JPS6349073A - 大型酵母の造成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学的手法による大型酵母の造成方法及
び該酵母の用途に関する。

〔従来の技術］ 細胞の機能は分裂と増殖であり、その機能は厳密な制御
機構によって制約を受けている。

酵母はグルコースあるいはグリセロールを代謝し、代謝
中間産物としてメチルグリオキサールを生成する。メチ
ルグリオキサールは分子内にカルダニル基とアルデヒド
基を各々１個有し、非常に反応性に富んだ化合物であり
他の生体分子、特にＢＨ化合物やアミノ化合物と共有結
合して存在する。オたメチルグリオキサールは酵素分子
のアルギニン残基に結合し酵素を失活させる作用ももっ
ている。したがって、メチルグリオキサールが細胞内に
存在するとポリアミンやグルタチオンの様な細胞増殖因
子あるいは酵累と反応し、細胞増殖阻害を引起す。列え
ば大腸菌においては１ｍＭ、　　酵母では２　ｍＭのメ
チルグリオキ丈−ルの存在で細胞の生育は顕著に阻害さ
れることが知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述したごとく、メチルグリオキサールは細胞の増殖抑
制因子として、細胞機能の制御に関与している七考えら
れる。

本発明の目的はメチルグリオキサールの細胞毒作用全制
御することにより大型の酵母を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は大型酵母の
造成方法に関し、メチルグリオキサール代謝酵素の遺伝
子で酵母を形質転換することを特徴とする。

また本発明の第２の発明は、第１の発明で得られた大型
酵母の用途に関し、該大型酵母を用いてメチルグリオキ
サールとグルタチオンからＳ−ラクトイルグルタチオン
ト製造する方法？特徴とする。

本発明者らはメチルグリオキサールの代謝酵素である、
グリオキサラーゼ■及び／又はメチルグリオキサール還
元酵素の遺伝子を酵母に導入することにより大型の酵母
が得られること、及び該大型酵母を用いることにより効
率よくＳ−ラクトイルグルタチオンｔｇ造できることを
見出し本発明を光成した。

以下本発明の詳細な説明する。

酵母サツカロミセス　セレビシェ（ｓａＣＣｈａ−ｒｏ
ｍｙｃｓｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　）　　ＤＫＤ
−５Ｄ−Ｈ（ａ、ｔｒｐ　　１　　、ｈｉｓ　５　、’
：ｌｅｕ　２−３　、ｌｅｕ　２−１１２　）　（特願
昭６０−１１９８１７号明細書参照）を栄養培地〔２憾
酵母エキス、１％ペプトン、２係グルコース、ｐＨ５，
０（以下ＹＰＤと略記する）］に１１６時間培養後染色
体ＤＮＡをサイトウ及びミウラ（５ａｉｔｏ　、Ｍｉｕ
ｒａ）らの方法〔バイオロジー　バイオロジー　アクタ
（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｅｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　）第７２巻、第６１９〜６２９頁（１９６３
）〕で抽出し、制限酵素８ａｕ　３　Ａ工で切断、断片
化した。他方、ベクターＹＫｐ　１３　（ジーン（０θ
ｎθ）第８巻、第１２１頁（１９７９））は、制限酵素
Ｂａｎ　Ｈ工　　で断片化した。かくして得られた染色
体ＤＮＡ（２０μ？）とベクターＹＥｐ　１３　（２０
μ？）両処理物をアニールした後、Ｔ、ＤＮＡ　　ＩＪ
ガーゼで連結し、組み換え体ＤＮＡの混合物を調製した
〔打出ら、アプライドアンド　エンパイロ　メンタル　
ミクロバイオロジー（ＡｐｐＬ　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏＬ　）　　第５０巻、第１２００〜１２
０７頁（１９８５）］。

０）　　グリオキサラーゼｌ遺伝子の単離及び物性酵母
サツカロミセス　セレビシェ　ＤＫＤ　−５Ｄ　−Ｈ（
以下ＤＫＤ−５Ｄ−）（と略記する）はメチルグリオキ
サールとグルタチオンの非酵素的生成物であるヘミメル
カプタールＱ１０ｍＭ以上含む最少培地［：（１７％　
イーストサイトロジエンベース、２壬　グルコース、２
０μ？／−トリプトファン、２０μ２／−ロイシン、２
０μ２／−ヒスチジン、ｐＨ５，２、（以下８Ｄ培地と
略記する）〕に生育できない。ヘミメルカプタールは酵
素グリオキサラーゼＩの真の基質であるので、ヘミメル
カプタール全最少生成阻止濃度以上の濃度で含むＳＤｉ
地で該酵母の生育を可能にするような遺伝子をスクリー
ニングすることによってグリオキサラーゼＩの遺伝子へ
単離を試みた。上記調製した組み換え体Ｄ　Ｎ　Ａ混合
物１０μ？を用いて酢酸リチウムで処理〔イトウ（工ｔ
ｏｈ　）　　ら、ジャーナル　オブ　バクテリオロジ−
（Ｊ、　Ｂａｃｔｓｒｉｏｌ、　）第１５３巻第１６３
頁（１９８３）Ｉした酵母ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈを形質転換
した。形質転換Ｓ度は１０μ？ＤＩＪム当り３０００で
あった。形質転換操作後の菌体１２０ｍＭ　メチルグリ
オキサールと２０ｍＭグルタチオンを含むＳＤ培地（但
しロイシン無添加）に１プレート当りの菌数が１０＠と
なるよう塗布し、３０℃で２〜３日間培養した。

