JPS6333659A - 抗体類、その製造方法と用途およびこれらを含む製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、小分子の結合を第２抗体の結合蛋白によっ
て安定化できる１群の第２抗体、このような第２抗体の
製法、コンペティティブアッセイのような診断テストで
のこれらの使用およびこれらを含有する診断キットに関
する。

私のヨーロッパ特許出願第８５９０１４９５号および同
第８５９０３１９号には、ことに小分子とその第１抗体
のコンプレックスに結合できるが゛小分子またはその第
１抗体の何れかと一方が存在しないときに結合できない
１群の第２抗体を開示している。このヨーロッパ特許出
願の開示をここに参照文献として入れる。ここに新しい
群の第２抗体を発見し、このものは公知の群の第２抗体
の利点の多くを有しかつ容易に製造できるものである。

この発明は、第２抗体が結合蛋白を小分子の存在または
不存在下で結合しうるが、その小分子を結合蛋白の不存
在下で結合し得ない、小分子の結合蛋白への結合を安定
化しうる第２抗体を提供すこのような第２抗体を以下ト
ラッピング抗体”ｔｒａｐｐｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ”と称する。このようなトラッピング抗体は、一般
に、小分子に関して１０’以下（かつ好ましくは１０″
以下）のに値を有し、結合蛋白または小分子と結合蛋白
のコンプレックスに関して少なくともｔｏ’　（好まし
くは１０＠）のに値を有する。

結合蛋白は、小分子を結合し、その結合が小分子に特異
的であるのが好ましい、抗体、酵素または他のレセプタ
である。抗体は、モノクロナールまたはポリクロナール
である。モノクロナール抗体は、使用における均一性か
ら好ましいが、ポリクロナール抗体は製法の容易さの点
で大きな利点がある。抗体は完全イミノグロブリンまた
は結合能を保持するそのフラグメント（たとえばＦａｂ
あるいはＦ（ａｂ’）ｔ）である。酵素は、ジヒドロホ
レート　リダクターゼのような結合酵素である。他のレ
セプタ類にはホルモンレセプタなどが含まれる。結合蛋
白は小分子を結合する材料の点で均一の製品が好ましい
。酵素に結合する小分子の適切な例としては、ジヒドロ
ホレート　レダクターゼに結合するメトトレキサートが
ある。

この発明に使用する結合蛋白は抗体が最も適し、モノク
ロナール抗体が最も好ましい。従って好ましい具体例に
よればこの発明は、第２抗体が小分子の存在又は不存在
下に第１モノクロナール抗体を結合しうるか、第１モノ
クロナール抗体の不存在下で小分子を結合し得ない、小
分子の第１モノクロナール抗体への結合を安定化しうる
第２抗体を提供するものである。

トラッピング抗体はポリクロナール又はモノクロナール
であってもよいが、モノクロナールが好ましい。トラッ
ピング抗体は、その結合能を保持する限り、抗体フラグ
メント（Ｆａｂ又はＦ（ａｂつ、フラグメント）であっ
てもよい。第１モノクロナール抗体は、またＦａｂ又は
Ｆ（ａｂ’）＊フラグメントのような抗体フラグメント
でもよい。

小分子は、分子量、たとえば１００〜１５００、より適
切には１２０〜１２００、望ましくは２００〜１０００
を有するものである。小分子はステロイド、医薬、乱用
の薬物、アミノ酸、ペプチッド、カルナチン、炭水化物
、環境汚染物などが適する。より適切な小分子としては
、プロゲステロン、エストラジオール、エストラトリオ
ール、エストロン硫酸塩、ハイドロコルチゾン、コルチ
ゾン、テストステロン、エストラゲンなどのようなステ
ロイドである。池のより適切な小分子としては、チオフ
ィリン、ジゴキシンのような医薬、ゲンタミシンのよう
なアミノグリコシド系抗生物質がある。また他の適切な
小分子としては、モルヒネ、コカインなどのような乱用
の薬物がある。

トラッピング抗体は、小分子、ことにアッセインする小
分子（ステロイド、医薬、乱用の薬物など）に関連した
構造のもののような干渉物質を含まないものを用いるの
が最も適する。ポリクロナール　トラッピング抗体は、
少量のポリクロナール重複抗体（前記のヨーロッパ特許
出願の明細書参照）で汚染されていることがよくあるが
、これは一般に問題とならず、何れにしても、このよう
な汚染物は適当な選択技術を用いて防ぐことができる（
同じくヨーロッパ特許出願の明細書参照）。

トラッピング抗体は固体であるのが最も適する。

トラッピング抗体は凍結乾燥固体の形が望ましい。

トラッピング抗体は密閉容器で提供するのが望ましい。

この発明のトラリビング抗体は前記のヨーロッパ特許出
願中に開示の方法で作ることができるが、抗体選択方法
を第１抗体に結合し、かつ小分子の第１モノクロナール
抗体への結合を安定化する抗体を選択するのに変更され
る。

小分子とその第１モノクロナール抗体間の結合を例証す
る何れの選択方法も使用できる。たとえば、平衡を示す
方法、コンプレックスのトラッピング抗体と及びそれな
しでの安定性を示す方法がある。

選択の適切な方法としては、抗体を抗血清から分離する
ことからなり、それを用いる方法としては次のものがあ
る。第１モノクロナール抗体を、マイクロ滴定用くぼみ
付ストリップ（ｗｅｌｌ　５ｔｒｉｌ））のくぼみに結
合される（このストリップは、各くぼみが切りとりでき
るような１列のくぼみを形成されており、適切なシンチ
レイション用液体と既知の放射能を含有する標準シンチ
レイション用バイアルに入れられている）。くぼみの全
部に、標準量の放射能をラベルした小分子を加える。次
いで、くぼみの半分に、標準量のテスト抗体製品を加え
、残りの半分の（ぼみに、無関係の抗原での免疫由来の
対照抗体製品を加える。次いで、これらのくぼみを、未
ラベルの小分子の大過剰（くぼみにおける小分子結合蛋
白量に対して）を含有する溶液で満たす。これがゼロ時
で、■セットのくぼみを直ちに取り、振とう・洗浄して
未結合の内容物を除去する。各セット時（たとえば１０
分のインターバル）で、各セットのくぼみを同様に処理
する。くぼみ中に保持された放射能を測定し、結果をプ
ロットする。これは添加した抗体（もし存在すれば）の
効果を示す。放射能カウントの増加を示すプロットが、
原抗血清中のトラッピング抗体の存在を示すものである
。モノクロナール製品中のトラッピ〉グ抗体の存在が同
様にして例証できる。適当な抗血清又は製品がトラッピ
ング抗体のソースとして使用できる。

