JPS6347636A

JPS6347636A - 紫外線写真法によるアフラトキシン産生カビの簡易同定法

Info

Publication number: JPS6347636A
Application number: JP19168586A
Authority: JP
Inventors: Kimiko Yabe; 矢部　希見子; Yoshimichi Andou; 安藤　義路; Michio Ito; 伊藤　道男; Masayoshi Terakado; 寺門　誠致
Original assignee: NORIN SUISANSYO KACHIKU EISEI SHIKENJO
Current assignee: NORIN SUISANSYO KACHIKU EISEI SHIKENJO
Priority date: 1986-08-18
Filing date: 1986-08-18
Publication date: 1988-02-29
Also published as: JPH0545174B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はＵＶ写真法によるアフラトキシン（以後ＡＦと
略す。）産生カビの簡易同定法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］ＡＦはアスペルギルス・７ラブス（Ａｇｐｅｒｇｉｌ　
Ｉｕｓ４及びアスペルギルス・バラシティクス（Ａｓｐ
、　ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）が生産するカビ毒であり
、急性毒性を持つとともに慢性毒性として強力な発癌性
を有する。ＡＦが食品中に含まれる場合は言うに及ばず
飼料中に含有される場合にも、ヒトは家畜の肝臓、乳な
どを通してＡＦの危険にさらされることになる。

そのため、従来より多数のＡＦ産生菌の検出法が報告さ
れており、これを大別すると以下の４種類に分けられる
。第１は、最も標準的な方法で、カビを固体培地または
液体培地中で培養し、有機溶媒による抽出法でＡＦを部
分精製後、最終的には薄層クロマトグラフィーまたは高
速液体クロマトグラフィーで分析する。しかし、末法は
個々のカビについて培養、抽出１分析を行うため、多数
のカビの分析には適していない、また、操作が複雑で、
かつ多量の有機溶媒を使用するため、安全性の点からも
問題が多い、第２は、カビ胞子を液体培地または寒天培
地に接種し、培地中に分泌されたＡＦの蛍光を検出する
方法である０本法は簡便性ではすぐれているが、蛍光物
質の特異性の問題やＡＦを検出するまでに長時間（１週
間以上の培養）を要するといった問題、さらに多数の検
体を取り扱うことが難しいといった問題点が未解決のま
まになっている。第３は、寒天培地中のカビ集落から寒
天培地の小片を切り出し、それを直接薄層プレート上に
置き、プレートに移行した培地液を薄層クロマトグラフ
ィーで分析する方法である０本法は第２の方法と同様に
簡便性ではすぐれているが、力ど集落の一部を切り出す
際胞子の飛散を招く危険性が高く、また各集落ごとに薄
層分析を行うにはかなりの労力を要する。第４の方法は
、近年開発されてきているＡＦ抗体による免疫検定法で
ある。この方法は非常に高い検出感度が得られるが、サ
ンプルの前処理として抽出操作が必要で、全体として操
作が煩雑であるため、多数の検体を短時間で処理するこ
とはきわめて難しい。

［問題点を解決するための手段］以上のようにこれまでの方法では、多数のカビ集落につ
いてＡＦ産生能を迅速、かつ安全に検出することが出来
なかった。そのため、ＡＦ産生菌の生態学的研究やＡＦ
産生菌の分子遺伝学的研究は極めて限られたものであっ
た。

ＡＦには数種の誘導体があり、そのほとんどが長波長紫
外光領域で吸収を示す、＃に菌代謝産物として生産され
るＡＦＢ＋、　ＡＦＢ２．　ＡＦＢ２６．　ＡＦＧＩ。

ＡＦＧ２．　ＡＦＧ２ａは３８２〜３１３５ｎｍに吸収
ピークを示すことから、本発明者らはこの紫外光領域の
吸収特性を利用して・簡便、かつ安全な同定法を開発し
た。ＡＦ産生カビ及び非産生カビの胞子をＧＹ寒天培地
（２％グルコース、０．５％酵母エキス。

