JPS6361939A - 被検体液中の特定成分の濃度又は活性を測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の特定成分を分析するための方法
に係り、更に詳しくは乾式分析素子を用いて光学濃度（
Ｄ）の時間変化を測定することにより生物学的流体試料
中の特定成分の活性又は濃度を測定する方法に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中の特定成分を分析するための測定手
段としての初速置去は、反応速度の測定によって検量を
行う方法で、酵素の活性測定のほか、反応速度が特定成
分の＠度に比例する呈色反応の場合などに用いられる。

しかしながら、前記生物学的流体試料中の共存物質の干
渉作用等により正確な分析を行うことができない場合が
ある。従来のウェットケミストリーの場合、全反応液量
に対する特定成分の液量の比率の低減、共存物質の阻害
剤又は除去剤の添加、試薬の添加の順序・時期などによ
り共存物質の干渉作用を除くことができる。一方、ドラ
イケミストリーの場合、反応溶液は通常前記生物学的流
体試料中の水分のみであるため、共存物質の影響を受け
やすい。また、共存物質の阻害剤又は除去剤を含有させ
ることは可能でおるが、すべての試薬は乾燥状態になっ
ており、測定時に流体試料と出会い、初めて試薬の含ま
れるマトリックスにおいて全反応が進行する次め、試薬
の添加順序・時期を設定することができず、必ずしも効
果的に共存物質の干渉作用を除くことができない。そし
て共存物質が前記特定成分の活性又は濃度に応じて生成
する中間生成物と同一の場合は、それらを阻害すること
も除去することもできない。例えばホルマザン発色系を
用いる方法は従来からよく知られているが、α−アミラ
ーゼ測測定おけるグルコース、ＧＯＴ（グルタミン酸オ
キザロ酢酸トランスアミナーゼ）、（）ＰＴ（グルタミ
ン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）測定におけるＬ−
グルタミン酸、トリグリセライド測定におけるグリセリ
ン等の共存物質は、各特定取分の活性又は濃度に応じて
生成する中間生成物と同一である。

ウェットケミストリーの場合、特開昭６０−５８０９７
号公報に開示されているように、あらかじめ前記共存物
質を除去し、その後にテトラゾリウム化合物を添加し、
特定成分を分析することができる。

〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、特開昭５９−８８０９７号、同５９−９
１　Ｂ９６号各公報、及び特願昭６０−１０４７７６号
明細書に詳述されているようなドライケミストリーの場
合、前記共存物質金除去できず、正誤差を生じる。

このような共存物質は、他に特開昭６０−４７６９６号
公報に開示されているようなピルビン酸１キシダーゼを
用いたＧＯＴ％ＧＰ’ｌ’測定におけるピルビン酸など
がある。

本発明の目的は、乾式分析素子を用いて特定成分の濃度
又は活性を測定する方法において、共存物質等に由来す
る誤差を除き、分析の正確度の改良された測定方法を提
供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は被検体液中の特定成分の
ｆａ度又は活性？測定すｂ方法に関する発明であって、
乾式分析素子を用いて光学濃度（Ｄ）の時間変化を測定
することによって、特定成分、及び該特定取分の濃度又
は活性に応じて生成する最終生成物と同じ最終生成物を
与える共存物質を＠有する被検体液中の前記特定成分の
濃度又は活性全測定する方法において、前記光学濃度の
時間変化率（ａｐ／ａｔ　）が０より大であり、かつ−
足である反応時間の間に少なくとも２点以上の光学濃度
を測定することを特徴とする。

本発明に係る乾式分析素子は、試薬が乾燥状態で含有さ
れ、流体試料と出会うと、試薬の含まれるマトリックス
において全化学反応が進行する素子であれば種類は問わ
ない。例えば、特公昭５０−５９５５８号公報や特開昭
５４−１５１０９６号公報に記載されているようなＦ紙
に試薬を含浸させた素子がある。また、光透過性かつ液
体不浸透性の支持体上に項次少なくとも１つの試薬鳩及
び多孔質展開層を有する分析素子、例えば特公昭５３−
２１６７７号公報に記載の非繊維多孔質媒体の展開Ｎｌ
Ｉを有する分析素子、特開昭５５−１６４３５６号公報
に記載の親水化処理した織物の展開ＩＳを有する分析素
子、特開昭５７−９４６５８号、同５７−１２５８４７
号、同５７−１９７４６６号及び同５８−７０１６１号
等の各公報に記載の繊維構造展開層ｔｌ−有する分析素
子、特開昭５８−？ＣＭ　６７号公報に記載の粒子結合
体構造展開Ｎａを有する分析素子などがある。