常法により、適当な抗血清又は製品から、固形及び／又
は精製した抗体を得ることができる。

この発明のトラッピング抗体は、小分子を定性又は定量
測定する方法に使用できる。測定法としては、通常コン
ペティティブ　アッセイであって、検出しうる小分子を
用いるものが望ましい。小分子は、同位元素的にラベル
化、たとえばラジオアイソトープや、核又は電子スピン
（たとえばｎｍｒまたはｅｓｒ）で検出しうるアイソト
ープでラベル化されることにより検出するのが好ましい
。

望ましい観点によれば、この発明は、この発明のトラッ
ピング抗体をコンペティティブ　アッセイに使用し、そ
こで小分子が同位元素的にラベル化されていることから
なる小分子の定量的測定法を提供するものである。

トラッピング抗体は、小分子のその第１モノクロナール
抗体への結合を安定化し、それにより高いシグナルを与
える。これは、洗浄などへの安定性が改善されたことに
よるものといえる。

測定は、水溶液中、通常の極端ではない条件下、たとえ
ば２℃〜５６℃、より普通には４℃〜４０℃、望ましく
は１０℃〜３７℃、好ましくは常温で行うのが普通であ
る。使用ｐＨは一般に４〜ＩＯで、５〜９がより適し、
はぼ中性のｐ）ｌが好ましい。

このようなテストでは、一般に、測定されるサンプルを
第１モノクロナール抗体にさらす。同時又は続いて、同
位元素でラベル化した小分子を加え、混合物を培養し、
トラッピング抗体を加え、混合物を培養し、結合したラ
ベル化小分子を未結合の小分子から分離し、結合及び／
又は未結合の放射能量を測定することからなる。標準サ
ンプル（調整及び比較用）について同様な操作を行う。

また、あまり望ましくはないが、トラッピング抗体を、
ラベル化小分子と同時に加えることができる。

結合した放射能ラベル化小分子の分離は、第１モノクロ
ナール抗体が表面に結合されているためであって、液体
を固相から分離するか、又は沈澱法で、たとえば沈澱す
る抗体を加え、液体が固相から分離することにより行わ
れる。

このような方法では、小分子は、同位元素的にラベル化
されているのが最も適し、その例としては、トリチウム
Ｃｌ　４でラベル化したステロイドがある。

分子の測定用に多くのコンペティティプ　アッセイが知
られている。これらの系の多くが有効であるが、一般に
、これをより有効にすることが得策であろう。ここに、
感度、範囲、スピードや特異性についての改良が提供さ
れる１つの方法を見出した。加えて、この新しい方法は
、小分子を特に望ましいやり方でアッセイする機会を提
供するものである。

従って、この発明は、 ａ）測定すべき小分子のサンプルとある量のラベル化小
分子を、その小分子のレセプタに、レセプタへのコンペ
ティションが起るように導入し、ｂ）結合したラベル化
小分子を未結合のラベル化小分子から分離し、 Ｃ）結合又は結合されていないラベル化小分子のフラク
ションを測定することからなり、ｄ）トラッピング抗体
を、小分子及びラベル化小分子のレセプタへの結合を改
良するのに用いることを特徴とする、 小分子のコンペティティブ　アッセイを提供するもので
ある。

ここで使用した用語“コンペティティブ　アッセイ（ｃ
ｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ａｓｓａｙ）　”とは、小分子
とラベル化小分子がレセプタに競合し、レセプタに結合
されたラベル化小分子の量が、測定すべき小分子の量を
示すのに用いられるアッセイを意味する。

このようなアッセイでは、小分子とラベル化小分子間の
競合は、同時に、続いて又は共にであってもよく、結合
されたラベル化小分子の量は、結合したラベル化小分子
又は結合しなかったラベル化小分子を測定することによ
って分かる。このように用語“コンペティティプ　アッ
セイ”を用いることは普通のことである。“レセプタ”
は、前に示したような何れの結合蛋白でもよい。レセプ
タは抗体であるのが最も適し、モノクロナール抗体が好
ましい。抗体は、完全イミノグロブリン又はそのフラグ
メントでもよい。

結合又は未結合のラベル化小分子の何れか又は両者が測
定できる。これは、相分離後に行うのが普通である。

小分子に適用するラベルは、ラベル化小分子が小分子の
レセプタへの競合を妨げないものであればよい。従って
、たとえば、酵素ラベル、蛍光ラベル、化学発光ラベル
、コエンチーム　ラベル及びアイソトープラベルが考え
られる。

この発明に使用されるラベル化小分子に用いるアイソト
ープラベルは、検出できるものであれば何れでもよく、
たとえば放射性崩壊により、その核スピン又は電子スピ
ン（天然又は誘因の何れか）により、磁気モーメントに
より検出できるものであればよい。

特に適切なアイソトープラベルは、小分子の１つの元素
を、異なる原子価の同じ元素で置換したものである。

他の特に適切なアイソトープラベル化は、小分子の１つ
の元素を化学的に別の元素、たとえば水素をフッ素又は
塩素で置換したものが含まれる。

放射能崩壊により検出できるアイソトープラベルとして
は、Ｈ３とＣ１４が含まれる。

Ｈ３やＣ１４のようなラベルを用いる利点は、これらが
実験室でよく使用されるものであることから理解される
であろう。この検出法は、自動アッセイ法を容易に採用
できること及びラベル化小分子が未ラベル化小分子と正
確に同じ様にレセプタに競合するという利点がある。

