JPS6398398A - 変異型エクオリン蛋白の製造法 - Google Patents
変異型エクオリン蛋白の製造法Info
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- JPS6398398A JPS6398398A JP24510986A JP24510986A JPS6398398A JP S6398398 A JPS6398398 A JP S6398398A JP 24510986 A JP24510986 A JP 24510986A JP 24510986 A JP24510986 A JP 24510986A JP S6398398 A JPS6398398 A JP S6398398A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔技術の分野〕
本発明は、変異型エクオリン遺伝子と変異型エクオリン
蛋白の製造法に関する。更に詳しくは、合成オリゴヌク
レオチドを用いた塩基特異的変異法により作成した変異
エクオリン遺伝子とこれを用いた上記蛋白の製造法に関
する。
蛋白の製造法に関する。更に詳しくは、合成オリゴヌク
レオチドを用いた塩基特異的変異法により作成した変異
エクオリン遺伝子とこれを用いた上記蛋白の製造法に関
する。
天然に存在するエクオリンは、海洋に生息する発光オワ
ンクラゲから分離、精製して得られるいわゆる発光蛋白
であり、高い利用価値を持った生体微量活性物質として
知られている。すなわち、エクオリンはＣａ”、 Ｓｒ
２＋等の金属イオンで発光することから、微量のＣａ２
” （１０−９Ｍ）の検出試薬として利用され、特に細
胞間のＣａ２・の測定には、有効であることが認められ
ている。しかし、その生産量は極めて少なく、研究用試
薬としてすら不足している状態である。
ンクラゲから分離、精製して得られるいわゆる発光蛋白
であり、高い利用価値を持った生体微量活性物質として
知られている。すなわち、エクオリンはＣａ”、 Ｓｒ
２＋等の金属イオンで発光することから、微量のＣａ２
” （１０−９Ｍ）の検出試薬として利用され、特に細
胞間のＣａ２・の測定には、有効であることが認められ
ている。しかし、その生産量は極めて少なく、研究用試
薬としてすら不足している状態である。
そこで先づ我々は、発光オワンクラゲより、ｃＩ］ＮＡ
遺伝子を分離同定し、ｐＡＱ４４０と名付けた（特開昭
６１−１３５５８８号）。さらに組換えＤＮＡ技術を用
いて大腸菌内でエクオリンを産生せしめることにも成功
しく特願昭８０−２８０２５９号）、このエクオリン蛋
白を用いてＣａ２”等の金属イオンの検出に利用できる
ことも示した（特願昭８ｌ−１０３８４Ｅ１号）。
遺伝子を分離同定し、ｐＡＱ４４０と名付けた（特開昭
６１−１３５５８８号）。さらに組換えＤＮＡ技術を用
いて大腸菌内でエクオリンを産生せしめることにも成功
しく特願昭８０−２８０２５９号）、このエクオリン蛋
白を用いてＣａ２”等の金属イオンの検出に利用できる
ことも示した（特願昭８ｌ−１０３８４Ｅ１号）。
しかし、その発光機構については、未だ不明な点が多い
。エクオリン蛋白の発光メカニズムを解明し、正確に理
解することは、エクオリン蛋白の具体的応用の可能性を
拡大する。より詳細には、有用性のある機能蛋白として
のエクオリンを蛋白質の構造と機能の面から理解するこ
とは、エクオリンの発光メカニズムの解明につながり、
さらには蛋白質工学的に意義の深いことであり、該理解
は産業的にも利用価値がある。
。エクオリン蛋白の発光メカニズムを解明し、正確に理
解することは、エクオリン蛋白の具体的応用の可能性を
拡大する。より詳細には、有用性のある機能蛋白として
のエクオリンを蛋白質の構造と機能の面から理解するこ
とは、エクオリンの発光メカニズムの解明につながり、
さらには蛋白質工学的に意義の深いことであり、該理解
は産業的にも利用価値がある。
エクオリン蛋白に係る以上の技術的事情にかんがみ、本
発明者らは組換えＤＮＡ技術を用い、天然型エクオリン
遺伝子（ｐＡＱ４４０）の変異体を作成し、この遺伝子
を利用して大腸菌内で変異型エクオリン遺伝子を産生せ
しめることに成功した。そしてこれらの変異型エクオリ
ン遺伝子の構造と機能をｐＡＱ４４０のそれと比較する
ことにより、後者についてのより深い発光メカニズムの
解析を可能にすることができた。
発明者らは組換えＤＮＡ技術を用い、天然型エクオリン
遺伝子（ｐＡＱ４４０）の変異体を作成し、この遺伝子
を利用して大腸菌内で変異型エクオリン遺伝子を産生せ
しめることに成功した。そしてこれらの変異型エクオリ
ン遺伝子の構造と機能をｐＡＱ４４０のそれと比較する
ことにより、後者についてのより深い発光メカニズムの
解析を可能にすることができた。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、上述
の解析を可能にするために有用な、特定の多種類の変異
