JPS6332794B2

JPS6332794B2 -

Info

Publication number: JPS6332794B2
Application number: JP16069680A
Authority: JP
Inventors: Toyohiko Nakamura; Akira Shibata
Original assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-11-17
Filing date: 1980-11-17
Publication date: 1988-07-01
Also published as: JPS5785390A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規抗生物質SY−９物質、その製法
及びSY−９物質を有効成分とするコクシジウム
症予防治療剤に関する。先に本発明者らは、放線菌ストレプトミセス属
に分類されるストレプトミセス・アルプス・ワツ
クスマン・アンド・ヘンリツチ第80614号菌（微
工研菌寄第419号）が、その培養中に抗菌活性を
示す物質を産生することを見出し、その培養物か
らサリノマイシン及びSY−１〜８物質を単離し
た（特開昭47−25392号、同51−86191号、同53−
92795号及び同53−148595号各公報参照）。本発明者らは更に研究を進めた結果、同じ培養
物中にサリノマイシン及びSY−１〜８物質とは
異なる新規な活性物質が存在することを発見し、
これを単離してSY−９物質と命名するとともに、
本物質が抗微生物活性を有するばかりでなくコク
シジウム症の予防及び治療に顕著な効果を有する
ことを見出した。本発明はこの知見に基づくもので、新規抗生物
質SY−９物質、並びにSY−９物質を生産する能
力を有するストレプトミセス属菌を培養し、その
培養物からSY−９物質を採取することを特徴と
する。SY−９物質の製法である。更に本発明は、
抗生物質SY−９物質を有効成分とするコクシジ
ウム症予防治療剤である。新規抗生物質SY−９物質は次式で表わされる。 SY−９物質の生産に使用されるストレプトミ
セス・アルプス第80614号菌（微工研菌寄第419
号）の菌学的性質は、特開昭51−86191号公報に
詳記されている。本発明によりSY−９物質を得るには、普通に
知られている放線菌の培養方法を用いることがで
きるが、工業的には通気撹拌培養が有利である。
培養温度は25〜35℃が適当である。培地としては
放線菌培養に一般に用いられるもの、すなわち炭
素源、窒素源、無機塩類、有機微量成分、消泡剤
などを適宜組合せたものを使用することができ
る。培養時間は通常72〜234時間である。培養混合物からSY−９物質の採取は、SY−９
物質の理化学的性質を利用して行われる。すなわ
ち本物質が弱酸性脂溶性物質であることを利用し
て、各種有機溶媒による抽出法、転溶法、各種吸
着剤によるクロマトグラフイーなどを適宜組合せ
て用いることにより目的物質を純粋な結晶として
得ることができる。 SY−９物質は菌体及び液の双方に含まれる
ので、たとえば培養物にメタノール、エタノー
ル、アセトン等の水と混和し易い溶媒を加えて抽
出し、過し、液中の溶媒を留去したのち、水
層を苛性ソーダでPH９〜10に調節し、酢酸エチ
ル、酢酸ブチル、塩化メチレン、クロロホルム等
の水と混和しない溶媒に転溶する。転溶溶媒を濃
縮して残留物をメタノール−水、エタノール−
水、アセトン−水等の溶媒系を用いて結晶化す
る。あるいは培養物に過助剤を加えて過し、
菌体をメタノール、エタノール、アセトン等で抽
出し、溶媒留去後苛性ソーダでPHを９〜10に調整
し、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム等で
抽出する。一方液は同一溶媒で抽出する。両抽
出液を合わせて濃縮し、濃縮物を前記の方法で結
晶化する。夾雑する成分が多い場合は、スチレン系の吸着
樹脂、シリカゲル、アルミナ等の担体でクロマト
グラフイーを行い巫夾物を除去する。たとえばア
ルミナクロマトグラフイーの場合は、展開溶媒と
して酢酸エチル−メタノール混合液を用い、溶媒
中のメタノールの濃度を２％から20％に変える段
階溶出法により、SY−９物質とサリノマイシン、
SY−１〜８物質及びその他の夾雑物とを分離す
る。またシリカゲルクロマトグラフイーの場合は
展開溶媒としてベンゼン−酢酸エチル（５〜７：
１液量比）混合液を用いて展開することにより、
SY−９物質を他物質から分離することができる。
得られた生物活性溶出区分を減圧濃縮し、前記の
溶媒から結晶化する。以上の各方法によりSY−
９物質の結晶が好収量で得られる。 SY−９物質ナトリウム塩の理化学的性質は下
記のとおりである。 (1) 色及び性状：無色柱状結晶 (2) 融点：223〜225℃ (3) 比旋光度：〔α〕²⁵ _D＋18℃（濃度１％、メタノ
ール） (4) 溶解性：メタノール、エタノール、アセト
ン、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル、四
塩化炭素、ヘキサン等に可溶。水に不溶。 (5) 安定性：PH５〜10で安定、PH４以下でやや不
安定。 (6) 呈色反応：レミユー、ニンヒドリン、塩化
鉄、フエーリング、バニリンの各反応は陰性、
ヨードと反応して赤褐色を呈する。 (7) 元素分析値：C₄₂H₆₇O₁₁NaとしてＣＨＯ Na 理論値（％） 64.45 8.70 22.85 2.98 実測値（％） 65.66 9.02 22.29 3.21 (8) 分子量：770（マススペクトル法） (9) 紫外線吸収スペクトル： λメタノール max222nｍ（ε＝9470）及び345nｍ
（ε＝46.0）に極大吸収。 (10) 赤外部吸収スペクトル：特性吸収値（cm^-1） 3400、1700、1560、1455、1390、1320、
1295、1235、1210、1155、1090、1040、
1020、990、870 臭化カリウム錠による吸収スペクトルを第１
図に示す。 (11) 核磁気共鳴スペクトル：重クロロホイル中で測定したスペクトルを第
２図に示す。 (12) 薄層クロマトグラフイー：シリカゲル薄層クロマトグラフイー（メルク
製シリカゲルGF254）で各種溶媒系にて展開し
たときのB_f値を第１表に示す。第１表溶媒糸 B_f値酢酸エチル 0.63 酢酸エチル：アセトン（４：１） 0.76 酢酸エチル：アセトン（２：１） 0.80 クロロホルム：メタノール（19：１） 0.55 酢酸エチル：ベンゼン（７：３） 0.45 (13) マススペクトル：第３図に示すとおり。 (14) 抗菌スペクトルは第２表に示すとおりであ
る。

