JPS63313589A - マイクロモノスポラのための遺伝子系 - Google Patents

マイクロモノスポラのための遺伝子系

Info

Publication number
JPS63313589A
JPS63313589A JP63049897A JP4989788A JPS63313589A JP S63313589 A JPS63313589 A JP S63313589A JP 63049897 A JP63049897 A JP 63049897A JP 4989788 A JP4989788 A JP 4989788A JP S63313589 A JPS63313589 A JP S63313589A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
strain
dna
complex
plasmid
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP63049897A
Other languages
English (en)
Inventor
デビツド・マイケル・ロススタイン
スーザン・フイテニ・ラブ
エレン・ズコスフスキイ・バウム
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth Holdings LLC
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of JPS63313589A publication Critical patent/JPS63313589A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/29—Micromonospora
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体と呼ぶ抗菌および
抗腫瘍剤を生産する、新規な放線菌（Ａ　ｃｔ　ｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅ）マイクロモノスポラｅエキノスポラ（Ｍ
　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｕｐｏｒａ　　ｅｃｈｉｎｏｓｐ
ｏｒａ）種カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）　
　（以後、Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｕｐｏｒａ　　ｅｃ
ｈｉｎｏｓｐｏｒａｌｌｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓと呼ぶ
）の遺伝子操作に関する。このような抗菌および抗腫瘍
剤は、１９８７年１月３０日提出された同時係属米国特
許出願第００９．３２１号に記載されており、この出願
は１９８５年ｌＯ月１７日に提出された同時継続米国特
許出願第７８７，０６６号の一部継続出願であり、後者
の出願は１９８４年１１月１６日に提出されかつ現在放
棄された米国特許出願第６７２．０３１号の一部継続出
願である。
ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の種々の誘導体生成物は、両
者共１９８７年１月３０日に提出された同時係属米国特
許出願筒００４．１５４号および米国特許出願第００４
．１５３号に記載されている。
すべてのこのような出願の開示は引用によってここに加
える。抗菌および抗腫瘍ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体は、
Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｕｐｏｒａ　　ｅｃｈｉｎｏｓ
ｐｏｒａ種ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓの新規な菌株の制御
された条件下の培養の間に生産される。この微生物は、
アメリカン・サイアナミド・カンパニーの医学研究部（
Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎ、　ＡｍｅｒｉｃａｎＣｙａｎａｍｉｄ　　Ｃｏ＋
１ｐａｎｙ、　Ｐ　ｅａｒｌ　　Ｒ１ｖｅｒ、　Ｎ　ｅ
ｗＹ　ｏｒｋ）の培養物収集物中に培養物番号ＬＬ−Ｅ
３３２８８として維持されている。この新規な微生物の
生存しうる培養物は、米国農務省の北部研究センターの
培養物収集研究所（ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　
Ｒｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｃｅｎｔｅ
ｒ、　Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　　Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｐｅｏｒｉａ、　ｌ１ｌｉｎｏ
ｉｓ）に１９８４年８月９日に受託されており、その永
久収集物に加えられている。それは、このような保管機
関によって、菌株表示ＮＲＲＬ−１５８３９を与えられ
ている。このような培養物の利用は、米国特許出願第０
０９．３２１号の係属中、それに対して権限を与えられ
た特許および商標の局長によって、３７　　Ｃ，Ｆ、Ｒ
，＠１．１４および３５　　Ｕ、Ｓ、Ｃ，口１２２の規
定に従い決定され、そしてこのような培養物についての
公衆への利用に対するすべての制限は米国特許出願第０
０９゜３２１号が許されたとき最終的に排除される。
われわれは、゛菌株ＮＲＲＬ−１５８３９を突然変異化
（ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅ）　Ｌ／、そして検出可能な生
