KR20040047951A

KR20040047951A - 피루빈산 인산 디키나제의 개선에 의해 식물의 광합성속도를 향상시키는 방법

Info

Publication number: KR20040047951A
Application number: KR10-2004-7005988A
Authority: KR
Inventors: 우사미사토루; 오오타쇼조; 이시다유지
Original assignee: 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤; 신젠타 리미티드
Priority date: 2001-10-23
Filing date: 2002-10-23
Publication date: 2004-06-05
Also published as: JPWO2003035875A1; EP1439232A1; US7396977B2; CN1608132A; US20060064783A1; EP1439232A4; US20080254536A1; WO2003035875A1; BR0213496A; AU2002338197B2; CA2463326A1

Abstract

본 발명은 C4 식물의 형질전환 방법에 관한 것이다. 또한, 외래 유전자를 C4 식물에서 고도로 발현시키는 방법에 관한 것이다. 상세하게는, C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소를 고발현시키는 것에 의해, 저온에서도 광합성능이 우수한 C4 식물을 작출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는, 프로모터, 상기 프로모터에 의해 제어되는 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 카세트를 사용하여, C4 식물을 형질전환한다. 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자는, 바람직하게는 C4 식물 게놈 유래의 PPDK 유전자, 또는 그 변이형이다.

본 발명은 특히, PPDK를 갖는 C4 식물의 증산(특히, 저온조건하에서의 옥수수의 증산)에 유용하다.

Description

피루빈산 인산 디키나제의 개선에 의해 식물의 광합성 속도를 향상시키는 방법{METHOD OF ELEVATING PHOTOSYNTHESIS SPEED OF PLANT BY IMPROVING PYRUVATE PHOSPHATE DIKINASE}

식물의 피루빈산 인산 디키나제(Pyruvate, orthophosphate dikinase(PPDK), EC2.7.9.1)는 C4 회로를 구성하는 중요한 효소의 하나이며, 그 활성과 C4 식물의 광합성 속도와의 사이에는 높은 상관관계가 있다고 여겨져 왔다. 또한, 그 활성은 C4 회로를 구성하는 효소 중 가장 낮고, PPDK에 의한 반응이 C4 광합성을 율속(律速)(rate-limiting)하고 있다고 생각되어 왔다. 또한, PPDK는 4개의 소단위체(subunit)로 이루어진 4량체이지만, 그 결합은 약하고, 저온조건(12℃ 이하)에 노출된 경우 2량체 또는 소단위체로 해리되어, 급속히 그 활성을 잃는 것으로 알려져 있다. 보통, 옥수수 PPDK는 0℃, 20분의 처리에서 약 70%의 활성을 잃는다. 한편, 다양한 온도에서 옥수수 PPDK의 활성을 측정하여, 아레뉴스 플롯(Arrhenius plot)을 작성하면 11.7℃에 변곡점이 존재하는 것으로 알려져 있어, 이 온도와 옥수수의 생육 한계온도가 일치하는 것으로 알려져 있다. 이러한 점으로부터, 저온하에서 C4 식물의 광합성 속도가 저하하는 주요원인으로서, PPDK의 활성저하가 고려되어 왔다.

국화과 식물Flaveria brownii(F.brownii)는 C3/C4 중간형으로 분류되며, 그 PPDK는 0℃의 저온처리에 있어서도 거의 실활(失活)하지 않는 것으로 알려져 있다 (Burnell JN:A comparative study of the cold-sensitivity of pyruvate, Pi dikinase inFlaveriaspecies. Plant Cell Physiol. 31, 295~297(1990)). 여기서, 이 저온 내성형의 PPDK 유전자를 이용하여, 보다 저온에서도 C4 광합성을 수행하는, 즉 보다 저온에 강한 C4 식물을 작출할 수 있다고 생각되었다.

본 발명자들은 지금까지의 연구에서,F.brownii의 PPDK 유전자를 단리·DNA 서열을 해독하는 것에 의해, PPDK가 저온 내성이 되기 위해 중요한 영역을 결정하는 데에 성공하였다. 또한, 상기 영역의 서열을 사용하고, 다른 식물유래의 저온감수성 PPDK의 DNA와의 사이에서 재조합을 일으키는 것에 의해, 저온감수성 PPDK를 저온 내성으로 바꾸는 것이 가능하다는 것을 보여주었다(WO95/15385, Usami S, Ohta S, Komari T, Burnell JN: Cold stability of pyruvate, orthophosphate dikinase of Flaveria brownii. Plant Mol Biol 27: 969-80(1995), Ohta S, Usami S, Ueki J, Kumashiro T, Komari T, Burnell JN: Identification of the amino acid residues responsible for cold tolerance in Flaveria brownii pyruvate,orthophosphate dikinase. FEBS Lett 396: 152~6(1996)).

그러나, 수많은 옥수수 형질전환체의 조사를 통하여, 본 발명자들은 인위적으로 도입한 PPDK(도입 PPDK)의 효과는, C4 식물이 원래 가지고 있는 PPDK(내생 PPDK)에 의해 마스크(mask)되어 버리는 것을 발견하였다. 이것은, C4 식물에는 내생 PPDK가 가용성 단백질의 수%를 차지할 만큼 다량으로 존재하고 있는 것이 원인이 되고 있다고 생각되었다. 또한, 본 발명자들은 도입 PPDK의 소단위체와 내생 PPDK의 소단위체가 헤테로(hetero)한 4량체를 형성하는 경우가 있다는 것도 발견하였다.

내생 PPDK에 의한 도입 PPDK 효과의 마스킹(masking)을 해결하는 수단으로서, 다음 2가지 방법이 있다. 하나는 도입 PPDK의 발현량을 높이는 방법이며, 다른 하나는 내생 PPDK를 억제하는 방법이다. 전자는 인트론 등의 서열을 형질전환용으로 구축한 유전자에 삽입하는 것(주로, 프로모터와 구조유전자 사이에 인트론을 삽입(integrate)하는 경우가 많다)으로, 외부로부터 도입되는 유전자의 발현량을 증대시키는 기술이다(WO96/30510:PLD 인트론, WO97/47755:2중결합 인트론). 후자는 발현을 억제하고 싶은 유전자가 만드는 mRNA와 상보적 서열을 가지는 mRNA를 만드는 유전자를 도입하는 것에 의해, 원하는 유전자의 발현량을 억제하는 안티센스(antisense) 기술이다(일본국 특허 2651442호, 이의 분할특허 2694924호). 본 발명자들은 이들 기술을 시도해 왔다.

