JPS6345557A - ムコタンパク質ベクタ−の測定のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、いわゆる血清及びその溶出液からムコタンパ
ク質を測定し、そして評価するための方法に関する。

〔従来の技術〕

哺乳類、特にヒトにおける種々の病理学上の変化は、血
清中のムコタンノ９り質の定性的及び定量的変化によっ
て明らかになる事実が良く知られている。特に、腫瘍疾
患の診断のためにその得られた結果を使用する可能性全
予想して、これらの変化を試験し、そして評価する試み
がすでに行なわＰａｌａｒｏｇｒａｆｉｅ　ｂｌｌｋｏ
ｖｉｎ　ａ　ｊ＠ｊｉ　ｋｌｉｎｌｃｋｅＶ　　　／ ｖｙｕｚｉｔｔ、６２〜６６　＃　１９６４ＳＺＮＰｒ
ａｂａ）は、α、−１α２−及びβ−グロブリンの分野
に存在する３徨の画分、ＭＰＩ　、　ＭＰ２及びＭＰ３
にムコタンパク質を分割した。Ｋａｌｏｕａ　（Ｋａｌ
ｏｕｓ　Ｖｍ：Ｃｈ＠ｍ、Ｌｉ５ｔｙ４８，７４７．１
９６４）は、癌腫がＭＰＩ画分金増大せしめることを示
した。ムコタンパク質画分が腫瘍疾患の診断の念めに情
報全提供することができるという享実がＷｉｎｚｌ・ｒ
（Ｗｉｎｚｌｅｒ　Ｒ，Ｊ＊＊　Ｂ＠ｈ＠ｓｉ　Ｇ、：
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣａｎｃ＠ｒ　Ｒ＠５ｅａｒｃ
ｈ　＊第２巻、１５０〜２０２゜１９６７　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）によって確
証され念。Ｄｅｒｍ＠ｒ　（Ｄｅｒｍ＠ｒ　Ｂ、Ｃ，。

５ｉｌｖ＊ｒｍａｎ　Ｍ、Ｌ、＊　Ｇ＠ｎｄｌｅｒ　Ｓ
、Ｊ−ｓ　Ｔｏｋｅｓ　ＬＡ、：　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ
、Ａｃｔａ　２６　＃　３　＃　３９２〜３９５ｓ１９
８０）は、糖タンパク質の電気泳動に専念した。彼は、
α２−糖タンノタク質画分に訃けるスプリットが種々の
腺癌に対して特異的であったことを見出し念。５ｎｙｄ
ｅｒ及びＡａｈｖ＠ｌｌ　（Ｓｎｙｄ＊ｒ　Ｓ、＊Ａｓ
ｈｖｒ＠１１　Ｇ、：　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ａｃ
ｔａ　３４　ｍ　４１９〜４５４．１９７１）はまた、
ヒト血清におけるムコタン／４り質のｔ’を試験し、そ
して癌腫において、一定のムコタンパク質の量が上昇し
、そして他のムコタン・ぜり質の世が下降すること全見
出し念。何人かの著者は、ムコタンノ４り質のｔを測定
する念めに、いわゆるＢｒｄｌｅｋａ　ｉｎｄ＠ｘ　（
ＢＩ　）（Ｈｏｍｅｌｋａ　Ｊ、：　Ｐｏｌａｒｏｇｒ
ａｆｌｅ　ｂｉｌｋｏｖｉｎ　ａｙ／ ｊａｊｌ　Ｋ１１ｎｉｃｋｅ　ｖｙｕｚｉｔｉ　３０〜
３０　、１９６４＊ＳＺＮ　Ｐｒａｈａ　）　ｆ採用し
て来念。しかし、ＢＩ値と悪性疾患との間に直接のつな
がりは、今まで示されていない。”　Ｂ１ｏｅｈｅｍｅ
ｅｌｌｎｅｂｏｈ＠ｎｏｓｌｏｖ＊’＊１３．１９８４
．１１５〜１２２イージ及びＡＯ第２３８，０２０号（
ＡＯ＝著者の証明書）においては、腫瘍疾患全診断する
ための方法全発見する比めに、クロマトグラフィーによ
って血清中のムコタンパク質の分離、ポーラログラフイ
ーによる個々の画分の活性の測定及びその得られた値の
何個の評価での試みの説明が存在する。たとえ、その得
られた結果が有望であるように思えたとしても、今まで
に発見され次男法は、広い実用的な適用の念めの実際的
手段ｔｉわさない。