【表】

【表】本抗生物質（SY−９）に類似する物質として
はサリノマイシン、SY1〜８物質があげられる
が、物理化学的性質においていずれも差異があ
る。実施例グリセリン２％、ヘプトン0.5％及び肉エキス
0.5％を含有する培地にストレプトミセス・アル
ブス・ワツクスマン・アンド・ヘンリツチ第
80614号菌（微工研菌寄第419号）を接種し、30℃
で30時間振盪培養した。この培養液１を大豆油
10％、グリコース1.0％、大豆粉1.0％、塩化ナト
リウム0.1％、塩化カルシウム0.1％、炭酸カルシ
ウム0.5％、第２燐酸カルシウム0.01％及び消泡
剤KM−68−2F0.1％を含有する液体培地100に
接種し、33℃で通気量100／分の条件下で210時
間撹拌培養した。培養後了後、培養液を硫酸でPH4.5〜5.0に調整
し、珪藻土４％を加えて過する。菌体部分は90
％アセトン水100を加えて撹拌しながら苛性ソ
ーダでPH10.0に調整する。撹拌を更に１時間続け
たのち過し、アセトンを減圧留去する。一方
液は酢酸エチル50で２回抽出したのち減圧濃縮
し、苛性ソーダでPHを9.0に調整し、菌体部のア
セトン抽出濃縮液に合わせ、室温に放置すると結
晶が析出する。これを別し、水洗したのち乾燥
したのち乾燥するとSY−９物質、サリノマイシ
ン、SY−１物質、SY−２物質等を含む混合物の
粗結晶3.5Kgが得られる。この粗結晶を20のベンゾールに溶解し、乾式
法で充填したシリカゲルのカラム（和光純薬製の
ワコーゲルＣ−200を50Kg使用）に通過させる。
次いで20のベンゾールを流し洗浄し、更にベン
ゾール−酢酸エチル（６：１）混液で展開する
と、SY−９物質が最初に溶出され、続いてSY−
１及びSY−２物質が溶出される。SY−９物質区
分を集めて濃縮し、前記シリカゲルカラムクロマ
トグラフイーを繰り返すことによりSY−９物質
が純粋に単離され、溶出液を濃縮し、適量の
0.1N苛性ソーダを添加してPH９〜10とし、室温
に放置するとSY−９物質のナトリウム塩の結晶
60ｇが得られる。本発明のコクシジウム症予防治療剤は、SY−
９物質を生理的に無害な固体又は液体の希釈剤と
混合し又は混合しないで散剤、粉剤、錠剤、カプ
セル剤、顆粒剤などとして用いられる。あるいは
これを飼料、飲料水などに混合してもよい。本剤
に用いられる固体担体としては、たとえば小麦
粉、大豆粉、米糠、殿粉、ブドウ糖、酵母、魚
粉、タルク、珪藻土等があげられ、また液体担体
としては、たとえば生理食塩水、蒸留水、生理的
に無害な有機溶媒等が用いられる。その他適宜の
補助剤たとえば乳化剤、分散剤、懸濁剤、湿潤
剤、ゲル化剤などを添加してもよい。更に殺菌
剤、防腐剤、酵素剤、抗生物質、乳酸菌製剤等を
添加することもできる。本発明のコクシジウム症予防治療剤は等に固体
の状態での使用が好ましく、この場合には有効成
分を市販の飼育飼料あるいは発育促進飼料等の固
体飼料中に撹拌、振盪又は粉砕等の手段で混入し
て使用するか、あるいは有効成分を前記のような
