JPS6339872B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 主面上に吸着された特定の生物学的粒子の層
を有する固体かつ剛性の基体部材、固体かつ剛性
の底部を有するホルダー、前記底部の内面に沿い
ながら概して長手方向に伸びかつ前記特定の生物
学的粒子に対して特異的な生物学的粒子を含む液
体を収容するのに役立つ収容手段、および前記基
体部材の少なくとも一部分が前記収容手段から離
隔しかつ前記特定の生物学的粒子の層が前記収容
手段と向かい合うようにしながら前記収容手段に
隣接して前記基体部材を保持するのに役立つ支持
手段の諸要素から成り、しかも前記収容手段の概
括的な長手方向に伸びる直線に沿つて見た前記基
体部材と前記収容手段との相対的な配置は前記基
体部材と前記収容手段との離間距離が前記収容手
段の一端から他端へ向かつて一定の割合で増加す
るようになつていることを特徴とする、生物学的
試料中における特定の生物学的粒子の有無および
前記特定の生物学的粒子の濃度を測定するための
装置。

２ 前記基体部材の表面が平面状である請求の範
囲第１項記載の装置。

３ 前記収容手段の表面が平面状である請求の範
囲第１項記載の装置。

４ 前記基体部材の表面および前記収容手段の表
面が共に平面状でありかつ互いに傾斜している請
求の範囲第１項記載の装置。

５ 前記基体部材の表面に対して垂直かつ前記収
容手段の長手方向に対して実質的に平行な平面が
前記収容手段の表面に対して垂直となるようにし
て平面状の前記表面同士が傾斜している請求の範
囲第４項記載の装置。

６ 前記基体部材の平面と前記収容手段の平面と
の成す角度が約３分から約10度までの範囲内にあ
る請求の範囲第４項記載の装置。

７ 前記収容手段が比較的一様な横断面の繰返し
パターンを成して形成された多孔質材料のただ１
枚の断片である請求の範囲第１項記載の装置。

８ 前記収容手段が蛇行状の形態を有する請求の
範囲第７項記載の装置。

９ 前記収容手段が実質的に一様な厚さの酢酸セ
ルロースから成る請求の範囲第１項記載の装置。

１０ 前記収容手段が前記底部の内面に貼付され
ている請求の範囲第１項記載の装置。

１１ 前記基体部材がインジウム被膜を有してい
て、その上に前記特定の生物学的粒子の層が吸着
している請求の範囲第１項記載の装置。

１２ 前記特定の生物学的粒子の層が精製ヒト
IgGの層である請求の範囲第１１項記載の装置。

１３ 前記支持手段が互いに向かい合つた１対の
外壁から成る請求の範囲第１項記載の装置。

１４ 特定の生物学的粒子に対して免疫学的に特
異的な生物学的粒子を含む一定量の液体を長手方
向に伸びた第１の区域内に配置し、前記第１の区
域と流通し得るようにして一定量の生物学的試料
液体を前記第１の区域上に滴下し、固体かつ剛性
の基体上に吸着させた前記特定の生物学的粒子の
層を前記試料液体の上面に接触させて配置するこ
とにより前記試料液体を通つて前記第１の区域の
表面から前記特定の生物学的粒子の層の表面に至
る最短距離が前記第１の区域の長手方向に伸びる
直線に沿つて見た場合に一定の割合で変化するよ
うな形状を持つた第２の区域を前記試料液体に形
成させ、所定の時間にわたつて上述の関係を維持
することにより前記の免疫学的に特異的な生物学
的粒子を前記第１の区域から前記第２の区域内へ
拡散させ、前記特定の生物学的粒子の層の吸着し
た前記基体を取除き、そして前記特定の生物学的
粒子の層の表面を検査することにより前記特定の
生物学的粒子の層に付着した第２の層の有無およ
び長手方向寸法を判定する諸工程から成ることを
特徴とする、生物学的試料中における特定の生物
学的粒子の有無および前記特定の生物学的粒子の
濃度を測定するための方法。

１５ 前記特定の生物学的粒子に対して免疫学的
に特異的な生物学的粒子を含む前記一定量の液体
を酢酸セルロースの薄層中に吸収させることによ
つて前記第１の区域が形成される請求の範囲第１
４項記載の方法。

１６ 前記第１の区域からの前記の免疫学的に特
異的な生物学的粒子の拡散速度に比べて前記試料
液体内の対流が無視できるように前記試料液体の
粘度が調整される請求の範囲第１４項記載の方
法。

１７ 前記試料液体が水溶液でありかつそれの粘
度調整のために使用される物質がヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースである請求の範囲第１６項
記載の方法。