型エクオリン遺伝子を提供することである。
の解析を可能にするために有用な、特定の多種類の変異
型エクオリン遺伝子を提供することである。
本発明は、下記（１）の構成を有する。
（１）エクオリン遺伝子ｐＡＱ４４０の下記塩基配列に
おいて ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧ
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ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ下記（ア）〜（ス）に示すいづれかの
塩基を他の塩基に変換し若しくは欠失した変異体を用い
ることを特徴とする変異型エクオリン蛋白の製造法。
おいて ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧ
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ＧＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣ
ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴ
ＴＴＣＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴ
ＡＡＴＴＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＡＡＴＣＧＡＡＴＧ
ＡＴＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＣＡＧＡ
ＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ下記（ア）〜（ス）に示すいづれかの
塩基を他の塩基に変換し若しくは欠失した変異体を用い
ることを特徴とする変異型エクオリン蛋白の製造法。
（ｙ）２２０番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（イ）２３８番目の塩基ＧをＡに変換した変異体。
（つ）３０７番目の塩基ＣをＴに、３０８番目の塩基Ａ
をＴに変換した変異体。
をＴに変換した変異体。
（１）４９９番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（才）５６８番目の塩基ＴをＣに変換した変異体。
（ｉ）５６９番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（キ）５９０番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（り）６０７番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（ケ）６２５番目の塩基ＧをＡに変換した変異体。
（コ）６１６番目の塩基ＧをＣに、６２５番目の塩基Ｇ
をＡに変換した変異体。
をＡに変換した変異体。
（す）６７４番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（シ）２０５番目から２０７番目の塩基ＧＡＴを欠失せ
しめた変異体。
しめた変異体。
（ス）５９２番目から５９４番目の塩基ＧＡＴを欠失せ
しめた変異体。
しめた変異体。
未発の変異型遺伝子は、添付図に示すような工程によっ
て製造できる。本発明の方法では、合成オリゴヌクレオ
チドを用い、塩基特異的変異法によりエクオリン遺伝子
へ後述する変異を導入した。該変異法としては、限定さ
れないが例えば、ギ−？ ツブ−デュプレックス法（Ｍ
ｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ。
て製造できる。本発明の方法では、合成オリゴヌクレオ
チドを用い、塩基特異的変異法によりエクオリン遺伝子
へ後述する変異を導入した。該変異法としては、限定さ
れないが例えば、ギ−？ ツブ−デュプレックス法（Ｍ
ｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ。
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ ２ ＠ ８３Ｂ−Ｅ
１３９（１９８４））を採用できる。同法は、例えば後
述の表１に示すように、変異源として合成オリゴヌクレ
オチドを用いる。
１３９（１９８４））を採用できる。同法は、例えば後
述の表１に示すように、変異源として合成オリゴヌクレ
オチドを用いる。
か覧る合成オリゴヌクレオチドは市販の自動ＤＮＡ合成
装置を用いて合成でき、精製は好ましくは高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行う。精製品は、公知方法で末
端リン酸化を行い、プラスミド作成のためのプライマー
とする。