この発明のラベル化す−ガントに用いる酵素ラベルは、
その酵素活性のため測定しうるシグナルを生じうるちの
であればよい。この目的に使用される代表的な酵素には
、ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼなどが含まれる。当業者は、このような酵素類が
ラベルとして広く用いられていることに気付くであろう
。酵素は、普通の方法、たとえば、共有結合により、抗
体やＦａｂフラグメントのようなその成分のごときリー
ガントに結合される材料とのコンプレックス形成により
、リーガントに結合できる。

ラベルとして用いる発蛍光団としては、古典的な発蛍光
団や、オイロピウムキレート発蛍光団のようなランサナ
イドベースの発蛍光団が適する。

ラベルとして用いる化学発光剤としては、古典的なルミ
ナール誘導体や最近のアリールアクリジニウムエステル
ラベルが適する。

補因子ラベルとしては、酵素補てんグループとして使用
できるフラビンアデニン　ジヌクレオチド、ニコチンア
ミド　アデニン　ジヌクレオチド及び類似のグループが
含まれる。特に好ましい観点によれば、この発明は、 ａ）測定すべき小分子のサンプルとある量のラベル化小
分子をモノクロナール抗体と競合を起すようにその小分
子に対するモノクロナール抗体に導入し、 ｂ）結合したラベル化小分子を未結合のラベル化小分子
から分離し、 Ｃ）結合又は未結合のラベル化小分子のフラクションを
測定することからなり ｄ）トラッピング抗体を小分子とラベル化小分子のモノ
クロナール抗体への結合を改良するのに用いることを特
徴とする、 小分子のコンペティティブ　アッセイを提供する。

トラッピング抗体は、コンペティティブ　アッセイ小分
子又はラベル化小分子のレセプタへの結合の改良を望む
何れの工程に用いてもよい。しかし、トラッピング抗体
は、小分子とラベル化小分子の競合が行われた後に使用
することが好ましい。

かくして、好ましい観点によれば、この発明は、ｉ）測
定すべき小分子のサンプルとある量のラベル化小分子を
、モノクロナール抗体と競合を起すように、その小分子
に対するモノクロナール抗体に導入し、 １ｉ））ラッピング抗体を、小分子とラベル化小分子の
モノクロナール抗体への結合を改良すべく導入し、 １ｉｉ）結合したラベル化小分子を未結合のラベル化小
分子から分離し、かつ ｉｖ）結合又は未結合のラベル化小分子のフラクション
を測定する ことからなる小分子のコンペティティプ　アッセイを提
供する。

小分子及びラベル化小分子は、先にコンペティション工
程で示したように、同時に又は続いてレセプタに導入で
きる。ラベル化小分子の添加前に、サンプルを加えるの
が好ましい。コンペティション工程は、コンペティティ
ブ　アッセイでよく知られているように２〜３秒から何
時間も要するが、数秒から２〜３時間のような短い時間
、一般に１５〜１時間、より普通には３０〜２０分、た
とえば１〜１０分が好ましい。

トラッピング抗体は、コンペティションをさせる期間の
終わりに導入するのが適する。原モノクロナール抗体の
ほとんど、好ましくは実質的に全部を飽和（小分子レセ
プタに関して）するのに十分なトラッピング抗体を加え
るのが普通である。

この工程は２〜３秒から何時間も行うことができるが、
数秒から２〜３時間を用いるのが最も適切で、一般に１
５秒〜１時間、より普通には３０秒〜２０分たとえば１
〜１０分がこのトラッピング工程に用いるのがよいと考
える。トラッピング抗体を多く用いれば用いる程、培養
期間はより短くなるのが一般である。

コンペティション及びトラッピング工程は共に、通常の
生理的条件下、たとえば２℃〜５６℃、より普通には４
℃〜４０℃で行うことができる。トラッピングには４℃
のような低温を用いるのが有利なことが証明されたが、
１０℃〜３７℃でもよく室温が適温で簡便なものとして
よく用いられる。使用ｐＨは４〜１０が普通で、５〜９
がより適切で、はぼ中性が好ましい。所望により、緩衝
液や張度調整剤を用いることができ、これらは通常のも
のが適用できる。

所望によりアッセイ中に使用される洗浄液中にトラッピ
ング抗体を存在させてもよい。これは固定化に関して多
くの利点があると思われる。

結合及び未結合ラベル化小分子の分離は、通常の方法、
たとえば、結合したラベル化小分子を固体に固定化する
ことにより行うことができる。固体としては、チューブ
のような容器やプレートのくぼみの表面であってもよく
、また固体は、ろ過しうる粒子、遠心分離しうる粒子、
又はより望ましくは磁性粒子などのような粒子を媒体に
懸濁したものであってもよい。モノクロナール抗体は表
面に固定されるのが適し、ラベル化小分子は固定化され
たモノクロナール抗体に結合するため固定化されること
になる。これか当該分野での常法で周知のものである。

このようにして、結合及び未結合のラベル化小分子は粒
状媒体を固形表面から分離することにより分けることが
できる。検出法を用いれば、固定化した成分と遊離成分
が分かる。

表面に及び又は小分子に会合したラベル量が測定できる
。

所望により未結合ラベルを固形表面からの洗浄に使用す
る洗浄液にトラッピング抗体を含めてもよい。

この発明のトラッピング抗体を使用することによる利点
は、アッセイの洗浄工程があまり重要でなくなることで
ある。

この発明のトラッピング抗体は、小分子とその結合蛋白
のコンプレックスを形成させ、そのコンプレックスを抗
体を生ずるのに用い、トラッピング抗体を選択すること
によって得ることができる。

選択法は上記の通りである。

所望により抗体を生ずるのに、繰り返し免疫を使用して
もよい。ある場合には、結合蛋白を投与すれば十分であ
るが、一般には、たとえば、小分子と結合蛋白とを水性
の溶液又は懸濁液中で、任意に緩衝液及び任意に界面活
性剤を加えて、十分に混合することによりコンプレック
スを予め形成さすのが好ましい。