１８ 前記特定の生物学的粒子に対して免疫学的
に特異的な生物学的粒子を含む前記液体が抗ヒト
IgG血清であり、前記特定の生物学的粒子の層が
精製ヒトIgGの層であり、かつ前記試料液体が希
釈されたヒト血清である請求の範囲第１４項記載
の方法。

１９ 前記ヒト血清がヒドロキシプロピルメチル
セルロース水溶液を用いて希釈される請求の範囲
第１８項記載の方法。

２０ 前記所定の時間が20分である請求の範囲第
１９項記載の方法。

２１ 前記第１の区域が蛇行状の形態を有する請
求の範囲第１４項記載の方法。

発明の背景 本発明は特異的な相互作用（たとえば免疫反
応）を行う生物学的粒子の試料中における濃度を
測定するための方法および装置に関するもので、
更に詳しく言えば、ヒト血清中における抗体レベ
ルを定量的に測定するための方法および装置に関
する。

免疫反応とは、免疫反応性を持つた第１の生物
学的粒子（たとえば抗体のごとき蛋白質）がそれ
に対して特異的な第２の生物学的粒子と結合する
高度に特異的な生化学的反応である。動物や人間
のごとき生体系の内部において起こる免疫反応
は、病気と戦う上で極めて重要である。免疫学的
に活性な外来の粒子（すなわち抗原）が生体系内
に侵入すると、その生体系は現時点ではまだ十分
に解明されていない過程により抗原に対して特異
的な抗体蛋白質を産生する。かかる抗体蛋白質分
子は化学結合部位を有していて、それらが最初の
抗原粒子の化学結合部位と補足し合う結果、両者
が結合して免疫学的に複合した粒子を形成する。

生体系は外来物質の侵入に応答して抗体を産生
するから、生体系内に存在する抗体を検出するこ
とはその生体系が暴露された抗原を決定する目的
から見て医学診断上の価値を有する。抗体の５つ
の主要なクラス（すなわち免疫グロブリンIgG、
IgM、IgA、IgEおよびIgD）の各々は、見かけ
上、アミノ酸の長いペプチド鎖（Ｈ鎖）および短
かいペプチド鎖（Ｌ鎖）を少なくとも２本ずつ有
することが特徴である。なお、アミノ酸単位間の
結合はペプチド結合として知られている。

上記のごとき診断試験を行うためには、免疫反
応を行う相手としての適当な蛋白質を入手しなけ
ればならない。抗体蛋白質の唯一の源泉として知
られているのは生体系である。更に詳しく言え
ば、異種蛋白質または粒子の導入に対して免疫反
応を示すことが現時点において知られているのは
背椎動物のみである。免疫技術界において公知の
ごとく、抗体分子は異種の背椎動物の生体系内に
導入されれば抗原として働く。従つて、かかる背
椎動物の生体系を用いれば特異的に反応する抗―
抗体を容易に産生させることができる。

免疫反応性を示す生物学的粒子の生物学的試料
中における濃度を測定するための方法および装置
は、ギアエヴア（Giaever）の米国特許第
3960489号明細書中に開示されている。なお、こ
の特許明細書は引用によつて本明細書の一部を成
すものである。

本明細書中で使用される「生物学的粒子」とい
う用語は、動物に注射した場合に抗体産生を刺激
する能力を有し（すなわち抗原として作用し）か
つ（あるいは）免疫学的（すなわちハプテンのご
とく）または非免疫学的に特異的な相互作用を行
う性質を有する任意の物質を包括するものであ
る。

本明細書中で使用される「診断用基体」と言う
用語は、それと共に使用される生物学的粒子に対
して反応性を示さない適当な材料（たとえば金
属、ガラス、プラスチツクまたは類似の材料）で
作られた基板の主面上に生物学的粒子の第１の層
を吸着させたものから成り、しかもかかる第１の
層の少なくとも一部分上に第２の層を形成し得る
ような特定の生物学的粒子の検出のために使用で
きるような構造物を意味する。各種の診断用基体
の構造および使用法は、ギアエヴアの米国特許第
3926564号、ギアエヴアの同第3979184号、ギアエ
ヴアの同第3979509号、ギアエヴアの同第4011308
号、ギアエヴアの同第4054646号、ギアエヴアの
同第4041146号、およびヒーリー（Healy）等の
同第4090849号明細書中に記載されている。また、
これらの特許明細書中に特記されているもの以外
の構造を持つた診断用基体も使用可能である。な
お、上記の特許明細書はいずれも引用によつて本
明細書の一部を成すものである。