装置を用いて合成でき、精製は好ましくは高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行う。精製品は、公知方法で末
端リン酸化を行い、プラスミド作成のためのプライマー
とする。
他方、図に示すプラスミド ｐＡＱ４４０のＥｃｏＲＩ
−ＨｉｎｄＩＩｒフラグメントとＡａｔ Ｈフラグメン
トを用い、ＡａｔｌＩフラグメントについては、公知方
法で脱リン酸化処理する。
−ＨｉｎｄＩＩｒフラグメントとＡａｔ Ｈフラグメン
トを用い、ＡａｔｌＩフラグメントについては、公知方
法で脱リン酸化処理する。
以上のようにして得られたｐＡ０４４０に基づく二つの
フラグメントを前述の末端リン酸化されたプライマーと
共に、例えば、三段階の処理（所定温度、所定時間処理
）を行って、アニーリングを行う。該段階とは、例えば
（１００’０．５分）、（３０℃、３０分）オヨび（４
℃、３０分）ノヨウナ順序からなる組合せである。
フラグメントを前述の末端リン酸化されたプライマーと
共に、例えば、三段階の処理（所定温度、所定時間処理
）を行って、アニーリングを行う。該段階とは、例えば
（１００’０．５分）、（３０℃、３０分）オヨび（４
℃、３０分）ノヨウナ順序からなる組合せである。
次に、得られた変異ｐＡＱ遺伝子を用いて次のようにＥ
、ｃｏｌｉへのトランスフォーメーションを行う。すな
わち、例えば上述のようにして得られたｄＸＴＰ（Ｘ＝
Ｇ、Ａ、ＴＩＣ）とＫｌｅｎｏｗ７ラグメント（大腸菌
ポリメレース）とをＴ４−リガーゼの存在下に反応させ
、二重鎖を作成する。かくして生成したブラスミドニ重
釦を公知方法によって、Ｅ、ｃｏｌｉにトランスフォー
メーションを行う。そして上述のそれぞれの変異源プラ
イマーをプローグとして変異体プラスミド（ｐＡＱ４４
０の変異体）をコロニーハイブリダイゼーションにより
スクリーニングを行う。
、ｃｏｌｉへのトランスフォーメーションを行う。すな
わち、例えば上述のようにして得られたｄＸＴＰ（Ｘ＝
Ｇ、Ａ、ＴＩＣ）とＫｌｅｎｏｗ７ラグメント（大腸菌
ポリメレース）とをＴ４−リガーゼの存在下に反応させ
、二重鎖を作成する。かくして生成したブラスミドニ重
釦を公知方法によって、Ｅ、ｃｏｌｉにトランスフォー
メーションを行う。そして上述のそれぞれの変異源プラ
イマーをプローグとして変異体プラスミド（ｐＡＱ４４
０の変異体）をコロニーハイブリダイゼーションにより
スクリーニングを行う。
変異体の確認法としては限定されないが、例えば（Ｈａ
ｔｔｏｒｉ ａｔ ａｌ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 １５２２３２−２３８、ＩＨ６のｄｉｄｅｏｘｙ
法により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行う。
ｔｔｏｒｉ ａｔ ａｌ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 １５２２３２−２３８、ＩＨ６のｄｉｄｅｏｘｙ
法により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行う。
次に、本発明（製造法の発明）では、」二連の変異エク
オリン遺伝子を用いてエクオリン蛋白の大腸菌内での産
生を行う。
オリン遺伝子を用いてエクオリン蛋白の大腸菌内での産
生を行う。
すなわち、その概要としては、変異ｐＡＱ４４０遺伝子
のＨｉｎｄＩ［Ｉ −ＥｃｏＲＩのｃＤＮＡフラグメン
ト断片をｌａｃのプロモーターを有するプラスミドｐＵ
Ｃ９−２の…ｄｍ−…ＲＩ部分にクローニングを行い得
られたプラスミドを大腸菌例えばＨＢＩＯＩ（Ｄ１２１
０ｊＱ）株にトランスホーメーションし、この大腸菌と
発現誘導体例えばＩＰＴＧを用いて変異エクオリン蛋白
を大腸菌内で産生させる。
のＨｉｎｄＩ［Ｉ −ＥｃｏＲＩのｃＤＮＡフラグメン
ト断片をｌａｃのプロモーターを有するプラスミドｐＵ
Ｃ９−２の…ｄｍ−…ＲＩ部分にクローニングを行い得
られたプラスミドを大腸菌例えばＨＢＩＯＩ（Ｄ１２１
０ｊＱ）株にトランスホーメーションし、この大腸菌と
発現誘導体例えばＩＰＴＧを用いて変異エクオリン蛋白
を大腸菌内で産生させる。
該産生方法ならびに集菌方法は、公知方法に従う。集菌
された菌体は、適当な公知のバッファー液に溶解させ、
公知方法（例えば超音波処理）で菌体を破壊し、遠心処
理して上清を取得し、測定酵素溶液とする。
された菌体は、適当な公知のバッファー液に溶解させ、
公知方法（例えば超音波処理）で菌体を破壊し、遠心処
理して上清を取得し、測定酵素溶液とする。
この溶液に対する発光の測定方法は、該溶液の所定量に
基質（セレンテラジン）と還元剤（２−メルカプトエタ
ノール）の所定量を混合し、２〜３時間水冷下に熟成し
て得られた測定液を光電管測定装置中の反応セルに移し
、さらに該セルに所定量のＣａＣｌ２溶液を注入し、生
成する発光を測定する。
基質（セレンテラジン）と還元剤（２−メルカプトエタ