２％寒天）上で培養後、プレートを逆さにしてカビ集落
のＵＶ写真をとったところ、ＵＶ写真上ＡＦ産生カビは
全て暗灰色または黒色の集落として検出されるのに対し
、非産生カビは吸収のない白色の集落となり、両者は明
瞭に区別されることを見出した。さらに、ＡＦ産生閑に
よって産生されるＵＶ吸収物質は、実際に菌糸から寒天
培地中に分泌されたＡＦであることも証明した。

なお、使用する培地については上記ＧＹ培地に限定され
るものではなく、ＡＦの産生を誘導できる培地であれば
任意に使用することができる。また、糖の濃度について
も２％程度が最適であるが、約１〜２０％の範囲内で適
当な濃度を選択することができる。例えば、後記実施例
３で示すように、グルコースの代りにスクロース、ラフ
ィノースなどの炭素源も利用できる。ただし、培地自身
が強いＵＶ吸収を示したり、生育したカビ集落の底面に
ひだができ、ＵＶ写真上にひだの影がＵＶ吸収と区別で
きなくなるなどの不適当な形態変化を誘導する培地や濃
度条件は避ける必要がある。

さらに本発明者らは、ＵＶ写真上でのＵＶ吸収がグルコ
ースの代りにＡＦ非誘導炭素源を培地に加えた場合には
生じないこと、またこのＵＶ吸収がＡＦ合成阻害剤によ
って減少することを確認し、以上の試薬を併用すること
によってＡＦ産生菌の同定法の精度の向上に成功した。

本発明は、カビの集落をＵＶ写真法で撮影し、ＵＶ吸収
の有無によりＡＦの存在を識別することを特徴とするＡ
Ｆ産生カビの簡易同定法を提供するものである。

ＵＶ写真法によるカビの集落の撮影は、カビを培養した
シャーレを逆さまにして黒色の板、布等の上に置き、紫
外線ライトを照射し、ＵＶレンズとＵＶフィルターを備
えたカメラで撮影することにより行う。紫外線ライトは
、ＡＦの場合、長波長（３１０〜３８０ｎｉ）の紫外線
を照射できるものであればよく、照射は前記シャーレの
上部方向から斜光照明で行い、好ましくは約４５度の角
度で行う。

また、ＵＶフィルターとしては可視光を遮断し、紫外光
を透過するものであればよく、本発明では３３０〜３９
０ｎｍの領域の紫外光を透過するフィルターを使用した
。なお、３６２ｎ＋ｗ近傍の干渉フィルターを使用して
もほとんど同じＵＶ写真を得ることができる。しかし、
許通の自然光写真ではＡＦ産生菌及び非産生菌はいずれ
も白色のコロニーとして検出され、両者間に区別ができ
ない。

したがって、ＡＦ産生閑における吸収は３８２ｎｍ近傍
のＵＶ領域に特異的であることが明らかとなった。

［実施例］次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１まず、ＡＦ産生菌及び非産生菌の胞子をプラスチックシ
ャーレ中のＧＹ寒天培地に接種し、２８℃、３日間暗所
で培養後、ＵＶ写真を撮影した。すなわち、第１図に示
すように、培養後のシャーレ１を黒色ベルベット２上に
逆さまに置き、プレートの上部方向から長波長紫外線ラ
イト（３８５ｍｍ　）で照射し、ＵＶレンズ３とＵＶ７
４ルター４を備えたカメラを用いて反射ＵＶ写真を撮影
した。この際、写真の質を一定に揃えるために３種のテ
ープ５をｇｒａｙｍａｒｋｅｔとして用い、シャーレと
共に写し込んだ。

その結果、ＵＶ写真上、ＡＦ産生カビアスペルギルス’
７ラブス（Ａｓｐ、　ｆｌａｖｕｓ）　５ＹＳ−３（Ｉ
ＦＯ３０１８０）、アスペルギルス・バラシティクス　
（Ａｓｐ。

