しなかった。しかしながら、レプチンリセプターを欠く^１ｄｂ／ｄｂマウスにおいても、アディポネクチンの抗糖尿病作用は減弱していなかった（図１２〜１４）。更に、野生型マウスに対するアディポネクチンの投与は、ＷＡＴ中のレプチン発現と血清レプチンレベル（ビークル投与：１１．１±２．１ｎｇ／ｍｌ；ｇＡｄ投与：１０．４±２．６ｎｇ／ｍｌ）を変化させなかった。ＫＫ（ビークル投与：１５．１±２．５ｎｇ／ｍｌ；ｇＡｄ投与：１３．４±２．７ｎｇ／ｍｌ）、ＫＫＡ^ｙ（ビークル投与：６１．５±５．４ｎｇ／ｍｌ；ｇＡｄ投与：５７．９±５．７ｎｇ／ｍｌ）及びｄｂ／ｄｂマウス（ビークル投与：１５３．９±２０．４ｎｇ／ｍｌ；ｇＡｄ投与：１４５．２±１４．７ｎｇ／ｍｌ）でもほぼ類似の血清レプチンレベル結果が得られた。これらの結果は、アディポネクチンがレプチンとは独立の経路で糖尿病治療作用を発揮することを示している。
産業上の利用可能性
本発明によれば、高脂肪食により誘発され、肥満を伴うインスリン抵抗性が改善され、糖尿病のほとんどを占める２型糖尿病が治療できる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ｄｂ／ｄｂマウスのＷＡＴ中のアディポネクチンｍＲＮＡ量（ａ）及び血清アディポネクチンレベル（ｂ）を示す図である。
図２は、ｄｂ／ｄｂマウスのグルコース負荷試験時の、グルコース曲線下面積値（ａ）及びインスリン曲線下面積値（ｂ）を示す図である。
図３は、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞中のアディポネクチンｍＲＮＡ量を示す図である。
図４は、ＷＡＴ中のＬＰＬｍＲＮＡ量を示す図である。
図５は、精巣上体ＷＡＴ重量を示す図である。
図６は、ＷＡＴ消失を示すマウス腹腔像を示す図である。
図７は、抗アディポネクチン抗体によるイムノブロッティングの結果を示す図である。
図８は、インスリン抵抗性指数を示す図である。
図９は、マウス骨格筋におけるＣＤ３６、ＡＣＯ、ＵＣＰ２及びＰＰＡＲ−αの各ｍＲＮＡ発現を示す図である。
図１０は、マウス肝におけるＣＤ３６、ＡＣＯ、ＵＣＰ２及びＰＰＡＲ−αの各ｍＲＮＡ発現を示す図である。
図１１は、マウス骨格筋におけるインスリンリセプター（ＩＲ）とインスリンリセプター基質（ＩＲＳ）−１のインスリン誘発性のチロシンリン酸化及びインスリン（Ｉｎｓ）刺激によるＡｋｔリン酸化を示す図である。
図１２は、Ｃ５７及びｄｂ／ｄｂマウスのグルコース負荷試験時の血清アディポネクチンレベルを示す図である。
図１３は、Ｃ５７及びｄｂ／ｄｂマウスのグルコース負荷試験時のグルコース曲線下面積を示す図である。
図１４は、Ｃ５７及びｄｂ／ｄｂマウスのグルコース負荷試験時のインスリン曲線下面積を示す図である。
図１５は、ＫＫ及びＫＫＡ^ｙマウスのグルコース負荷試験と基の血清アディポネクチンレベルを示す図である。
図１６は、ＫＫ及びＫＫＡ^ｙマウスのグルコース負荷試験時のグルコース曲線下面積を示す図である。
図１７は、ＫＫ及びＫＫＡ^ｙマウスのグルコース負荷試験と基のインスリン曲線下面積を示す図である。

Claims (4)

1. アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とするインスリン抵抗性改善剤。
2. アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子及びレプチン又はその遺伝子を有効成分とするインスリン抵抗性改善剤。
3. アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とする２型糖尿病治療剤。
4. アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子及びレプチン又はその遺伝子を有効成分とする２型糖尿病治療剤。

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