かくして生じたコロニー（１０＠個当り８個）をグリオ
キサラーゼｌ遺伝子を持つ株として分離した。分離した
８株のうち４株は、高いグリオキサラーゼＩ活性を示し
た。その中の１株をＳＤ培地（但しロイシン無添加）で
培養後、前記村田らの方法で粗ＤＮＡを調製し、大腸菌
Ｃ６００（Ｆ−１ｈｓｄ　　Ｒ，ｈｓｄ　　Ｍ、　　　
ｒｅｃ　　Ａ、　　　ｔｈｒ、’ｌｅｕ。

ｔｈｉ、　１ａｃ　Ｙ、　ｓｕｐ　Ｆ：、、　　ｔｏｎ
　Ａ　）　ｌ：ジエネテイツク転換に供した。大腸菌の
形質転換株は、５０μ？／ｍｌ　　のアンピシリンを含
む栄賽培地〔α１係クルコース、ａ５％酵母エキス、１
％ヘフトン、α５１ＮａＯｔ（ｐＨ７，２）、以下り培
地と略記する〕の寒天プレート上で選択した。かくして
得られた大腸菌の形質転換株よりプラスミドを単離精製
した。方法は、村田ら〔アプライド　アンド　エンバイ
ロメンタル　ミクロバイオロジー第４４巻、第１４４４
〜１４４８頁（１９８２））の方法に準じた。得られた
プラスミドはｐＹＧＬ　７　　と称し、この制限地図？
第１図のように決定した。すなわち第１図はメチルグリ
オキサール代謝酵素の遺伝子を持つプラスミド（ｐＹＧ
Ｌ　７、ｐＹＭＧ　１４　）　　の制限地図を示すグラ
フである。第１図に示すように、このｐＹＧＬ７は全長
１３Ｋｂ　で、約３　Ｋｂ　の染色体ＤＮＡ断片が組み
込まれていた。

プラスミドｐＹＧＬ　７（１ｏ　ｐｙ　）　’ｚ用いテ
ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈを再形質転換した。前記酢酸リチウム
処理菌体を用いた場合の形質転換頻度は１０μｆ−ＤＮ
Ａ当り１５００個であり、形質転換株は８Ｄ培地（但し
ロイシン無添加）のプレート上で単離した。かぐして得
られた形質転換株（Ｄ　Ｋ　Ｄ　−５Ｄ　−Ｈ／　ｐＹ
ＧＬ　７　）とＹＥｐ１Ｂベクターで形質転換した株（
ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ＹＥｐ　１５　）をグルコースある
いはグリセロールを炭素源とする日り培地（但しロイシ
ン無添加）で培養し、両培地の濁度がｔ　Ｇ　（０，Ｄ
、　６１０　ｎｍ　）Ｋ達した時、両菌株の細胞サイズ
を光学顕微鏡下で観察するとＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧ
Ｌ　７の細胞の９５係以上はＤ　Ｋ　Ｄ　−５Ｄ　−Ｈ
／　ＹＥｐ１３の細胞サイズより顕著に増大すること全
見出した。

（２）　　メチルグリオキサール還元酵素の遺伝子の単
離とその物性 醇母ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈは２　ｍＭ以上のメチルグリオキ
サール？含むＳＤ培地には生育できない。そこで、２ｍ
Ｍのメチルグリオキサールを含むＳＤ培地での生育を可
能にするような遺伝子のスクリーニングを試みた。上記
調製した組み換え体ＤＮＡ混合物（１０μ？）を用いて
酢酸リチウムで処理した酵母菌体を形質転換した。