ｐａｒａｓｊｔｉｃｕｓ）ＳＹＳ−４（ＮＲＲＬ　２９
９９）、アスペルギルス・トキシカリウス（Ａｓｐ、　
ｔｏｘｉｃａｒｉｕｓ）ＳＭＳ−８（Ａ↑ＣＣｌ３５１
？）は暗灰色または黒色の集落として検出されたのに対
し、ＡＦ非産生カビアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐ
、　ｏｒｙｚａｅ）　５ＹＳ−２（ＴＦＯ４２５１）が
白色の集落として検出された。なお、ＧＹ培地のＵＶ吸
収は１．５日培養集落でも検出可能である。また、他の
ＡＦ産生カビアスペルギルス・バラシティクｏｒ７ｚａ
ｅ）ＳＹＳ−１（ＩＦＯ４２１４）、アスペルギルス・
オリゼー（Ａｓｐ、　ｏｒｙｚａｅ）ＳＹＳ−７（ＩＦ
Ｏ４２０３）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐ、　
ａｒｙｚａｅ）ＳＹＳ−１１（ＩＦＯ５７８５）。

アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐ、　ｏｒｙｚａｅ）
　５ＹＳ−１２（ＩＦＯ３０１１２）、　　アスペルギ
ルス・ソーヤ（狂ム５ｏｊａｅ）ＳＹＳ−１３，アスペ
ルギルス・ソーヤ（Ａｓｐ。

３ｏｊａｅ）ＳＹＳ−１４を調べたが上記の場合と同様
ＡＦ産生菌のみがＵＶ吸収を示した。

さらに、ＡＦ産生菌によるＵＶ吸収がＡＦによるもので
あることを以下のセロファン移植実験及びシリカゲル薄
層クロマトグラフィーによっても確認した。

実施例２まず、ＧＹ寒天培地上を覆ったセロファン上にアスペル
ギルス・バラシティクス　（Ａｓｐ。

ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｇ）　５ＹＳ−４の同一の集落を
主賓させ、その一方をセロファンごと新しいＧＹ培地に
移植した。二つのプレートを逆さにしてＵＶ写真をとる
と、ＵＶ吸収物質は最初の寒天培地中に残っていた。さ
らに、吸収のある部分の寒天を切り出し、クロロホルム
抽出を行い、シリカゲル薄層クロマトグラフィーをした
結果が第２図である。すなわち、シリカゲル薄層クロマ
トグラフィーで展開し、蛍光写真（Ａ）及びＵＶ写真（
Ｂ）を撮影した０図中、ＳＴは４種のＡＦ標準試薬を示
し、レーン１はアスペルギルス・オリゼー５Ｍ５−２　
（ＩＦＯ↓ ４２５１）の抽出液、レーン２はアスペルギス・バラシ
ティクス５ＹＳ−４（ＮＲＲＬ　２９９９）の抽出液を
２０ｍｇの寒天に相当する量だけスポットした。

ＡＦＢＩ及びＡＦ（＋に相当する位置にスポットが表わ
れ、またトリフルオロ酢酸（↑ＦＡ）処理すると、標準
試薬のＡＦＢＩ及びＡＦＧ、をＴＦＡ処理した場合と同
一位置にそれぞれのＴＦＡ誘導体のスポットが生じるこ
とから、ＵＶ吸収物質がＡＦＢＩ及びＡＦＧ＋であるこ
とが確認された０以上の結果から、ＵＶ吸収を指標にす
ればＡＦ産生菌の同定が可能であることが証明された。

ところで、自然界にはＵＶ吸収物質を産生ずる多種の生
物の存在が推定される。従って、土壌や飼料中に存在す
る多種多様な微生物への応用を目的とした場合には、さ
らにこの方法の特異性を高める必要がある。そこで本発
明者らは、ＡＦ合成に影響を与えることが知られている
種々の試薬の効果をＵＶ写真によって検討した。

実施例３まず、ＡＦ産生は培地中の炭素源に影響されることが知
られているため、寒天２％および酵母エキス０．５％を
含む培地に種々のＡＦ誘導炭素源及びＡＦ非誘導炭素源
を２％濃度となるように添加し、アスペルギルス・バラ
シティクス５ＹＳ−４（ＮＲＲＬ　２９９９）を接種し
、２８℃で３日間培養した。