인트론 등에 의한 도입 PPDK의 발현량 증가와 관련하여 형질전환에 사용하는 유전자는, 통상적인 방법에 따라 옥수수 PPDK 프로모터(Glackin CA, Grula JWOrgan-specific transcripts of different size and abundance derive from the same pyruvate, orthophosphate dikinase gene in maize. PNAS 87, 3004~3008(1990))에F.brownii,F.bidentis(Usami S, Ohta S, Komari T, Burnell JN: Cold stability of pyruvate, orthophosphate dikinase of Flaveria brownii. Plant Mol Biol 27: 969~80(1995)) 또는 옥수수 PPDK 유전자(Matsuoka M: Structure, genetic mapping, and expression of the gene for pyruvate, orthophosphate dikinase from maize. J. Biol. Chem 265: 16772~16777(1990))의 cDNA를 결합(ligation)하는 형태로 구축하였다. 이 경우, 프로모터와 구조유전자의 사이에 피마자(Castor bean) 카탈라제(catalase) 유전자의 제 1 인트론(Ohta S, Mita S, Hattori T, Nakamura K Construction and expression in tobacco of a β-glucuronidase(GUS) reporter gene containing an intron within the coding sequence. Plant Cell Physiol 31, 805~813(1990)), 벼 포스포리파제 D 유전자 제 1 인트론(Ueki J, Morioka S, Komari T, Kumashiro T, Purification and characterization of phospholipase D from rice and maize(Zea mays L.). Plant Cell Physiol 36, 903~914(1995)), 옥수수 유비퀴틴(ubiquitin) 제 1 인트론 (Christensen 등(1992)) 및 옥수수 Shrunken1 제 1 인트론(Vasil V, Clancy M, Ferl RJ, Vasil IK, Hannah LC Increased gene expression by the first intron of maize Shrunken-1 locus in grass species. Plant Physiol 91, 1575~1579(1989))을 삽입하여, 인트론 등에 의한 도입 PPDK의 발현량 증가를 시도하였다. 또한, 인트론을 중복하면 발현량이 증가한다는 보고(Ueki J, Ohta S, Morioka S, Komari T,Kuwata S, Kubo T, Imaseki H, The synergistic effects of two-intron insertions on heterologous gene expression and advantages of the first intron of a rice gene for phospholipase D. Plant Cell Physiol 40, 618~623(1999))에 기초하여, 복수의 인트론을 중복하여 삽입하는 것도 행하였다.

본 발명은 C4 식물의 형질전환 방법에 관한 것이다. 또한, 외래유전자를 C4 식물에서 고도로 발현시키는 방법에 관한 것이다. 상세하게는, C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소를 고발현시키는 것에 의해, 저온에서도 광합성능이 뛰어난 C4 식물을 작출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히, PPDK를 가지는 C4 식물의 증산(增産)(특히, 저온조건에서의 옥수수의 증산)에 유용하다.

도 1은 실시예 1의 #2706의 작성 순서를 나타낸다.

도 2A는 옥수수 게노믹 유전자(#2706)에 의한 형질전환체의 후대의 식물체중에서의 PPDK의 존재량을, 도입한 PPDK 유전자를 호모 또는 헤테로로 가지고 있는 개체(homo 또는 hetero)와 가지지 않는 개체(nul1)를 비교한 결과를 나타낸다. 세로축은 녹엽생 중량 1g당 포함되는 PPDK 발현량(㎍/gfwt)을, 바(bar)는 표준 오차를 나타낸다. homo 또는 hetero와 nu11은 유의수준 1%로 유의한 차이가 있었다.

도 2B는 옥수수 게노믹 유전자(#2706)에 의한 형질전환체의 후대의 각종 잎면 온도에서의 광합성 속도를, homo 또는 hetero와 null을 비교한 결과를 나타낸다. 세로축은 광합성 속도(μmolCO₂·m^-2·s^-1)를, 바는 표준 오차를 나타낸다. 잎면 온도 8℃에서, homo 또는 hetero와 nul1은 유의수준 5%로 유의한 차이가 있었다.

도 3은 PPDR게놈으로의F.brownii형 변이의 도입 순서를 나타낸다.

도 4는 실시예 2의 #2838의 작성 순서를 나타낸다.

도 5A는 옥수수 PPDK 아미노산 서열을 나타낸다.

도 5B는F.browniiPPDK 아미노산 서열을 나타낸다. 저온 내성에 중요한 C말단으로부터 약 1/6의 영역의 아미노산 서열을 둘레선으로 나타내었다.

도 5C는 옥수수 PPDK 아미노산 서열과F.browniiPPDK의 아미노산 서열의 각각의 C말단 1/6서열을 비교한 도면이다. 양자간에 다른 아미노산 잔기를 둘레선으로 나타내었다.

도 6A는 변이도입 옥수수 게노믹 유전자(#2838)에 의한 형질전환체의 후대의 식물체중에서의 PPDK의 존재량을, homo 또는 hetero 개체와 null 개체를 비교한 결과를 나타낸다. 세로축은 녹엽생 중량 1g당 포함되는 PPDK 발현량(㎍/gfwt)을, 바(bar)는 표준 오차를 나타낸다.

도 6B는 #2838에 의한 형질전환체의 후대의 각종 잎면 온도에서의 광합성 속도를, homo 또는 hetero와 null을 비교한 결과를 나타낸다. 세로축은 광합성 속도(μmolCO₂·m^-2·s^-1)를, 바는 표준 오차를 나타낸다.

도 7A는 각종의 잎면 온도에서의 변이도입 옥수수 게노믹 유전자(#2838)에 의한 형질전환체의 후대의 식물체중에서의 PPDK의 존재량을, homo 또는 hetero 개체와 null 개체를 비교한 결과를 나타낸다. 세로축은 녹엽생 중량 1g당 포함되는 PPDK 발현량(㎍/gfwt)을, 바는 표준 오차를 나타낸다.

도 7B는 #2838에 의한 형질전환체의 후대의 각종의 잎면 온도에서의 광합성 속도를, homo 또는 hetero와 null을 비교한 결과를 나타낸다. 세로축은 광합성 속도(μmolCO₂·m^-2·s^-1)를, 바는 표준 오차를 나타낸다. 잎면 온도 20℃ 및 13℃에 서, homo 또는 hetero와 null은 유의수준 5%로 유의한 차이가 있었다. 잎면 온도 8℃에서, 유의수준 1%로 유의한 차이가 있었다.

도 8은 변이형 옥수수 게노믹 유전자를 가지는 형질전환체에 있어서의 PPDK의 저온불활성화 패턴을 나타낸다. 가로축은 빙상에서의 시간(min), 세로축은 PPDK 활성(%)을 나타낸다. △, □, ▲, ● 및 ○은 형질전환체(탈염 녹엽생 중량 1g당에 포함되는 PPDK량은, 순차로 4152.3μg/gfwt, 9122.4μg/gfwt, 1390.6μg/gfwt, 9802.8μg/gfwt 및 1292.1μg/gfwt이다.)이다. ×는F.brownii이며, ＋는 옥수수 인브레드 라인(inbred line) A188(1495.2μg/gfwt)이다. 식물체내의 PPDK 함량이 많은 것은 빙상에서도 PPDK 활성의 저하가 어려워 거의F.brownii와 같았다.

발명의 상세한 설명

본 발명에서 말하는 「C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소」는 여러가지 알려져 있지만, 그 중에서도 발현량이 비교적 적은 효소, 실활하기 쉬운 효소, 및/또는 광합성 경로의 율속 단계에 관여하는 효소의 발현량을 증가시키기 위해서, 본 발명의 방법을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 저온(예컨대, 약 12℃ 이하)에서 상기와 같은 특성을 갖는 효소의 발현량 증가를 위하여 사용할 수 있다. 그러한 효소의 예로서는 PPDK가 있다. 또한, 본 발명의 방법은, 통상은 저온(예컨대, 약 12℃ 이하)에서 생육한계를 갖는 C4 식물에서 저온에서의 광합성능을 높이기 위해서 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 형질전환 C4 식물을 얻으려고 하는 경우, 「광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자」로서는, 다음중 어느 것의 DNA로 이루어지는 유전자를 사용할 수 있다. 이러한 유전자를 사용하는 방법은, 저온조건하에서의 광합성 속도를 향상시킨 옥수수를 얻는 경우에 특히 바람직하다.

