JPWO2003035875A1 - ピルビン酸リン酸ジキナーゼの改善により植物の光合成速度を向上させる方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｃ４植物の形質転換方法に関する。さらに外来遺伝子をＣ４植物で高度に発現させる方法に関する。詳細には、Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素を高発現にすることにより、低温でも光合成能の優れたＣ４植物を作出する方法に関する。本発明においては、プロモーター、該プロモーターにより制御される光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセットを用いて、Ｃ４植物を形質転換する。光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子は、好ましくはＣ４植物ゲノム由来ＰＰＤＫ遺伝子、又は、その変異型である。本発明は特に、ＰＰＤＫを持つＣ４植物の増産（特に低温条件下でのトウモロコシの増産）に有用である。
Description
技術分野
本発明は、Ｃ４植物の形質転換方法に関する。さらに外来遺伝子をＣ４植物で高度に発現させる方法に関する。詳細には、Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素を高発現にすることにより、低温でも光合成能の優れたＣ４植物を作出する方法に関する。本発明は特に、ＰＰＤＫを持つＣ４植物の増産（特に低温条件下でのトウモロコシの増産）に有用である。
背景技術
植物のピルビン酸リン酸ジキナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ（ＰＰＤＫ），ＥＣ２．７．９．１）は、Ｃ４回路を構成する重要な酵素の一つであり、その活性とＣ４植物の光合成速度との間には高い相関関係があるといわれてきた。さらに、その活性はＣ４回路を構成する酵素のうち最も低く、ＰＰＤＫによる反応がＣ４光合成を律速していると考えられてきた。また、ＰＰＤＫは４つのサブユニットから成る４量体であるが、その結合は弱く、低温条件（１２℃以下）にさらされた場合、２量体もしくは単量体に解離し、急速にその活性を失うことが知られている。通常、トウモロコシＰＰＤＫは、０℃、２０分の処理で約７０％の活性が失われる。一方で、様々な温度でトウモロコシＰＰＤＫの活性を測定し、アレニウスプロットを作成すると１１．７℃に変曲点が存在することがわかっており、この温度とトウモロコシの生育限界温度が一致することがわかっている。これらの点から、低温下でＣ４植物の光合成速度が低下する主要因として、ＰＰＤＫの活性低下が考えられてきた。
キク科植物Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ（Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ）はＣ３／Ｃ４中間型に分類され、そのＰＰＤＫは０℃の低温処理においてもほとんど失活しないことが知られている（Ｂｕｒｎｅｌｌ ＪＮ：Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｒｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｄ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，Ｐｉｄｉｋｉｎｅｓｅ ｉｎ Ｆｌａｖｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３１，２９５−２９７（１９９０））。そこで、この低温耐性型のＰＰＤＫ遺伝子を利用し、より低温でもＣ４光合成を行なう、すなわちより低温に強いＣ４植物を作出できると考えられた。
本発明者らはこれまでの研究でＦ．ｂｒｏｗｎｉｉのＰＰＤＫ遺伝子を単離・ＤＮＡ配列を解読することにより、ＰＰＤＫが低温耐性であるために重要な領域を決定することに成功した。またこの領域の配列を用い、他の植物由来の低温感受性ＰＰＤＫのＤＮＡとの間で組換えを起こすことにより、低温感受性ＰＰＤＫを低温耐性に変えることができることを示した（ＷＯ９５／１５３８５、Ｕｓａｍｉ Ｓ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｂｕｒｎｅｌｌ ＪＮ：Ｃｏｌｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｏｆ Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７：９６９−８０（１９９５）、Ｏｈｔａ Ｓ，Ｕｓａｍｉ Ｓ，Ｕｅｋｉ Ｊ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｂｕｒｎｅｌｌ ＪＮ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ３９６： １５２−６（１９９６））。
しかしながら、数多くのトウモロコシ形質転換体の調査を通じ、本発明者らは人為的に導入したＰＰＤＫ（導入ＰＰＤＫ）の効果は、Ｃ４植物がもともと持っているＰＰＤＫ（内生ＰＰＤＫ）によってマスクされてしまうことを発見した。このことはＣ４植物では内生ＰＰＤＫは可溶性タンパク質の数％を占めるほど多量に存在していることが原因となっていると思われた。さらに本発明者らは導入ＰＰＤＫのサブユニットと内生ＰＰＤＫのサブユニットがヘテロな４量体を形成することがあることも見い出した。
内生ＰＰＤＫによる導入ＰＰＤＫの効果のマスキングを解決する手段として、次の２つの方法がある。ひとつは導入ＰＰＤＫの発現量を高める方法であり、もう一つは内生ＰＰＤＫを抑える方法である。前者はイントロン等の配列を形質転換用に構築した遺伝子に組み込むこと（おもにプロモーターと構造遺伝子との間にイントロンを組み込むことが多い）で外部から導入される遺伝子の発現量を増大させる技術である（ＷＯ９６／３０５１０：ＰＬＤイントロン、ＷＯ９７／４７７５５：２重結合イントロン）。後者は発現を抑えたい遺伝子の作るｍＲＮＡと相補的配列を持つｍＲＮＡを作る遺伝子を導入することにより、目的の遺伝子の発現量を抑えるアンチセンス技術である（特許２６５１４４２号、左記の分割特許２６９４９２４号）。本発明者らはこれらの技術を試みてきた。
イントロン等による導入ＰＰＤＫの発現量増加に関し、形質転換に用いる遺伝子は、常法にしたがってトウモロコシＰＰＤＫプロモーター（Ｇｌａｃｋｉｎ ＣＡ，ＧｒｕｌａＪＷ Ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅ ａｎｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍａｉｚｅ．ＰＮＡＳ８７，３００４−３００８（１９９０））にＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ、Ｆ．ｂｉｄｅｎｔｉｓ（Ｕｓａｍｉ Ｓ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｂｕｒｎｅｌｌ ＪＮ：Ｃｏｌｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｏｆ Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７：９６９−８０（１９９５））又はトウモロコシＰＰＤＫ遺伝子（Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｍ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｍａｉｚｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６５： １６７７２−１６７７７（１９９０））のｃＤＮＡを結合する形で構築した。この際、プロモーターと構造遺伝子の間にヒマ（Ｃａｓｔｏｒ ｂｅａｎ）カタラーゼ遺伝子の第一イントロン（Ｏｈｔａ Ｓ，Ｍｉｔａ Ｓ，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｏｆ ａ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３１，８０５−８１３（１９９０））、イネホスホリパーゼＤ遺伝子第一イントロン（Ｕｅｋｉ Ｊ，Ｍｏｒｉｏｋａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３６，９０３−９１４（１９９５））、トウモロコシユビキチン第一イントロン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９２））、トウモロコシＳｈｒｕｎｋｅｎ１第一イントロン（Ｖａｓｉｌ Ｖ，Ｃｌａｎｃｙ Ｍ，Ｆｅｒｌ ＲＪ，Ｖａｓｉｌ ＩＫ，Ｈａｎｎａｈ ＬＣ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ Ｓｈｒｕｎｋｅｎ−１ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｇｒａｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１，１５７５−１５７９（１９８９））を挿入し、イントロン等による導入ＰＰＤＫの発現量増加を試みた。さらに、イントロンを重ねると発現量が増えるという報告（Ｕｅｋｉ Ｊ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｍｏｒｉｏｋａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｋｕｗａｔａ Ｓ，Ｋｕｂｏ Ｔ，Ｉｍａｓｅｋｉ Ｈ Ｔｈｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ−ｉｎｔｒｏｎ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４０，６１８−６２３（１９９９））に基づき、複数のイントロンを重ねて挿入することも行った。
発明の開示
本発明者らの調査では、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ１第一イントロン ＜ ヒマ（Ｃａｓｔｏｒｂｅａｎ）カタラーゼ遺伝子の第一イントロン ＜ イネホスホリパーゼＤ遺伝子第一イントロンの順に発現量増加効果は大きく、また重ねて挿入したものではイネホスホリパーゼＤ遺伝子第一イントロンとヒマ（Ｃａｓｔｏｒ ｂｅａｎ）カタラーゼ遺伝子の第一イントロンやイネホスホリパーゼＤ遺伝子第一イントロンとトウモロコシユビキチン第一イントロンの組み合わせで単独の場合よりも発現量が増大した。
しかし、最も導入ＰＰＤＫの発現量が増加した形質転換体でも内生ＰＰＤＫの半分程度（緑葉生重１ｇ当たり７００μｇ程度）であり、導入ＰＰＤＫの効果は顕著に現われなかった。導入ＰＰＤＫの発現量そのものは人為的に導入した遺伝子の発現量としては高く、今回の様に内生遺伝子の産物が多い（発現量が多い）場合には内生遺伝子を抑えない限り導入遺伝子の効果を明らかにできないと思われた。
他方、内生ＰＰＤＫを抑えるためのアンチセンス遺伝子は、トウモロコシＰＰＤＫ遺伝子の５’非翻訳領域中のＳａｃ Ｉから第一イントロン中のＥｃｏ ＲＩまでを含む３９５ｂｐの配列、その配列を６コピー繰り返してつないだもの、さらにトウモロコシＰＰＤＫの成熟酵素部分のほとんどをカバーするｃＤＮＡ由来のＰｓｔ Ｉ断片（２．４ｋｂ）を基にして構築し、トウモロコシに対して形質転換を行った。３９５ｂｐの配列に注目したのは、この配列がトランジットペプチド部分に相当しトウモロコシＰＰＤＫとＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫとの間で相同性が低いため、トウモロコシＰＰＤＫのみを選択的に抑えることができると考えたからであった。
結果、３９５ｂｐの配列に対するアンチセンス遺伝子を導入しただけでは発現量を抑える効果は見られなかった。３９５ｂｐの配列を６コピー繰り返してつないだものやｃＤＮＡ由来のＰｓｔ Ｉ断片（２．４ｋｂ）に対するアンチセンス遺伝子を導入したトウモロコシでは、低頻度であるが内生ＰＰＤＫが抑えられた転換体が出現した。しかし、こうした内生ＰＰＤＫが減少した転換体では導入ＰＰＤＫも減少してしまい、内生ＰＰＤＫのみを特異的に抑えることはできなかった。またＣ４植物にとって必須であるＰＰＤＫが内生ＰＰＤＫも導入ＰＰＤＫもともに抑えられてしまったことにより、こうした転換体の生育は極めて脆弱であり多くのものは生育途中で枯死した。また開花に至ったものでも種子は取れなかった。アンチセンス技術により、よく似た配列を持つ遺伝子の発現を選択的に制御することはその作用機構から考えて理論上困難であり、今回のような事例では適応できないことが判明した。
ｃＤＮＡに代わり、ゲノム遺伝子を導入することにより、Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子を、Ｃ３植物体内で高発現させようと試みた事例がある（特開平１０−２４８４１９）。しかし、この例は、Ｃ３植物がもっていない（又はもっていても発現量が極めて少ない）遺伝子を、Ｃ４植物から導入した例にすぎない。Ｃ４植物が元来有している遺伝子をＣ４植物体内でさらに発現させること、あるいは光合成関連の酵素のようにＣ４植物内で既に多量に発現しているタンパク質をコードする遺伝子をＣ４植物体内でさらに高発現させることは、Ｃ４植物由来の遺伝子をＣ３植物において発現させることより一層困難に思われた。
また、これまでの種々の生化学的研究から、Ｃ４植物ではＰＰＤＫが光合成を律速しているのではないかと推定されているが、Ｃ４植物で実際にＰＰＤＫを大量に発現させたり、新しい特性を持つＰＰＤＫを人為的に導入した報告はなく、これまでの研究が正しいという確証はなかった。
先に述べた様に、ｃＤＮＡではイントロン等を組み合わせても充分なレベルまで導入遺伝子の発現量を増大させることはできず、またアンチセンス技術では選択的に内生の遺伝子のみを抑えることは不可能であった。そこで本発明者らは、ゲノム遺伝子を導入することを検討した。
一方、本発明者らの研究から、低温耐性型であるＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫ ｃＤＮＡをそのままトウモロコシに導入しても導入遺伝子の発現量は極めて少ないことがわかった。これは、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉがＣ３とＣ４の中間型の植物であり、もともとＰＰＤＫの存在量がＣ４植物に比べると少ないからであると考えられた。さらに本発明者らは、完全なＣ４植物であるＦ．ｂｉｄｅｎｔｉｓ又はトウモロコシと、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉとの間でキメラ遺伝子を構築することで、Ｃ４植物中でのＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫの発現が向上することを見出してきた。