形質転換頻度は１０μｆ　ＤＮＡ当り４０００であった
。次に形質転換操作後の菌体を、２ｍＭのメチルグリオ
キサール？含む５ＤＪｅ地（但しロイシンは無添加）に
１プレート当り１０’＋７）菌数となるよう塗布し、３
０℃で２〜３日間培養した。かくして生じたコロニー（
１ｏ’当り１２個）全メチルグリオキサール還元酵素の
遺伝子を持つ株として分離した。いずれの株も、高いメ
チルグリオキサール還元酵素活性を示した。グリオキサ
ラーゼＩ遺伝子の場合と同様にして、大腸菌Ｅ、　ｃｏ
’ｌｉ　Ｃ６００を経由してメチルグリオキサール還元
酵素の遺伝子を持つプラスミドを単１精製し、ｐＹＭＧ
　　１４と称した。

ｐＹＭＧ　１４　Ｆｉ全長１９．５Ｋｂでａ　８　Ｋｂ
の染色体ＤＮＡ断片が組み込まれていた。第１図にその
制限地図？示した。

ｐＹＭＧ　１４と細胞サイズとの関係をみるためｐＹＭ
０１４１０μ２でＤＫＤ−５Ｄ−Ｈを再形質転換した。

前記、酢酸リチウム処理菌体を用いた場合の形質転換頻
度は１０μｆ　ＤＮＡ当り２５ＱＯ個であり形質転換株
はＳＤ培地（但しロイシン無添加）のプレート上で単離
した。

かくして得られた形質転換株１’ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐ
ＹＭＧ　１４　）とベクターＹＥｐ　１３で形質転換し
た株（Ｄ　Ｋ　Ｄ　−５Ｄ　−Ｈ／　ＹＥｐ　１３　）
’ｔグルコースあるいはグリセロールを炭素源とするＳ
Ｄ培地（但しロイシン無添加）で培養し、両培地の濁度
がｔ　Ｏ（０，Ｄ、　６１Ｑ　ｎｍ　）に達した時、両
菌株の細胞サイズを調べた。その結果ＤＫＤ−５Ｄ　−
Ｈ／１）ＹＭＧ　１４株の細胞サイズは全細胞の９３％
以上が肥大することを見出した。

（３）Ｓ−ラクトイルグルタチオンの製造法Ｓ−ラクト
イルグルタチオンば、メチルグリオキサールとグルタチ
オンよシグリオキサラーゼＩの作用で合成されるチオー
ルエステルテアリ、生理作用としては微小管の集合の促
進、ヒスタミン遊離の増進、炎症反応あるいは腫瘍細胞
の増殖促進作用などが報告されている。

このよう々生理作用を持つチオールエステルを効率よく
生産するため、グリオキサラーゼ！の遺伝子で該酵素の
活性？増強した酵母の利用を検討した。組み換え体ＤＮ
ＡｐＹＧＬ７あるいはＹＥｐ　１５ベクターで形質転換
し之酵母ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧＬ７とＤＫＤ−５Ｄ
−Ｈ／ＹＥｐ１３　ｆ　２％のグルコースあるいは２％
のグリセロールを炭素源とするＥＩＤ最少培地（但しロ
イシン無添加）で培養しく３０℃）、得られた酵母の菌
体処理物（抽出液、トルエン処理菌体、アセトン処理菌
体など）をグリオキサラーゼＩ源とし、Ｓ−ラクトイル
グルタチオン生成反応に供した。Ｓ−ラクトイルグルタ
チオン生成のための反応液としては、５〜１０ｍＭメチ
ルグリオキサール、５〜１０ΩｍＭ　グルタチオン、２
０〜１００ｍＭ緩衝液（ｐＨ６〜９）に酵素源として菌
体処理物を加える。反応温度は２５〜４０℃、反応時間
は３０〜１２０分で十分である。

１００℃で３分間処理して反応を止めた後、その上清中
０８−ラクトイルグルタチオンは、２４０　ｎｍ　の吸
収塵の増大あるいはグリオキサラーゼ■を用いる酵素法
によって測定できる。

グリオキサラーゼ■は炭素源としてグリセロールを用い
て培養すると２０〜３０倍誘導され、極めて高活性とな
るので、上記反応東件下で効率よくＳ−ラクトイルグル
タチオンを合成することができる。