その結果、表１に示したように、ＵＶ吸収は顕著な炭素
源依存性を示した。さらに、従来液体培養実験によって
得られていた各種のＡＦ産生阻害剤をＧＹ寒天培地中に
添加し、上記と同じカビを接種して２８℃で３日間培養
し、ＵＶ吸収に対する効果を検討した０表２に示したよ
うに、すべての阻害剤は吸収強度の減少を生じさせた。

表１．υＶ吸収強度に対する種々の炭素源の効果−−２
，１グルコース　　＋＋　＋　＋　　　　　２．９スクロー
ス　　＋＋　＋　＋　　　　　２．９ラフイノース　　
　＋＋　＋　＋　　　　　　２．７グリセロール　　　
＋＋　＋　　　　　　　２．６ソルポース　　　＋＋２
．３コハク酸（Ｎａ塩）　　−２，ｆｌフマル酸（Ｎａ塩）　　−１，５ピルビン酸（Ｎａ塩）　　−２，４ペ　　ブ　　ト　　ン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１．９表２．ＵＶ吸収強度に対する
種々の阻害剤の効果＃１−　　　　　　　　　　　　　
　　＋＋＋＋２．９月、　アスペルギルス・バラシティ
クス５ＭＳ−４０ＪＲＩ？Ｌ　２９９９）、　　Ｇ　Ｙ
寒天培地、２８℃、３日間培養。

籾、　アフラトキシン非産生カビ５Ｍ５−２が示したＵ
Ｖ吸収との差を測定した。

目、括弧の数字は、ＵＶ吸収を示した範囲の直径を示し
た。

以上の結果から、これら炭素源依存性、阻害剤特異性を
併用すれば、多種の微生物の中でＡＦ産生菌を簡便、か
つ正確に識別できることが証明された。

次に、ＵＶ写真法によるＡＦ産生菌同定法の応用例とし
て、ＡＦ産生菌の変異株の分離及び飼料トウモロコシの
洗浄液中からのカビの分離について述べる。

応用例ＩＡＦ産生菌アスペルギルス・バラシティクス５ＹＳ−４
（ＮＲＲＬ　２９Ｈ）の胞子懸濁液を２５４ｎｍの紫外
光で照射後、コンラージ棒を用いて０．０５％デオキシ
コール酸Ｎａ塩を含むＧＹ寒天培地上に接種した。デオ
キシコール酸は集落のサイズをコンパクトにするために
添加している。培養４日後のＵＶ写真によると、野生株
と同様の黒色集落以外に灰色や白色の種々の集落が検出
され、これらの胞子を得ることによって容易にＡＦ産生
能の減少した変異株が単離できた。なお、得られた変異
株の一部については液体培養でもＡＦ産生量の減少を確
認した。

応用例２飼料トウモロコシ粒を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液
で洗い、その洗浄液をコンラージ棒でデオキシコール酸
を含むＧＹ寒天培地上に広げた。２８℃で培養４日後に
ＵＶ写真をとると、アスペルギルス属カビの中でＵＶ吸
収を示すものは検出されなかったが、アスペルギルス属
以外のカビでＵＶ吸収を示すものが検出された。この吸
収がＡＦによるものでないことは、ＡＦ合成阻害剤であ
るジクロルポス、ジメチルスルホキシドを含むＧＹ寒天
培地を用いて検討した。その結果、ＡＦ産生の対照菌ア
スペルギルス・フラブス５ＹＳ−３（ＩＦＯ３０１８０
）、アスペルギルス・バラシティクス５ＹＳ−４（ＮＲ
ＲＬ　２９９９）はＵＶ吸収強度が顕著に減少したのに
対し、トウモロコシ洗浄液由来のカビの場合は、ＵＶ吸
収に何らの変化も認められなかった。このことから、Ｕ
Ｖ写真法とＡＦ阻害剤の併用によって、自然界に存在す
る多種のカビ類の中からＡＦ産生カビのみを正確に同定
できることが証明された。