(a) 옥수수 PPDK 게노믹 유전자, 즉 서열표의 서열번호 15의 번호 1732~8508기재의 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 15의 번호 1732~8508에 있어서, 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열로서, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 15의 번호 1732~8508 기재의 염기서열을 갖는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)하고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA; 또는

(d) 서열표의 서열번호 15의 번호 1732~8508 기재의 염기서열과 적어도 50% 이상(바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA. 또한, 염기서열에 관한 상동성의 계산에는 시판되는 소프트웨어를 사용할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 말하는 「스트린젠트한 조건」이란, 온도 약 40℃ 이상, 염농도 약 6×SSC(1×SSC=15mM 구연산나트륨 완충액; pH7.0; 0.15M 염화나트륨), 0.1% SDS, 바람직하게는 약 50℃ 이상, 더욱 바람직하게는 약 65℃ 이상에서의 하이브리다이즈 조건을 말한다.

또는, 다음중 어느 것의 단백질을 코드하는 유전자를 사용할 수 있다.

(a) 서열표의 서열번호 17 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;

(b) 서열표의 서열번호 17에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열로서, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질;

(c) C4 식물유래의 PPDK; 또는

(d) 서열표의 서열번호 17 기재의 아미노산 서열과 적어도 50% 이상(바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질. 또한, 본 명세서에서 아미노산 서열에 관해서 「상동」이란, 비교되는 서열간에 각각의 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 일치의 정도의 의미로 사용하고 있다. 이 때, 갭(gap)의 존재 및 아미노산의 성질이 고려된다. 상동성의 계산에는 시판되는 소프트웨어를 사용할 수 있다.

본 명세서에서 「게노믹 유전자(게놈 유전자라고 하는 경우도 있다.)」란,특별한 경우를 제외하고는, 게놈 유래의 유전자 자체와 게놈 유래의 유전자를 개변한 것을 포함한다. 본 발명의 「광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자」는 C4 식물 게놈 유래의 유전자 자체, 및 그것을 개변한 것을 포함한다. 이러한 개변형 유전자는 바람직하게는 코드하는 효소의 아미노산 서열이, 저온 내성 등의 바람직한 형질을 갖는 식물, 바람직하게는 C4 식물 또는 C3과 C4의 중간 성질을 갖는 식물, 보다 바람직하게는Flaveria속에 속하는 식물, 더욱 바람직하게는F.brownii또는F.bidentis에 있어서, 대응하는 효소의 아미노산 서열과 동등해지도록, 1 또는 수개의 염기가 치환된 것이다. 이러한 치환은 바람직하게는 인트론(intron) 부분을 가능한 한 그대로 유지하고, 엑손(exon) 부분에 생기도록 한다. 치환되는 염기의 수는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 광합성 경로를 구성하는 효소가 PPDK일 경우, 바람직하게는 약 1~50개, 보다 바람직하게는 약 1~40개, 가장 바람직하게는 약 1~30개(예컨대 29개)이다. 또한, 치환되는 아미노산의 수는 광합성 경로를 구성하는 효소가 PPDK일 경우, 바람직하게는 약 1~40개, 보다 바람직하게는 약 1~30개, 가장 바람직하게는 약 1~20개(예컨대, 도 5에 나타낸 17개)이다.

저온 내성 C4 식물을 얻으려고 하는 경우의 본 발명의 하나의 바람직한 태양은, 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자로서, 저온 내성형으로 개변되고, 또한 도입되는 식물에 있어서 고발현가능한 PPDK 유전자를 사용하는 것이다.

저온 내성형으로의 개변은, 예컨대, 발현되는 PPDK의 아미노산 서열이 저온내성형 PPDK를 발현하는 식물(그 발현량도 많은 식물인 것이 바람직하다)의 PPDK의 아미노산 서열과 「동등」하게 하는 것에 의한다. 상세하게는, 예컨대, 아미노산 서열이F.brownii의 PPDK와 동등해지도록 변이를 도입하는 것에 의한다. 보다 상세하게는, 예컨대, 옥수수 PPDK 유전자의 C말단으로부터 약 1/6의 영역의 아미노산 서열(서열번호 15의 서열 7682 이하에 대응한다.)이F.brownii의 PPDK의 저온 내성에 중요한 C말단으로부터 약 1/6의 영역의 아미노산 서열(서열번호 16의 서열 7682 이하에 대응한다.)과 동일해지도록, 옥수수 PPDK 게놈 유래 유전자의 제 15엑손 하류(downstream)의 17개소에 점변이(point mutation)를 도입하는 것에 의한다. 이 경우, 사용하는 코돈이 옥수수중에서 고빈도로 사용되고 있는 것으로 하면 좋다. 점변이의 도입은 당업자에게 주지의 통상적인 방법, 예컨대 변이를 포함하는 프라이머(primer) 세트를 사용한 PCR에 의해 행할 수 있다.

본 명세서에서 아미노산 서열에 관하여 「동등」이란, 아미노산 서열이 「동일」인 경우와, 아미노산의 성질이 고려되어 아미노산 서열이 유사한 성질의 아미노산으로 치환된 것인 경우를 포함한다. 또한, 어떤 효소의 아미노산 서열이 「바람직한 형질을 갖는 식물에서의 대응하는 효소의 아미노산 서열과 동등해지는」이란, 전자의 아미노산 서열이 후자의 아미노산 서열과 완전 동일하게 되는 경우와, 완전히 동일하지는 않지만 전자의 아미노산 서열에서 후자의 아미노산과는 다른 1 또는 수개(바람직하게는, 약 1~40개, 보다 바람직하게는 약 1~30개, 가장 바람직하게는 약 1~20개)의 아미노산을 후자의 아미노산과 동등해지도록 하는 것을 말한다.

저온 내성형으로 개변되고, 또한 도입되는 식물에서 고발현가능한 PPDK 유전자를 얻기 위해서는, 예컨대, 엑손 부분에 있어서 상기의 변이를 행하고, 또한 C4 식물 게놈 유래의 PPDK 유전자의 인트론 부분을 가능한 한 그대로 유지하는 것에 의한다.

변이형의 「광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자」란, 다음중 어느것의 DNA로 이루어지는 유전자를 사용할 수 있다. 이러한 유전자는 저온조건하에서 광합성 속도를 향상시킨 옥수수를 얻는 경우에 특히 바람직하다.

(a) 옥수수 PPDK 게노믹 유전자의 15엑손 보다 하류의 영역에서, 아미노산 서열이F.browniiPPDK의 아미노산 서열과 동일해지도록 변이시킨 염기서열, 즉 서열표의 서열번호 16의 번호 1732~8508 기재의 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 16의 번호 1732~8508에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열로서, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 16의 번호 1732~8508 기재의 염기서열을 갖는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA; 또는

(d) 서열표의 서열번호 16의 번호 1732~8508 기재의 염기서열과 적어도 50% 이상(바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA.

또는, 다음증 어느 것의 단백질을 코드하는 유전자를 사용할 수 있다.

(a)F.browniiPPDK, 즉 서열표의 서열번호 18 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;

(b) 서열표의 서열번호 18에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열로서, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질;

(c) 저온 내성의 C4 식물 유래의 PPDK, 또는 저온 내성의 C3/C4 중간형 식물 (바람직하게는,Flaveria brownii)유래의 PPDK; 또는

(d) 서열표의 서열번호 18 기재의 아미노산 서열과 적어도 50% 이상(바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질.

