CS263622B1

CS263622B1 - Mykoprotein vector determining method

Info

Publication number: CS263622B1
Application number: CS864514A
Authority: CS
Inventors: Jaroslav Ing Csc Jansa; Peter Ing Csc Urbanek; Milan Ing Cesal; Karel Ing Bitto
Original assignee: Jaroslav Ing Csc Jansa; Peter Ing Csc Urbanek; Cesal Milan; Karel Ing Bitto
Priority date: 1986-06-18
Filing date: 1986-06-18
Publication date: 1989-04-14
Also published as: US4900447A; EP0250216A3; CS451486A1; JPS6345557A; EP0250216A2; HUT44861A

Description

Vynález se týká způsobu zjišťování a vyhodnocování tzv. mukoproteinového vektoru z krevního séra a jeho eluátů.

Je již známo, že různé chorobné změny v organismu savců, zejména člověka, se projevují kvalitativními a kvantitativními změnami mukoproteinů v krevním séru. Byly již činěny pokusy o sledování a vyhodnocování těchto změn, zejména s ohledem na možnost použití zjištěných výsledků к diagnostice nádorových onemocnění. Tak již Mehl (Homolka J.: Polarografie bílkovin a-její klinické využití, 62 až 66, 1964 SZN Praha) rozdělil mukoproteiny na tři frakce, a to MP 1, MP 2 а MP3, které se vyskytují v oblasti alfa-1, alfa-2 a beta-globulinů. Kalous (Kalous V.: Chem. listy 48, 747, 1964) prokázal, že při karcinomech dochází ke zvýšení frakce MP 1. Tato skutečnost potvrzuje i Winzlerův (Winzler R. J., Behesi G.: Methods in Cancer Research, Vol. 2, 150 až 202, 1967 Academie Press New York) názor, že frakcionace mukoproteinů může poskytnout informace pro diagnózu nádorových onemocnění. Dermer (Dermer B. G., Silverman M. L., Gendler S. J., Tokes Z. A.: Clin. Chem. Acta 26, 3, 392 až 395, 1980) se zaměřil na elektroforetickou analýzu glykoproteinů. Zjistil, že rozštěpení frakce alfa-2-glykoproteinů bylo specifické pro různé adenokarcinomy. Snyder a Ashwell (Snyder S., Ashwell G. : Clin. Chem. Acta 34, 449 až 454, 1971) rovněž zkoumali obsah mukoproteinů v lidském séru a zjistili, že obsah některých mukoproteinů v karcinomu stoupá, některých naopak klesá. Řada autorů používala pro určení obsahu mukoproteinů tzv. Brdičkův index (BI) (Homolka J.: Polarografie bílkovin a její klinické využití 30 až 37, 1964, SZN Praha). Souvislost hodnoty BI s výskytem zhoubného onemocnění byla však dosud neprůkazná. V Biochem. clin, bohemoslov. 13, 1984, str. 115 až 122 a v АО č. 238 020 se popisuje chromatografické dělení mukoproteinů krevního séra, stanovení polarografických aktivit jednotlivých frakcí a pokusy o individuální vyhodnocování získaných hodnot s cílem nalézt metodu к vyhledávání nádorových onemocnění. I když dosažené výsledky jsou povzbudivé, nepředstavují dosud známé způsoby vyhodnocování výsledků měření spolehlivé metody pro rozšířenější praktické využití.

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že lze dospět к mnohem přesnějším a reprodukovatelným výsledkům v případě, že se mukoproteiny krevního séra rozdělí nejméně na dvě podskupiny, v celém séru a v těchto podskupinách se změří koncentrace mukoproteinů a získané hodnoty se vynesou na osy x, у a z, čímž se v trojrozměrném prostoru získá bod, který je pro danou krev a dané uspořádání celého stanovení charakteristický, a který odpovídá tzv. mukoproteinovému vektoru (tak je tomu v případě tří koncentrací; v případě n-koncentrací se získá bod v n-rozměrném prostoru).

Vlastním předmětem vynálezu je tedy způsob zjišťování mukoproteinového vektoru z krevního séra a jeho eluátů získaných separací na iontoměniči, který spočívá v tom, že se bílkoviny krevního séra v jeho složce mukoproteinů rozdělí gelovou iontoměničovou chromatografií, nejméně na dvě podskupiny, v těchto podskupinách a v celém séru se změří koncentrace mukoproteinů a jednotlivé hodnoty koncentrací se vynesou na osy x, у a z, čímž se v prostoru získá bod, odpovídající mukoproteinovému vektoru charakteristickému pro danou krev.