〔実１イｉ汐り〕 以下本発明を実施例により更に具体的に説明するが本発
明はこれら実施列に限定され々い。

実′ｔＡ例１ グリオキサラーゼｌの遺伝子（組み換え体ＤＮＡｐＹＧ
Ｌ７）？含む形質転換株ＤＫＤ−５Ｄ　−Ｅ　／Ｉ）Ｙ
ＧＩＪ　ｙとベクターＹＥｐ　１３を持つ酵母Ｄ　Ｋ　
Ｄ　−５Ｄ　−Ｈ／　ＹＫｐ　１３を８Ｄ最少培地（但
しロイシン無添加、炭素源として２％のグルコース又は
２優のグリセロールを含む）で対数増殖期中期まで３０
℃で振とり培養する。両菌株について透過型電子顕微鏡
写真像をとると、ＤＫＤ　−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧＬ　７株
では長軸方向に２倍程度伸長し肥大細胞であった。第２
図にグルコース含有培地生育のＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ＹＫ
ｐ　１３の細胞の形態、第３図にグルコース含有培地生
育のＤＫＤ−５Ｄ−Ｅ／１）ＹＧＩＩ　ｙの細胞の形態
を、透過型電子顕微鏡写真で示す。

細胞肥大はグルコース及びグリセロール含有培地の両方
で認められた。

実施例２ 実施例１と同様の実験をメチルグリオキサール還元酵素
の遺伝子を持つ組み撲え体ＤＩムｐＹＭＧ　１４を含む
株ＤＫＤ−５Ｄ−）！／Ｉ）ＹＭＧ１４とその対照とし
てＤ　Ｋ　Ｄ　−５Ｄ　−Ｈ／　Ｙｌｌ！：ｐ１３につ
いて検討した。この場合％　ｐＹＭＧ　１ａを持つ細胞
ではその９５％以上が第４図に示すように長袖側に２〜
３倍伸長し、肥大細胞を示した。なお第４図はグルコー
ス含有培地生育のＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＭＧ　１４の
細胞の形態を示す透過型電子顕微鏡写真である。

実施例３ 実施１４１１に記載した形質転換株ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／
　ｐＹＧＬ　７とＤ　Ｋ　Ｄ　−５Ｄ　−Ｈ／　ＹＥｐ
　１３をグルコースあるいはグリセロールを含む最少培
地（ＳＤ、但しロイシン無添加）に３０℃で培養（対６
期後期まで）した後、集洗菌後５ｍＭのトリスＨＣ１緩
衝液に１ｌｌｉ［ｔ、、ブラウンホモゲナイザーで破砕
（０℃、３０秒）した。２５０００ｔで３０分遠心して
上清全とり、そのグリオキサラーゼ！活性を測定した。

その結果を表１に示した。

衆　　１ 実施例４ 実施例３において調製したグルコース２％及びグリセロ
ール２憾生育菌の無細胞抽出液を１０ｍＭメチルグリオ
キサール、５ｍＭグルタチオン、５０ｍＭ）リスｍａｔ
緩衝液（ｐＨ７，０）（１，０ｗ／　）と共にインキュ
ベートし、Ｓ−ラクトイルグルタチオンの生合成を行っ
た。反応液中のタンパク＃度は１η／−１反応時間３０
分、反応温度は２５℃とした。その結果を表２に示した
。

表　　２ 〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明により大型酵母の造
成方法が提供された。酵母の大型化は発酵工業における
菌体分離、洗浄、脱水等の工程を短縮するという効果を
有する。また本発明の酵母により種々の生理作用を有す
るＳ−ラクトイルグルタチオンを効率よく製造すること
が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図はメチルグリオキサール代謝酵素の遺伝子を持つ
プラスミドの制限地図を示すグラフ、第２図〜第４図は
いずれもグルコース含有培地で生育した、第２図はＤ　
Ｋ　Ｄ　−５Ｄ　−Ｈ／　ＹＥｐ１３、第３図はＤＫＤ
−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧＬ　７、第４図はＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ
／ｐＹＭＧ　１４の各細胞の形態を示す電子顕微鏡写真
である。 特許出願人　ｆｆ！ｆ酒造株式会社 代浬人　中　本　　宏 同　　　　　井　　　上　　　　　閉 園　　　　　　吉　　　　嶺　　　　　　桂第　２　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、メチルグリオキサール代謝酵素の遺伝子で酵母を形
   質転換することを特徴とする大型酵母の造成方法。 ２、該メチルグリオキサール代謝酵素の遺伝子が、グリ
   オキサラーゼ I の遺伝子である特許請求の範囲第１項
   記載の大型酵母の造成方法。 ３、該メチルグリオキサール代謝酵素の遺伝子が、メチ
   ルグリオキサール還元酵素の遺伝子である特許請求の範
   囲第１項記載の大型酵母の造成方法。 ４、該グリオキサラーゼ I の遺伝子が、第１図で示さ
   れる遺伝子である特許請求の範囲第２項記載の大型酵母
   の造成方法。 ５、グリオキサラーゼ I の遺伝子で形質転換された大
   型酵母を用いて、メチルグリオキサールとグルタチオン
   からＳ−ラクトイルグルタチオンを製造することを特徴
   とするＳ−ラクトイルグルタチオンの製造方法。