本発明に係る光学濃度とは反射光学濃度であり、積分球
やオプティカルファイバー法なトを用いた反射型吸光光
度計によって測定する。

本発明においては、反応速度の測定によって検量を行う
レイトアッセイ法で分析できるすべてのｑ！ｆ定成分成
分定することができる。例えば、ＧＯＴ　、　ＧＰＴ　
、　ＬＤＨ（乳酸脱水木酢Ｘ）、ＡＬＰ（アルカリホス
ファターゼ）、ＬＡＰ（ロイシンアミノペプチダーゼ）
、γ−Ｃ）ＴＰ　（γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ）、ＣＰＫ（クレアチンホスホキナーゼ）等が挙げら
れる。

本発明に係る前記特定成分に応じて生成する最終生成物
は用いる反応系によって異なる。したがって、該最終生
成物と同一の最終生成物を与える共存物質も用いる反応
系に応じて異なる。

例えば、前述の特開昭５９−８８０９７号、同５９−９
１８９６号各公報及び特願昭６０−１０４７７６号明細
書に記載されているように、色素形成前駆物質としてテ
トラゾリクム化合物を用いる場合、最終生成物はホルマ
ザン色素であり、共存物質としてはアスコルビン酸及び
乳酸、またα−アミラーゼ測定におけるグルコース、更
にＧＯＴ及びＧＰＴ測定におけるＬ−グルタミン酸、更
にまたトリグリセリド測定におけるグリセリン等がある
。また、前述の特開昭６０−４７６９６号公報に記載の
過酸化水素を生成するＧＯＴ　、　ＧＰＴ測定用の素子
の場合、最終生成物はキノン系色素であり、同一最終生
成物を与える被検体液中の共存物質としてはオキザロ酢
酸やピルビン酸がある。その他に、特開昭６１−５６０
９９号公報に記載されている還元型補ｅ素を用いる場合
、最終生成物は酸化盤補酵素−ジ であるニコチンアミドアアニンヌクレオチド△ （ＮＡＤ”）　　であり、このＮＡＤ＋　を与える被検
体液中の共存物質としては、　ＬＤＨの基質であるピル
ビン酸がある。

本発明に係る元学濃度（Ｄ）の時間変化の１例を、第１
図にＤ（縦軸）と時間（ｔ％横軸）との関係でグラフと
して示す。また、第２図に、第１図に対応した光学濃度
の時間変化率（ａＶａｔ　）の時間変化を、ａＤ／ａｔ
　（縦軸）と時間（ｔ％横軸）との関係でグラフとして
示す。本発明における岐／ａ　ｔが０より大であジ、か
つ一定である灰石時間の間とは、共存物質の干渉作用の
影響のなくなるｔｌからｔ２までの時間を示す。その時
間は反応条件によって異なるが、前述の特開昭５７−９
４６５８号、同５７−１２５８４７号、同５７−１９７
４６６号及び同５８−７０１６１号等の各公報に記載の
繊維構造展開層を有する分析素子を３７℃でインキュベ
ートして測定する場合、４１１分後以降２０後１での間
、好ましくは６分後以降１５分後までの間に少なくとも
２点の光学濃度を測定することが望ましい。

２点測定の場合、その時間の間隔は１分以上好ましくは
２分以上が望ましい。このように自動分析機器をセット
すれば、初期の誤差なく、正確な分析を行うことができ
る。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例−１（ＧＯＴ用分析素子） 膜厚１８０μｍの透明な下引源ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に下記組成の第１の試薬層を設けた。

第１の試薬層 ゼラチン　　　　　　　　　　　　２１．０？／ｍ”グ
ルタミン酸脱水素酵素　　　　　４２，００００７ｍ”
ジアホラーゼ　　　　　　　　　　　２，１０００７ｍ
”トリトンＸ−１００（ロームアンドハース（Ｒｏｈｍ
　＆　Ｈａｇｓ　）社、ｌ　　　　　　　２．１　ｆ／
ｌｎ２上記第１の試薬層上に、更に下記の第２の試薬層
及び展開７ｉｔを順次設け、本発明の分析素子を作成し
た。

第２の試薬層 トリスヒドロキシメチルアミンメタン　５．７０？／＝
２／Ｉ／　ヒス：ｌ　−Ａ／　ＶＡ　−２８”　”　　
　　　　　　２．０　ｆ　／ｒｎ”トリトンＸ−１００
α５ｆ／ｒｎ２ 畳１）ＢＡｓｐ社の商品名二Ｎ−ビニルピロリドンー酢
酸ビニル共重合体（モル比２ｏ：畳　上記第２の試薬層
は、溶媒としてｎ−ブタノールを用いて、サンドグライ
ンダー直接分散により塗設。

展開層 粉本Ｐ紙〔東洋１紙（ａ−）　４０〜１００メツシュ）
　　　　　　　　　　　　　　９１１７ｍ”アスパラギ
ン酸−ナトリウム　　　　　　４．１１７ｍ”α−ケト
グルタル酸　　　　　　　　　　α５ｆ／ｍ”トリトン
Ｘ−１００９９／ｍ工 脣　キシレン溶媒にて塗設 ４７スパラギン酸−ナトリウム及びＮＡＤ”は別途に溶
媒としてキシレンを用い、サンドグラインダーにより１
接分散して添加。