Samotná gelová iontoměničová chromatografie je o sobě známá a v oblasti biochemie běžně používaná. Pro účely vynálezu nejsou nutné žádné aparaturní ani technologické úpravy obvyklých zařízení a postupů.

Koncentrace mukoproteinů v celém séru a v jednotlivých podskupinách se může měřit rovněž o sobě známým způsobem. Obvykle se tato koncentrace měří polarograficky, nic však nebrání tomu, aby se к danému účelu použily i jiné známé metody, jako je zejména fotometrie nebo elektroforesa.

Vynášení naměřených hodnot na jednotlivé osy se může sice provádět ručně, ale zejména pro větší počet stanovení je účelnější použití elektronického výpočetního ^ařízení, opatřeného vhodným programem, což pro odborníka nepředstavuje žádný problém.

Způsob podle vynálezu je možno aplikovat u přiměřené řady osob se známou diagnózou a tak si daný prostor okalibrovat. Při každém dalším stanovení pak bude zjištěný mukoproteinový vektor lokalisován v některém z úseků tohoto prostoru, čímž bude možno s mimořádnou jednoduchostí a velkou přesností definovat stav sledované osoby.

Způsob stanovení mukoproteinového vektoru podle vynálezu byl použit ke sledování zdravotního stavu pacientů se zaměřením na diagnózu maligních nádorových onemocnění, přičemž zjištěná úspěšnost diagnózy se pohybuje okolo 90 %. Bližší popis použití vhodné metodiky a vyhodnocování výsledků je uveden v příkladu provedení.

Z výše uvedeného je zřejmé, že způsob podle vynálezu představuje značné obohacení dosavadního stavu techniky v oblasti biochemických metod sloužících ke sledování zdravotního stavu lidí, zejména pokud jde o diagnostiku nádorových onemocnění ještě před tím, než se objeví jejich klinické příznaky. Jak známo, je včasné rozpoznání nádorových chorob v drtivé většině případů rozhodující pro úspěšnou léčbu.

Jednoduchost způsobu podle vynálezu by mohla sloužit i к monitorování populace obyvatelstva za ekonomicky velice přijatelných podmínek a bylo by možno ji zavést v takovém rozsahu jako například povinné snímkování plic.

Vynález ilustruje následující příklad provedení, jímž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.

Příklad provedení

Složení a příprava roztoků:

1. Základní TRIS-HC1 pufr: 50 mM vodný roztok upravený koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 7,0.

2. Eluční roztok A: do základního pufru se naváží tolik chloridu sodného, aby výsledná koncentrace Cl” byla 45 až 50 mmol/litr.

Eluční roztok B: do základního pufru se naváží tolik chloridu sodného, aby výsledná koncentrace Cl byla 320 až 330 mmol/litr. '

Eluční roztok C: do základního pufru se naváží tolik chloridu sodného, aby výsledná koncentrace Cl” byla 480 až 500 mmol/litr.

3. Gel Sephadex DEAE A-50: asi 1,0 g nativní substance se zalije 100 ml základního pufru který vytváří nad gelem vrstvu kapaliny. Suspenze gelu se připravuje 24 hodiny před použitím a doba její použitelnosti je asi 14 dnů. Suspenze se uchovává v chladničce.

4. 2N amoniak.

5. Zásobní roztok chloridu hexaamokobaltitého:

0,267 5 g [Čo(NH^) Cl₃ a 5,35 g chloridu amonného se rozpustí ve vodě a roztok se destilovanou vodou doplní na objem 500 ml.

6. Brdičkův roztok trojmocného kobaltu: smísí se roztok č. 4 s roztokem č. 5. Doba použitelnosti je asi 1 měsíc.

7. 20% vodný roztok kyseliny sulfosalicylové.

8. 0,lN vodný roztok hydroxidu draselného.

Při provádění způsobu se postupuje takto:

Do kolonky z plastické hmoty se navrství 3,5 ml gelu (potřebná výška sloupce gelu je na kolonce předem označena). Po odkápnutí poslední kapky kapaliny ze sloupce se na povrch gelu nanesou 2 ml elučního roztoku A a nechají se gravitačně protéci. Potom se na povrchu gelu nanese 0,5 ml zkoumaného séra, které se nechá do gelu vsáknout. Pod kolonku se umístí kádinka označená jako eluát A”, na povrch gelu se napipetuje nejprve 1 ml elučního roztoku A tak, aby se gel nerozvířll, tento roztok se nechá protéci a pak se na povrch gelu napipetují ještě další 3 ml elučního roztoku A. Po odkápnutí poslední kapky se získá eluát A.