본 발명은 또한, 프로모터 등의 발현조절영역, 그 하류의 상기 영역에 의해 제어되는 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자(게놈 유래의 유전자 자체여도 좋고, 그 개변형이어도 좋다.) 및 터미네이터를 포함하는 발현 카세트도 제공한다.

본 발명의 발현 카세트에는 형질전환하려고 하는 식물내에서 기능가능한 프로모터이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대, PPDK(Matsuoka 등:Proc Natl Acad Sci USA 90:9586~9590(1993))나 PEPC(Yanagisawa 및 Izui:J Biochem 106:982~987(1989), 및 Matsuoka 등 :Plant J 6:311~319(1994)),Rubisco(Matsuoka 등:Plant J 6:311~319(1994))라는 광합성 관련 유전자의 녹색기관에서 유전자를 고발현시키는 프로모터; cauliflower mosaic virus 35S 프로모터, 유비퀴틴 프로모터(Cornejo 등:Plant Mol Biol 23:567~581(1993)), 액틴(actin) 프로모터(McElroy 등:Plant Ce11 2:163~171(1990)), α-튜블린(tubulin) 프로모터(Carpenter 등:Plant Mol Bio1 21:937~942(1993)), Sc프로모터(Schenk 등:Plant Mol Bio1 39:1221~1230(1999)), 완두 PAL 프로모터, Prp1 프로모터(특표평 10-500312), hsr203J 프로모터(Pontier 등:Plant J5:507~521(1994)), EAS4 프로모터(Yin 등:Plant Physiol 115:437~451(1997)), PR1b1 프로모터(Tornero 등:Mol Plant Microbe Interact 10:624~634(1997)), tap1프로모터(Mohan 등:Plant Mol Biol 22:475~490(1993)), AoPR1 프로모터(Warner 등:Plant J 3:191~201(1993))를 사용할 수 있다.

본 발명의 발현 카세트에는, 형질전환하려고 하는 식물내에서 기능가능한 터미네이터라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대, nos 터미네이터, CaMV 35S 터미네이터, gene7 터미네이터, 프로테아제 억제제(protease inhibitor) II 터미네이터를 사용할 수 있다.

이러한 본 발명의 발현 카세트의 예로서는, 다음의 DNA를 포함하는 발현 카세트가 있다.

(a) 서열표의 서열번호 15 기재의 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 15에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 15 기재의 염기서열을 갖는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(d) 서열표의 서열번호 15 기재의 염기서열과 적어도 50% 이상(바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는,

(a) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 16에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열을 갖는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(d) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열과 적어도 50% 이상(바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA.

본 발명의 발현 카세트는 저온조건하에서 광합성 속도를 향상시킨 C4 식물을 작출하기 위해서 특히 유용하다. 본 발명은 또한, 그러한 발현 카세트를 포함하는, 재조합 벡터도 제공한다.

본 발명의 발현 카세트의 구성요소가 되는 각 DNA단편을 서브클로닝하기 위한 벡터는, 간편하게는 당업계에서 입수가능한 재조합용 벡터(플라스미드 DNA)에 원하는 유전자를 통상적인 방법에 의해 연결하므로써 조제할 수가 있다. 사용할 수 있는 벡터로서는, 구체적으로는, 대장균 유래의 플라스미드로서, 예컨대, pCR2 .1, pBluescript, pUC18, pUC19, pBR322 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 발현 카세트를 목적으로 하는 식물에 도입하기 위한 벡터는, 식물형질전환용 벡터가 유용하다. 식물용의 벡터로서는 식물세포중에서 해당 유전자를 발현하고, 해당 단백질을 생산하는 능력을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, pBI221, pBI121(이상 Clontech사제), 및 이것들로부터 파생한 벡터를 들 수 있다. 또한, 특히 단자엽식물의 형질전환에는, pIG121Hm, pTOK233(이상 Hiei 등, Plant J., 6, 271~282(1994)), pSB424(Komari 등, Plant J., 10, 165~174(1996)), pSB11, pSB21 및 이것들로부터 파생한 벡터 등을 들 수 있다.

식물 형질전환용 벡터는 적어도 프로모터, 번역개시코돈, 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자(게놈 유래의 유전자 자체여도 좋고, 그 개변형이어도 좋다.), 번역종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 시그널 펩티드를 코드하는 DNA, 인핸서(enhancer) 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역영역, 선발마커(selective marker)영역 등을 적당히 포함하고 있어도 좋다. 마커 유전자의 예로서는, 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신, 네오마이신, 하이그로마이신 또는 스펙티노마이신 등의 항생물질 내성유전자 등 이외에, 루시페라제 유전자, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제(GUS), 녹색형광단백질 (green fluorescent protein:GFP), β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 등을 들 수 있다.

식물의 형질전환 방법은 이미 확립되어 있고, 아그로박테리움(Agrobacterium) 방법을 채용할 수 있다. 이 방법은 주지의 방법이며, 쌍자엽식물에서도 단자엽식물(WO94/00977, WO95/06722)에서도 형질전환할 수 있다. 또한 프로토플라스트(protoplast)에 통상적인 방법인 일렉트로포레이션법(electroporation) 등에 의해 유전자 도입하는 것도 가능하고, 파티클 건(particle gun)을 사용하여 통상적인 방법에 따라서 유전자를 도입할 수도 있다. 또한, 본 명세서에서 유전자에 관하여 「도입」이란, 특별할 경우를 제외하고, 대상식물(통상은 식물세포이다)에 외부로부터 유전자를 삽입하는 것을 말한다. 도입된 유전자는 대상식물의 게놈에 재조합되는 것이 바람직하다.

형질전환세포는 적당한 마커를 지표로 한 스크리닝에 의해 선택할 수가 있다. 형질전환세포는 종래기술을 이용해서 분화시키는 것에 의해 목적하는 형질전환 식물체로 하는 것이 가능하다.

형질전환체의 해석은 당업자에게 주지인 각종의 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예컨대, 도입한 유전자의 DNA 서열을 기초로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하고, 이것을 사용한 PCR에 의해 형질전환 식물의 염색체 DNA를 해석할 수가있다. 또한, 도입한 유전자에 대응하는 mRNA, 또는 단백질의 발현의 유무에 의해 해석할 수가 있다. 또한, 얻어진 식물체의 저온 내성 등에 의해서도 해석할 수가 있다. PPDK의 게놈 유전자를 도입한 경우는 PPDK의 발현량에 의해 해석할 수가 있다. 또한, 저온 내성 여부는 그 형질전환체 또는 형질전환체로부터 얻어진 PPDK를, 저온처리했을 때의 PPDK의 활성의 저하정도에 의해 해석할 수가 있다. 이러한 해석 방법은 당업자에게는 잘 알려져 있다.

본 발명의 형질전환 식물은, 형질전환되어 있지 않은 식물과 비교해서 광합성 경로를 구성하는 효소를 보다 많이 발현할 수 있다. 발현량은 바람직하게는 그 형질전환 식물의 광합성 속도의 향상에 유효한 양이다. 「광합성 속도의 향상에 유효한 양」이란, 어떤 온도, 바람직하게는 저온(예컨대, 약 12℃, 약 0℃）에 있어서 그 형질전환 식물이 광합성 경로를 구성하는 상기 효소가 형질전환되어 있지 않은 것과 비교해서 보다 많이 발현되어 있고, 그 때문에 그 형질전환 식물의 광합성의 속도가 보다 큰 것, 및/또는 그 형질전환 식물의 생육이 보다 뛰어나거나, 그 형질전환 식물로부터 얻어지는 원하는 수확물의 수량이 보다 많은 것을 포함한다.