ノール）の所定量を混合し、２〜３時間水冷下に熟成し
て得られた測定液を光電管測定装置中の反応セルに移し
、さらに該セルに所定量のＣａＣｌ２溶液を注入し、生
成する発光を測定する。
測定対象となった本発明の合成オリゴヌクレオチド（プ
ライマー）を後述実施例１の表１に、プライマーのエク
オリン活性を同じく表２に示す。
ライマー）を後述実施例１の表１に、プライマーのエク
オリン活性を同じく表２に示す。
表１．２により、エクオリン遺伝子の塩基配列を変異ま
たは欠落せしめた位置如何によってエクオリン活性が変
化し、または消滅する程度が明白である。
たは欠落せしめた位置如何によってエクオリン活性が変
化し、または消滅する程度が明白である。
以下実施例によって本発明を説明する。
１）合成オリゴヌクレオチドを用いた塩基特異的変異法
によるエクオリン遺伝子（ｐＡ０４４０）への変異の導
入（図に示す） 塩基特異的変異法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈ−ｎｏ１ｏｇｙ２巻８３Ｂ−８３９（１９８４）
）のギー？−／ブーディプレックス法により行った。
によるエクオリン遺伝子（ｐＡ０４４０）への変異の導
入（図に示す） 塩基特異的変異法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈ−ｎｏ１ｏｇｙ２巻８３Ｂ−８３９（１９８４）
）のギー？−／ブーディプレックス法により行った。
すなわち、表１に示すように、変異源として合成オリゴ
ヌクレオチド（プライマーとして）を用いた。合成オリ
ゴヌクレオチドは、 ＡＢＩ社の自動ＤＮＡ合成装置で
合成し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｔ４−
キナーゼで末端リン酸化を行い用いた。プラスミドＰＡ
Ｑ４４０のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［ｎフラグメントと
Ａａｔ ｎフラグメントを用い、Ａａｔ Ｉｎフラグメ
ントはアルカリフォスファターゼ処理し脱リン酸化を行
った。この２つのフラグメントとプライマーとともに、
１００℃、５ｍ１ｎ処理後、３０’Ｃ，３ｍ１ｎ、４
℃、 ３０ｍ１ｎと放置し、アニーリングを行い、１２
℃、１２時間テｄｘＴＰ（Ｘ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）とＫｌ
ｅｎｏｗ７ラグメント（大腸菌ポリメレース）とＴ４−
リガーゼの存在下、反応させ、二重鎖を作成する。
ヌクレオチド（プライマーとして）を用いた。合成オリ
ゴヌクレオチドは、 ＡＢＩ社の自動ＤＮＡ合成装置で
合成し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｔ４−
キナーゼで末端リン酸化を行い用いた。プラスミドＰＡ
Ｑ４４０のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［ｎフラグメントと
Ａａｔ ｎフラグメントを用い、Ａａｔ Ｉｎフラグメ
ントはアルカリフォスファターゼ処理し脱リン酸化を行
った。この２つのフラグメントとプライマーとともに、
１００℃、５ｍ１ｎ処理後、３０’Ｃ，３ｍ１ｎ、４
℃、 ３０ｍ１ｎと放置し、アニーリングを行い、１２
℃、１２時間テｄｘＴＰ（Ｘ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）とＫｌ
ｅｎｏｗ７ラグメント（大腸菌ポリメレース）とＴ４−
リガーゼの存在下、反応させ、二重鎖を作成する。
生成したプラスミドニ重鎖を常法によりＥ、ｃｏｌｉに
トランスフォーメーションを行い、それぞれの変異源プ
ライマーをプローブとして変異体プラスミド（ＰＡ０４
４０の変異体）をコロニーハイブリタイゼーションによ
りスクリーニングを行い、変異体の確認は、ＨａＨｏｒ
ｉ ら（Ａｎａｌ、 Ｂｉａｃｈｅｍ。
トランスフォーメーションを行い、それぞれの変異源プ
ライマーをプローブとして変異体プラスミド（ＰＡ０４
４０の変異体）をコロニーハイブリタイゼーションによ
りスクリーニングを行い、変異体の確認は、ＨａＨｏｒ
ｉ ら（Ａｎａｌ、 Ｂｉａｃｈｅｍ。
１５２２３２−２３８．１９８８）のｄｉｄｅｏｘｙ法
により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行った。
により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行った。
２）種々の変異エクオリン遺伝子を用いて大腸菌内での
産生 変異ｐＡＱ４４ｏ遺伝子の…ｄｍ−陵Ｉ’ｌｌのｃＤＮ
Ａフラグメント断片をｌａｃのプロモーターを有するプ
ラスミドｐＵＧｌ］−２のＨｉｎｄｍ−ＥｃｏＲＩ部分
にクローニングを行い、大腸菌ＨＢ１０１（Ｄ１２１０
ｉ０）株にトランスフォーメーションを行い、発現誘導