基体構造の記載に際して本明細書中で使用され
る「金属被覆」という用語は金属層を有すること
を意味し、またかかる層中に存在するような１種
または数種の金属の酸化物が付随する場合もあ
る。以上の用語を用いて述べれば、好適な診断用
基体は金属被覆表面領域上に特定の生物学的粒子
の層を吸着させた金属被覆スライドガラスであ
る。

発明の説明 本発明に従えば、（その一部分として第１の生
物学的粒子すなわち特定の生物学的粒子の露出層
を有する）固体かつ剛性の診断用基体およびそれ
から離隔して配置されかつ第２の生物学的粒子を
含む溶液を保持するのに役立つ収容手段を併用す
る診断装置が提供される。ここで言う第２の生物
学的粒子はたとえば免疫反応によつて特定の生物
学的粒子と特異的な相互作用を行うものである。

上記の収容手段は概して長手方向に伸びかつ剛
性の表面上に配置され、また上記の診断用基体は
特定の生物学的粒子の層が収容手段に隣接しなが
ら向かい合うようにして支持されている。しか
も、収容手段の概括的な長手方向に伸びる直線に
沿つて見た診断用基体と収容手段との相対的な配
置は、診断用基体と収容手段との離間距離が収容
手段の一端から他端へ向かつて一定の割合で増加
するようになつている。

試験の実施に当つては、濃度を測定すべき特定
の生物学的粒子に対して特異的な第２の生物学的
粒子を含む液体が収容手段中に吸収させられ、次
いで特定の粒子を含むかどうか疑われる少量の試
験液が収容手段上に直接に滴下される。通例、か
かる試験液は高い粘度を示すように調整されてい
る。次に、診断用基体上に位置する特定の粒子の
層が試験液と接触しかつ診断用基体の少なくとも
一部分が収容手段から離隔するようにして診断用
基体が配置される。その結果、最初に滴下された
試験液は変形され、そして一定の割合で増加する
厚さを持つた液体充満区域が形成される。

先ず、第２の（特異的な）生物学的粒子が収容
手段から液体充満区域内へ拡散すると、これら第
２の粒子は試験液中に存在する特定の粒子と複合
し、従つて診断用基体上に位置する特定の粒子の
層に到達してそれと結合することができない。時
間が経てば、試験液中における特定の粒子の濃度
に応じ、第２の粒子の一部が診断用基体に至るま
で拡散して特定の粒子の露出層と複合することが
可能となる。かかる複合が起こつた場所には、目
に見える第２の層が形成される。このような第２
の層の形成が最初に起こるのは、試験液で満たさ
れた区域の薄い側の端部であつて、そこでは第２
の粒子を診断用基体から隔てる特定の粒子の量が
少ないのである。更に長い時間にわたつて拡散を
行わせると、複合現象は診断用基体に沿いながら
上記区域の厚い側へ向かつて進行する。収容手段
の長軸に沿つた液体充満区域の厚さの変化は明確
に規定されているから、診断用基体上における二
重層形成の程度すなわち長さおよび（または）面
積を読取れば、試験液中に存在する特定の粒子の
濃度の尺度が得られる。使用する診断用基体およ
びそれの使用方法に応じ、肉眼でも良好なコント
ラストを持つて第２の層を見ることもできるし、
あるいは第２の層を取除いてそれの含量（または
有無）を測定することもできる。

好適な構成に基づけば、収容手段は平らな表面
に沿つて広がるほぼ平面状を成して配置され、ま
た診断用基体は平面状のものである。この場合に
おける診断用基体と収容手段との相対的な配置
は、診断用基体の下面および収容手段の上面が試
験液によつて満たされるべき実質的にくさび形の
容積の２つの相対する面を規定するようになる。
このような構成の場合にはまた診断用基体に対し
て垂直かつ収容手段の長軸に対して実質的に平行
な平面は収容手段の平面に対して垂直であるとい
う関係が診断用基体と収容手段との間に成立す
る。

【図面の簡単な説明】

保護を受けようとする本発明の要旨は、以下に
示されるような本発明の説明の終りに請求の範囲
として提示されている。以下の説明は本発明の製
造方法および使用方法を示すものであり、また添
付の図面は本発明の図解による説明の一部を成す
ものである。

第１図は本発明の診断装置の垂直断面図であ
る。

第２および３図はかかる診断装置の線２―２に
沿つた断面図であつて、収容手段の各種形態を示
している。

発明の構成および使用方法 本発明の装置および方法は他の生物学的粒子と
特異的な相互作用を行う性質を有する特定の生物
学的粒子の試験液中における濃度を測定するため
に広く適用し得るが、以下の説明においてはヒト
血清中における免疫グロブリンIgGのレベルの測
定に関連して本発明が記載される。なお、ここに
示される装置は例示的なものに過ぎない。たとえ
ば、診断用基体は平面状である必要はないのであ
つて、階段状のものや湾曲したものであつてもよ
い。