血清のムコタンノ母り質が少なくとも２種のサブグルー
プに分離され、そしてムコタンノ譬り質濃度が全血清及
び該サブグループにおいて測定される場合、より一層正
確且つ再現可能な結果が得られることが現在発見され比
。その得られ比値はＸ。

ｙ及び２軸にプロットされ、そして与えられた血液及び
全測定値の一定の配置Ｋｎして特異的であり、そしてい
わゆる”ムコタンノ母り質ベクター２に相当する点が立
体空間に得られる。（これは、３種の濃度の場合に効果
的である。ｎ−濃度の場合、ｎ−次元空間における点が
得られる。）従って、本発男の目的は、イオン交換体に
よる分離を通して得られ念血清及びその溶出液からムコ
タンパク質ベクター全測定するための方法である。この
方法の原理は、ムコタンパク質成分の血清タンパク質が
ゲルイオン交換クロマトグラフィーによって少なくとも
２種のサブグループに分けられ、そして次に、ムコタン
ノやり５を濃度が該２種のサブグループ及びま念全血清
中で測定されることである。次に、個々の濃度１直がＸ
、７及び２軸にプロットされ、そして与えられ念血液に
対して特異的なムコタンパク質ベクターに相当する、空
間における点が得られる。ゲルイオン交換クロマトグラ
フィー自体はひじょうに良く知られていて、そして−船
釣に生化学において使用される。本発明の目的のために
は、装置及び技法又は方法における修飾は必要でない。

全血清及び個々のサブグループにおけるムコタンパク質
濃度は、他の方法によってまた測定され得る。普通、そ
れはプーラログラフイーによって行なわれるが、しかし
他の既知の方法、念とえば測光法又は電気泳動法もまた
使用することができる。

その得られｔ値は、個々の軸に手動によりプロットされ
るが、しかしひじょうに多くの測定値の之めに、適切な
プログラムを備え九電子計算機全使用することが好まし
い。

この方法（本発明の目的）は、既知の診断により十分な
数の人に適用され得、そして従って、与えられ九空間は
１種食”され得る。次に、次の測定値は、ムコタンパク
質ベクターを空間の確かなセクションに配置するであろ
う。そしてこれは、検量される人への正しい診断の定義
を、ひじょうに簡単且つ正確にするであろう。

本発明のムコタンパク質ベクターを測定するための方法
は、悪性の増殖を診断する目的で患者の健康状態を調べ
るために適用された。約９０％の正しい結果が得られ之
。本発明の方法の適用及び得られた結果の評価のより詳
細な説明がさらに与えられる。

上記事実から、本発明の方法は、いづれかの臨床的な症
候が見つかる前、悪性の増殖の診断に関して、特に人々
の健康状態を調べるために今まで適用され念生化学的方
法の主要な改良を示すことが明らかである。悪性腫瘍の
初期の診断が、好結果をもたらす処理のために見込みあ
る決定的な役割を示すことは、良く知られ念事実である
。

本発明の方法の単用性は、経済的に許容できる条件下で
人口のばく大な部分金スクリーニングするためにその適
用を導びく、そ／′１．は、たとえば義務的なＸ−線に
よる肺のスクリーニングと同じ範囲で導入され得る。