上記したように、私の先願であるヨーロッパ特許出願（
及び米国出願第１１０３１３７及び８３２７１０号）を
参照としてここに入れる。

（以下余白） 実施例１ ウサギの広く毛を剃った背中に次の混合物を多重の皮内
注射して（片側２０）免疫性を与えた。

５０ｍＭ）リス緩衝液ｐＨ７，４２ＱＯμｉ２中抗工ス
トラジオール単クローン性抗体（プロティンＡを含むカ
ラムアフィニティークロマトグラフィによる通常の精製
法により精製した免疫グロブリン、ＩｇＧ）を同緩衝液
８００ｕ（！ウェストラジオール５０μｇと混合し、室
温（２２℃）で３０分間培養し、ついでこの混合物を同
量（１ｍ＋２）の完全フロイント　アジュバントと乳化
して油中水型の乳剤とした混合物。１２日後、この動物
の背中の皮下注射１０個の間に、さらにエストラジオー
ル２００μｇ単独のトリス緩衝液を分注対した。さらに
１０日後、次の混合物ニドリス緩衝液１００μＱ中に同
じ抗エストラジオール単りローン性抗体１００μｇとト
リス緩衝液８００μＱ中エストラジオール８００μＱと
を混合し、室温で３０分間培養し、ついで不完全フロイ
ンドアジュバント９００μｅと乳化した混合物を（側腹
部へ）筋肉注射して追加抗原刺激を行った。

トラッピング抗体を得るためにこのウサギから次の上う
に採血した： ブリードト・・・・・最初の注射から７日後；ブリード
２・・・・・・二番目の注射から７８後ニブリード３・
・・・・・三番目の注射から７日後。

大要では、この測定は次のように行われた：第一の抗エ
ストラジオール単りローン性抗体をプラスチックのウェ
ルに吸収させた。ついでこのウェルに、ラベルしたエス
トラジオールと（上記血液又は予め免疫された血液のい
ずれかの）抗血清の一定量を入れた。全ウェルを溶媒な
しで振とうし、洗浄して、冷却した（ラベルしていない
）エストラジオールを加えた。

“ゼロ　タイム°ウェルを直ちに溶媒なしで振とうし、
４回洗浄した。ついで各ウェルの中に残っている、ラベ
ルしたエストラジオールをシンチレーションカウンター
により測定した。さらに次の１時間中、ウェルでは第一
抗体からラベルしたエストラジオールの分離速度が同様
に測定された。

実施例の条件は次のとおりである：５０ｍＭ炭酸水素塩
緩衝液ｐＨ９，６中、第一の抗エストラジオール単クロ
ーン抗体２００μＱを一連のリムーバウェルストリップ
（イムノン２．ダイナチック　ラボラトリ−社製）の各
ウェル中に入れ、３７℃で２時間培養した。ついでこの
溶液を除去し、室温で１時間、０．２％ＢＳＡの同緩衝
液２００μｇでウェルをおおった。覆った溶液を除去し
、このウェルを０．２％ＢＳＡと０．０２％ツイーン２
０　（ＴＢＴ）を含む、５０ｍＭ）リス緩衝液ｐｉ（７
，４で４回洗浄した。

５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７，４中ラベルしたエストラ
ジオール１８０μ（ｌ　（１００，［１１００ｃｐ、ア
メルシャム　インターナショナル　ピーエルシー社製、
２．４．６．７゜−３Ｈエストラジオール　チーアール
ケイ、３２２９５　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とウェルを室温で
１時間培養した。

プレーブリード（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）血清２０ｕＱを
１連（１２）のウェルに加えるか又はトリス緩衝液、つ
づいてテストされるべき抗血清、各々１０μｅを一連の
各ウェルにいれた。ついでこれを室温でさらに１時間培
養した。溶液を振り出し、ウェルを４回ＴＢＴで洗浄し
た。ついで、トリス緩衝液中ラベルしてないエストラジ
オール１００μＱ／ｍＱを２００μｅ加えて、１時間培
養し、内容物を振り出し、ウェルを４回ＴＢＴで洗浄し
た。ついで各ウェルを液体シンチレータ−５ｍＱを含む
シンチレーション　バイアルに入れ、そのトリチウム含
量を測定した。

その結果は第１表に示す通りであり、複合体の保護をも
たらす抗血清の増加力を示す。

第１表 試　料　　　カウント プレーブリード　　２５０ ブリード　１　　３２０ ブリード　２　　５２０ ブリード　３　　６３０ ブリード３のトラッピング抗体をプロティンＡカラムク
ロマトグラフィーで精製した。

実施例２　抗エストラジオールトラッピング抗体ミクロ
滴定用ウェル　ストリップ　ダイナチック　イムロンＩ
Ｉ　（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　１ｍｉ＋ｕｌｏｎ）を（エス
トラジオールとＢＳＡの複合体に対して通常の方法で製
した）抗エストラジオール単クローン抗体で覆い、各ウ
ェルの中に５０ｍＭ炭酸水素塩緩衝液ｐＨ９，６中抗体
ｌμｇを含む溶液２００μＱを入れて、３７℃で２時間
放置した。ついでこの溶液を振り出し、０．２％カゼイ
ン含有の同じ緩衝液を入れ、室温（２１’Ｃ）でさらに
１時間放置した。ついでウェルを０．０２％ツイーン２
０を含む５０ｍＭ）リスｐＨ７，４で４回洗浄した。エ
ストラジオール５０μｇ　／ｍＱを含む標準溶液を５０
ｍＭ０ｍＭトリスル、４で作製した。