［発明の効果］本発明によれば、カビの集落をＵＶ写真法で撮影し、Ｕ
Ｖ吸収の有無からＡＦ産生カビを簡易に同定することが
できる。

本発明の方法は原理的にはＡＦ産生カビに限らず、紫外
光吸収物質を産生ずる多くの微生物に応用可能である。

その際には、吸収波長領域にあった紫外光光源、ＵＶフ
ィルターを用い、さらにその物質に特異的な銹導物質や
阻害剤を用いれば良い、また、その物質が菌体外に分泌
されていないものであれば、有機溶媒などを菌糸上に滴
下するなど菌体外に溶出させる処理をすれば応用可能と
思われる。ＡＦ以外のマイコトキシン産生菌としてはア
スペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐ。

ｏｃｈ　ｒａｃｅｕｓ）などのオクラトキシンＡ産生菌
、ペニシリウム・エクスバンスム　（Ｐｅｎ、　ｅｘｐ
ａｒｒｓｕｒｘ）などのパラリン産生菌など、抗生物質
産生菌としてはテトラサイクリン産生菌、ストレプトミ
セス・オーレオファシェンス　（Ｓｔｒ、　ａｕｒｅｏ
ｆａｃｉｅｎｓ）などがあり、これらへの適用が考えら
れる。

なお、ＡＦ吸収においては３８５ｎｍ近傍の長波長紫外
光が対象であるため、ＵＶレンズを用いなくても、ポラ
ロイドカメラ及び高感度ポラロイドフィルムを用いれば
、類似の写真を撮影することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＵＶ写真法の原理を示す説明図である。第２図
はシリカゲル薄層クロマトグラフィーの結果を示す。特許出願人　　農林水産省家畜衛生試験場長代　理　人
　弁理士　久保１）藤部第１図第２図手続主甫正書１発）１、事件の表示特願昭６１−１９１６８５２、発明の名称ＵＶ写真法によるアフラトキシン産生カビの簡易同定法３、補正をする者事件との関係　　特許出願人東京都中央区京橋１丁目１番１０号電話（２７５）０７２１番５、補正の対象明ｍ書の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄９発明の
詳細な説明の欄および図面６、補正の内容（１、発明の名称を「紫外線写真法によるアフラトキシ
ン産生カビの簡易同定法」と訂正する。（２、特許請求の範囲を別紙の如く訂正する。（３）明細書第１真下８行目のｒＵＶＪを「紫外線（以
後ＵＶと略す。）」に訂正する。（４）同第２頁９行目の「固体培地」を「固型培地」に
訂正する。（５）同第３頁１３〜１６行目の「サンプル前処理とし
て・・・・・・処理することはきわめて難しい。」を次
の如く訂正する。「使用するＡＦ抗体は実験者自身が調製しな（てはなら
ず、さらに種々の高価な試薬、器具を必要とするため、
免疫検定法の実用面への適用は容易ではない。」（６）同第８頁１１行目のｒ（ＩＦＯ３０１１２）Ｊを
ｒ（ＩＦＯ３０１１３）Ｊに訂正する。（７）同第９頁１６行目のｒＡＦＢ、及び」の前に「ア
スペルギルス・バラシティクス　５ＹＳ−４（ＮＲＲＬ
・２９９９）では、」を加入する。（８）　　同第１６頁１０行目の「ポラロイドカメラ」
を「一般のカメラ」に訂正する。（９）　　同第１６頁１０〜１１行目の「高感度ポラロ
イドフィルム」を「高感度フィルム」に訂正する。（１０）第１図を別紙の如く訂正する。（以上）特許請求の範囲カビの集落を孟五爽写真法で撮影し、聚外課吸収の有無
によりアフラトキシンの存在を識別することを特徴とす
るアフラトキシン産生カビの簡易同定法。

Claims

【特許請求の範囲】

カビの集落をＵＶ写真法で撮影し、ＵＶ吸収の有無によ
りアフラトキシンの存在を識別することを特徴とするア
フラトキシン産生カビの簡易同定法。