畳　α−ケトグルタル酸はメタノールに溶解後添加。

上記分析素子に人血ｆｉ２００検体を各々１０μを展開
層上に滴下した後、３７℃でインキュベーションし、表
−１に示すそれぞれの時間経過後の２点の反射濃度を反
射分元元度計で５４６ｍｍ　のフィルターを通して測足
し、この反射濃度の差を求め、２００検体のそれぞれの
値と日立自動分析機７０６Ｄとの相関をとり表−２の表
−２ 表−２の結果から明らかなように、比較の測定法−１は
共存物質の干渉等のため相関が悪いのに対して１回目の
測定が４分以降の本発明の測定法−１〜３ではその影響
をほとんど受けず、分析の正確度が向上していることが
判る。

実施例−２（ＧＰＴ用分析素子） 膜厚１８０μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に下記組成の第１の試薬層を設けた。

第１の試薬層 ゼラチン　　　　　　　　　　　２１・０９７ｍ”グル
タミン酸脱水素酵素　　　　　　２１，００　Ｄ　０７
ｍ”ジアホラーゼ　　　　　　　　　　　　２，１００
０７ｍ”トリトンＸ　−１００２，１９７ｍ” 上記第１の試薬層上に、更に下記の第２の試薬層及び展
開ＮＩを順次設け、本発明の分析素子を作成した。

第２の試薬層 トリスヒドロキシメチルアミノメタン　　　５．７０１
７ｍ”塩酸トリスヒドロキ・／メチルアミノ メタン　　　　　　　　　　　　　　　　１．２２　？
／＝２ルビスコールＶＡ　＝　２８　　　　　　　　　
　　ＫＯ１７ｍ２）　’）　）　ｙｘ　−１０００，５
ｆ／Ｊ僑　上記第２の試薬層は、溶媒としてｎ−ブタノ
ールを用いて、サンドグラインダー直接分散によジ塗設
。

展開／ｉｔ　（Ｓ） アラニン　　　　　　　　　　　２．２ｆ／？？Ｉ”α
−ケトグルタル酸　　　　　　　　α２５り／、＋２ト
リトンＸ−１００９９７゜２ 畳　キシレン溶媒にて塗設 費　アラニン及びＮＡＤ＋は別途に溶媒としてキシレン
を用い、サンドグラインダーにより直接分散して添加。

養　α−ケトグルタル酸はメタノール−キシレンに溶解
後、粉末ｆ紙を加えてかくはん含浸させ、濾過乾失して
使用。

上記の分析素子に対してＧＰＴ　（シグマ社、ボーシン
ハート（Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｈｅａｒｔ　）　〕ｆ添加し
た透析プール血清（ＧＦＴ　３　［ＩＫ−Ｕ　）に更に
それぞれアスコルビン酸０．１０．２０岬Ｚｄｔを添加
した谷プール血清及びＬ−グルタミン酸０．５．１０岬
７ｒｘｔｙ２添加した各プール血清を１０μを展開海上
に滴下した後、３７℃でインキュベーションし、滴下彼
我−１に示す時間経過後の２点の反射光学濃度を反射分
元元度計で５４６ｎｍ　のフィルターを通して測定し、
表−３及び表−４の結果を得た。

表−３ 表−４ 表−４の結果から明らかなように、比較の測定法−１は
Ｌ−グルタミン酸の影響が大きいのに対して本発明の測
定法−１〜３ではその影響をほとんど受けず、分析の正
確度が同上しているのが判る。また表−６の結果から、
比較の測定法−１はアスコルビン酸の影響が大きいのに
対して、本発明の測定法−１〜３はその影響全はとんど
受けずアスコルビン酸オキシダーゼのような除去剤を添
加しなくても分析の正確度が同上しているのが判る。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明方法は簡単な方法で共存物
質の影響を除き、試薬の無駄な使用もなく、正確な分析
を可能にした点で極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る乾式分析素子の光学濃度の時間変
化の関係の１例を示すグラフ、第２図はその際の九学＠
度の時間変化率（ａＤ／４ｔ　）の時間変化の関係を示
すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、乾式分析素子を用いて光学濃度（Ｄ）の時間変化を
   測定することによつて、特定成分、及び該特定成分の濃
   度又は活性に応じて生成する最終生成物と同じ最終生成
   物を与える共存物質を含有する被検体液中の前記特定成
   分の濃度又は活性を測定する方法において、前記光学濃
   度の時間変化率（ｄＤ／ｄｔ）が０より大であり、かつ
   一定である反応時間の間に少なくとも２点以上の光学濃
   度を測定することを特徴とする被検体液中の特定成分の
   濃度又は活性を測定する方法。