この溶液０〜ｌμｇまでの濃度範囲のものを作り、この
菌液１８０μぐを各ウェルに加えた。このウェルを室温
で３０分間培養した。ついでトリチウム化エストラジオ
ール（２，４，６，７−３Ｈエストラジオール９５　Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ　　ＴＲＫ、　３２２．バッチ（Ｂａｔｃ
ｈ）７５アメルシヤム　インターナショナル社製）を０
．１μｃｉ　（約１００，０００ｃｐ＋ｍ）含有の２０
ａＱずつ各ウエルに加えた。ついでトラッピング抗体（
抗血清から、実施例１の通常のプロティンＡ吸収により
精製したＩ　ｇＧ）を各ウェルに加えた後、各ウェルを
室温で１５分間培養した。同様に一連のウェルに無関係
抗体１０μｅを入れ、このウェルを室温で１時間培養し
た。溶液を振り出し、ウェルを０．０２％ツイーン２０
を含む５０ｍＭ）リスｐＨ７、４で２回洗浄した。つい
で、５０ｍＭ）リスｐＨ７，４の２００μｆ２中ラベル
してないニステラジオール１０μｇを各ウェルに加え、
このウェルを室温で３０分間培養した。溶液を振り出し
、各ウェルを、０．０２％ツイーン２０を含む５０ｍＭ
）リスｐＨ７，４で４回洗浄した。ついでこのウェルを
互いに分離し、液体を含むシンチレーションバイアルの
中に入れて放射能を測定した。

トラッピング抗体を有するものと、有しないものの結果
を第２表に示す。トラッピング抗体の付加はラベルした
物質の結合量を大きくし、定量法の特徴を改良する標準
曲線の匂配を急にした。この差は特に低分子量の低濃度
で著しい。

第２表 １μｇ　　　　　　　　　　１２０　　　１６２１００
ｎｇ　　　　　　　　　　１６８　　　３５０Ｌｏｎｇ
　　　　　　　　　　３５５　　　４９８１ｎｇ　　　
　　　　　　　４８１　　　８０５ｔｏｏｐｇ　　　　
　　　　　　５４６　　　−１０ｐｇ　　　　　　　　
　　５６０　　　８４８ｔｐｇ　　　　　　　　　　６
１０　　　９３２実施例３ 抗プロゲステロントラッピングファクターウサギを次の
ように免疫にした：広い面積の毛を剃った背中（片側２
０）につぎの混合物を多重皮内注射した。−プロゲステ
ロン２．５ｍｇを含む不完全フロイント　アジュバント
１ｍ（（溶けるまで振とう）を腹水１００μσ中、単り
ローン性抗プロゲステロン抗体１０ｊ）ｇ　ｇで乳化し
、５０ｍＭ）リスｐＨ７，４の１ｍ（２で油中水型乳剤
にした。

この２ケ月後、さらに完全フロイント　アジュバント０
　、７５　ｍ　Ｑ中プロゲステロン２００μｇと食塩水
含有の燐酸塩緩衝液０　、７５　ｍ　Ｑ牛革りローン性
抗体１００μｇを一緒にして、その０．５ｍＱをこの動
物の１足祉と各腹側部に筋肉注射した。１０日後、不完
全フロイント　アジュバント２００μＱ中プロゲステロ
ンエ００μｇとＰ　Ｂ　Ｓ　２００μｅ中モノクロ一ン
体２５０μｇを一緒にして腋窩のリンパ結節の領域に注
射した。

トラッピング抗体を得るためにウサギから次のように採
血したニ ブリードロー免疫に先立って予め採血した、ブリード１
−最初の注射から１４日後、ブリード２−最初の注射か
ら５週間後（次に使用せずブリード３−最初の注射から
７週間後、ブリード４−３番目の注射後すぐ（次に使用
せず）、ブリード５−３番目の注射から７日後、ブリー
ド６−３番目の注射から１４日後。

トラッピング抗体の測定のアウトラインは次のようにし
て行った。プロゲステロンに対する第１モノクローナル
抗体はプラスチックのウェル（Ｗｅｌｌ）上に吸着させ
た。このウェルに所定員のラベル化プロゲステロンと抗
血清（上記ブリード、予め免疫されたブリード又は無関
係（ｕｎｒｅｌａｔｅａ）の免疫コンプレックスで免疫
されたラビットからのブリード、からのもの）を入れた
。すべてのウェルを振盪して溶液を除去し、洗浄し、コ
ールドな（ラベル化されていない）プロゲストロンを加
えた。

「ゼロ時間」ウェルを次いで速やかに振盪して溶液除去
し、水で４回洗浄した。各ウェルについて残存するラベ
ル化プロゲステロンをシンチレーションカウントにより
測定した。以後１時間に亘ってさらにウェルを同様に処
理して、第１抗体から）のラベル化プロゲステロンの分
離速度を測定した。

実施例の条件は次のとおりである。プロゲステロンに対
する第１モノクローナル抗体（２００μｇ）を含むｐＨ
９，６の５０ｍＭ重炭酸塩バッファを、ウェル除去スト
リップ（ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ　５ｔｒｉｐ）　　（Ｉ
　ｍｍｕｎｏｎ２　：　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ製）の一系列の各ウェルに入れ、室温で
一晩インキユベートした。

この溶液を除去し、ウェルを０．０２％のツイーン２０
を含むｐＨ７，４の５０ｍＭ）リスバッファ（以下ＴＴ
）で４回洗浄した。１９０μＱのラベル化プロゲステロ
ン（１１０００００ｃｐ　；　Ａ’ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉ
　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｉｅ、　１，２．６．
７，３ＨプロゲステロンＴＲＫ４Ｌ３９１Ｃｉ／ＩＩ１
ｍｏ　Ｌ　）を含むｐＨ７，４の５０ａＩＭ）リスバッ
ファを加え、このウェルを室温で３０分インキュベート
した。

各抗血清の１０μｇをウェルの系列（１２）に各々加え
た。

これらを室温でさらに１時間インキュベートした。

溶液を振盪除去し、ウェルを前記ＴＴで４回洗浄した。

トリスバッファ１０ｍｆ２中にプロゲステロン５ｍｇを
加えこの混合液を６０℃で１時間振盪培養して作ったプ
ロゲステロンの飽和溶液２００μＱを次いで加え、３０
分インキュベートした。このウェルを各ストリップから
分離し内容物を振盪除去し、ＴＴで４回洗浄した。個々
のウェルをシンチレーション液（５ｍｅ）を含む別々の
シンチレーションバイアルに入れ、それらのトリチウム
含量を測定した。