Elučním roztokem A se vymyjí převážně beta- a gama-globuliny. Tento eluát přispívá pouze к selektivnímu získání níže uvedených eluátů В a C a pro další analýzu se nepoužívá.

Pod kolonku se umístí kádinka označená eluát B, na povrch gelu se napipetuje 1 ml elučního roztoku B, nechá se protéci a potom se na povrch gelu napipetují další 2 ml elučního roztoku B. Po odkápnutí poslední kapky se získá eluát B, který se důkladně promíchá.

Pod kolonku se nakonec umístí kádinka označená jako eluát C a na povrch gelu se napipetují 2 ml elučního roztoku C. Po odkápnutí poslední kapky se získá eluát C, který se rovněž důkladně promíchá.

Do zkumavky, která je označena písmenem S, se napipetuje 0,4 ml vyšetřovaného séra, do zkumavky označené Ε^θθ se napipetuje 0,6 ml eluátu В a do zkumavky označené Ε^θθ se napipetuje 0,6 ml eluátu C. Do všech tří zkumavek se pak přidá vždy 1 ml O,1N roztoku hydroxidu draselného, obsah zkumavek se promíchá a zkumavky se ponechají 45 minut stát. Po uplynutí této doby se do každé zkumavky přikape vždy 1 ml 20% kyseliny sulfosalicylové, obsah zkumavek se důkladně promíchá a nechá se stát po dobu 10 minut, načež se vyloučené sraženiny odfiltrují. Pokud některý z filtrátů není čirý musí se odstředit při 5 500 až 6 000 ot/min po dobu 10 minut, nejlépe v chlazené odstředivce při teplotě 2 °C. Z filtrátu obsahu zkumavky označené S se odpipetuje 0,2 ml, z filtrátů obsahů zkumavek označených a Ε,-θθ pak vždy 0,8 ml, ke každému z těchto podílů se přidají vždy 2 ml Brdičkova roztoku a výsledné roztoky se podrobí polarografii. ’

Polarografie se provádí v rozsahu od 0,6 V do asi 1,6 V (vytvoření bílkovinné polarograf ické dvojvlny) s přírůstkem napětí 400 mV/min. Jde o katodickou polarisaci, přičemž anoda může být tvořena i stříbrným drátem. Od výšky vlny pokusu se odečítá výška vlny slepé zkoušky, která je tvořena pracovním roztokem trojmocného kobaltu podle Brdičky v rozmezí od 1,3 do 1,45 V.

Naměřené hodnoty se označují následujícím způsobem:

Vg = výška polarografické vlny séra (zkumavka označená S) po odečtení výšky vlny slepé zkoušky v_E ^E300 = výška polarografické vlny eluátu Ε^θθ po odečtení výšky vlny slepé zkoužky ^VE ^E500 = výška polarografické vlny eluátu Ε₅θθ po odečtení výšky vlny slepé zkoužky

V norm = průměrná výška V_g polarografické vlny séra dárce krve.

Následující vztahy definují symboly BI, BI- a BI„ :

^E300 ^e500 polarografické indexy séra a jeho dvou eluátů, označované norm ^BIE ^E300 ^VE ^E300

V norm ^BIE = ^b500 norm

К praktickým aplikacím se používají další dvě veličiny a to procentuální polarografické indexy eluátů %Ε₃θθ ^{a %Ε}5θο' jsou definovány vztahy:

^BIE ^%E300 = ^{x 100} * ^BIE ^%e500 “ ^{x 100 %}

Sérum a jeho dva eluáty jsou nyní charakterizovány trojicí polarografických indexů

BI, %Ε₃θθ a %Ε^θθ, kterou lze v trojrozměrném vektorovém prostoru popsaném počátkem = [o, 0, o] a trojicí os označených BI (osa z) , %E₃₀₀ (osa у) a %Ε₅θθ (osa x) znázornit bodem X = [bi, %E_3Q(), %Ε₅θθ] nebo vektorem X = (BI, %Ε₃₀θ, %Ε₅θθ) , jak je patrno z obr. 1.