本発明は矢の例によって例示されるが、しかしながらこ
の発明の範囲を限定するものではない。

例 組成物及び溶液の調製； １、基本のＴＲｌ５−ＨＣＬ緩衝液：濃塩酸によって処
理され念水溶液５０ｄ（ｐＨ＝７．０）。

２、溶離溶液Ａ二適量の塩化ナトリウムを計量し、前記
基本の緩衝液に添加し、４５〜５０ｍモル／ｌのＣｔ−
濃度の溶液を作る。

溶離溶液Ｂ：適量の塩化ナトリウム全計量し、前記基本
の緩衝液に添加し、３２０〜３３０ｒｎモル／ｌのＣｔ
−濃度の溶１ｆ！、を作る。

溶離溶液Ｃ：適量の塩化ナトリウム全計量し、前記基本
の緩衝液に添卯し、４８０〜５００ｍモル／ｌのＣｔ−
濃度の溶液を作る。

３、グルセファデックスＤＥＡＥ　Ａ　−５０：基本緩
衝液１００１１ｔｔを、同じ純粋な物質１．０ｇに注ぐ
。

その緩衝液はグル上で液体層を形成する。ｒＡ／懸濁液
は、２４時間前に調製されるべきであり、そしてそれは
１４日間、使用される。その懸濁液は冷蔵庫に貯蔵され
るべきである。

４、２Ｎアンモニア ５、ヘキサアモコバルト　トリクロリドの原液二０．２
６７５ｇの（Ｃ０（ＮＨ，）６〕Ｃ１３及び塩化７ｙモ
ニウム５．３５９’ｇ、水に溶解し、蒸留水を添加し、
５００−の体積にする。

′Ｖ ６、三価のコバルトのＢｒｄｉｅｋａ溶液：第４溶液を
、第５溶液と混合する。その得られた溶液は１力月間使
用され得る。

７、スルホサリチル酸の２０％水溶液 ８、水酸化カリウムの０．ＩＮ水溶液 方法： グル３．５ｄ’ｉグラスチツクカラム（グルカラムの必
要な高さがあらかじめグラスチックカラムの壁土に印を
付けられている）中に充填する。液体の最後の小滴がカ
ラム全流れ出逢後、２ゴの溶離溶液Ａｔ−１そのグルカ
ラム上に注ぎ、そして重力による通過？許す。その後、
試験される血清０．５＋＋Ｑ７そのグル表面上に注ぎ、
セしてグルに浸透せしめる。１溶出ｆｆＡ″と印全付け
られたビーカーを、七のカラムの下に置く。まず、ｌ−
の溶離溶ＨＡをｒル衆面上にビにットで添加する。グル
を攪拌しないように注意すべきである。その溶液を通過
せしめる。次に、３ｆＲｔの溶離溶液Ａ全グル式面上に
ピペットで添加する。最後の滴下の後、溶出液Ａを得る
。

はとんどのβ−及びγ−グロブリンは、溶離溶液Ａによ
り洗い流される。この溶出液は、Ｂ及びＣ溶出液の選択
的獲得のためにのみ作用し、そしてさらに分析のために
は使用されない。

“溶出ＱＢ”と印金付けら′ｒＬ念ビ念力−カーカラム
の下に置く。１−の溶離溶液Ｂｔ−１七のグル弐面上に
ピペットで添加し、そして通過せしめる。

次に、他の２−の溶離溶液Ｂを１そのグル表面上番でピ
ペットで添加する。最後の滴下の後、溶出液Ｂを得、そ
して十分に攪拌する。

最後に、１溶出液Ｃ”と印金付けられたビーカー？、カ
ラムの下に置き、そして２−の溶離溶液Ｃを、そのデル
表面上【ピペットで添加する。最後の滴下の後、溶出液
Ｃ’（Ｈ得、そして十分に攪拌するＯ 分析される血ｆｆ０１４ｔｔ／全、　Ｓと印を付けられ
た試験管中にピペットで添加し、０．６Ｔｎｔの溶出液
Ｂを％　Ｅ３００と印を付づられた試験管にピペットで
添加し、そして０．６−の溶離液Ｃを、Ｅｓａｏと印を
付けられた試験管中に添加する。次に、０．ＩＮ水酸化
カリウム溶液１ゴを、３本の試、装管のそれぞれにｍ　
２１１０　Ｌ、その試験管の内容物全十分に混合し、そ
してその試験管全４５分間放置する。その後、２０％ス
ルホサリチル酸１−を３本の試験管のそれぞれに添加し
、その内容物全十分に攪拌し、そして１０分間放置する
。次に、除去された沈殿物を戸去する。そのＦ液のいく
らかが透明でない場合、それを、５，５００〜６．００
　Ｏｒ、ｐ、ｍｓで遠５，５＋離、ｊ６（ユ能５．２８
倫１オ遠、。ア離オ、）。