더욱이, 개변된 게노믹 유전자를 사용한 본 발명의 형질전환 식물에서는, 형질전환되어 있지 않은 식물과 비교해서 광합성 경로를 구성하는 효소가 보다 많이 발현되어 있고, 및/또는 상기 효소가 보다 실활하기 어렵다. 이 경우의 발현량/실활의 정도는 바람직하게는 그 형질전환 식물의 광합성 속도의 향상에 유효한 양/정도이다. 「광합성 속도의 향상에 유효한 양」에 대해서는 이미 언급한 대로이다. 활성에 관해 「광합성 속도의 향상에 유효한 정도」란, 어떤 온도, 바람직하게는저온(예컨대, 약 12℃, 약 0℃）에서, 형질전환되지 않은 것과 비교해서 그 형질전환 식물의 해당 효소가 보다 실활하기 어렵고, 그 때문에 상기 형질전환 식물의 광합성의 속도가 보다 큰 것, 및/또는 그 형질전환 식물의 생육이 보다 뛰어나거나, 그 형질전환 식물로부터 얻어지는 원하는 수확물의 수량이 보다 많은 것을 포함한다.

본 발명은 후술하는 실시예에 기재되어 있는 옥수수 이외의 C4 식물, 예를 들면 사탕수수, 털비름(green amaranth), 피(Japanese millet), 조(foxtail millet), 솔검(sorgum), 밀렛(millet), 찰기장(proso millet) 등에도 적용할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 「형질전환 식물」이란, 본 발명의 방법에 의해 재조합 식물세포를 얻고, 상기 식물세포를 식물체에 재생시키는 것에 의해 얻은 형질전환 식물(T₀세대)뿐만 아니라, 상기 형질전환 식물로부터 얻어진 후대(T₁세대 등)의 식물도 그 도입된 형질이 유지되어 있는 한 포함한다. 또한, 본 명세서에서 「식물」이란, 특별히 명기한 경우를 제외하고는, 식물체(개체) 외에, 종자(발아종자, 미숙종자를 포함한다), 기관 또는 그 부분(잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 수술, 암술, 그것들의 조각(片)을 포함한다), 식물배양세포, 캘러스(callus), 프로토플라스트를 포함한다.

본 발명의 방법에 의하면, 광합성 경로를 구성하는 효소(예컨대, C4 회로의 중요효소 PPDK 자체, 개변형 효소 또는 PPDK)를 C4 식물에서 보다 많이 발현시킬 수 있다. 그리고, C4 식물의 광합성 속도를 저온에서 향상시켜, 상기 C4 식물을 저온 내성으로 할 수 있다. 이것은 PPDK를 가지는 C4 식물의 증산, 특히 저온조건하에서의 옥수수 등의 증산을 가능하게 한다.

종래, C4 식물의 게놈 유전자를 C3 식물에서 발현시킨 예는 있었지만, C4 식물의 게놈 유전자를 C4 식물에 도입하므로써 고발현시킨 사례는 없었다. 기본적으로, C3 식물은 C4 광합성에 관계되는 유전자를 가지고 있지 않으므로(또는, 가지고 있어도 존재량은 극히 소량이다), 간단히 도입한 유전자의 효과가 나타난다. 본 발명에 의하면, C4 식물에서 C4 식물의 게놈 유전자를 고발현시킬 수 있고, 내생의 유전자에 의해 마스크되는 일 없이, 도입 유전자의 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 태양에 있어서는, 점변이의 수법을 사용해서 유전자의 성질을 개변하여, 단지 발현량을 늘리는 경우와 다르게, 특정한 조건(예컨대, 저온조건)에서 보다 큰 효과를 올릴 수 있다. 본 발명은 C4 식물의 광합성에 관계되는 PPDK 유전자를 C4 식물에서 대량으로 발현시킬 수 있고, 지금까지 실현될 수 없었던 C4 식물에 있어서의 광합성 속도의 향상을 처음으로 달성하였다.

본 발명의 방법은 이상 설명한 대로, C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소에 관한 형질전환에 유용하지만, 같은 수법은 다른 바람직한 형질을 C4 식물에 부여하는 경우에도 적용가능할 것이다. 즉, 본 발명은 프로모터, 상기 목적 단백질을 코드하고 있고, 상기 프로모터에 의해 제어되는 식물의 게노믹 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 카세트를 사용하여, 식물중에서 목적 단백질을 고발현시키는 방법도 제공한다. 여기에서의 게노믹 유전자는, 상기 목적 단백질을 코드하고 있는 상기 식물 게놈 유래의 유전자의 염기서열에서, 인트론 부분은 유지된 채, 엑손 부분의 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열을 갖는 것이 바람직할 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 C4 식물의 형질전환에 유용하지만, 같은 수법은 C4 식물 이외의 형질전환에도 적용가능할 것이다.

실시예

<실시예 1>

(#2706의 구축)

옥수수 PPDK의 게놈 유전자를 그대로 옥수수에 도입하기 위해서, 다음과 같이 형질전환용 유전자(#2706)를 구축하였다.

λ ongC에 클로닝된 옥수수 PPDK 게놈 클론(Matsuoka M, 1990)으로부터, 제 1인트론 후반부터 제 6인트론 전반까지를 포함하는 4.5kbBamHI 단편을 잘라내어, pSB11(Komari T, Hiei Y, Saito Y, Murai N, Kumashiro T: Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated byAgrobacterium tumefaciensand segregation of transformants free from selection marker. Plant J 10, 165~175 1996)의BamHI 사이트에 삽입하였다. 이 플라스미드를XbaI에 의해 소화(digestion)하여 λ 암(arm) 부분을 제거하고, 말단을 Klenow 효소에 의해 평활화(blunt-ended)하였다. 여기에, λ EMBL3에 클로닝 된 게노믹 클론(Matsuoka M, 1990)으로부터 잘라낸 2kbEcoRI 단편(프로모터 영역으로부터 제 1인트론의 도중까지를 포함한다)을 동일하게 말단을 평활화해서 연결하였다. 다음으로, 제 6인트론 후반부터 전사 종결 영역까지를 포함하는 3.3kbBamHI 단편을 λ ongC 클론으로부터 잘라내어, 프로모터에서 제 6인트론 전반까지를포함하는 벡터의BamHI 사이트에 삽입하였다. 마지막으로, 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 동(同) 인트론 및 nos 터미네이터를 결합한 bar 유전자를KpnI 사이트에 삽입하였다(도 1). 최종적으로 구축된 클론 #2706의 DNA 서열(프로모터에서 터미네이터까지)을 서열번호 15에 나타내었다.

(형질전환 식물의 작출 및 그 평가)

아그로박테리움법에 의해 옥수수 인브레드 라인(A188)에 형질전환용 유전자(#2706)를 도입하여, 형질전환 식물을 작출하였다. 이때에, 제초제 바스타(Basta)에 대한 저항성 유전자를 선발 마커로서 사용하였다. 얻어진 전환체를 자식(自殖)하고, 차세대를 재배, 유묘기(幼苗期)에 자른 잎을 바스타를 포함하는 배지에 넣는 것에 의해, 도입한 PPDK 유전자를 호모 또는 헤테로로 가지고 있는 개체(homo 또는 hetero 개체)와 가지지 않는 개체(null 개체)로 분류하였다 (Ming-Bo Wang, Peter M. Waterhouse :A rapid and simple method of assaying plants transformed with hygromycin or PPT resistance. Plant Molecular Biology Reporter 15: 209~215(1997)).