そこで、本発明者らは、ゲノム遺伝子の導入に際し、Ｃ３とＣ４の中間型であるＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫのゲノム遺伝子ではなく、トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子を基本として種々の検討を行った結果、トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子をそのままトウモロコシに導入することによりトウモロコシにおいてＰＰＤＫの発現量が増大すること、さらにトウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子の一定領域に変異を導入し、低温耐性型に改変した遺伝子を用いることにより、低温栽培時におけるトウモロコシのＰＰＤＫの発現量が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、プロモーター、該プロモーターにより制御される光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセットを用いて形質転換することを含む、Ｃ４植物中で該酵素発現量を増加させる方法、及びその方法により得られうる形質転換Ｃ４植物を提供する。
発明の詳細な説明
本発明でいう「Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素」は種々知られているが、その中でも発現量の比較的少ない酵素、失活しやすい酵素、及び／又は光合成経路の律速段階に関わる酵素の発現量を増加させるために、本発明の方法を用いることができる。特に本発明の方法は、低温（例えば、約１２℃以下）において上記のような特性を有する酵素の発現量増加のために用いることができる。そのような酵素の例としてはＰＰＤＫがある。また、本発明の方法は、通常は低温（例えば、約１２℃以下）に生育限界を有するＣ４植物における、低温での光合成能を高めるために用いることができる。
本発明の方法により、形質転換Ｃ４植物を得ようとする場合、「光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子」としては、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子を用いることができる。このような遺伝子を用いる方法は、低温条件下での光合成速度を向上させたトウモロコシを得る場合に特に好ましい。
（ａ）トウモロコシＰＰＤＫゲノミック遺伝子、すなわち配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。なお、塩基配列に関する相同性の計算には、市販のソフトを用いることができる。また、本明細書でいう「ストリンジェントな条件」とは、温度約４０℃以上、塩濃度約６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７．０；０．１５Ｍ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、好ましくは約５０℃以上、更に好ましくは約６５℃以上でのハイブリダイズ条件をいう。
あるいは、次のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
（ａ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１７において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質；
（ｃ）Ｃ４植物由来のＰＰＤＫ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質。なお、本明細書でアミノ酸配列に関して「相同」というときは、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いている。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される。相同性の計算には、市販のソフトを用いることができる。
本明細書で「ゲノミック遺伝子（ゲノム遺伝子ということもある。）」というときは、特別な場合を除き、ゲノム由来の遺伝子そのものとゲノム由来の遺伝子を改変したものとを含む。本発明の「光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子」は、Ｃ４植物ゲノム由来の遺伝子そのもの、及びそれを改変したものを含む。このような改変型遺伝子は、好ましくはコードする酵素のアミノ酸配列が、低温耐性等の望ましい形質を有する植物、好ましくは、Ｃ４植物又はＣ３とＣ４の中間の性質を有する植物、より好ましくはＦｌａｖｅｒｉａ属に属する植物、さらに好ましくはＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ又はＦ．ｂｉｄｅｎｔｉｓにおける、対応する酵素のアミノ酸配列と同等になるように、１又は複数個の塩基が置換されたものである。このような置換は、好ましくは、イントロン部分をできるだけそのまま維持し、エキソン部分に生じるようにする。置換される塩基の数は、特に限定されることはないが、光合成経路を構成する酵素がＰＰＤＫである場合、好ましくは約１〜５０個、より好ましくは約１〜４０個、最も好ましくは約１〜３０個（例えば２９個）である。また、置換されるアミノ酸の数は、光合成経路を構成する酵素がＰＰＤＫである場合、好ましくは約１〜４０個、より好ましくは約１〜３０個、最も好ましくは約１〜２０個（例えば図５に示す１７個）である。
低温耐性Ｃ４植物を得ようとする場合の本発明の１つの好ましい態様は、光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子として、低温耐性型に改変され、かつ導入される植物において高発現可能なＰＰＤＫ遺伝子を用いることである。
低温耐性型への改変は、例えば、発現されるＰＰＤＫのアミノ酸配列が、低温耐性型ＰＰＤＫを発現する植物（その発現量も多い植物であることが好ましい）のＰＰＤＫのアミノ酸配列と「同等」にすることによる。詳細には、例えば、アミノ酸配列がＦ．ｂｒｏｗｎｉｉのＰＰＤＫと同等になるように変異を導入することによる。より詳細には、例えば、トウモロコシＰＰＤＫ遺伝子のＣ末端から約１／６の領域のアミノ酸配列（配列番号１５の配列７６８２以下に対応する。）が、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉのＰＰＤＫの低温耐性に重要なＣ末端から約１／６の領域のアミノ酸配列（配列番号１６の配列７６８２以下に対応する。）と同一になるように、トウモロコシＰＰＤＫゲノム由来遺伝子の第１５エキソン以降の１７箇所に点変異を導入することによる。この際、使用するコドンがトウモロコシ中で高頻度に用いられているものとなるようにするとよい。点変異の導入は、当業者に周知の常法、例えば変異を含むプライマーセットを用いたＰＣＲにより行うことができる。
本明細書でアミノ酸配列に関連して「同等」というときは、アミノ酸配列が「同一」である場合と、アミノ酸の性質が考慮され、アミノ酸配列が類似の性質のアミノ酸に置換されたものである場合とを含む。また、ある酵素のアミノ酸配列が、「望ましい形質を有する植物における対応する酵素のアミノ酸配列と同等になる」とは、前者のアミノ酸配列が後者のアミノ酸配列と完全同一になる場合と、完全に同一ではないが、前者のアミノ酸配列において、後者のアミノ酸とは異なる一又は複数個（好ましくは、約１〜４０個、より好ましくは約１〜３０個、最も好ましくは約１〜２０個）のアミノ酸を、後者のアミノ酸と同等になるようにすることをいう。
低温耐性型に改変され、かつ導入される植物において高発現可能なＰＰＤＫ遺伝子を得るには、例えば、エキソン部分において上記の変異を行い、かつＣ４植物ゲノム由来のＰＰＤＫ遺伝子のイントロン部分を可能な限りそのまま維持することによる。
変異型の「光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子」としては、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子を用いることができる。このような遺伝子は、低温条件下で光合成速度を向上させたトウモロコシを得る場合に特に好ましい。
（ａ）トウモロコシＰＰＤＫゲノミック遺伝子の１５エキソンより下流の領域において、アミノ酸配列がＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫのアミノ酸配列と同じになるように変異させた塩基配列、すなわち配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
あるいは、次のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
（ａ）Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫ、すなわち配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質；
（ｃ）低温耐性のＣ４植物由来のＰＰＤＫ、若しくは低温耐性のＣ３／Ｃ４中間型植物（好ましくは、フラベリア・ブローニ（Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ））由来のＰＰＤＫ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質。
本発明はまた、プロモーター等の発現調節領域、その下流の該領域により制御される光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子（ゲノム由来の遺伝子そのものであっても、その改変型であってもよい。）、及びターミネーターを含む発現カセットをも提供する。
本発明の発現カセットには、形質転換しようとする植物内で機能可能なプロモーターであればいずれも用いることができる。例えば、ＰＰＤＫ（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：９５８６−９５９０（１９９３））やＰＥＰＣ（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ａｎｄ Ｉｚｕｉ：Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １０６：９８２−９８７（１９８９）、及びＭａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｊ６：３１１−３１９（１９９４））、Ｒｕｂｉｓｃｏ（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｊ６：３１１−３１９（１９９４））といった光合成関連遺伝子の緑色器官で遺伝子を高発現させるようなプロモーター；カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３：５６７−５８１（１９９３））、アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３−１７１（１９９０））、アルファチューブリンプロモーター（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１：９３７−９４２（１９９３））、Ｓｃプロモーター（Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９：１２２１−１２３０（１９９９））エンドウＰＡＬプロモーター、Ｐｒｐ１プロモーター（特表平１０−５００３１２）、ｈｓｒ２０３Ｊプロモーター（Ｐｏｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｊ５：５０７−５２１（１９９４））、ＥＡＳ４プロモーター（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ１１５：４３７−４５１（１９９７））、ＰＲ１ｂ１プロモーター（Ｔｏｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ １０：６２４−６３４（１９９７））、ｔａｐ１プロモーター（Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：４７５−４９０（１９９３））、ＡｏＰＲ１プロモーター（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｊ３：１９１−２０１（１９９３））を用いることができる。
本発明の発現カセットには、形質転換しようとする植物内で機能可能なターミネーターであればいずれも用いることができる。例えば、ｎｏｓターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｇｅｎｅ７ターミネーター、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩターミネーターを用いることができる。
このような本発明の発現カセットの例としては、次のＤＮＡを含む発現カセットがある。
（ａ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１５において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；若しくは
（ｄ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；又は、
（ａ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１６において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；若しくは
（ｄ）配列表の配列番号１６の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
本発明の発現カセットは、低温条件下で光合成速度を向上させたＣ４植物を作出するために特に有用である。本発明はまた、そのような発現カセットを含む、組換えベクターをも提供する。
本発明の発現カセットの構成要素となる各ＤＮＡ断片をサブクローニングするためのベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡ）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターとしては、具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示される。
本発明の発現カセットを目的とする植物に導入するためのベクターは、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用のベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，１６５−１７４（１９９６））、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２１及びこれらから派生したベクターなどが例示される。