生理的に無害な担体を含む粉末濃厚物の形で前記
飼料に混合してもよい。本発明のコクシジウム症予防治療剤を使用する
には、その有効成分であるSY−９物質の含量と
して約0.0001重量％以上が適当である。一般にそ
の投与量は家禽、家畜の種類、日令、投与方法、
症状等により変わるが、たとえばにわとりのコク
シジウム症予防の目的には、有効成分であるSY
−９物質の割合が約0.001〜0.01％（飼料の全重
量に対し）で投与することが好ましい。また治療
の目的には約0.003〜0.03％で投与することが好
ましい。これらの場合には飼料中にSY−９物質
を濃度が約５〜300ppmになるように混和する。
本剤は特にアイメリア・テネラによる疾患の予防
及び治療において良好な結果が得られる。 SY−９物質のマウスにおける急性毒性LD₅₀値
は腹腔内投与25〜50mg／Kg、経口投与500mg／Kg
である。 SY−９物質は抗菌活性、抗コクシジウム作用
を有するほかに牛豚等の家畜の下痢、赤痢の予防
及び治療効果ならびに飼料効率改善及び発育促進
効果も認められる。そのほか殺ダニ作用、抗ウイ
ルス作用を有し、また循環不全治療剤、抗肥満剤
及びトリグリセリド減少剤としても有用である。実験例１ (1) 供試薬剤： SY−９物質、比較物質としての硝酸ジメチ
アリウム及びクロピドールを濃度100ppmで用
いた。比較物質の化学構造は下記とおりであ
る。硝酸ジメチルアリウムクロピドール (2) スポロゾイド：アイメリア・テネラの感受性菌（Ｓ）、キノ
リン系抗コクシジウム剤の耐性株（Ｒ）及びア
イメリア・ブルネツテイの３株を用い、スポロ
ゾイトはこれらの発育オーシストをドラン及び
フアルの方法で脱のうさせた。 (3) 培養細胞と培養液：スポロゾイトの培養は鶏胎児細胞、ヒナ腎細
胞又はイーグル培養液で行い、６×32mmのカバ
ースリツプを入れた試験管内で培養した。 (4) 試験方法：各薬剤を所定の濃度に溶解した細胞培養液９
mlに、スポロゾイトを３×10⁵個含む液１mlを
接種し、40℃で１時間静置してスポロゾイトを
細胞内に侵入させたのち、メタノールで固定
し、ギムザ染色をした。各種薬剤の抗コクシジ
ウム作用は、スポロゾイトの細胞内侵入数を薬
剤非添加対照と比較して判定した。すなわちス
ポロゾイトの細胞内侵入は染色後、顕微鏡500
倍率でカバースリツプの長径を４ケタ鏡検して
数をかぞえ、対照の侵入数を100％としてその
侵入率で比較した。その結果を第４表に示す。

【表】この結果から、SY−９物質はスポロゾイトの
細胞内侵入を著明に阻止し、従来使用されている
他の薬剤より優れた結果を示すことが認められ
た。実験例２ (1) 供試ヒナ：白色レグホン系雄。 (2) 接種オーシストと接種量：アイメリア・テネラの胞子形成オーシストを
１羽当たり6.8×10⁴個ずつ経口接種した。 (3)供試薬剤：抗生物質SY−９物質。 (4) 供試薬剤の飼料への混合：第５表に示す飼育飼料に、供試薬剤を100ppm
の濃度になるように混合した。