体ＩＰＴＧにより大腸菌内で産生させた。
産生 変異ｐＡＱ４４ｏ遺伝子の…ｄｍ−陵Ｉ’ｌｌのｃＤＮ
Ａフラグメント断片をｌａｃのプロモーターを有するプ
ラスミドｐＵＧｌ］−２のＨｉｎｄｍ−ＥｃｏＲＩ部分
にクローニングを行い、大腸菌ＨＢ１０１（Ｄ１２１０
ｉ０）株にトランスフォーメーションを行い、発現誘導
体ＩＰＴＧにより大腸菌内で産生させた。
すなわち、変異遺伝子を含むｐＵｃ：９−２プラスミド
の１２時間培養菌体の１／１００量を５ｈ＋ｇ／＋ｍｌ
のアンピシリンを含む１０１１文のＬ−ｂｒｏｔｈ培地
に添加後、３７℃で２時間培養し、ＩＰＴＧを最終濃度
１ｍＭになるように添加し、さらに３７℃で２時間培養
後、集菌を行い、該菌体な５ｍＭのＭ８塩溶液で洗浄す
る。この洗浄物を１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２．５ｍＭ
（７）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ
７，８）に溶解させた後、超音波処理（６０秒）で菌体
を破壊し、１０，０００ｒｐ腸で１０分間遠心分＃後、
」二清を測定酵素液として用いた。
の１２時間培養菌体の１／１００量を５ｈ＋ｇ／＋ｍｌ
のアンピシリンを含む１０１１文のＬ−ｂｒｏｔｈ培地
に添加後、３７℃で２時間培養し、ＩＰＴＧを最終濃度
１ｍＭになるように添加し、さらに３７℃で２時間培養
後、集菌を行い、該菌体な５ｍＭのＭ８塩溶液で洗浄す
る。この洗浄物を１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２．５ｍＭ
（７）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ
７，８）に溶解させた後、超音波処理（６０秒）で菌体
を破壊し、１０，０００ｒｐ腸で１０分間遠心分＃後、
」二清を測定酵素液として用いた。
測定方法は、該酵素溶液１鳳文に基質セレンテラジン８
ｍｇおよび２−メルカプトエタノール１０用文を添加後
、氷上で２〜３時間放置し、光電管測定装置中の反応セ
ル中に移し、さらに２０ｍＭ ＣａＣｌ２１．５ｍＭを
注入することにより、生成する発光を測定した。
ｍｇおよび２−メルカプトエタノール１０用文を添加後
、氷上で２〜３時間放置し、光電管測定装置中の反応セ
ル中に移し、さらに２０ｍＭ ＣａＣｌ２１．５ｍＭを
注入することにより、生成する発光を測定した。
結果を表２に示した。
変異位置 ブライマー名 プライマー塩基配列
５° ３′２２０番
目 ＧＩＲＡＣＣＡＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＴＣ４４９
／／ Ｇ２ＲＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＡＧＣＣＡＴＴ
６０７／／ Ｇ３ＲＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＣ
ＴＣＧ５６９／／ ＣＩＳ ＣＡＧＡＡ
ＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡ５６８／／ ＣＩＲＣＡ
ＧＡＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＡＡ５９０／／ Ｃ２
Ｓ ＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＡＴＡＴＴＧ６
７４／／ Ｃ３Ｓ ＴＣＣＴＧＣＴＴＣ
ＣＧＡＡＡＡＧＣ２３８ｔｔ Ｅ３５Ｋ
ＴＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴ６２５／／
Ｅ１６４Ｋ ＴＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡ
Ａ＝； 変異位置 、； 脱落位置衣２．変異エ
クオリンの大腸菌での産生（測定ｌ） エクオリン ３８．９ ＧＩＲＱ Ｇ２Ｒ１９、２ Ｇ３Ｒ３７、９ ＨＦ Ｑ Ｅ３５Ｋ ０ Ｅ１６４Ｋ ０ Ｄ１６１Ｈ＋Ｋ Ｏ ２４△Ｄ０ １５３ΔＤ Ｏ （測定２） エクオリン ２２．９ ＣＩＳ １５．４ ＣＩＲ１１、０ Ｃ２Ｓ １３．６ Ｃ３Ｓ ６ 、８
５° ３′２２０番
目 ＧＩＲＡＣＣＡＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＴＣ４４９
／／ Ｇ２ＲＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＡＧＣＣＡＴＴ
６０７／／ Ｇ３ＲＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＣ
ＴＣＧ５６９／／ ＣＩＳ ＣＡＧＡＡ
ＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡ５６８／／ ＣＩＲＣＡ
ＧＡＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＡＡ５９０／／ Ｃ２
Ｓ ＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＡＴＡＴＴＧ６
７４／／ Ｃ３Ｓ ＴＣＣＴＧＣＴＴＣ
ＣＧＡＡＡＡＧＣ２３８ｔｔ Ｅ３５Ｋ
ＴＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴ６２５／／
Ｅ１６４Ｋ ＴＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡ
Ａ＝； 変異位置 、； 脱落位置衣２．変異エ
クオリンの大腸菌での産生（測定ｌ） エクオリン ３８．９ ＧＩＲＱ Ｇ２Ｒ１９、２ Ｇ３Ｒ３７、９ ＨＦ Ｑ Ｅ３５Ｋ ０ Ｅ１６４Ｋ ０ Ｄ１６１Ｈ＋Ｋ Ｏ ２４△Ｄ０ １５３ΔＤ Ｏ （測定２） エクオリン ２２．９ ＣＩＳ １５．４ ＣＩＲ１１、０ Ｃ２Ｓ １３．６ Ｃ３Ｓ ６ 、８
図は、本発明の実施例に係る塩基特異的変異法を示す。
以」二
Claims (1)
- （１）エクオリン遺伝子ｐＡＱ４４０の下記塩基配列に
おいて 【遺伝子配列があります】 下記（ア）〜（ス）に示すいづれかの塩基を他の塩基に
変換し若しくは欠失した変異体を用いることを特徴とす
る変異型エクオリン蛋白の製造法。 （ア）２２０番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （イ）２３８番目の塩基ＧをＡに変換した変異体。 （ウ）３０７番目の塩基ＣをＴに、３０８番目の塩基Ａ
をＴに変換した変異体。 （エ）４９９番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （オ）５６８番目の塩基ＴをＣに変換した変異体。 （カ）５６９番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （キ）５９０番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （ク）６０７番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （ケ）６２５番目の塩基ＧをＡに変換した変異体。 （コ）６１６番目の塩基ＧをＣに、６２５番目の塩基Ｇ
をＡに変換した変異体。 （サ）６７４番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （シ）２０５番目から２０７番目の塩基ＧＡＴを欠失せ
しめた変異体。 （ス）５９２番目から５９４番目の塩基ＧＡＴを欠失せ
しめた変異体。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24510986A JPS6398398A (ja) | 1986-10-15 | 1986-10-15 | 変異型エクオリン蛋白の製造法 |
| US07/105,602 US5093240A (en) | 1986-10-15 | 1987-10-08 | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
| DE8787115044T DE3776857D1 (de) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Aequoringen-varianten und verfahren zur herstellung von entsprechenden aequorinproteinen. |
| EP87115044A EP0264819B1 (en) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24510986A JPS6398398A (ja) | 1986-10-15 | 1986-10-15 | 変異型エクオリン蛋白の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6398398A true JPS6398398A (ja) | 1988-04-28 |
Family
ID=17128754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24510986A Pending JPS6398398A (ja) | 1986-10-15 | 1986-10-15 | 変異型エクオリン蛋白の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6398398A (ja) |
-
1986
- 1986-10-15 JP JP24510986A patent/JPS6398398A/ja active Pending
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