植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子（ゲノム由来の遺伝子そのものであっても、その改変型であってもよい。）、翻訳終始コドン及びターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。マーカー遺伝子の例としては、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシン又はスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等の他、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等が挙げられる。
植物の形質転換方法は既に確立されており、アグロバクテリウム法を採用することができる。この方法は周知の方法であり双子葉植物でも単子葉植物（ＷＯ９４／００９７７，ＷＯ９５／０６７２２）でも形質転換することができる。またプロトプラストに常法であるエレクトロポレーション法等によって遺伝子導入することもできるし、パーティクルガンを用い常法にしたがって遺伝子を導入することもできる。なお、本明細書で遺伝子に関して「導入」というときは、特別な場合を除き、対象植物（通常は、植物細胞である）に外から遺伝子を入れることをいう。導入された遺伝子は、対象植物のゲノムに組み込まれることが好ましい。
形質転換細胞は、適当なマーカーを指標としたスクリーニングによって選択することができる。形質転換細胞は、従来技術を利用して分化させることにより、目的の形質転換植物体とすることができる。
形質転換体の解析は、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができる。例えば、導入した遺伝子のＤＮＡ配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これを用いたＰＣＲにより形質転換植物の染色体ＤＮＡを解析することができる。また、導入した遺伝子に対応するｍＲＮＡ、又はタンパク質の発現の有無により解析することができる。さらには、得られた植物体の低温耐性等によっても解析することができる。ＰＰＤＫのゲノム遺伝子を導入した場合は、ＰＰＤＫの発現量により解析することができる。また、低温耐性であるか否かは、その形質転換体又は形質転換体から得られたＰＰＤＫを、低温処理したときのＰＰＤＫの活性の低下の程度により解析することができる。これらの解析方法は当業者にはよく知られている。
本発明の形質転換植物は、光合成経路を構成する酵素を、形質転換されていない植物と比較して、より多く発現しうる。発現量は、好ましくはその形質転換植物の光合成速度の向上に有効な量である。「光合成速度の向上に有効な量」とは、ある温度、好ましくは低温（例えば、約１２℃、約０℃）において、その形質転換植物が、光合成経路を構成する該酵素を形質転換されていないものと比較してより多く発現しており、そのためにその形質転換植物の光合成の速度がより大きいこと、及び／又はその形質転換植物の生育がよりすぐれていたり、その形質転換植物から得られる目的の収穫物の収量がより多いことを含む。
さらに、改変されたゲノミック遺伝子を用いた本発明の形質転換植物においては、形質転換されていない植物と比較して光合成経路を構成する酵素がより多く発現されており、及び／又は該酵素がより失活しにくい。この場合の発現量／失活の程度は、好ましくはその形質転換植物の光合成速度の向上に有効な量／程度である。「光合成速度の向上に有効な量」については既に述べたとおりである。活性に関し「光合成速度の向上に有効な程度」とは、ある温度、好ましくは低温（例えば、約１２℃、約０℃）において、形質転換されていないものと比較してその形質転換植物の該酵素がより失活しにくく、そのためにその形質転換植物の光合成の速度がより大きいこと、及び／又はその形質転換植物の生育がよりすぐれていたり、その形質転換植物から得られる目的の収穫物の収量がより多いことを含む。
本発明は、後述の実施例に記載されているトウモロコシ以外のＣ４植物、例えばサトウキビ、アオビユ、ヒエ、アワ、ソルガム、ミレット、キビ等にも適用することができる。
また、本明細書で「形質転換植物」というときは、本発明の方法により組換え植物細胞を得て、該植物細胞を植物体に再生させることにより得た形質転換植物（Ｔ０世代）のみならず、該形質転換植物より得られた後代（Ｔ１世代等）の植物をも、その導入された形質が維持されている限り含む。また、本明細書で「植物」というときは、特に明記した場合を除き、植物体（個体）の他、種子（発芽種子、未熟種子を含む）、器官又はその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
本発明の方法によれば、光合成経路を構成する酵素（例えば、Ｃ４回路の重要酵素ＰＰＤＫ自体、又は改変型酵素若しくはＰＰＤＫ）を、Ｃ４植物でより多く発現させることができる。そして、Ｃ４植物の光合成速度を低温において向上させ、該Ｃ４植物を低温耐性とすることができる。これはＰＰＤＫを持つＣ４植物の増産、特に低温条件下でのトウモロコシ等の増産を可能とする。
従来、Ｃ４植物のゲノム遺伝子をＣ３植物で発現させた例はあったが、Ｃ４植物のゲノム遺伝子をＣ４植物に導入することによって高発現させた事例はなかった。基本的にＣ３植物はＣ４光合成に関係する遺伝子を持っていない（もしくは持っていても存在量はごくわずかである）ので、たやすく導入した遺伝子の効果が現われる。本発明によれば、Ｃ４植物でＣ４植物のゲノム遺伝子を高発現させることができ、内生の遺伝子によってマスクされることなく、導入遺伝子の効果を手にすることができる。また、本発明の別の態様においては、点変異の手法を用いて遺伝子の性質を改変し、単に発現量を増やす場合と違い、特定の条件（例えば、低温条件）でより大きな効果をあげることができる。本発明は、Ｃ４植物の光合成に関係するＰＰＤＫ遺伝子をＣ４植物で大量に発現させることができ、これまで実現できなかったＣ４植物における光合成速度の向上を始めて達成した。
本発明の方法は、以上説明したとおりＣ４植物の光合成経路を構成する酵素に関する形質転換に有用であるが、同様の手法は他の望ましい形質をＣ４植物に付与する場合にも適用可能であろう。すなわち、本発明は、プロモーター、該目的タンパク質をコードしており、該プロモーターにより制御される植物のゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセットを用いて、植物中で目的タンパク質を高発現させる方法をも提供する。ここでのゲノミック遺伝子は、該目的タンパク質をコードしている該植物ゲノム由来の遺伝子の塩基配列において、イントロン部分は維持されたまま、エキソン部分の１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有するものであることが好ましいであろう。また、本発明の方法は、Ｃ４植物の形質転換に有用であるが、同様の手法はＣ４植物以外の形質転換にも適用可能であろう。
実施例
＜実施例１＞
（＃２７０６の構築）
トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子をそのままトウモロコシに導入するため、以下の様に形質転換用遺伝子（＃２７０６）を構築した。
λ ｏｎｇＣにクローニングされたトウモロコシＰＰＤＫゲノムクローン（Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｍ，１９９０）から、第１イントロン後半から第６イントロン前半までを含む４．５ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ断片を切り出し、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｈｉｅｉ Ｙ，Ｓａｉｔｏ Ｙ，Ｍｕｒａｉ Ｎ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ：Ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ Ｔ−ＤＮＡｓ ｆｏｒ ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｆｒｅｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ．Ｐｌａｎｔ Ｊ１０，１６５−１７５１９９６）のＢａｍ ＨＩサイトに挿入した。このプラスミドをＸｂａ Ｉにより消化してλアーム部分を除去し、末端をＫｌｅｎｏｗ酵素により平滑化した。ここに、λＥＭＢＬ３にクローニングされたゲノミッククローン（Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｍ，１９９０）から切り出した２ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩ断片（プロモーター領域から第１イントロンの途中までを含む）を、同様に末端を平滑化して連結した。次に、第６イントロン後半から転写終結領域までを含む３．３ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ断片をλｏｎｇＣクローンから切り出し、プロモーターから第６イントロン前半までを含むベクターのＢａｍ ＨＩサイトに挿入した。最後にトウモロコシユビキチンプロモーター及び同イントロン、ｎｏｓターミネータを結合したｂａｒ遺伝子をＫｐｎ Ｉサイトに挿入した（図１）。最終的に構築されたクローン＃２７０６のＤＮＡ配列（プロモーターからターミネーターまで）を、配列番号１５に示した。
（形質転換植物の作出及びその評価）
アグロバクテリウム法によりトウモロコシインブレットライン（Ａ１８８）に形質転換用遺伝子（＃２７０６）を導入し、形質転換植物を作出した。この時に除草剤バスタに対する抵抗性遺伝子を選抜マーカーとして用いた。得られた転換体を自殖し、次世代を栽培、幼苗期に切り葉をバスタを含む培地にさすことによって、導入したＰＰＤＫ遺伝子をホモ又はヘテロで持っている個体（ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体）と持たない個体（ｎｕｌｌ個体）に分類した（Ｍｉｎｇ−Ｂｏ Ｗａｎｇ，Ｐｅｔｅｒ Ｍ．Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ：Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｓｓａｙｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｈｙｇｒｏｍｙｅｉｎ ｏｒ ＰＰＴ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５：２０９−２１５（１９９７））。
その後、葉から得た緑葉抽出液を用いてウエスタン分析を行い、ＰＰＤＫの存在量を推定した。
さらに、膝高期から雄穂抽出期にかけて、ＬＩ−ＣＯＲ社製の光合成測定装置ＬＩ−６４００を用いて光合成速度を測定した。測定は２台の装置を用いて行い、常に同一形質転換体に由来するｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体をペアにして同時に測定した（２５ペア）。光合成測定条件は、チャンバー内の光（人工光 ＬＥＤ ｓｏｕｒｃｅ）は１０００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１一定、チャンバー内ＣＯ２濃度は、３５０μｍｏｌ・ＣＯ２ｍｏｌ−１一定、チャンバー内湿度は原則制御しない（測定に支障が無い範囲でゆるく制御）、チャンバー内気流（流速）は５００μｍｏｌ・ｓ−１一定とした。葉面温度３０℃、２０℃、１３℃及び８℃で光合成速度を測定したが、低温条件のものは光合成測定装置と植物体（測定葉のみ）を低温保冷庫へ持ちこんで測定した。データ解析はペアのｔ検定により行った。
（結果）
緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ量は、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏでは平均２４８４．０μｇ／ｇｆｗｔであり、ｎｕｌｌでは１１７９．６μｇ／ｇｆｗｔであった。対応のあるｔ検定で、両者は有意水準１％で有意な差があった。すなわち、トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子導入により、ＰＰＤＫの発現量が増大することが分かった（図２Ａ）。
また、ＰＰＤＫ発現量の増大は、導入した遺伝子の効果を明らかにするのに充分なほどであった。葉面温度８℃においては、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ固体とｎｕｌｌ固体との間での光合成速度がｎｕｌｌ固体より改善されていることを見出した（有意水準５％で有意差あり）（図２Ｂ）。
＜実施例２＞
次に本発明者らはトウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子を低温耐性型に改変することを試みた。本発明者らは以前の研究で、ｃＤＮＡ同士のキメラ遺伝子を作り低温耐性型ＰＰＤＫ遺伝子を人為的に作出することに成功しているので（ＷＯ９５／１５３８５）、スプライシングの結果作られるｍＲＮＡがｃＤＮＡ同士の低温耐性キメラ遺伝子から作られるｍＲＮＡと同じになるように、トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子の一部分をＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫのｃＤＮＡで置換したものを作出した。このキメラ遺伝子をトウモロコシに導入したが、遺伝子の発現量は低かった。この結果はゲノム遺伝子の一部分をｃＤＮＡで置換したために、本来ゲノム遺伝子に存在していたイントロンが削除されてしまったために引き起こされたと考えられた。
そこでトウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子の構造をできるだけ維持したまま低温耐性型に改変することとし、下記のようにして点変異導入により、低温耐性に改変したトウモロコシＰＰＤＫゲノム遺伝子（＃２８３８）を構築した。
（＃２８３８の構築）