그 후, 잎으로부터 얻은 푸른잎 추출액을 사용하여 웨스턴 분석(Western analysis)을 행하여, PPDK의 존재량을 추정하였다.

또한, 슬고기(膝高期)로부터 웅수유출기(雄穗柚出期)에 걸쳐서, LI-COR사제의 광합성측정 장치 LI-6400을 사용하여 광합성 속도를 측정하였다. 측정은 2대의 장치를 사용하여 행하고, 항상 동일한 형질전환체 유래의 homo 또는 hetero 개체와 nu11 개체를 페어(pair)로 해서 동시에 측정하였다(25 페어). 광합성 측정 조건은,챔버내의 광(인공광 LED source)은 1000μmol·m^-2·s^-1일정, 챔버내 CO₂농도는 350μmol·CO₂mol^-1일정(一定), 챔버내 습도는 원칙제어하지 않고(측정에 지장이 없는 범위에서 느슨하게 제어), 챔버내 기류(유속)는 500μmol·s^-1일정으로 하였다. 잎면온도 30℃, 20℃, 13℃ 및 8℃에서 광합성 속도를 측정했지만, 저온조건의 것은 광합성 측정 장치와 식물체(측정 잎만)를 저온보냉고에 가지고 들어가서 측정하였다. 데이터 해석은 페어의 t 검정에 의해 행하였다.

(결과)

녹엽생 중량 1g당 포함되는 PPDK량은, homo 또는 hetero에서는 평균 2484.0μg/gfwt이며, null에서는 1179.6μg/gfwt이었다. 대응하는 어느 t 검정에서, 양자는 유의수준 1%로 유의한 차이가 있었다. 즉, 옥수수 PPDK의 게놈 유전자 도입에 의해, PPDK의 발현량이 증대하는 것을 알았다(도 2A).

또한, PPDK 발현량의 증대는 도입한 유전자의 효과를 밝히는데 충분한 정도였다. 잎면 온도 8℃에서는, homo 또는 hetero 개체와 null 개체와의 사이에서의 광합성 속도가 null 개체보다 개선되어 있는 것을 발견하였다(유의수준 5%로 유의차이 있음)(도 2B).

<실시예 2>

다음으로, 본 발명자들은 옥수수 PPDK의 게놈 유전자를 저온 내성형으로 개변하는 것을 시도하였다. 본 발명자들은 이전의 연구에서, cDNA끼리의 키메라 유전자를 만들어 저온 내성형 PPDK 유전자를 인위적으로 작출하는 것에 성공하고 있으므로(WO95/15385), 스플라이싱의 결과 만들어지는 mRNA가 cDNA끼리의 저온 내성 키메라 유전자로부터 만들어지는 mRNA와 동일하게 되도록 옥수수 PPDK의 게놈 유전자의 일부분을F.browniiPPDK의 cDNA로 치환한 것을 작출하였다. 이 키메라 유전자를 옥수수에 도입했지만 유전자의 발현량은 낮았다. 그 결과는 게놈 유전자의 일부분을 cDNA로 치환했기 때문에, 본래 게놈 유전자에 존재하고 있었던 인트론이 삭제되어 버렸기 때문에 기인된 것이라고 생각되었다.

여기에서, 옥수수 PPDK의 게놈 유전자의 구조를 가능한 한 유지한 채 저온 내성형으로 개변하는 것으로 하여, 하기와 같이 하여 점변이 도입에 의해 저온 내성으로 개변한 옥수수 PPDK 게놈 유전자(#2838)를 구축하였다.

(#2838의 구축)

게놈 클론으로의 변이도입은 PCR에 의해 행하였다(Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR:Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77, 51~59(1989)). PCR의 폴리머라제에는 증폭시의 오류를 최소한으로 하기 위해서 ExTaq 또는 Pyrobest(모두 다카라주조제)를 사용하고, 1 스텝마다 단편을 플라스미드 벡터 pCR2.1 또는 pUC19에 서브클로닝하고, 염기서열에 이상이 없는 것을 확인하였다. 변이는 아미노산 서열이F.brownii의 PPDK와 동일하게 되도록 도입하고, 사용하는 코돈은 옥수수 PPDK 유전자에서 고빈도로 사용되고 있는 것을 선택하였다. 우선, PPDK의 저온 내성에 중요한 C말단으로부터 약 1/6의 영역(Ohta S 등(1996), 제 15엑손 하류에 상당)을, 변이를 포함하는 프라이머 세트 F1 및 R1, F2 및 R2, F3 및 R3, F4 및 R4, F5 및 R5, 및 F6 및 R6(서열번호 1~6 및 8~13)을 사용하여, 6 단편으로 나누어서 증폭하였다. 다음에, 서로 이웃하는 두개의 단편을 PCR에 의해 순차결합하고, 다음으로 단편 1로부터 단편 4까지를 결합, 최후에 전체를 결합해서XhoⅠ-BamHI 단편을 완성하였다(도 3).

한편, 옥수수 PPDK 게놈 클론의 제 14엑손 후반부터 제 16엑손 전반까지를 포함하는SmaⅠ-EcoRI 단편을 pUC18에 서브클로닝하고, 프라이머 세트 M4(서열번호 7) 및 mXho(서열번호 14)를 사용하여, PCR에 의해 제 15엑손중에XhoI사이트를 도입하였다. 이것을 상기XhoⅠ-BamHI 단편과 연결하고,BamHI 3.3kb 단편에 상당하는 부분을 치환하였다. 이 단편을 프로모터에서부터 제 6인트론 전반까지를 포함하는 벡터의BamHI 사이트에 삽입하고, 최후에 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 동(同) 인트론 및 nos 터미네이터를 결합한 bar 유전자를KpnⅠ사이트에 삽입하였다(도 4). 최종적으로 구축된 변이도입 클론 #2838의 DNA 서열(프로모터에서 터미네이터까지)을 서열번호 16에 도시하였다.

또한,F.browniiPPDK의 저온 내성에 중요한 C말단으로부터 약 1/6의 영역의 아미노산 서열(서열번호 16의 서열 7682 이하에 대응한다)을 옥수수 PPDK의 동 영역의 아미노산 서열(서열번호 15의 서열 7682 이하에 대응한다)과 함께 도 5에 도시하였다.

(형질전환 식물의 작출 및 그 평가)

점변이를 도입하므로써 저온 내성형으로 한 옥수수 PPDK의 게놈유전자(#2838)를 실시예 1과 동일하게 하여 옥수수 인브레드 라인(A188)에 도입하고, 형질전환 식물을 작출하였다.

그 후, 실시예 1과 동일하게 하여 homo 또는 hetero 개체와 null 개체를 선별, 웨스턴 분석에 의한 PPDK량의 추정과 광합성 속도의 측정을 행하였다. 광합성 속도의 측정은 실시예 1과 동일하게 2대의 장치를 사용하여 행하고, 통상적으로 동일한 형질전환체 유래의 homo 또는 hetero 개체와 null 개체를 페어로 하여 동시에 측정하였다. 데이터 해석도 페어의 t 검정에 의하여 행하였다.

(결과 1)

PPDK량은 homo 또는 hetero에서는 평균 2742.2μg/gfwt이며, null에서는 1471.8μg/gfwt이었다(도 6A). 즉, 점변이 도입에 의해 저온 내성으로 된 옥수수 PPDK의 게놈 유전자 도입에 의해, PPDK의 발현량이 증대하는 것을 알았다.