互いに向かい合つた不透過性の外壁１１，１２
および平らな上面を有する底部１３を備えたほぼ
溝形のホルダー１０が試験液を保持するために役
立つ。所望ならば側壁（図示せず）を設けること
もできる。外壁１１に沿つて棚１４が形成されて
いるが、これは傾斜した診断用基体（インジウム
層１６ａおよびその上に吸着された精製ヒトIgG
の層１６ｂを有するスライドガラス）１６の下端
を支持するのに役立つ。なお、診断用基体１６の
上端は外壁１２の上部に載つている。図解の都合
上、傾斜の度合は誇張してある。図示の状態にお
いては、スライドガラス（すなわち診断用基体）
１６、外壁１２、底部１３および垂直面１７によ
つてほぼくさび形の容積が規定されることにな
る。

収容手段１８は適当な液体吸収材料（すなわち
多孔質で非反応性の材料）たとえば酢酸セルロー
スから成つている。かかる収容手段（または水分
保持媒体）は接着剤転写テープ１９によつて底部
１３の上面に貼付され、しかも平面図（第２およ
び３図）で見た場合には底部１３の上面に対して
平らに貼付された旋回状または蛇行状の形態を成
すことが好ましい。かかる収容手段は、たとえ
ば、酢酸セルロースまたはセルロースの薄いシー
トから切抜きまたは打抜きによつて容易に得るこ
とができる。あるいはまた、底部１３のくぼみの
中に配置されたゲルによつて収容手段を構成する
こともできる。

両端を棚１４および外壁１２上に載せた状態で
配置されたスライドガラス１６は収容手段１８の
平面に対して小さな角度を成すが、その角度は約
３分から約10度までの範囲内にあることが好まし
い。くさび形の容積を規定するこの角度は比較的
小さいとは言え、（ヒト血清の希釈液である試験
液２１を導入した場合には）層１６ｂの上端およ
び下端の間において抗ヒトIgG分子の到達度に顕
著な差異をもたらすのに十分である。

抗ヒトIgG分子が収容手段１８から試験液２１
中を通つて移動する現象はほぼ純粋な拡散による
ことが好ましい。このような理由により、試験液
２１中における対流を抑制することが必要な場合
もある。そのためには、試験液２１の粘度を十分
に高くすればよい。対流が拡散速度に比べて無視
できる程度に抑制されていれば、収容手段１８の
示す繰返しパターンがはつきりした輪郭を有する
第２の層（図示せず）として層１６ｂ上に複製さ
れる。かかる複製パターンの輪郭がぼやけていれ
ば、先ず最初に試験液２１の粘度を高めることが
試みられる。水溶液の場合、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース溶液またはグリセリン溶液中に
試験液を導入することによつて適当な粘度上昇を
達成することができる。このようにしても輪郭の
ぼやけの問題が解決されなければ、より濃厚な試
料を使用するのがよい。

第２および３図の各々には、繰返しパターンを
成して切抜かれた収容手段１８のただ１枚の断片
を設置したところが示されている。しかるに、所
望に応じて断片の数を増加させ、そしてその各々
に相異なる濃度の抗ヒトIgG血清を吸収させるこ
ともできる。更に別の変形例においては、それら
の断片に相異なる抗ヒト血清を吸収させる一方、
スライドガラス上には直下の断片に関連した生物
学的粒子の層を帯状に設置することもできる。こ
のようにすれば、たとえばIgG、IgMおよびIgA
に関する試験を同時に行うことができる。

現行の一段阻止試験の１種である本発明の方法
を実施する際には、任意所望の形状を成す酢酸セ
ルロース紙の断片が転写テープ１９の使用により
図示のごとく底部１３の上面に貼付される。次い
で、酢酸セルロース紙１８に抗ヒトIgG血清が吸
収させられる。吸収後、余分の抗IgG血清は吸取
紙によつて除去される。IgGレベルを測定すべき
ヒト血清を１％ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース溶液で希釈した後、かかる混合物の少量（た
とえば約0.2ml）が酢酸セルロース紙１８上に直
接に滴下される。最後に、インジウム層１６ａお
よびその上に吸着された精製ヒトIgGの層１６ｂ
を有する平らなスライドガラス１６が図示のごと
くに配置される。すなわち、両端は棚１４および
外壁１２上に載りかつ層１６ｂは下向きとなるよ
うにスライドガラス１６が配置される。スライド
ガラス１６をこのように配置した結果、ヒト血清
の希釈液すなわち試験液２１はくさび形の区域を
形成することになる。なお、予め滴下される試験
液の量はスライドガラス１６とホルダー１０との
間の容積を満たすのに必要な量に等しいか、ある
いはそれより僅かに多いものとする。