ゲノムクローンへの変異導入は、ＰＣＲにより行った（Ｈｏ ＳＮ，Ｈｕｎｔ ＨＤ，Ｈｏｒｔｏｎ ＲＭ，Ｐｕｌｌｅｎ ＪＫ，Ｐｅａｓｅ ＬＲ： Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ ７７，５１−５９（１９８９））。ＰＣＲのポリメラーゼには増幅時の誤りを最小限にするためＥｘＴａｑ又はＰｙｒｏｂｅｓｔ（ともに宝酒造）を用い、１ステップごとに断片をプラスミドベクターｐＣＲ２．１又はｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列に誤りのないことを確認した。変異はアミノ酸配列がＦ．ｂｒｏｗｎｉｉのＰＰＤＫと同じになるように導入し、使用するコドンはトウモロコシＰＰＤＫ遺伝子で高頻度に用いられているものを選んだ。まずＰＰＤＫの低温耐性に重要なＣ末端から約１／６の領域（Ｏｈｔａ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、第１５エキソン以降に相当）を、変異を含むプライマーセットＦ１及びＲ１、Ｆ２及びＲ２、Ｆ３及びＲ３、Ｆ４及びＲ４、Ｆ５及びＲ５、並びにＦ６及びＲ６（配列番号１〜６及び８〜１３）を用いて、６断片に分けて増幅した。次に隣り合う二つの断片をＰＣＲにより順次結合し、次いで断片１から断片４までを結合、最後に全体を結合してＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片を完成した（図３）。
一方、トウモロコシＰＰＤＫゲノムクローンの第１４エキソン後半から第１６エキソン前半までを含むＳｍａ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ断片をｐＵＣ１８にサブクローニングし、プライマーセットＭ４（配列番号７）及びｍＸｈｏ（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲにより第１５エキソン中にＸｈｏ Ｉサイトを導入した。これを先のＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片と連結し、Ｂａｍ ＨＩ ３．３ｋｂ断片の相当する部分を置換した。この断片を、プロモーターから第６イントロン前半までを含むベクターのＢａｍ ＨＩサイトに挿入し、最後にトウモロコシユビキチンプロモーター及び同イントロン、ｎｏｓターミネータを結合したｂａｒ遺伝子をＫｐｎ Ｉサイトに挿入した（図４）。最終的に構築された変異入りクローン＃２８３８のＤＮＡ配列（プロモーターからターミネーターまで）を、配列番号１６に示した。
なお、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫの低温耐性に重要なＣ末端から約１／６の領域のアミノ酸配列（配列番号１６の配列７６８２以下に対応する。）を、トウモロコシＰＰＤＫの同領域のアミノ酸配列（配列番号１５の配列７６８２以下に対応する。）とともに図５に示した。
（形質転換植物の作出及びその評価）
点変異を導入することで低温耐性型としたトウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子（＃２８３８）を、実施例１と同様にしてトウモロコシインブレットライン（Ａ１８８）に導入し、形質転換植物を作出した。
その後、実施例１と同様にしてｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体を選抜、ウエスタン分析によるＰＰＤＫ量の推定と光合成速度の測定を行なった。光合成速度の測定は実施例１と同様に２台の装置を用いて行い、常に同一形質転換体に由来するｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体をペアにして同時に測定した。データ解析もペアのｔ検定により行った。
（結果１）
ＰＰＤＫ量は、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏでは平均２７４２．２μｇ／ｇｆｗｔであり、ｎｕｌｌでは１４７１．８μｇ／ｇｆｗｔであった（図６Ａ）。すなわち、点変異導入により低温耐性となったトウモロコシＰＰＤＫゲノム遺伝子導入により、ＰＰＤＫの発現量が増大することが分かった。
また、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ固体とｎｕｌｌ固体との間での光合成速度がｎｕｌｌ固体より改善されていることを見出した（１５ペアを使って解析）（図６Ｂ）。
（結果２）
光合成速度の測定に使った植物体の数は、３０℃１５ペア、２０℃１９ペア、８℃２１ペアであり、それぞれのＰＰＤＫ量を温度別に示した（図７Ａ）。ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体がｎｕｌｌ個体を大きく上まわった（有意水準１％で有意差あり。）。
また、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ固体とｎｕｌｌ固体との間での光合成速度がｎｕｌｌ固体より改善されていることを見出した（図７Ｂ）。
点変異導入により低温耐性となったトウモロコシＰＰＤＫゲノム遺伝子をトウモロコシに導入することにより、ＰＰＤＫ発現量が極めて高くなり、単にゲノミックＰＰＤＫを導入した場合に比べ、より光合成速度が改善される、すなわち単に発現量を増やすのみでは差がなかった温度域でも光合成速度が改善されることを本発明者らは見出した。
＜実施例３＞
さらに本発明者らは、低温耐性改良型ゲノミック遺伝子を導入したトウモロコシのＰＰＤＫ活性を調べた。実験には、ＰＰＤＫ発現量の異なる数種の形質転換トウモロコシ、並びに対照として、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ及びトウモロコシインブレットライン（Ａ１８８）を用いた。それぞれの葉から得た緑葉抽出液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムにより脱塩し、その後０℃に置いて（氷上に放置）、定期的にＰＰＤＫ活性をチェックすることにより、低温にさらした場合のＰＰＤＫ活性の経時的変化を測定した。ＰＰＤＫ活性の測定は常法に従った（Ｊｅｎｋｉｎｓ ＣＬ，Ｈａｔｃｈ ＭＤ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｃ４ ｌｅａｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，Ｐｉ ｄｉｋｉｎａｓｅ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２３９：５３．６２ １９８５）。
結果を図８に示した。ＰＰＤＫ発現量が多い形質転換体は、氷上でもＦ．ｂｒｏｗｎｉｉと同様に失活しにくいことが確認できた。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１の＃２７０６の作成手順を示す。
図２Ａは、トウモロコシゲノミック遺伝子（＃２７０６）による形質転換体の後代の、植物体中でのＰＰＤＫの存在量を、導入したＰＰＤＫ遺伝子をホモ又はヘテロで持っている個体（ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ）と持たない個体（ｎｕｌｌ）とで比較した結果を示す。縦軸は、緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ発現量（μｇ／ｇｆｗｔ）、バーは標準誤差を表す。ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌは有意水準１％で有意な差があった。
図２Ｂは、トウモロコシゲノミック遺伝子（＃２７０６）による形質転換体の後代の、種々の葉面温度における光合成速度をｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌとで比較した結果を示す。縦軸は、光合成速度（μｍｏｌ ＣＯ２・ｍ−２・ｓ−１）、バーは標準誤差を表す。葉面温度８℃において、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌは有意水準５％で有意な差があった。
図３は、ＰＰＤＲゲノムへのＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ型変異の導入手順を示す。
図４は、実施例２の＃２８３８の作成手順を示す。
図５Ａは、トウモロコシＰＰＤＫアミノ酸配列を示す。
図５Ｂは、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫアミノ酸配列を示す。低温耐性に重要なＣ末端から約１／６の領域のアミノ酸配列を囲みで示した。
図５Ｃは、トウモロコシＰＰＤＫアミノ酸配列とＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫのアミノ酸配列の、それぞれのＣ末端１／６配列を比較した図である。両者間で異なるアミノ酸残基を囲みで示した。
図６Ａは、変異入りトウモロコシゲノミック遺伝子（＃２８３８）による形質転換体の後代の、植物体中でのＰＰＤＫの存在量を、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体とで比較した結果を示す。縦軸は、緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ発現量（μｇ／ｇｆｗｔ）、バーは標準誤差を表す。
図６Ｂは、＃２８３８による形質転換体の後代の、種々の葉面温度における光合成速度をｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌとで比較した結果を示す。縦軸は、光合成速度（μｍｏｌ ＣＯ２・ｍ−２・ｓ−１、バーは標準誤差を表す。
図７Ａは、種々の葉面温度における変異入りトウモロコシゲノミック遺伝子（＃２８３８）による形質転換体の後代の、植物体中でのＰＰＤＫの存在量を、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体とで比較した結果を示す。縦軸は、緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ発現量（μｇ／ｇｆｗｔ）、バーは標準誤差を表す。
図７Ｂは、＃２８３８による形質転換体の後代の、種々の葉面温度における光合成速度をｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌとで比較した結果を示す。縦軸は、光合成速度（μｍｏｌ ＣＯ２・ｍ−２・ｓ−１）、バーは標準誤差を表す。葉面温度２０℃及び１３℃において、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌは有意水準５％で有意な差があった。葉面温度８℃において、有意水準１％で有意な差があった。
図８は、変異型トウモロコシゲノミック遺伝子をもつ形質転換体におけるＰＰＤＫの低温不活性化パターンを示す。横軸は氷上での時間（ｍｉｎ）、縦軸はＰＰＤＫ活性（％）を表す。△、□、▲、●及び○は、形質転換体（脱塩緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ量は、順に、４１５２．３μｇ／ｇｆｗｔ、９１２２．４μｇ／ｇｆｗｔ、１３９０．６μｇ／ｇｆｗｔ、９８０２．８μｇ／ｇｆｗｔ及び１２９２．１μｇ／ｇｆｗｔである。）である。×は、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉであり、＋は、トウモロコシインブレットラインＡ１８８（１４９５．２μｇ／ｇｆｗｔ）である。植物体内のＰＰＤＫ含量が多いものは、氷上でもＰＰＤＫ活性は下がりにくく、ほとんどＦ．ｂｒｏｗｎｉｉと同じであった。
本発明は、Ｃ４植物の形質転換方法に関する。さらに外来遺伝子をＣ４植物で高度に発現させる方法に関する。詳細には、Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素を高発現にすることにより、低温でも光合成能の優れたＣ４植物を作出する方法に関する。本発明は特に、ＰＰＤＫを持つＣ４植物の増産（特に低温条件下でのトウモロコシの増産）に有用である。
背景技術
植物のピルビン酸リン酸ジキナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ（ＰＰＤＫ），ＥＣ２．７．９．１）は、Ｃ４回路を構成する重要な酵素の一つであり、その活性とＣ４植物の光合成速度との間には高い相関関係があるといわれてきた。さらに、その活性はＣ４回路を構成する酵素のうち最も低く、ＰＰＤＫによる反応がＣ４光合成を律速していると考えられてきた。また、ＰＰＤＫは４つのサブユニットから成る４量体であるが、その結合は弱く、低温条件（１２℃以下）にさらされた場合、２量体もしくは単量体に解離し、急速にその活性を失うことが知られている。通常、トウモロコシＰＰＤＫは、０℃、２０分の処理で約７０％の活性が失われる。一方で、様々な温度でトウモロコシＰＰＤＫの活性を測定し、アレニウスプロットを作成すると１１．７℃に変曲点が存在することがわかっており、この温度とトウモロコシの生育限界温度が一致することがわかっている。これらの点から、低温下でＣ４植物の光合成速度が低下する主要因として、ＰＰＤＫの活性低下が考えられてきた。
キク科植物Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ（Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ）はＣ３／Ｃ４中間型に分類され、そのＰＰＤＫは０℃の低温処理においてもほとんど失活しないことが知られている（Ｂｕｒｎｅｌｌ ＪＮ：Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｒｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｄ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，Ｐｉｄｉｋｉｎｅｓｅ ｉｎ Ｆｌａｖｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３１，２９５−２９７（１９９０））。そこで、この低温耐性型のＰＰＤＫ遺伝子を利用し、より低温でもＣ４光合成を行なう、すなわちより低温に強いＣ４植物を作出できると考えられた。
本発明者らはこれまでの研究でＦ．ｂｒｏｗｎｉｉのＰＰＤＫ遺伝子を単離・ＤＮＡ配列を解読することにより、ＰＰＤＫが低温耐性であるために重要な領域を決定することに成功した。またこの領域の配列を用い、他の植物由来の低温感受性ＰＰＤＫのＤＮＡとの間で組換えを起こすことにより、低温感受性ＰＰＤＫを低温耐性に変えることができることを示した（ＷＯ９５／１５３８５、Ｕｓａｍｉ Ｓ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｂｕｒｎｅｌｌ ＪＮ：Ｃｏｌｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｏｆ Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７：９６９−８０（１９９５）、Ｏｈｔａ Ｓ，Ｕｓａｍｉ Ｓ，Ｕｅｋｉ Ｊ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｂｕｒｎｅｌｌ ＪＮ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ３９６： １５２−６（１９９６））。