또한, homo 또는 hetero 개체와 null 개체와의 사이에서의 광합성 속도가 null 개체보다 개선되어 있는 것을 발견하였다(15페어를 사용하여 해석)(도 6B).

(결과 2)

광합성 속도의 측정에 사용한 식물체의 수는, 30℃ 15페어, 20℃ 19페어, 8℃ 21페어이며, 각각의 PPDK량을 온도별로 도시하였다(도 7A). homo 또는 hetero 개체가 null 개체를 크게 상회하였다(유의수준 1%로 유의차이 있음).

또한, homo 또는 hetero 개체와 nu11 개체와의 사이에서의 광합성 속도가 nu11 개체보다 개선되어 있는 것을 발견하였다(도 7B).

점변이 도입에 의해 저온 내성이 된 옥수수 PPDK게놈 유전자를 옥수수에 도입하는 것에 의해, PPDK 발현량이 극히 높아지고, 단지 게노믹 PPDK를 도입한 경우에 비하여 보다 광합성 속도가 개선되며, 즉 단지 발현량을 늘리는 것 만으로는 차이가 없었던 온도영역에서도 광합성 속도가 개선되는 것을 본 발명자들은 발견하였다.

<실시예 3>

또한, 본 발명자들은 저온 내성 개량형 게노믹 유전자를 도입한 옥수수의 PPDK 활성을 조사하였다. 실험에는, PPDK 발현량이 다른 수종의 형질전환 옥수수, 및 대조군으로서F.brownii및 옥수수 인브레드 라인(A188)을 사용하였다. 각각의 잎으로부터 얻은 푸른잎 추출액을 Sephadex G25 칼럼에 의해 탈염(desalt)하고, 그 후 0℃에 두고(빙상에 방치), 정기적으로 PPDK 활성을 체크하는 것에 의해, 저온에 둔 경우의 PPDK 활성의 경시적 변화를 측정하였다. PPDK 활성의 측정은 통상적인 방법을 따랐다(Jenkins CL, Hatch MD:Properties and reaction mechanism of C4 1eaf pyruvate, Pi dikinase. Arch Biochem Biophys 239: 53~62 1985).

결과를 도 8에 도시하였다. PPDK 발현량이 많은 형질전환체는 빙상에서도F.brownii와 동일하게 실활하기 어려운 것을 확인할 수 있었다.

발명의 개시

본 발명자들의 조사에서는, Shrunkenl 제 1인트론 ＜ 피마자 카탈라제 유전자의 제 1인트론 ＜ 벼 포스포리파제 D 유전자 제 1인트론의 순으로 발현량 증가 효과는 크고, 또한 중복 삽입한 것으로는 벼 포스포리파제 D 유전자 제 1인트론과 피마자 카탈라제 유전자의 제 1인트론이나 벼 포스포리파제 D 유전자 제 1인트론과 옥수수 유비퀴틴 제 1인트론의 조합이 단독의 경우 보다도 발현량이 증대하였다.

그러나, 도입 PPDK의 발현량이 가장 증가한 형질전환체에서도 내생 PPDK의 반분정도(녹엽생(綠葉生) 중량 1g당 700㎍ 정도)이며, 도입 PPDK의 효과는 현저히 나타나지 않았다. 도입 PPDK의 발현량 자체는 인위적으로 도입한 유전자의 발현량으로서는 높으나, 이번과 같이 내생 유전자의 산물이 많은(발현량이 많은) 경우에는 내생 유전자를 억제하지 않는 한, 도입 유전자의 효과를 명확히 할 수 없다고 생각되었다.

반면, 내생 PPDK를 억제하기 위한 안티센스 유전자는, 옥수수 PPDK 유전자의 5' 비번역영역중의SacI로부터 제 1 인트론중의EcoRI까지를 포함하는 395bp의 서열, 이 서열을 6 카피(copy) 반복하여 연결한 것, 또한 옥수수 PPDK의 성숙효소부분의 대부분을 커버하는 cDNA 유래의PstI 단편(2.4kb)을 기초로 하여 구축하고, 옥수수에 대하여 형질전환을 행하였다. 395bp의 서열에 주목한 것은, 이 서열이 트랜짓 펩티드(transit peptide) 부분에 상당하여 옥수수 PPDK와F.browniiPPDK 사이에서 상동성이 낮기 때문에, 옥수수 PPDK만을 선택적으로 억제할 수 있다고 생각했기 때문이었다.

결과적으로, 395bp의 서열에 대한 안티센스 유전자를 도입한 것만으로는 발현량을 억제하는 효과는 관찰되지 않았다. 395bp의 서열을 6 카피 반복하여 연결한 것이나 cDNA 유래의PstI 단편(2.4kb)에 대한 안티센스 유전자를 도입한 옥수수에서는, 저빈도이지만 내생 PPDK가 억제된 전환체가 출현하였다. 그러나, 이러한 내생 PPDK가 감소한 전환체에서는 도입 PPDK도 감소해버려서, 내생 PPDK만을 특이적으로 억제할 수는 없었다. 또한, C4 식물에서 필수적인 PPDK가 내생 PPDK와 도입 PPDK가 함께 억제되어 버리므로써, 이러한 전환체의 생육은 극히 취약하여 많은 것이 생육 도중에 고사하였다. 또한, 개화에 이르른 것이라도 종자는 생기지 않았다. 안티센스 기술에 의해 매우 유사한 서열을 가지는 유전자의 발현을 선택적으로 제어하는 것은, 그 작용 기구면에서 보면 이론상 곤란해서 이번 경우와 같은 사례에서는 적용할 수 없다는 것이 밝혀졌다.

cDNA 대신 게놈 유전자를 도입하는 것에 의해, C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 유전자를 C3 식물체내에서 고발현시키려고 시도한 사례가 있다(특개평 10-248419). 그러나, 이러한 예는 C3 식물이 가지고 있지 않은(또는, 가지고 있어도 발현량이 극히 적다) 유전자를 C4 식물로부터 도입한 예에 지나지 않는다.

C4 식물이 원래 갖고 있는 유전자를 C4 식물체내에서 더욱 발현시키는 것, 또는 광합성 관련 효소와 같이 C4 식물내에서 이미 다량으로 발현되고 있는 단백질을 코드(code)하는 유전자를 C4 식물체내에서 더욱 고발현시키는 것은, C4 식물 유래의 유전자를 C3 식물에서 발현시키는 것보다 더욱 곤란하게 여겨졌다.

또한, 지금까지의 여러가지 생화학적 연구로부터, C4 식물에서는 PPDK가 광합성을 율속하고 있는 것은 아닐지 추정되고 있지만, C4 식물에서 실제로 PPDK를 대량으로 발현시키거나, 새로운 특성을 갖는 PPDK를 인위적으로 도입한 보고는 없고, 지금까지의 연구가 옳다고 하는 확증은 없었다.

상술하 바와 같이, cDNA로는 인트론 등을 조합시켜도 충분한 레벨까지 도입 유전자의 발현량을 증대시킬 수는 없고, 또한 안티센스 기술로는 선택적으로 내생의 유전자만을 억제하는 것은 불가능하였다. 이에 본 발명자들은, 게놈 유전자를 도입하는 것을 검토하였다.