結果は第３表に示されるようであり、プロゲステロンと
抗プロゲステロンとのコンプレックスを保護するための
抗血清の増加された力（ｉｎ　ｃｒｅａｓｅｄ　ｐｏｗ
ｅｒ）を示している。これらの力（ｐｏｗｅｒ）によっ
て、プロゲステロンとプロゲステロンに対する異なるー
モノクローナル抗体との結合を保護する保護率を検査し
た時に、保護的影響は観察されなかった。

第３表 試　料　　　　　　　カウント コントロール（平均）４０ ブリード１２１０ ブリード３３００ ブリード５３２５ ブリード６６５０ ブリード６は、引続いて、プロティンＡクロマトグラフ
ィによって、単離され凍結乾燥されるプロゲステロンに
対するトラッピング抗体の調製に用いた。精製された固
型のトラッピング抗体（Ｌｏｎｇ）をバッファ（０，１
％のカゼインを含むＰＨ７，４の５０ｍＭトリスバッフ
ァ）１００−に溶解し、バイアル１００に分散した。バ
イアルの内容物を凍結乾燥しバイアルをキャップした。

実施例４ エストラジオールに対する精製されたトラッピング抗体 抗血清５ｄをとり、２５℃下、硫酸ナトリウム溶液（硫
酸ナトリウム１８％）に調製し３０分放置した。

沈澱が形成し、これを遠心分離で採り、蒸留水２．５ａ
＋ｆ２に溶解した。次いで、２７％の硫酸ナトリウム溶
液を加えた（溶液中に硫酸ナトリウムが１４％となるよ
うに）。これを２５℃下３０分放置し、得られた沈澱物
を遠心分離で採り、次いで蒸留水１．５ｍ（に溶解した
。この溶液を次いでリン酸でバッファ化された塩水（ｐ
Ｈ８）に対して２日間透析した。

プロティンＡ（セファローズ　０Ｌ−４Ｂ）の５ｍ１２
カラムを作製し、リン酸でバッファ化された塩水（ｐＨ
８）で平衡させた。透析からの溶液の１７５をゆっくり
とカラムに入れこのカラムを、５０ｍ１２のリン酸塩バ
ッファ（ｐＨ８）で洗浄した。抗体は１Ｍの酢酸溶液で
溶出し、カラムからのフラクションについてプロティン
含量（２８０ｎｍ）とトラッピング抗体の量（エストラ
ジオール及びその第１モノクローナル抗体を安定化する
能力によって）を検査した。透析物の残りも同様に処理
した。

これらを、予め第１の抗エストラジオールが常法により
過剰量結合されたサイオゲン　プロミド（ｃｙｏｇｅｎ
　ｂｒｏａ＋１ｄｅ）活性化セファ０−ズ４Ｂ（ファー
マシア）のカラム（２０ｍｉ２）に供して更に精製した
。このカラムを５０ａ＋Ｍのトリスバッファー塩水でプ
ロティンの溶出がなくなるまで洗浄し、次いでトラッピ
ング抗体を酸性下で溶出させ、ｐＨ７，６の２００＋ｎ
Ｍ）リスバッファを添加して中和した。

トラッピング抗体を含むフラクションをプールし、凍結
乾燥して、固体のトラッピング抗体を得た（プロゲステ
ロンのような他の小さな分子に対するトラッピング抗体
は同様にして得ることができる）。（プロティンＡの代
わりにＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィを用いるこ
とができる）実施例５ メトトレキセートに対するトラッピング抗体ジヒドロ葉
酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）（５μｇ）を１００μｇの
メトトレキセート含有の４ｍＱのリン酸緩衝塩水（Ｐ　
Ｂ　Ｓ　）と混合し、得られた混合物について、２Ｑの
ＰＢＳに対する４℃８時間の透析を２回行った。透析液
を４ｍＱの完全フロインドアジュバントで懸濁させ、そ
の液を４回筋肉内注射することによってヒツジを免疫化
するのに用いた。１ケ月後にこの動物に同じシリーズの
注射をしたがこの時は不完全フロインドアジュバントを
用いた。

さらに１ケ月後、最終の免疫化を行ったが、この時はア
ジュバントを添加しなかった。抗血清が得られ、ＩｇＧ
フラクションが硫酸ナトリウム沈澱法で得られた。

ＤＨＰＲ（１ｍｇ）　、メトトレキセート（２５μｇ）
、上記のヒツジの第１免疫化後に得られ？：ＩｇＣ抗体
（５ｍｇ）を含有する２ｍ１２のＰＢＳを、同量の完全
フロインドアジュバントで懸濁させ、これでウサギを免
疫化した。その動物から１ケ月後に採血し、その血液か
ら抗血清を作製した。

高度に精製されたＤＨＰＲのＰＢＳ溶液（１００μｇ／
ｍｆ２）を作製し、そのＬＯｕＱを、ＩＱＱ、０００ｃ
ｐｍの３゛。

５−．７−３Ｈメトトレキセート（アマ−ジャム・イン
ターナショナル・カタログ番号ＴＲＫ２２４）含有の１
００μｅのＰＢＳに添加、した。この液に、被検物の免
疫グロブリンもしくは抗血清の１０μＱを添加し、次い
で標識をつけていないメトトレキセートの溶液（ｔｍｇ
／ｌＩｌ＆）の１ｏｏｕ１２を混合した。この時がゼロ
タイムであった。一部を採取しその混合物を室温（２１
’Ｃ）に保持し、次いで１０μｅづつ採取した。

採取後直ちに各採取液を、ＰＢＳと平衡にしたセファデ
ックスＧ２Ｓカラム（約５ｍ（！　）に入れ、次いで溶
出液中の蛋白フラクションと結合して残っている放射能
を測定した。メトトレキセートのＤＨＰＲとの結合を安
定化する添加された抗体の性能を示すグラフを作成した
。