しかしながら、数多くのトウモロコシ形質転換体の調査を通じ、本発明者らは人為的に導入したＰＰＤＫ（導入ＰＰＤＫ）の効果は、Ｃ４植物がもともと持っているＰＰＤＫ（内生ＰＰＤＫ）によってマスクされてしまうことを発見した。このことはＣ４植物では内生ＰＰＤＫは可溶性タンパク質の数％を占めるほど多量に存在していることが原因となっていると思われた。さらに本発明者らは導入ＰＰＤＫのサブユニットと内生ＰＰＤＫのサブユニットがヘテロな４量体を形成することがあることも見い出した。
内生ＰＰＤＫによる導入ＰＰＤＫの効果のマスキングを解決する手段として、次の２つの方法がある。ひとつは導入ＰＰＤＫの発現量を高める方法であり、もう一つは内生ＰＰＤＫを抑える方法である。前者はイントロン等の配列を形質転換用に構築した遺伝子に組み込むこと（おもにプロモーターと構造遺伝子との間にイントロンを組み込むことが多い）で外部から導入される遺伝子の発現量を増大させる技術である（ＷＯ９６／３０５１０：ＰＬＤイントロン、ＷＯ９７／４７７５５：２重結合イントロン）。後者は発現を抑えたい遺伝子の作るｍＲＮＡと相補的配列を持つｍＲＮＡを作る遺伝子を導入することにより、目的の遺伝子の発現量を抑えるアンチセンス技術である（特許２６５１４４２号、左記の分割特許２６９４９２４号）。本発明者らはこれらの技術を試みてきた。
イントロン等による導入ＰＰＤＫの発現量増加に関し、形質転換に用いる遺伝子は、常法にしたがってトウモロコシＰＰＤＫプロモーター（Ｇｌａｃｋｉｎ ＣＡ，ＧｒｕｌａＪＷ Ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅ ａｎｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍａｉｚｅ．ＰＮＡＳ８７，３００４−３００８（１９９０））にＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ、Ｆ．ｂｉｄｅｎｔｉｓ（Ｕｓａｍｉ Ｓ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｂｕｒｎｅｌｌ ＪＮ：Ｃｏｌｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｏｆ Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７：９６９−８０（１９９５））又はトウモロコシＰＰＤＫ遺伝子（Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｍ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｍａｉｚｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６５： １６７７２−１６７７７（１９９０））のｃＤＮＡを結合する形で構築した。この際、プロモーターと構造遺伝子の間にヒマ（Ｃａｓｔｏｒ ｂｅａｎ）カタラーゼ遺伝子の第一イントロン（Ｏｈｔａ Ｓ，Ｍｉｔａ Ｓ，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｏｆ ａ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３１，８０５−８１３（１９９０））、イネホスホリパーゼＤ遺伝子第一イントロン（Ｕｅｋｉ Ｊ，Ｍｏｒｉｏｋａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３６，９０３−９１４（１９９５））、トウモロコシユビキチン第一イントロン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９２））、トウモロコシＳｈｒｕｎｋｅｎ１第一イントロン（Ｖａｓｉｌ Ｖ，Ｃｌａｎｃｙ Ｍ，Ｆｅｒｌ ＲＪ，Ｖａｓｉｌ ＩＫ，Ｈａｎｎａｈ ＬＣ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ Ｓｈｒｕｎｋｅｎ−１ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｇｒａｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１，１５７５−１５７９（１９８９））を挿入し、イントロン等による導入ＰＰＤＫの発現量増加を試みた。さらに、イントロンを重ねると発現量が増えるという報告（Ｕｅｋｉ Ｊ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ｍｏｒｉｏｋａ Ｓ，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｋｕｗａｔａ Ｓ，Ｋｕｂｏ Ｔ，Ｉｍａｓｅｋｉ Ｈ Ｔｈｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ−ｉｎｔｒｏｎ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４０，６１８−６２３（１９９９））に基づき、複数のイントロンを重ねて挿入することも行った。
発明の開示
本発明者らの調査では、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ１第一イントロン ＜ ヒマ（Ｃａｓｔｏｒｂｅａｎ）カタラーゼ遺伝子の第一イントロン ＜ イネホスホリパーゼＤ遺伝子第一イントロンの順に発現量増加効果は大きく、また重ねて挿入したものではイネホスホリパーゼＤ遺伝子第一イントロンとヒマ（Ｃａｓｔｏｒ ｂｅａｎ）カタラーゼ遺伝子の第一イントロンやイネホスホリパーゼＤ遺伝子第一イントロンとトウモロコシユビキチン第一イントロンの組み合わせで単独の場合よりも発現量が増大した。
しかし、最も導入ＰＰＤＫの発現量が増加した形質転換体でも内生ＰＰＤＫの半分程度（緑葉生重１ｇ当たり７００μｇ程度）であり、導入ＰＰＤＫの効果は顕著に現われなかった。導入ＰＰＤＫの発現量そのものは人為的に導入した遺伝子の発現量としては高く、今回の様に内生遺伝子の産物が多い（発現量が多い）場合には内生遺伝子を抑えない限り導入遺伝子の効果を明らかにできないと思われた。
他方、内生ＰＰＤＫを抑えるためのアンチセンス遺伝子は、トウモロコシＰＰＤＫ遺伝子の５’非翻訳領域中のＳａｃ Ｉから第一イントロン中のＥｃｏ ＲＩまでを含む３９５ｂｐの配列、その配列を６コピー繰り返してつないだもの、さらにトウモロコシＰＰＤＫの成熟酵素部分のほとんどをカバーするｃＤＮＡ由来のＰｓｔ Ｉ断片（２．４ｋｂ）を基にして構築し、トウモロコシに対して形質転換を行った。３９５ｂｐの配列に注目したのは、この配列がトランジットペプチド部分に相当しトウモロコシＰＰＤＫとＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫとの間で相同性が低いため、トウモロコシＰＰＤＫのみを選択的に抑えることができると考えたからであった。
結果、３９５ｂｐの配列に対するアンチセンス遺伝子を導入しただけでは発現量を抑える効果は見られなかった。３９５ｂｐの配列を６コピー繰り返してつないだものやｃＤＮＡ由来のＰｓｔ Ｉ断片（２．４ｋｂ）に対するアンチセンス遺伝子を導入したトウモロコシでは、低頻度であるが内生ＰＰＤＫが抑えられた転換体が出現した。しかし、こうした内生ＰＰＤＫが減少した転換体では導入ＰＰＤＫも減少してしまい、内生ＰＰＤＫのみを特異的に抑えることはできなかった。またＣ４植物にとって必須であるＰＰＤＫが内生ＰＰＤＫも導入ＰＰＤＫもともに抑えられてしまったことにより、こうした転換体の生育は極めて脆弱であり多くのものは生育途中で枯死した。また開花に至ったものでも種子は取れなかった。アンチセンス技術により、よく似た配列を持つ遺伝子の発現を選択的に制御することはその作用機構から考えて理論上困難であり、今回のような事例では適応できないことが判明した。
ｃＤＮＡに代わり、ゲノム遺伝子を導入することにより、Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子を、Ｃ３植物体内で高発現させようと試みた事例がある（特開平１０−２４８４１９）。しかし、この例は、Ｃ３植物がもっていない（又はもっていても発現量が極めて少ない）遺伝子を、Ｃ４植物から導入した例にすぎない。Ｃ４植物が元来有している遺伝子をＣ４植物体内でさらに発現させること、あるいは光合成関連の酵素のようにＣ４植物内で既に多量に発現しているタンパク質をコードする遺伝子をＣ４植物体内でさらに高発現させることは、Ｃ４植物由来の遺伝子をＣ３植物において発現させることより一層困難に思われた。
また、これまでの種々の生化学的研究から、Ｃ４植物ではＰＰＤＫが光合成を律速しているのではないかと推定されているが、Ｃ４植物で実際にＰＰＤＫを大量に発現させたり、新しい特性を持つＰＰＤＫを人為的に導入した報告はなく、これまでの研究が正しいという確証はなかった。
先に述べた様に、ｃＤＮＡではイントロン等を組み合わせても充分なレベルまで導入遺伝子の発現量を増大させることはできず、またアンチセンス技術では選択的に内生の遺伝子のみを抑えることは不可能であった。そこで本発明者らは、ゲノム遺伝子を導入することを検討した。
一方、本発明者らの研究から、低温耐性型であるＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫ ｃＤＮＡをそのままトウモロコシに導入しても導入遺伝子の発現量は極めて少ないことがわかった。これは、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉがＣ３とＣ４の中間型の植物であり、もともとＰＰＤＫの存在量がＣ４植物に比べると少ないからであると考えられた。さらに本発明者らは、完全なＣ４植物であるＦ．ｂｉｄｅｎｔｉｓ又はトウモロコシと、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉとの間でキメラ遺伝子を構築することで、Ｃ４植物中でのＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫの発現が向上することを見出してきた。
そこで、本発明者らは、ゲノム遺伝子の導入に際し、Ｃ３とＣ４の中間型であるＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫのゲノム遺伝子ではなく、トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子を基本として種々の検討を行った結果、トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子をそのままトウモロコシに導入することによりトウモロコシにおいてＰＰＤＫの発現量が増大すること、さらにトウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子の一定領域に変異を導入し、低温耐性型に改変した遺伝子を用いることにより、低温栽培時におけるトウモロコシのＰＰＤＫの発現量が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、プロモーター、該プロモーターにより制御される光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセットを用いて形質転換することを含む、Ｃ４植物中で該酵素発現量を増加させる方法、及びその方法により得られうる形質転換Ｃ４植物を提供する。
発明の詳細な説明
本発明でいう「Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素」は種々知られているが、その中でも発現量の比較的少ない酵素、失活しやすい酵素、及び／又は光合成経路の律速段階に関わる酵素の発現量を増加させるために、本発明の方法を用いることができる。特に本発明の方法は、低温（例えば、約１２℃以下）において上記のような特性を有する酵素の発現量増加のために用いることができる。そのような酵素の例としてはＰＰＤＫがある。また、本発明の方法は、通常は低温（例えば、約１２℃以下）に生育限界を有するＣ４植物における、低温での光合成能を高めるために用いることができる。
本発明の方法により、形質転換Ｃ４植物を得ようとする場合、「光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子」としては、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子を用いることができる。このような遺伝子を用いる方法は、低温条件下での光合成速度を向上させたトウモロコシを得る場合に特に好ましい。
（ａ）トウモロコシＰＰＤＫゲノミック遺伝子、すなわち配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。なお、塩基配列に関する相同性の計算には、市販のソフトを用いることができる。また、本明細書でいう「ストリンジェントな条件」とは、温度約４０℃以上、塩濃度約６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７．０；０．１５Ｍ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、好ましくは約５０℃以上、更に好ましくは約６５℃以上でのハイブリダイズ条件をいう。
あるいは、次のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
（ａ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１７において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質；
（ｃ）Ｃ４植物由来のＰＰＤＫ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質。なお、本明細書でアミノ酸配列に関して「相同」というときは、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いている。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される。相同性の計算には、市販のソフトを用いることができる。