Ｓ試験管のＦ液から０．２１ｎｔ’ｉピペツトで取り、
Ｅ３ｏｏ及び”５００試験管の炉液から０．８−をピ（
ットで取る。次に、Ｂｒｄ　ｉ　ｅｋａ溶液２ゴを前記
部分のそれぞれに添加し、そしてその得られた溶液全ポ
ーラロダラフィーにより試験する。

ポーラログラフイーは、４００ｍＶ／分の電圧増幅でも
って、０．６ｖ〜１．６ｖの範囲内（タンノ母り質のポ
ーラログラフイー二重波の形成）で行なわれる。それは
陰極分極であり、陽極は銀線によって形成され得る。そ
の波の振幅から、対照試験の波の掘福が引き算されるべ
きである。その対照試験は、１．３〜１．４５Ｖの範囲
内で三価のコバルト溶液（Ｂｒｄｉｃｋａによる）全使
用する。

その得られｔ値は、次の方法で印を付けられる：ｖ、＝
参照試験波の振幅が引かれた後の血清（Ｓと印を付けら
れ九試装管）のポーラログラフイー波の去幅。

■！！１００”参照試験波の振幅が引かれｔ後の”３０
０溶出液のポーラログラフイー波の振幅。

ｖｚｓｏｏ　”参照試験波の振幅が引かれた後のＥ５０
０溶出液のポーラログラフイー波の振幅。

ｖＮｏｒｍ＝血液供与者の血清のポーラログラフイー波
の平均のＶ、振幅。

次の関係は、血清及び記号ＢＩ　Ｉ　ＢＩ、。。及びＢ
Ｉ。５０Ｑによって印さｎ念その２種の溶出液のポーラ
ログラフイーインデックスを定義する：実際の適用の九
めに、さらに２種の量、すなわち次の関係によって定義
される”ｎｏ及びＥ５０Ｇ溶出液のチポーラログラフィ
ーインデックスを使用する： ％Ｅ３ｏｏ＝””’　Ｘ　１００％ Ｉ ％Ｅｓ　ｏ　ｏ　＝””’　Ｘ　１００　％Ｉ 血清及びその２種の溶出液は、起点０＝（０゜０．０〕
及び第１図に示されるように点Ｘ＝（ＢＩ　、％Ｅ３０
０’％Ｅ５００〕又はベクターＸ＝ＣＢＩ　、％Ｅ　　
０％”５００）による、ＢＩ（ｚ軸）、％Ｅ３００　（
Ｙ軸）及び％”５ｏｏ（！ｌ’ｔｌｌｌ）’に示す３軸
によって与えられる立体のベクトル空間内に示され得る
、３覆のポーラログラフイーインデックス、Ｂｌ、５Ｅ
ｓａｏ及び％Ｅ５゜。によりて特定される。

第１図は３種のポーラログラフイーインデックス、ＢＩ
、％”！ｔｏｏ及び％Ｅｓａｏによって表わされるモニ
ター結果を例示する。図中において、適用できる断面は
、点Ａ＝［”Ｏ，０，１０α〕、Ｂ＝（０，１００，０
）及びＣ＝［２，Ｏ，Ｏ］により軸Ｘ＊７．Ｚ上に定義
される。そのＸ点は、□Ａ、ＯＢ　及びＯＣ七グメント
によって得られ。

セしてＡ、Ｂ　及びＣ点は、ＣＯ，Ｏ，％Ｅ５００：”
〔０１％Ｅ３ｏ（１ａＯ）及び（ＢＩ　、　０　、０　
：ｌのそれらの座標全方する。

立体空間の検１のために、既知症候を有する４種類の人
のグループを用いた： （１）正常で健康な人のグループ（Ｎ）（２）慢性の炎
症疾患全方する患者のグループ（ＣＨ） （３）急性の炎症疾患を有する患者のグループ（Ａ） （４）悪性増殖疾患を有する患者のグループ（Ｍ）。