第４表は、塩で分画したヒツジＩｇＧで達成された安定
化の結果を示す。第５表は免疫化されたウサギから得た
抗血清で達成された安定化の結果を示す。

実施例６ エストラジオールに対するモノクロナル抗体ｌμｇを各
ウェル中で２００μＱの５０ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ９
，６）に室温（２１℃）で−夜浸すことによって、グイ
アンチック社（Ｄ　ｙａｎｔｅｃｋ）から入手した微量
分析ストリップ〔インムノンＩＩ　（Ｉ　ｉ＋ｍｕｎｏ
ｎ）〕を、前記抗体で被覆した。次いでウェルを０．２
％カゼイン含有の５０ｍＭｐＨ７，４（Ｔ　７．４）緩
衝液からなるグレージング溶液で４回洗浄し、次いで最
後にＴ７．４液だけで洗った。

次Ｎ）で濃度が１０μｇ１ｍＱ〜ｌｏｆｇ／ｍＱのエス
トラジオールのＴ７．４による標準溶液を作製し、それ
ぞれを１８０μＱづつ別々のウェルに添加しく第１ステ
ツプ）、室温で３０分間培養することによって標準曲線
を作成した。次いでトリチウム化（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ
）エストラジオール（１００、０００ｃｐｍ含有）のＬ
Ｏｕ（ｌを各ウェルに混合してその混合物をさらに１５
分間室温で培養し、その後ｌＯμＱのトラッピング抗体
を混合しその混合液を１時間室温で培養した。この抗体
を、過剰のエストラジオールを混合したモノクロナル抗
体でウサギを繰り返し免疫化することによって生成させ
た。培養後ウェルの内容物を除き、ウェルをＴ７．４で
２回洗い、次にエストラジオールのＴ７．４による飽和
溶液２００μＱを全ウェルに添加した。それらを室温で
３０分間培養し、次いで０．０２％ツイーン２０　（Ｔ
ｗｅｅｎ　２０）含有のＴＴ、４で４回洗浄した。次に
個々のウェルを分離し、バイアルビンに入ったシンチレ
ーション液内にいれてシンチレーション計数することに
よって、それぞれの放射能Ｉを測定した。次に保持され
た放射能と添加したエストラジオール標準の量との間の
関係を示す標準曲線を作成した。

未知の試料を同じプロトコールを用いて分析したが、前
記第１ステツプでの標準品を添加する代わりに、その試
料を添加した。その試料が含有するエストラジオールの
濃度は、標準曲線を用い、それらウェル内に保持された
放射能の量をエストラジオールの濃度に関連させること
によって得られた。

実施例７ エストラジオールに対するモノクロナル・トラッピング
抗体 １００μｇエストラジオールと混合した、エストラジオ
ールに対する第１モノクロナル抗体の１００μｇを繰返
し腹腔注射することによってマウスを免疫化したが、第
１免疫化の際には完全フロインドアジュバント中に懸濁
させ、第２免疫化の際には不完全フロインドアジュバン
トを用い、それ以後の注射の際にはアジュバントを用い
なかった。最後の注射をしてから３日後、動物の膵臓を
取り出して、セルラインＡｇ８’ｉ用いる標準技術によ
ってハイブリドーマを作製した。

そのハイブリドーマを次のような２段法によってスクリ
ーニングする。

第１ステツプとして、Ｎ　ｕｎｃの微量滴定プレートの
ウェルを、親和性で単離されたヒツジ抗−μ抗体〔シグ
マ・ケミカル・カンパニイ・リミテッド（Ｓ　ｉｇｍａ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ　Ｌ　ｔｄ）　ロンドン、１
９８６年、カタログ番号Ｍ１１４７）　１Ｂｇづつ含有
している５０ＬＩＩＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）で、
−夜室温に放置することによってコートした。溶液を除
き、０．２％カゼイン含有の同じ緩衝液１５０μＱづつ
でウェルをグレイズした。その液を３０分間ウェル中に
残しておき、次いで０．０２％のツイーン２０含有の５
０ａ＋ＭトリスｐＨ７，４（ＴＴ）で洗った。次に被検
培養液の１００μｇをウェル内に置いて室温でさらに１
時間培養した。次いで溶液を除き、ウェルをＴＴで洗っ
た。１ＢｇのマウスＩｇＭ（シグマ・ケミカル・カンパ
ニイのマウス骨髄腫ＩｇＭ、１９８６年カタログ番号Ｍ
１５２０）含有の５０ＩＩＩＭトリス緩衝液ｐＨ７，４
１００μＱのブロッキング溶液をウェルに加え室温で３
０分間培養した。溶液を除去し、ウェルをＴＴで４度洗
った。Ｖｏｌｌｅｒ、Ａ、　Ｄ　、　Ｅ　、　Ｂ　ｉｄ
ｗｅｌｌおよびＡ　ｎｎ　Ｂ　ａｒｔｌｅｔｔのＢｕｌ
ｌ、Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎ、。

５３．５５（１９７６）の方法により、１．４Ｂの抗−
エストラジオールモノクロナル抗体と５ｍｇのアルカリ
ホスファターゼ（シグマ・ケミカル・カンパニイ・リミ
テッド、ロンドン、１９８６年、カタログ番号Ｐ６７７
４）とから出発して製造されたコンジュゲートを５０ｆ
ｆ＋ＭトリスｐＨ７，４でｌニア５０に希釈し、それの
１００μＱづつを各ウェルに添加し、室温で１時間培養
した。

溶液を除去し、ウェルをＴＴで４回洗った。１０ｍＭの
パラニトロフェノールホスフェートと３．３ｍＭＭｇＣ
ｌ！とを含有する５０ｍＭ重炭酸緩衝液Ｐ）Ｉ　１０．
３の１００μＱを各ウェルに添加し室温で培養した。４
０５ｎｍにおける吸光度の変化を追跡した。試験中、吸
光度が有意に増加する培養液を産出するハイブリドーマ
（例えば陰性の対照物がまだ０．４単位の場合に、１単
位以上の吸光度を示すもの）を選別する。