本明細書で「ゲノミック遺伝子（ゲノム遺伝子ということもある。）」というときは、特別な場合を除き、ゲノム由来の遺伝子そのものとゲノム由来の遺伝子を改変したものとを含む。本発明の「光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子」は、Ｃ４植物ゲノム由来の遺伝子そのもの、及びそれを改変したものを含む。このような改変型遺伝子は、好ましくはコードする酵素のアミノ酸配列が、低温耐性等の望ましい形質を有する植物、好ましくは、Ｃ４植物又はＣ３とＣ４の中間の性質を有する植物、より好ましくはＦｌａｖｅｒｉａ属に属する植物、さらに好ましくはＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ又はＦ．ｂｉｄｅｎｔｉｓにおける、対応する酵素のアミノ酸配列と同等になるように、１又は複数個の塩基が置換されたものである。このような置換は、好ましくは、イントロン部分をできるだけそのまま維持し、エキソン部分に生じるようにする。置換される塩基の数は、特に限定されることはないが、光合成経路を構成する酵素がＰＰＤＫである場合、好ましくは約１〜５０個、より好ましくは約１〜４０個、最も好ましくは約１〜３０個（例えば２９個）である。また、置換されるアミノ酸の数は、光合成経路を構成する酵素がＰＰＤＫである場合、好ましくは約１〜４０個、より好ましくは約１〜３０個、最も好ましくは約１〜２０個（例えば図５に示す１７個）である。
低温耐性Ｃ４植物を得ようとする場合の本発明の１つの好ましい態様は、光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子として、低温耐性型に改変され、かつ導入される植物において高発現可能なＰＰＤＫ遺伝子を用いることである。
低温耐性型への改変は、例えば、発現されるＰＰＤＫのアミノ酸配列が、低温耐性型ＰＰＤＫを発現する植物（その発現量も多い植物であることが好ましい）のＰＰＤＫのアミノ酸配列と「同等」にすることによる。詳細には、例えば、アミノ酸配列がＦ．ｂｒｏｗｎｉｉのＰＰＤＫと同等になるように変異を導入することによる。より詳細には、例えば、トウモロコシＰＰＤＫ遺伝子のＣ末端から約１／６の領域のアミノ酸配列（配列番号１５の配列７６８２以下に対応する。）が、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉのＰＰＤＫの低温耐性に重要なＣ末端から約１／６の領域のアミノ酸配列（配列番号１６の配列７６８２以下に対応する。）と同一になるように、トウモロコシＰＰＤＫゲノム由来遺伝子の第１５エキソン以降の１７箇所に点変異を導入することによる。この際、使用するコドンがトウモロコシ中で高頻度に用いられているものとなるようにするとよい。点変異の導入は、当業者に周知の常法、例えば変異を含むプライマーセットを用いたＰＣＲにより行うことができる。
本明細書でアミノ酸配列に関連して「同等」というときは、アミノ酸配列が「同一」である場合と、アミノ酸の性質が考慮され、アミノ酸配列が類似の性質のアミノ酸に置換されたものである場合とを含む。また、ある酵素のアミノ酸配列が、「望ましい形質を有する植物における対応する酵素のアミノ酸配列と同等になる」とは、前者のアミノ酸配列が後者のアミノ酸配列と完全同一になる場合と、完全に同一ではないが、前者のアミノ酸配列において、後者のアミノ酸とは異なる一又は複数個（好ましくは、約１〜４０個、より好ましくは約１〜３０個、最も好ましくは約１〜２０個）のアミノ酸を、後者のアミノ酸と同等になるようにすることをいう。
低温耐性型に改変され、かつ導入される植物において高発現可能なＰＰＤＫ遺伝子を得るには、例えば、エキソン部分において上記の変異を行い、かつＣ４植物ゲノム由来のＰＰＤＫ遺伝子のイントロン部分を可能な限りそのまま維持することによる。
変異型の「光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子」としては、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子を用いることができる。このような遺伝子は、低温条件下で光合成速度を向上させたトウモロコシを得る場合に特に好ましい。
（ａ）トウモロコシＰＰＤＫゲノミック遺伝子の１５エキソンより下流の領域において、アミノ酸配列がＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫのアミノ酸配列と同じになるように変異させた塩基配列、すなわち配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
あるいは、次のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
（ａ）Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫ、すなわち配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質；
（ｃ）低温耐性のＣ４植物由来のＰＰＤＫ、若しくは低温耐性のＣ３／Ｃ４中間型植物（好ましくは、フラベリア・ブローニ（Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ））由来のＰＰＤＫ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質。
本発明はまた、プロモーター等の発現調節領域、その下流の該領域により制御される光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子（ゲノム由来の遺伝子そのものであっても、その改変型であってもよい。）、及びターミネーターを含む発現カセットをも提供する。
本発明の発現カセットには、形質転換しようとする植物内で機能可能なプロモーターであればいずれも用いることができる。例えば、ＰＰＤＫ（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：９５８６−９５９０（１９９３））やＰＥＰＣ（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ａｎｄ Ｉｚｕｉ：Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １０６：９８２−９８７（１９８９）、及びＭａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｊ６：３１１−３１９（１９９４））、Ｒｕｂｉｓｃｏ（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｊ６：３１１−３１９（１９９４））といった光合成関連遺伝子の緑色器官で遺伝子を高発現させるようなプロモーター；カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３：５６７−５８１（１９９３））、アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３−１７１（１９９０））、アルファチューブリンプロモーター（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１：９３７−９４２（１９９３））、Ｓｃプロモーター（Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９：１２２１−１２３０（１９９９））エンドウＰＡＬプロモーター、Ｐｒｐ１プロモーター（特表平１０−５００３１２）、ｈｓｒ２０３Ｊプロモーター（Ｐｏｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｊ５：５０７−５２１（１９９４））、ＥＡＳ４プロモーター（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ１１５：４３７−４５１（１９９７））、ＰＲ１ｂ１プロモーター（Ｔｏｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ １０：６２４−６３４（１９９７））、ｔａｐ１プロモーター（Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：４７５−４９０（１９９３））、ＡｏＰＲ１プロモーター（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｊ３：１９１−２０１（１９９３））を用いることができる。
本発明の発現カセットには、形質転換しようとする植物内で機能可能なターミネーターであればいずれも用いることができる。例えば、ｎｏｓターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｇｅｎｅ７ターミネーター、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩターミネーターを用いることができる。
このような本発明の発現カセットの例としては、次のＤＮＡを含む発現カセットがある。
（ａ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１５において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；若しくは
（ｄ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；又は、
（ａ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１６において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；若しくは
（ｄ）配列表の配列番号１６の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
本発明の発現カセットは、低温条件下で光合成速度を向上させたＣ４植物を作出するために特に有用である。本発明はまた、そのような発現カセットを含む、組換えベクターをも提供する。
本発明の発現カセットの構成要素となる各ＤＮＡ断片をサブクローニングするためのベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡ）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターとしては、具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示される。
本発明の発現カセットを目的とする植物に導入するためのベクターは、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用のベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，１６５−１７４（１９９６））、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２１及びこれらから派生したベクターなどが例示される。
植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子（ゲノム由来の遺伝子そのものであっても、その改変型であってもよい。）、翻訳終始コドン及びターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。マーカー遺伝子の例としては、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシン又はスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等の他、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等が挙げられる。
植物の形質転換方法は既に確立されており、アグロバクテリウム法を採用することができる。この方法は周知の方法であり双子葉植物でも単子葉植物（ＷＯ９４／００９７７，ＷＯ９５／０６７２２）でも形質転換することができる。またプロトプラストに常法であるエレクトロポレーション法等によって遺伝子導入することもできるし、パーティクルガンを用い常法にしたがって遺伝子を導入することもできる。なお、本明細書で遺伝子に関して「導入」というときは、特別な場合を除き、対象植物（通常は、植物細胞である）に外から遺伝子を入れることをいう。導入された遺伝子は、対象植物のゲノムに組み込まれることが好ましい。
形質転換細胞は、適当なマーカーを指標としたスクリーニングによって選択することができる。形質転換細胞は、従来技術を利用して分化させることにより、目的の形質転換植物体とすることができる。
形質転換体の解析は、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができる。例えば、導入した遺伝子のＤＮＡ配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これを用いたＰＣＲにより形質転換植物の染色体ＤＮＡを解析することができる。また、導入した遺伝子に対応するｍＲＮＡ、又はタンパク質の発現の有無により解析することができる。さらには、得られた植物体の低温耐性等によっても解析することができる。ＰＰＤＫのゲノム遺伝子を導入した場合は、ＰＰＤＫの発現量により解析することができる。また、低温耐性であるか否かは、その形質転換体又は形質転換体から得られたＰＰＤＫを、低温処理したときのＰＰＤＫの活性の低下の程度により解析することができる。これらの解析方法は当業者にはよく知られている。
本発明の形質転換植物は、光合成経路を構成する酵素を、形質転換されていない植物と比較して、より多く発現しうる。発現量は、好ましくはその形質転換植物の光合成速度の向上に有効な量である。「光合成速度の向上に有効な量」とは、ある温度、好ましくは低温（例えば、約１２℃、約０℃）において、その形質転換植物が、光合成経路を構成する該酵素を形質転換されていないものと比較してより多く発現しており、そのためにその形質転換植物の光合成の速度がより大きいこと、及び／又はその形質転換植物の生育がよりすぐれていたり、その形質転換植物から得られる目的の収穫物の収量がより多いことを含む。
さらに、改変されたゲノミック遺伝子を用いた本発明の形質転換植物においては、形質転換されていない植物と比較して光合成経路を構成する酵素がより多く発現されており、及び／又は該酵素がより失活しにくい。この場合の発現量／失活の程度は、好ましくはその形質転換植物の光合成速度の向上に有効な量／程度である。「光合成速度の向上に有効な量」については既に述べたとおりである。活性に関し「光合成速度の向上に有効な程度」とは、ある温度、好ましくは低温（例えば、約１２℃、約０℃）において、形質転換されていないものと比較してその形質転換植物の該酵素がより失活しにくく、そのためにその形質転換植物の光合成の速度がより大きいこと、及び／又はその形質転換植物の生育がよりすぐれていたり、その形質転換植物から得られる目的の収穫物の収量がより多いことを含む。
本発明は、後述の実施例に記載されているトウモロコシ以外のＣ４植物、例えばサトウキビ、アオビユ、ヒエ、アワ、ソルガム、ミレット、キビ等にも適用することができる。
また、本明細書で「形質転換植物」というときは、本発明の方法により組換え植物細胞を得て、該植物細胞を植物体に再生させることにより得た形質転換植物（Ｔ０世代）のみならず、該形質転換植物より得られた後代（Ｔ１世代等）の植物をも、その導入された形質が維持されている限り含む。また、本明細書で「植物」というときは、特に明記した場合を除き、植物体（個体）の他、種子（発芽種子、未熟種子を含む）、器官又はその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