抗ヒトIgG血清が酢酸セルロース紙から上記の
くさび形区域内に拡散すると、抗ヒト血清から成
る特異的な抗体が（試験液２１中に存在する限度
までは）ヒトIgG分子と複合し、そのためスライ
ドガラス１６に向かつてそれ以上進むことができ
ない。時間が経てば、くさび形区域内における
IgGの濃度に応じ、十分な量の遊離抗体（すなわ
ち第２の生物学的粒子）が上方へ拡散してIgG層
１６ｂに到達し得る。その結果。抗体は層１６ｂ
の分子と複合して目に見える第２の層を形成す
る。このような現象が最初に起こるのは、くさび
形区域の薄い側の端部（すなわちスライドガラス
１６の下端に近い方の端部）であつて、そこでは
酢酸セルロース紙１８とスライドガラス１６の層
１６ｂとの間に存在するヒトIgGの量が少ないの
である。更に長い時間にわたつて拡散を行わせる
と、複合現象はくさび形区域の厚い側へ向かつて
徐々に進行する。スライドガラスを取除いた後、
それの洗浄および（たとえば送風による）乾燥が
行われる。

診断用基体上における第２の生物学的粒子の層
形成の程度すなわち長さおよび（または）面積を
容易に測定し得るようにするため、たとえば第２
および３図に示されるごとく繰返しパターンを成
すように酢酸セルロース紙１８を切抜くのがよ
い。

棚１４と外壁１２との距離が１インチでありか
つ底部１３の上面から測つた棚１４および外壁１
２の上部の高さがそれぞれ0.010インチおよび
0.020インチであるような第１および２図の構造
の診断装置において、１％ヒドロキシプロピルメ
チルセルロース溶液を用いて調製された対照ヒト
血清の１：100希釈液、インジウム被膜上に配置
された精製IgG分子の層、ウサギから得られた未
希釈の抗ヒトIgG（完全分子）血清、および20分
の拡散時間を使用しながら試験を行つたところ、
スライドガラス１６の全長の約1/2まで可視的な
抗ヒトIgGの層が形成されることが判明してい
る。このような条件下で試験を行えば、0.04〜
0.4mg／mlのIgG濃度が満足すべき精度をもつて再
現可能に測定されるはずである。

かかる試験を行つたところ第２の層が全く認め
られない場合には、患者の血清中におけるIgGレ
ベルが極めて高いことがわかる。そのような場
合、はつきりした定量値を求めるためには、更に
希釈度の高い試料を用いて試験を繰返せばよい。
他方、所定の拡散時間中に酢酸セルロース紙の全
パターンが第２の層として複製された場合には、
患者の血清中におけるIgGレベルが極めて低いこ
とがわかる。そのような場合、はつきりした定量
値を求めるためには一層希薄な抗ヒトIgG血清溶
液を用いて試験を繰返す必要がある。

使用する生物学的粒子溶液の濃度は、特定の生
物学的粒子の問題となる濃度範囲がスライドガラ
ス上に記録されるように選定される。試験の実施
に当つては、通例、（たとえば血清１ml当りの
IgG含量が12mgである）対照血清を用いて最初の
試験を行うことにより正常値が求められる。この
ようにして正常範囲を設定すれば、以後の測定値
をそれとの関係に基づいて考察することができ
る。正常範囲の設定を容易にすため、スライドガ
ラス上に単位目盛を付けることもできる。

ここに記載した診断装置に様々な変形を加え得
ることは容易に理解されよう。たとえば、丁番に
よりスライドガラス１６を棚１４または外壁１２
に取付けることもできるし、あるいは診断用基体
のための独立した支持手段と共に平板状のホルダ
ーを使用することもできる。

最良の実施態様 実験室において本発明の免疫学的試験の実用実
験が行われた。その際には、互いに向かい合つた
棚１４と外壁１２との距離が約１インチでありか
つ底部１３の上面から測つた棚１４および外壁１
２の上部の高さがそれぞれ0.010インチおよび
0.020インチであるような図示のごとき診断装置
が使用された。また、インジウムで被覆してから
IgG層を配置した平面状のスライドガラスおよび
酢酸セルロース紙の断片を貼付した平底のホルダ
ーが使用された。