第１パートでかような陽性の結果を与えるクローンを、
次いで下記のようなスクリーニング法の第２パートに付
する。

マイクロエリザ・ウェル（ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ　ｗｅ
ｌｌ）（インムンロンＩＩ　、　Ｉｍｍｕｎｌｏｎｎ　
）のストリップを、１００μｇのモノクロナル抗エスト
ラジオール抗体含有の５０ｍＭ重炭酸緩衝液ｐＨ９，６
溶液１００ｕ１２をおいて、４℃で一夜放置することに
よって前記抗体でコートした。次いでそのストリップを
０．２％のカゼインを含有する緩衝液１６０μｅととも
に３０分間培養することによってグレイズする。次に各
ウェルに、トリチウム化したエストラジオール（８０、
０００ｃｐｍ／ウェル）含有の５０ｍ１ｖｌトリスｐＨ
７，４の溶液１００μＱを添加する。そのウェルを１時
間室温で培養する。被検培養液５０μＱをデユーブリケ
イトウエルに添加し、骨髄腫セルラインから得た培養液
を対照ウェルに添加した。そのウェルをさらに３０分間
培養した。その溶液を振盪して除き、０．０２％ツイー
ン２０含有の５０ｍＭ）リスｐＨ７，４で４回洗浄する
。次いでエストラジオールの飽和溶液の１００μｇを、
各ウェルに添加し、各デュープリケイトのひとつのウェ
ルを直ちにとりだし、溶液を除きそのウェルをＴＴで洗
い、シンチレーション液内に入れ、保持されているトリ
チウム標識を測定した。デューブリケイトを室温でさら
に１０分間培養し、次いで同様に洗うて測定した。ハイ
ブリドーマとしては、培養液を産出し、クローンされる
ハイブリドーマが選別され、マウスの腹水産生法の標準
法により、抗体が大量に生産される。

実施例８ モノクロナルトラッピング抗体の用途 エストラジオールのラジオイムノアッセイを、エストラ
ジオールに対する上記モノクロナル抗体を用いて開発し
た。簡単にのべれば、この方法は、チューブを前記モノ
クロナルでコートし、非特異的バックグラウンドを減少
させるためチューブをグレイズし、次いで、固相に競合
する試料が放射能で標識を付したエストラジオールで抗
体に結合するコンペティティブアッセイにそれらを用い
ることからなるものである。そのアッセイは、種を培養
し次いでそのチューブを充分に洗い、次いで保持されて
いる標識が測定される標準アッセイである。通常の培養
段階の後、トラッピングモノクロナル抗体を添加してか
ら短時間（例えば５分間）培養することによってこのア
ッセイが改良される（そのトラッピングモノクロナル抗
体も、充分な洗浄のために用いられる最終的な洗浄溶液
に添加してもよい）。

手続補正書く方式） ％式％ ２、発明の名称 抗体類、その製造方法と用途およびこれらを含む製品３
、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住　所　　イギリス国、ケンブリッジ　シイビイ３　オ
ービイエル、ハンチングン・ロード、マウント・プレザ
ント・ハウス（無番地） 名　称　　　アンチボディ・チクノロシイ・リミテッド
代表者　ダブリュ・デイ・コール ４、代理人　〒５３０ 住　所　　大阪市北区西天満５丁目１−３クォーター・
ワンビル６、補正の対象 補正の内容 １、明細書第１頁第３行の「抗体、その製法と用途なら
びにその含有製品」を 「抗体類、その製造方法と用途およびこれらを含む製品
」に補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第２抗体が、結合蛋白を小分子の存在下または不存
   在下で結合させうるが小分子を結合蛋白の不存在下で結
   合させ得ない、小分子のその結合蛋白への結合を安定化
   しうる第２抗体。 ２、第２抗体が、第１モノクロナール抗体を小分子の存
   在下または不存在下で結合させうるが小分子を結合蛋白
   の不存在下で結合させ得ない、小分子のその第１モノク
   ロナール抗体への結合を安定化しうる特許請求の範囲第
   １項による第２抗体。 ３、分子量２００〜１０００の小分子の結合を安定化し
   うるモノクロナール抗体である特許請求の範囲第１また
   は２項による第２抗体。 ４、小分子がプロゲステロン、エストラジオール、エス
   トラトリオール、エステロン硫酸塩、ハイドロコーチゾ
   ン、コーチゾン、テストステロン、エストロゲン、チオ
   フィリン、ジゴキシンまたはデンタミシンである特許請
   求の範囲第２または３項による第２抗体。 ５、小分子とその結合蛋白とのコンプレックスを形成さ
   せ、そのコンプレックスを抗体を生ずるのに用い、小分
   子のその結合蛋白への結合を安定化させうるもので、か
   つ結合蛋白を小分子の存在下または不存在下で結合しう
   るが小分子を結合蛋白の不存在下で結合し得ない抗体を
   選択することからなる特許請求の範囲第１〜４項の何れ
   かによるトラッピング抗体の製法。 ６、特許請求の範囲第１〜４項の何れかによるトラッピ
   ング抗体の小分子の定性または定量への使用。 ７、（ａ）測定すべき小分子のサンプルとある量のラベ
   ル化小分子をレセプタへのコンペティションが起るよう
   に小分子のレセプタに導入し、 （ｂ）結合したラベル化小分子を未結合のラベル化小分
   子から分離し、 （ｃ）結合又は結合されないラベル化小分子のフラクシ
   ョンを測定することからなり、 （ｄ）トラッピング抗体を小分子とラベル化小分子のレ
   セプタへの結合を改良するのに使用することを特徴とす
   る 小分子のコンペティションアッセイ。 ８、レセプタがモノクロナール抗体である特許請求の範
   囲第７項によるアッセイ。 ９、ラベル化小分子が、放射能崩壊によって検出しうる
   アイソトープでラベル化されている特許請求の範囲第７
   または８項によるアッセイ。 １０、トラッピング抗体が、小分子とラベル化小分子と
   のコンペティションが行われた後で用いられる特許請求
   の範囲第７または８項によるアッセイ。