한편, 본 발명자들의 연구로부터, 저온 내성형인F.browniiPPDK cDNA를 그대로 옥수수에 도입해도 도입 유전자의 발현량은 극히 적은 것을 알았다. 이것은,F.brownii가 C3과 C4의 중간형의 식물이며, 원래 PPDK의 존재량이 C4 식물에 비하면 적기 때문이라고 생각되었다. 또한, 본 발명자들은 완전한 C4 식물인F.bidentis또는 옥수수와F.brownii와의 사이에서 키메라(chimera) 유전자를 구축하므로써, C4 식물중에서의F.browniiPPDK의 발현이 향상하는 것을 발견해 왔다.

여기서, 본 발명자들은 게놈 유전자를 도입할 때에, C3과 C4의 중간형인F.browniiPPDK의 게놈 유전자가 아닌 옥수수 PPDK의 게놈 유전자를 기본으로 하여각종 검토를 행한 결과, 옥수수 PPDK의 게놈 유전자를 그대로 옥수수에 도입하는 것에 의해, 옥수수에서 PPDK의 발현량이 증대하는 것, 더욱이 옥수수 PPDK의 게놈 유전자의 일정 영역에 변이를 도입하여 저온 내성형으로 개변한 유전자를 사용하므로써 저온 재배시에 옥수수의 PPDK의 발현량이 증대하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은, 프로모터, 상기 프로모터에 의해 제어되는 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자 및 터미네이터(terminator)를 포함하는 발현 카세트를 사용하여 형질전환시키는 것을 포함하는, C4 식물중에서 상기 효소 발현량을 증가시키는 방법 및 그 방법에 의해 얻을 수 있는 형질전환 C4 식물을 제공한다.

Claims

프로모터, 상기 프로모터에 의해 제어되는 목적 단백질을 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 카세트를 사용하여 형질전환하는 것을 포함하는, C4 식물내에서 목적 단백질 발현량을 증가시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 C4 식물 게노믹 유전자가, 목적 단백질을 코드하는 게놈 유래의 유전자의 염기서열에서 인트론 부분이 유지된 채 엑손 부분의 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, C4 식물내에서 목적 단백질 발현량을 증가시키는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 목적 단백질이 광합성 경로를 구성하는 효소인 것을 특징으로 하는, C4 식물내에서 목적 단백질 발현량을 증가시키는 방법.
프로모터, 상기 프로모터에 의해 제어되는 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 카세트를 사용하여 형질전환되고, 광합성 속도의 향상에 유효한 양의 상기 효소를 발현할 수 있는 형질전환 C4 식물.
제 4항에 있어서, 상기 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자가, 코드하는 광합성 경로를 구성하는 효소의 아미노산 서열이 저온 내성형 식물의 광합성 경로를 구성하는 대응하는 효소의 아미노산 서열과 동등해지도록, 엑손에 존재하는 1 또는 수개의 염기가 치환된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물.
제 5항에 있어서, 상기 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자가, 피루빈산 인산 디키나제(PPDK)를 코드하는 것인 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물.
제 6항에 있어서, 상기 PPDK가 옥수수 PPDK이며, 상기 C4 식물이 옥수수인 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물.
제 7항에 있어서, 상기 치환이 제 15엑손 하류에서 되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물.
제 4항에 있어서, 상기 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자가 다음중 어느 것의 DNA로 이루어지는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물:

(a) 서열표의 서열번호 15의 번호 1732~8508 기재의 염기서열로 이루어지는DNA;

(b) 서열표의 서열번호 15의 번호 1732~8508에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열로서, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 15의 번호 1732~8508 기재의 염기서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA;또는

(d) 서열표의 서열번호 15의 번호 1732~8508 기재의 염기서열과 적어도 50% 이상의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA.
제 4항에 있어서, 상기 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자가, 다음중 어느 것의 단백질을 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물:

(a) 서열표의 서열번호 17 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;

(b) 서열표의 서열번호 17에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열이며, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질;

(c) C4 식물유래의 PPDK; 또는

(d) 서열표의 서열번호 17 기재의 아미노산 서열과 적어도 50% 이상의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질.
다음중 어느 것의 DNA를 포함하며, 프로모터, 상기 프로모터에 의해 제어되는 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 카세트:

(a) 서열표의 서열번호 15 기재의 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 15에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 15 기재의 염기서열을 갖는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(d) 서열표의 서열번호 15 기재의 염기서열과 적어도 50% 이상의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA.
제 5항에 있어서, 상기 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자가, 다음중 어느 것의 DNA로 이루어지는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물:

(a) 서열표의 서열번호 16의 번호 1732~8508 기재의 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 16의 번호 1732~8508에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열로서, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 16의 번호 1732~8508 기재의 염기서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA; 또는

(d) 서열표의 서열번호 16의 번호 1732~8508 기재의 염기서열과 적어도 50% 이상의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA.
제 5항에 있어서, 상기 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자가, 다음중 어느 것의 DNA로 이루어지는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물:

(a) 서열표의 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 19에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열로서, 또한 C4 식물중에서 PPDK 발현량을 증가시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 C4 식물중에서 PPDK 발현량을 증가시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA;

(d) 서열표의 서열번호 19의 염기서열과 적어도 50% 이상의 상동성을 갖고, 또한 C4 식물중에서 PPDK 발현량을 증가시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA.
제 5항에 있어서, 상기 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자가, 다음중 어느 것의 단백질을 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 C4 식물:

(a) 서열표의 서열번호 18 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;

(b) 서열표의 서열번호 18에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열이며, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질;

(c) 저온 내성의 C4 식물 유래의 PPDK 또는 저온 내성의 C3/C4 중간형 식물 (바람직하게는, 프라베리아 브로우니(Flaveria brownii) 유래의 PPDK; 또는

(d) 서열표의 서열번호 18 기재의 아미노산 서열과 적어도 50% 이상의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질.
다음중 어느 것의 DNA를 포함하는, 프로모터, 상기 프로모터에 의해 제어되는 광합성 경로를 구성하는 효소를 코드하는 C4 식물 게노믹 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 카세트:

(a) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 16에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열로서, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열을 갖는 DNA와 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(d) 서열표의 서열번호 16의 염기서열과 적어도 50% 이상의 상동성을 갖고, 또한 PPDK 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA.
프로모터, 상기 프로모터에 의해 제어되는 다음중 어느 것의 DNA로 이루어지는 C4 식물 게노믹 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 카세트:

(a) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열의 일부로서, PPDK의 C말단으로부터 1/6의 영역에 대응하는 염기서열로 이루어지는 DNA;

(b) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열의 일부이며, PPDK의 C말단으로부터 1/6의 영역에 대응하는 염기서열에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기서열로서, 또한 C4 식물중에서 PPDK 발현량을 증가시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA;

(c) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열의 일부이며, PPDK의 C말단으로부터 1/6의 영역에 해당하는 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 C4 식물중에서 PPDK 발현량을 증가시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA; 또는

(d) 서열표의 서열번호 16 기재의 염기서열의 일부이며, PPDK의 C말단으로부터 1/6의 영역에 해당하는 염기서열과 적어도 50% 이상의 상동성을 갖고, 또한 C4 식물중에서 PPDK 발현량을 증가시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지는 DNA.
제 11항, 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 발현 카세트는 저온조건하에 있는 C4 식물의 광합성 속도를 향상시키기 위한 것임을 특징으로 하는 발현 카세트.
제 11항, 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 PPDK 활성이 저온 내성 PPDK 활성인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
제 11항, 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.