本発明の方法によれば、光合成経路を構成する酵素（例えば、Ｃ４回路の重要酵素ＰＰＤＫ自体、又は改変型酵素若しくはＰＰＤＫ）を、Ｃ４植物でより多く発現させることができる。そして、Ｃ４植物の光合成速度を低温において向上させ、該Ｃ４植物を低温耐性とすることができる。これはＰＰＤＫを持つＣ４植物の増産、特に低温条件下でのトウモロコシ等の増産を可能とする。
従来、Ｃ４植物のゲノム遺伝子をＣ３植物で発現させた例はあったが、Ｃ４植物のゲノム遺伝子をＣ４植物に導入することによって高発現させた事例はなかった。基本的にＣ３植物はＣ４光合成に関係する遺伝子を持っていない（もしくは持っていても存在量はごくわずかである）ので、たやすく導入した遺伝子の効果が現われる。本発明によれば、Ｃ４植物でＣ４植物のゲノム遺伝子を高発現させることができ、内生の遺伝子によってマスクされることなく、導入遺伝子の効果を手にすることができる。また、本発明の別の態様においては、点変異の手法を用いて遺伝子の性質を改変し、単に発現量を増やす場合と違い、特定の条件（例えば、低温条件）でより大きな効果をあげることができる。本発明は、Ｃ４植物の光合成に関係するＰＰＤＫ遺伝子をＣ４植物で大量に発現させることができ、これまで実現できなかったＣ４植物における光合成速度の向上を始めて達成した。
本発明の方法は、以上説明したとおりＣ４植物の光合成経路を構成する酵素に関する形質転換に有用であるが、同様の手法は他の望ましい形質をＣ４植物に付与する場合にも適用可能であろう。すなわち、本発明は、プロモーター、該目的タンパク質をコードしており、該プロモーターにより制御される植物のゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセットを用いて、植物中で目的タンパク質を高発現させる方法をも提供する。ここでのゲノミック遺伝子は、該目的タンパク質をコードしている該植物ゲノム由来の遺伝子の塩基配列において、イントロン部分は維持されたまま、エキソン部分の１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有するものであることが好ましいであろう。また、本発明の方法は、Ｃ４植物の形質転換に有用であるが、同様の手法はＣ４植物以外の形質転換にも適用可能であろう。
実施例
＜実施例１＞
（＃２７０６の構築）
トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子をそのままトウモロコシに導入するため、以下の様に形質転換用遺伝子（＃２７０６）を構築した。
λ ｏｎｇＣにクローニングされたトウモロコシＰＰＤＫゲノムクローン（Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｍ，１９９０）から、第１イントロン後半から第６イントロン前半までを含む４．５ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ断片を切り出し、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉ Ｔ，Ｈｉｅｉ Ｙ，Ｓａｉｔｏ Ｙ，Ｍｕｒａｉ Ｎ，Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ：Ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ Ｔ−ＤＮＡｓ ｆｏｒ ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｆｒｅｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ．Ｐｌａｎｔ Ｊ１０，１６５−１７５１９９６）のＢａｍ ＨＩサイトに挿入した。このプラスミドをＸｂａ Ｉにより消化してλアーム部分を除去し、末端をＫｌｅｎｏｗ酵素により平滑化した。ここに、λＥＭＢＬ３にクローニングされたゲノミッククローン（Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｍ，１９９０）から切り出した２ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩ断片（プロモーター領域から第１イントロンの途中までを含む）を、同様に末端を平滑化して連結した。次に、第６イントロン後半から転写終結領域までを含む３．３ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ断片をλｏｎｇＣクローンから切り出し、プロモーターから第６イントロン前半までを含むベクターのＢａｍ ＨＩサイトに挿入した。最後にトウモロコシユビキチンプロモーター及び同イントロン、ｎｏｓターミネータを結合したｂａｒ遺伝子をＫｐｎ Ｉサイトに挿入した（図１）。最終的に構築されたクローン＃２７０６のＤＮＡ配列（プロモーターからターミネーターまで）を、配列番号１５に示した。
（形質転換植物の作出及びその評価）
アグロバクテリウム法によりトウモロコシインブレットライン（Ａ１８８）に形質転換用遺伝子（＃２７０６）を導入し、形質転換植物を作出した。この時に除草剤バスタに対する抵抗性遺伝子を選抜マーカーとして用いた。得られた転換体を自殖し、次世代を栽培、幼苗期に切り葉をバスタを含む培地にさすことによって、導入したＰＰＤＫ遺伝子をホモ又はヘテロで持っている個体（ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体）と持たない個体（ｎｕｌｌ個体）に分類した（Ｍｉｎｇ−Ｂｏ Ｗａｎｇ，Ｐｅｔｅｒ Ｍ．Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ：Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｓｓａｙｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｈｙｇｒｏｍｙｅｉｎ ｏｒ ＰＰＴ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５：２０９−２１５（１９９７））。
その後、葉から得た緑葉抽出液を用いてウエスタン分析を行い、ＰＰＤＫの存在量を推定した。
さらに、膝高期から雄穂抽出期にかけて、ＬＩ−ＣＯＲ社製の光合成測定装置ＬＩ−６４００を用いて光合成速度を測定した。測定は２台の装置を用いて行い、常に同一形質転換体に由来するｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体をペアにして同時に測定した（２５ペア）。光合成測定条件は、チャンバー内の光（人工光 ＬＥＤ ｓｏｕｒｃｅ）は１０００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１一定、チャンバー内ＣＯ２濃度は、３５０μｍｏｌ・ＣＯ２ｍｏｌ−１一定、チャンバー内湿度は原則制御しない（測定に支障が無い範囲でゆるく制御）、チャンバー内気流（流速）は５００μｍｏｌ・ｓ−１一定とした。葉面温度３０℃、２０℃、１３℃及び８℃で光合成速度を測定したが、低温条件のものは光合成測定装置と植物体（測定葉のみ）を低温保冷庫へ持ちこんで測定した。データ解析はペアのｔ検定により行った。
（結果）
緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ量は、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏでは平均２４８４．０μｇ／ｇｆｗｔであり、ｎｕｌｌでは１１７９．６μｇ／ｇｆｗｔであった。対応のあるｔ検定で、両者は有意水準１％で有意な差があった。すなわち、トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子導入により、ＰＰＤＫの発現量が増大することが分かった（図２Ａ）。
また、ＰＰＤＫ発現量の増大は、導入した遺伝子の効果を明らかにするのに充分なほどであった。葉面温度８℃においては、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ固体とｎｕｌｌ固体との間での光合成速度がｎｕｌｌ固体より改善されていることを見出した（有意水準５％で有意差あり）（図２Ｂ）。
＜実施例２＞
次に本発明者らはトウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子を低温耐性型に改変することを試みた。本発明者らは以前の研究で、ｃＤＮＡ同士のキメラ遺伝子を作り低温耐性型ＰＰＤＫ遺伝子を人為的に作出することに成功しているので（ＷＯ９５／１５３８５）、スプライシングの結果作られるｍＲＮＡがｃＤＮＡ同士の低温耐性キメラ遺伝子から作られるｍＲＮＡと同じになるように、トウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子の一部分をＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫのｃＤＮＡで置換したものを作出した。このキメラ遺伝子をトウモロコシに導入したが、遺伝子の発現量は低かった。この結果はゲノム遺伝子の一部分をｃＤＮＡで置換したために、本来ゲノム遺伝子に存在していたイントロンが削除されてしまったために引き起こされたと考えられた。
そこでトウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子の構造をできるだけ維持したまま低温耐性型に改変することとし、下記のようにして点変異導入により、低温耐性に改変したトウモロコシＰＰＤＫゲノム遺伝子（＃２８３８）を構築した。
（＃２８３８の構築）
ゲノムクローンへの変異導入は、ＰＣＲにより行った（Ｈｏ ＳＮ，Ｈｕｎｔ ＨＤ，Ｈｏｒｔｏｎ ＲＭ，Ｐｕｌｌｅｎ ＪＫ，Ｐｅａｓｅ ＬＲ： Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ ７７，５１−５９（１９８９））。ＰＣＲのポリメラーゼには増幅時の誤りを最小限にするためＥｘＴａｑ又はＰｙｒｏｂｅｓｔ（ともに宝酒造）を用い、１ステップごとに断片をプラスミドベクターｐＣＲ２．１又はｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列に誤りのないことを確認した。変異はアミノ酸配列がＦ．ｂｒｏｗｎｉｉのＰＰＤＫと同じになるように導入し、使用するコドンはトウモロコシＰＰＤＫ遺伝子で高頻度に用いられているものを選んだ。まずＰＰＤＫの低温耐性に重要なＣ末端から約１／６の領域（Ｏｈｔａ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、第１５エキソン以降に相当）を、変異を含むプライマーセットＦ１及びＲ１、Ｆ２及びＲ２、Ｆ３及びＲ３、Ｆ４及びＲ４、Ｆ５及びＲ５、並びにＦ６及びＲ６（配列番号１〜６及び８〜１３）を用いて、６断片に分けて増幅した。次に隣り合う二つの断片をＰＣＲにより順次結合し、次いで断片１から断片４までを結合、最後に全体を結合してＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片を完成した（図３）。
一方、トウモロコシＰＰＤＫゲノムクローンの第１４エキソン後半から第１６エキソン前半までを含むＳｍａ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ断片をｐＵＣ１８にサブクローニングし、プライマーセットＭ４（配列番号７）及びｍＸｈｏ（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲにより第１５エキソン中にＸｈｏ Ｉサイトを導入した。これを先のＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片と連結し、Ｂａｍ ＨＩ ３．３ｋｂ断片の相当する部分を置換した。この断片を、プロモーターから第６イントロン前半までを含むベクターのＢａｍ ＨＩサイトに挿入し、最後にトウモロコシユビキチンプロモーター及び同イントロン、ｎｏｓターミネータを結合したｂａｒ遺伝子をＫｐｎ Ｉサイトに挿入した（図４）。最終的に構築された変異入りクローン＃２８３８のＤＮＡ配列（プロモーターからターミネーターまで）を、配列番号１６に示した。
なお、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫの低温耐性に重要なＣ末端から約１／６の領域のアミノ酸配列（配列番号１６の配列７６８２以下に対応する。）を、トウモロコシＰＰＤＫの同領域のアミノ酸配列（配列番号１５の配列７６８２以下に対応する。）とともに図５に示した。
（形質転換植物の作出及びその評価）
点変異を導入することで低温耐性型としたトウモロコシＰＰＤＫのゲノム遺伝子（＃２８３８）を、実施例１と同様にしてトウモロコシインブレットライン（Ａ１８８）に導入し、形質転換植物を作出した。
その後、実施例１と同様にしてｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体を選抜、ウエスタン分析によるＰＰＤＫ量の推定と光合成速度の測定を行なった。光合成速度の測定は実施例１と同様に２台の装置を用いて行い、常に同一形質転換体に由来するｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体をペアにして同時に測定した。データ解析もペアのｔ検定により行った。
（結果１）
ＰＰＤＫ量は、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏでは平均２７４２．２μｇ／ｇｆｗｔであり、ｎｕｌｌでは１４７１．８μｇ／ｇｆｗｔであった（図６Ａ）。すなわち、点変異導入により低温耐性となったトウモロコシＰＰＤＫゲノム遺伝子導入により、ＰＰＤＫの発現量が増大することが分かった。
また、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ固体とｎｕｌｌ固体との間での光合成速度がｎｕｌｌ固体より改善されていることを見出した（１５ペアを使って解析）（図６Ｂ）。
（結果２）
光合成速度の測定に使った植物体の数は、３０℃１５ペア、２０℃１９ペア、８℃２１ペアであり、それぞれのＰＰＤＫ量を温度別に示した（図７Ａ）。ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体がｎｕｌｌ個体を大きく上まわった（有意水準１％で有意差あり。）。
また、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ固体とｎｕｌｌ固体との間での光合成速度がｎｕｌｌ固体より改善されていることを見出した（図７Ｂ）。
点変異導入により低温耐性となったトウモロコシＰＰＤＫゲノム遺伝子をトウモロコシに導入することにより、ＰＰＤＫ発現量が極めて高くなり、単にゲノミックＰＰＤＫを導入した場合に比べ、より光合成速度が改善される、すなわち単に発現量を増やすのみでは差がなかった温度域でも光合成速度が改善されることを本発明者らは見出した。