Obr. 1 znázorňuje výsledek monitorování reprezentovaný trojicí polarografických indexů ^{BIf %E}300 ^{a %E}50CT Na tomto obrázku jsou použitelné úseky na osách x, у a z vymezeny body A = [o, 0, lOCj , В = [O, 100, o] a C = [2,0, O,oJ . Bod X se sestrojí (získá) za pomoci úseček OA¹, OB¹ а ОС¹, přičemž body А¹, В¹ a C¹ mají souřadnice [o, 0, %Ε₅θθ] / [o, ^%E300' popřípadě £в1, 0,0J.

Ke kalibraci trojrozměrného prostoru byly použity čtyři skupiny osob se známou diagnózou, a to

1) skupina normálních zdravých osob (N)

2) skupina pacientů s chronickým zápalovým onemocněním (CH)

3) skupina pacientů s akutním zápalovým onemocněním (A)

4) skupina pacientů s maligním nádorovým onemocněním (M).

Každá z těchto skupin sestávala z 80 až 120 osob. Skupina N se vyznačuje nízkým indexem BI (BI<1,1), skupina CH se vyznačuje mírně zvýšeným indexem BI a nízkými indexy %Ε₃θ_β a %E_5oq, skupina A se vyznačuje zvýšenou hodnotou indexu %Ε₃θθ a skupina M se vyznačuje zvýšenou hodnotou indexu %Ε^θθ. Jednotlivé shluky je možno rozdělit hraničními plochami. Vzniklou situaci znázorňuje obr. 2, na kterém osy x, у a z odpovídají osám x, у a z v obr. 1.

Obr. 2 znázorňuje kalibraci trojrozměrného prostoru za použití skupin osob s různou diagnózou:

A prostor pro skupinu pacientů s akutním zápalovým onemocněním

CH prostor pro skupinu pacientů s chronickým zápalovým onemocněním

N prostor pro skupinu normálních zdravých osob

M prostor pro skupinu pacientů s maligním nádorovým onemocněním

Osa x udává hodnoty %Ε₅θθ, osa у udává hodnoty %Ε₃θθ a osa z udává hodnoty BI.

Znalost parametrů jednotlivých shluků pak umožňuje na základě analýzy (v tomto případě polarografické, prováděné za totožných podmínek jako výše) mukoproteinů séra rozhodnout, do které ze skupin N, CH, A a M sledovaná osoba patří.

Při diagnostikování léčených i neléčených nádorových chorob (poměr léčených к neléčeným byl v mezích běžných vyšetření prováděných v biochemických laboratořích) byla asi v 10 % případů zjištěna falešná” negativita. Většinou se jedná o případy, kdy je nádor v pokročilém stádiu, které je spojeno s regresivními změnami, což vede к zvýšení zápalové složky ^%Ε ₃θθ v krevním séru. Tyto stavy jsou tedy obvykle vyhodnoceny jako akutní zápaly. V tomto stádiu však monitorování pacienta již není potřebné, protože hlavní přínos popisované metody spočívá ve vyhledávání nádorových chorob ještě před tím, než dojde к jejich klinické manifestaci.

Úspěšně léčené nádory dávají výsledky zpravidla v oblasti chronických zápalových procesů.

Ч¹·

Pacienty s těmito výsledky je možno průběžně monitorovat a sledovat tak úspěšnost jejich léčby.

Falešná pozitiva se pozoruje velmi zřídka. Prakticky se jedná o několik případů zápalového onemocnění dětí, které bylo vyhodnoceno jako onemocnění nádorové.

Ze zjištěných výsledků vyplývá, že dosud ověřená účinnost shora popsané metody se pohybuje okolo 90 %. Metoda poskytuje novou možnost diagnózy nádorových onemocnění v ranném stádiu - bez specifikace jejich druhu a lokality. Metoda dále poskytuje možnost sledování úspěšnosti léčby maligních nádorových onemocnění klasickými metodami.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob zjišťování mukoproteinového vektoru z krevního séra a jeho eluátů získaných separací na iontoměniči, vyznačující se tím, že se bílkoviny krevního séra v jeho složce mikoproteinů rozdělí gelovou iontoměničovou chromatografií nejméně na dvě podskupiny, v těchto podskupinách a v celém séru se změří koncentrace mukoproteinů a jednotlivé hodnoty koncentraci se vynesou na osy x, у a z, čímž se získá bod odpovídající mukoproteinovému vektoru charakteristickému pro danou krev.

2 . Způsob podle bodu 1, vyznačuj ící se tím, že se měření koncentrace mukoproteinů provádí polarograficky. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se měření koncentrace mukoproteinů provádí fotometricky. 4'. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se měření koncentrace mukoproteinů

provádí elektroforeticky.