それぞれのグループは、８０〜１２０人から成る。Ｎグ
ループの特徴は、ひじょうに低いＢＩインデックス（Ｂ
Ｉ（１，１）であり、ＣＨＮグループ特徴はわづかに高
められたＢＩインデックス及び低い％Ｅ３００及び％”
　ｓｏｏインデックスであり、Ａグループの特徴は高め
られ九％Ｅ！５００インデックスであり、セしてＭグル
ープの特徴は高められ九％Ｅｓｏｏインデックスである
。個々の集団は、境界域によって分離され得る。その得
られ九位置は第２図に例示され、ここで！、７及び２＠
は、第１図上のｘ、ｙ及び２軸に対応する。

第２図は、種々の症候を有する人のグループによる立体
空間の検量を例示する： Ａ＝急性の炎症疾患を有する患者のグループの念めの空
間 ＣＨ＝慢性の炎症疾患を有する患者のグループのための
空間 Ｎ＝正常で健康な人のグループのための空間Ｍ＝悪性増
殖を有する患者のグループのための空間。

！軸は％ＥｓｏｏＯ値を示し、ｙ＠は％”！５００の値
を示し、そして２軸はＢＩＯ値を示す。

個々の集団のノぐラメ−ター（試験される４種類のグル
ープ、Ｎ、ＣＨ，Ａ、Ｍが属する）の知識は、１ｊ定さ
れるムコタン・母り質血清の分析（この場合、上記と同
じ条件下で行なわれ７ｔＪ−ラログラフィー分析）に酉
づいて、測定を促進せしめる。

治療され之及び治療されていない悪性の増殖を診断する
場合（治療された及び治療されていない人の間の割合は
、生化学実験室で行なわれる一般の試験の範囲内にある
）、′誤っ念”陰性が約１０％の事例で発見され念。大
部分、それらは、悪性の増殖が、進行した段階（ここで
退行性変化が生じる）にある場合であり、そしてそれら
は、血清中における炎症の％Ｅ、。。成分の増大を導び
く。従って、これらの状態は、普通、急性炎症として評
価される。しかし、この段階において、患＠をモニター
することは、もはや必要でない。なぜならば、記載され
た方法の主な貢献は、それらが臨床的に明らかになる前
、悪性の増殖を発見することにあるからである。

好結果をもたらすように治療され念悪性増殖は、慢性の
炎症過程の空間内に一般的な結果を示す。

これらの患者を永久的にモニターし、そして従って、治
療の有効性ヲ調べることが可能である。

誤り比隣性は、ひじょうにまれに生じた。実際的に、そ
れらは、いくつかの炎症疾患を有する子供のほとんどな
い事例であり、そして本発明の方法によって得られた結
果は悪性の増殖を指摘し念。

今までに得られた結果から、記載された方法の実証され
念信頼性は、約９０％に達する。その方法は、それぞれ
のタイプ及び位Ｉｔを特定しないで、それらの初期段階
における悪性増殖を診断するための新しい可能性を提供
する。その方法はまた、従来の方法により悪性増殖の治
療の効率′に調べるための可能性も提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種類のポーラログラフイー　インデックス、
Ｂｌ、％Ｅ　　及び％Ｅｓｏｏによって費わされるモニ
ター結果を例示し、そして 第２図は種々の症候を有する人のグループによる立体空
間の検ｔｖ例示する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イオン交換体上での分離により得られた血清及びそ
   の溶出液からムコタンパク質ベクターを測定する方法で
   あって、ムコタンパク質成分の血清タンパク質がゲルイ
   オン交換クロマトグラフィによって少なくとも２種のサ
   ブグループに分離され、次に該２種のサブグループ及び
   全血清中のムコタンパク質の濃度が測定され、そして個
   々の濃度値がｘ，ｙ及び１軸にプロットされ、それによ
   って、与えられた血液に対して特異的なムコタンパク質
   ベクターに対応する点を得ることを特徴とする方法。 ２、ムコタンパク質濃度の測定を、ポーラログラフィー
   によって行なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３、ムコタンパク質濃度の測定を、測光法によって行な
   うことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、ムコタンパク質濃度の測定を、電気泳動によって行
   なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
   。