【表】

【表】 (5) 試験方法：供試ヒナとしては14日令の健康なヒナを用
い、体重平均が等しくなるように３群に分け、
第１群はオーシスト接種１日前から所定の供試
薬剤を含有する飼料で飼育し、第２群は感染後
供試薬剤を含まない飼料で飼育する感対照区と
し、第３群は非感染対照区とした。オーシスト
は第１群及び第２群のヒナに１羽当たり6.8×
10⁴個のアイメリア・アネラの胞子形成オーシ
ストを経口接種した。 (6) 効果判定基準：抗生物質SY−９投与群（第１群）はアーシ
スト接種１日前から投薬を開始し、試験終了ま
で連用した。ヒナは試験開始時と試験終了時
（層殺前）の２回体重を測定し、試験期間中は
朝、夕２回糞の状態の観察と生死の観察を行つ
た。オーシスト接種日より７日目から９日目ま
で糞を集め、プランクトン計数盤を用いて糞中
のオーシスト接種後９日目にへい死及び生存全
列例を剖検し、腸管病変の肉眼的観察並びに十
二脂腸、空腸、小腸下部及び盲腸部のオーシス
ト寄生数を求め、薬剤の効果を判定した。その
結果を第６表及び第７表に示す。相体増体率に試験区の増体量／非感染体照区の増体量
×100 増体量とは試験開始日より試験終了日迄の体
重の増加量の和を生存羽数で除したものであ
る。へい死率＝試験終了時の死亡羽数／試験開始日の羽数
×100 O.P.G：糞１ｇ中のオーシスト数盲腸病変：鶏のコクシジウム検査法に従う。盲腸病変の一〜〓は下記の意味を有する。 −盲腸は全く正常。＋盲腸の形は正常。内容物はやや流動性を帯び
色も黄色がかる。盲腸粘膜は部分的に軽度の
腫張があり白つぽくなる。盲腸の形はほぼ正常。粘膜の腫張は全面にみ
られる。内容に出血はなく、粘液は黄色みを
おび退色している。粘膜内には少数の白色点
状壊死単や出血斑が見られる。盲腸の委縮、変形は明瞭で直腸よりもやや長
い程度となる。正常な内容物は全くなく、凝
血または灰白色チーズ状の変性物が充満して
いることが多い。盲腸壁の肥厚は顕著でもろ
くなり、点状出血斑がまだ残つていることも
ある。病変は盲腸基部にまで達するが直腸に
まで達しない。〓盲腸の委縮、変形は顕著。一般にソーセージ
状を呈し、その長さは直腸と同じかまたは短
かくなつている。病変は直腸の1/3〜1/4位の
所にまで達する。その他はと同様である。

【表】

【表】第６表及び第７表から知られるように、SY
−９物質を投与した群は糞の状態、相対増体
率、へい死率、O.P.G及び剖検所見において優
れた治療効果が認められた。実験例３従来の抗コクシジウム剤、たとえばビキノレー
ト、アンプロリウム、メチルベンゾクエート、ク
ロピドール、スルフアジメトキシンなどでは、使
用期間が長ければ耐性菌の出現がみられる。そこ
で従来の抗コクシジウム剤に耐性を有する野外株
を用いて、本発明の抗コクシジウム剤の効果を試
験した。 (1) 供試ヒナ：白色レグホン系雄。 (2) 接種オーシストと接種量：メチルベンゾクエート40ppmに耐性を有する
アイメリア・テネラの胞子形成オーシストを１
羽当たり6.8×10⁴個経口接種した。 (3) 供試薬剤：抗生物質SY−９物質及びアンプロールプラ
ス（大日本製薬社製、抗サイアミン剤） (4) 供試薬剤の飼料への混合：第４表に示す飼料に第８表に示す供試薬剤を
それぞれ10又は100ppmになるように混合した。 (5) 試験方法：健康ヒナは14日令時に体重が等しくなるよう
に５群に分け、第１群はオーシスト接種５日前
から抗生物質SY−９物質10ppmを含む飼料で
飼育し、第２群には接種日から抗生物質SY−
９物質100ppmを含む飼料で飼育し、第３群に
は市販の抗コクシジウム剤であるアンプロール
プラス100ppmを含む飼料をオーシスト接種５
日前から投与し、第４群はオーシスト感染対照
区とし、第５群は非感染対照区とした。オーシ
ストの接種は21日令時に行い、接種後７日目に
全例を剖検した。 (6) 効果判定基準：効果の判定、表の記載は実験例２の場合と同
じである。試験結果は第８表及び第９表に示
す。

【表】

【表】第８〜９表の結果から抗生物質SY−９投与群
（第１群、第２群）は糞の状態、O.P.G.、相対増
体率、へい死率及び剖検所見からコクシジウム症
に対する予防及び治療において、市販の抗コクシ
ジウム剤であるアンプロールプラスより優れてい
ることが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図はSY−９物質の赤外部吸収スペクトル
図、第２図はその核磁気共鳴スペクトル図、第３
図はそのマススペクトル図である。

Claims

【特許請求の範囲】１次式で表わされるSY−９物質。２後記式で表わされるSY−９物質を生産する
能力を有するストレプトミセス属菌を培養し、そ
の培養物からSY−９物質を採取することを特徴
とする、次式で表わされるSY−９物質の製法。３次式で表わされるSY−９物質を有効成分とするコク
シジウム症予防治療剤。