＜実施例３＞
さらに本発明者らは、低温耐性改良型ゲノミック遺伝子を導入したトウモロコシのＰＰＤＫ活性を調べた。実験には、ＰＰＤＫ発現量の異なる数種の形質転換トウモロコシ、並びに対照として、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ及びトウモロコシインブレットライン（Ａ１８８）を用いた。それぞれの葉から得た緑葉抽出液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムにより脱塩し、その後０℃に置いて（氷上に放置）、定期的にＰＰＤＫ活性をチェックすることにより、低温にさらした場合のＰＰＤＫ活性の経時的変化を測定した。ＰＰＤＫ活性の測定は常法に従った（Ｊｅｎｋｉｎｓ ＣＬ，Ｈａｔｃｈ ＭＤ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｃ４ ｌｅａｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，Ｐｉ ｄｉｋｉｎａｓｅ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２３９：５３．６２ １９８５）。
結果を図８に示した。ＰＰＤＫ発現量が多い形質転換体は、氷上でもＦ．ｂｒｏｗｎｉｉと同様に失活しにくいことが確認できた。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１の＃２７０６の作成手順を示す。
図２Ａは、トウモロコシゲノミック遺伝子（＃２７０６）による形質転換体の後代の、植物体中でのＰＰＤＫの存在量を、導入したＰＰＤＫ遺伝子をホモ又はヘテロで持っている個体（ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ）と持たない個体（ｎｕｌｌ）とで比較した結果を示す。縦軸は、緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ発現量（μｇ／ｇｆｗｔ）、バーは標準誤差を表す。ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌは有意水準１％で有意な差があった。
図２Ｂは、トウモロコシゲノミック遺伝子（＃２７０６）による形質転換体の後代の、種々の葉面温度における光合成速度をｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌとで比較した結果を示す。縦軸は、光合成速度（μｍｏｌ ＣＯ２・ｍ−２・ｓ−１）、バーは標準誤差を表す。葉面温度８℃において、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌは有意水準５％で有意な差があった。
図３は、ＰＰＤＲゲノムへのＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ型変異の導入手順を示す。
図４は、実施例２の＃２８３８の作成手順を示す。
図５Ａは、トウモロコシＰＰＤＫアミノ酸配列を示す。
図５Ｂは、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫアミノ酸配列を示す。低温耐性に重要なＣ末端から約１／６の領域のアミノ酸配列を囲みで示した。
図５Ｃは、トウモロコシＰＰＤＫアミノ酸配列とＦ．ｂｒｏｗｎｉｉ ＰＰＤＫのアミノ酸配列の、それぞれのＣ末端１／６配列を比較した図である。両者間で異なるアミノ酸残基を囲みで示した。
図６Ａは、変異入りトウモロコシゲノミック遺伝子（＃２８３８）による形質転換体の後代の、植物体中でのＰＰＤＫの存在量を、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体とで比較した結果を示す。縦軸は、緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ発現量（μｇ／ｇｆｗｔ）、バーは標準誤差を表す。
図６Ｂは、＃２８３８による形質転換体の後代の、種々の葉面温度における光合成速度をｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌとで比較した結果を示す。縦軸は、光合成速度（μｍｏｌ ＣＯ２・ｍ−２・ｓ−１、バーは標準誤差を表す。
図７Ａは、種々の葉面温度における変異入りトウモロコシゲノミック遺伝子（＃２８３８）による形質転換体の後代の、植物体中でのＰＰＤＫの存在量を、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏ個体とｎｕｌｌ個体とで比較した結果を示す。縦軸は、緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ発現量（μｇ／ｇｆｗｔ）、バーは標準誤差を表す。
図７Ｂは、＃２８３８による形質転換体の後代の、種々の葉面温度における光合成速度をｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌとで比較した結果を示す。縦軸は、光合成速度（μｍｏｌ ＣＯ２・ｍ−２・ｓ−１）、バーは標準誤差を表す。葉面温度２０℃及び１３℃において、ｈｏｍｏ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏとｎｕｌｌは有意水準５％で有意な差があった。葉面温度８℃において、有意水準１％で有意な差があった。
図８は、変異型トウモロコシゲノミック遺伝子をもつ形質転換体におけるＰＰＤＫの低温不活性化パターンを示す。横軸は氷上での時間（ｍｉｎ）、縦軸はＰＰＤＫ活性（％）を表す。△、□、▲、●及び○は、形質転換体（脱塩緑葉生重１ｇあたりに含まれるＰＰＤＫ量は、順に、４１５２．３μｇ／ｇｆｗｔ、９１２２．４μｇ／ｇｆｗｔ、１３９０．６μｇ／ｇｆｗｔ、９８０２．８μｇ／ｇｆｗｔ及び１２９２．１μｇ／ｇｆｗｔである。）である。×は、Ｆ．ｂｒｏｗｎｉｉであり、＋は、トウモロコシインブレットラインＡ１８８（１４９５．２μｇ／ｇｆｗｔ）である。植物体内のＰＰＤＫ含量が多いものは、氷上でもＰＰＤＫ活性は下がりにくく、ほとんどＦ．ｂｒｏｗｎｉｉと同じであった。
Claims (19)
- プロモーター、該プロモーターにより制御される目的タンパク質をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセットを用いて形質転換することを含む、Ｃ４植物中で目的タンパク質発現量を増加させる方法。
- Ｃ４植物ゲノミック遺伝子が、目的タンパク質をコードする、ゲノム由来の遺伝子の塩基配列において、イントロン部分が維持されたまま、エキソン部分の１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有するものである、請求項１に記載された方法。
- 目的タンパク質が、光合成経路を構成する酵素である、請求項１又は２に記載された方法。
- プロモーター、該プロモーターにより制御される光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセットを用いて形質転換され、光合成速度の向上に有効な量の該酵素を発現しうる、形質転換Ｃ４植物。
- 光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子が、コードする光合成経路を構成する酵素のアミノ酸配列が低温耐性型の植物の光合成経路を構成する対応する酵素のアミノ酸配列と同等になるように、エキソンに存在する１若しくは数個の塩基が置換された塩基配列を有するものである、請求項４に記載された形質転換Ｃ４植物。
- 光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子が、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）をコードするものである、請求項５に記載された形質転換Ｃ４植物。
- ＰＰＤＫがトウモロコシＰＰＤＫであり、Ｃ４植物がトウモロコシである、請求項６に記載された形質転換Ｃ４植物。
- 置換が第１５エキソン以降においてされている、請求項７に記載された形質転換Ｃ４植物。
- 光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項４に記載された形質転換Ｃ４植物：
（ａ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１５の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。 - 光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子が、次のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項４に記載された形質転換Ｃ４植物：
（ａ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１７において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質；
（ｃ）Ｃ４植物由来のＰＰＤＫ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質。 - 次のいずれかのＤＮＡを含む、プロモーター、該プロモーターにより制御される光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセット：
（ａ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１５において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。 - 光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項５に記載された形質転換Ｃ４植物：
（ａ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１６の番号１７３２〜８５０８に記載の塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。 - 光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項５に記載された形質転換Ｃ４植物：
（ａ）配列表の配列番号１９の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１９において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＣ４植物中でＰＰＤＫ発現量を増加させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１９の塩基配列からなるＤＮＡを相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣ４植物中でＰＰＤＫ発現量を増加させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号１９の塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつＣ４植物中でＰＰＤＫ発現量を増加させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。 - 光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子が、次のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項５に記載された形質転換Ｃ４植物：
（ａ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１８において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質；
（ｃ）低温耐性のＣ４植物由来のＰＰＤＫ、若しくは低温耐性のＣ３／Ｃ４中間型植物（好ましくは、フラベリア・ブローニ（Ｆｌａｖｅｒｉａ ｂｒｏｗｎｉｉ））由来のＰＰＤＫ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質。 - 次のいずれかのＤＮＡを含む、プロモーター、該プロモーターにより制御される光合成経路を構成する酵素をコードするＣ４植物ゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセット：
（ａ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１６において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１６の塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつＰＰＤＫ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。 - プロモーター、該プロモーターにより制御される次のいずれかのＤＮＡからなるＣ４植物ゲノミック遺伝子、及びターミネーターを含む発現カセット：
（ａ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の一部であってＰＰＤＫのＣ末端から１／６の領域に対応する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の一部であってＰＰＤＫのＣ末端から１／６の領域に対応する塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって、かつＣ４植物中でＰＰＤＫ発現量を増加させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の一部であってＰＰＤＫのＣ末端から１／６の領域に対応する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＣ４植物中でＰＰＤＫ発現量を増加させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の一部であってＰＰＤＫのＣ末端から１１６の領域に対応する塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつＣ４植物中でＰＰＤＫ発現量を増加させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。 - 低温条件下におけるＣ４植物の光合成速度を向上させるための、請求項１１、１５又は１６に記載された発現カセット。
- ＰＰＤＫ活性が低温耐性ＰＰＤＫ活性である、請求項１１、１５又は１６に記載された発現カセット。
- 請求項１１、１５、１６、１７又は１８に記載された発現カセットを含む、組換えベクター。
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