産物を生産しないか、あるいは生産物の変更したパター
ンを生産する誘導体の菌株についてスクリーニングする
有効な方法を開発した。プラスミドで菌株ＮＲＲＬ−１
５８３９を形質転換させる、プロトプラスト化（ｐｒｏ
ｔｏｐｌａｓｔｉｎｇ）および再生の養生法（ｒｅｇｉ
ｍｅｎ）を開発した。さらに、菌株ＮＲＲＬ−１５８３
９からのＤＮＡ断片を分離し、そして分析した。このＤ
ＮＡ断片は、主としてＬＬ−Ｅ　３３２８８複合体が生
産されるＮＲＲＬ−１５８３９の生命環の段階で、プロ
モーター活性を含有する。これらの遺伝子および生化学
の進歩を利用することによって、改良された特性（すな
わち、毒性が減少した化合物の生産）を有する菌株ＮＲ
ＲＬ−１５８３９の新規な誘導体を生産することができ
、そして生成物の収率を増大することができる。ヨウド
ーＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の収率はプロモーＬＬ−Ｅ
３３２８８複合体より高いので、ヨウドーＬＬ−Ｅ３３
２８８複合体をわれわれの研究においてもっばら使用し
た。
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９は、菌糸体とよぶ多細胞の形
態として成長する。成長する培養物の多細胞の性質は突
然変異誘発のための１つの問題である；劣性突然変異を
含有する細胞は野生型細胞の集塊中に検出されないであ
ろう。胞子の突然変異誘発、有機体の成長しない単細胞
の形態、または成長する細胞の突然変異誘発に頼らなく
てはならず、次いで引続いてこれらをプロトプラスト化
（細胞壁の消化）または音波処理（細胞壁の機械的剪断
）によって処理する。プロトプラストまたは音波処理し
た菌糸体を調製することによって、単細胞のまたは単細
胞に近い遺伝子単位を人工的に発生させる。われわれは
、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の断片化菌糸体をニトロソ
グアニジンおよび紫外線で突然変異誘発することを包含
する有効なプロトコールを記載する。
組換えＤＮＡを生産性有機体中に転移するためには、プ
ロトプラストが一般に外因性ＤＮＡを取込み、これに対
して菌糸体または成長しない胞子な取込まないので、プ
ロトプラスト化−再生系を開発することが必須であった
。われわれは、プロトプラスト化および再生は繊細な手
順であるように思えたので、これらの手順のすべての詳
細を含めた。また、プロトプラストの融合による菌株間
の遺伝子物質の転移のための手順の詳細を含めた。
遺伝子を菌株ＮＲＲＬ−１５８３９中にクローニングす
るために、有機体中で複製することのできるベクターを
発生させることが必要である。プラスミドｐｌＪ４８６
の誘導体、カナマイシン耐性遺伝子のための菌株ＮＲＲ
Ｌ−１５８３９からのプロモーターを含有するストレプ
トマイセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　　（以後
、Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓと呼ぶ）のプラスミド（
Ｊ、Ｍ、ワード（Ｗａｒｄ）も、モレキュラー・アンド
・ジェネラル・ジエネティツクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　　ａｎｄ　　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
、１９８６．４６８−４７８ページ］を使用して菌株Ｎ
ＲＲＬ−１５８３９を形質転換した。内因性プラスミド
は菌株ＮＲＲＬ−１５８３９において観察されなかった
。しかしながら、これより大きいプラスミドは検出でき
いであろう。
生合成経路を操作するためにわれわれだ取ったアローチ
は、いくつかの面において、ストレプトマイセス・７ラ
ジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｆｒａｄｉａｅ）
中のチロシンの生産またはストレプトマイセス・エリト
レウス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｅｒｙｔｈｒ
ｅｕｓ）中のエリスロマイシンの生産の研究に類似する
［セノ（Ｓｅｎｏ）　、　Ｅ、　Ｔ、およびＣ，Ｒ，７
チンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、１９８６、「細菌
（Ｔｈｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ）　Ｊ　、Ｖｏｌ、　Ｉ
　ＸＳＳ　、　Ｗ、クイーナー（Ｑｕｅｅｎｅｒ）　、
　Ｌ　、　Ｃ＋ディ（Ｄ　ａｙ）編；アカデミツク・プ
レス・インコーホレーテッド（Ａ　ｃａｄｅｎ＋ｉｃ　
　Ｐ　ｒｅｓｓ　　Ｉ　ｎｃｏ、ニューヨーク、２３１
−２７９ページ〕。これらの研究は、抗生物質の生産を
遮断された突然変異の分離、および抗生物質の生合成に
関係する遺伝子のクローニングを包含した。ＬＬ−Ｅ３
３２８８複合体の生産においてとくに遮断される突然変
異は、薬物の生合成経路を確立するとき有用でることが
ある。Ｌ　Ｌ　−Ｅ’３３２８８複合体の生合成に関係
する遺伝子のクローニングは１．薬物の収率の増加およ
び新規な誘導体の生産において大きい価値をもつことが
できる。
われわれは、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の生産を遮断さ
れた突然変異を分離した。遮断突然変異のいつかの対は
活性生産物を同時合成（ｃｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ）
する。ある対の一方の突然変異は、他方の突然変異がＬ
Ｌ−Ｅ　３３２８８複合体に変換できる中間体を分泌す
る。遮断突然変異によってつくられる中間体を分離およ
び同定することによって、われわれはＬＬ−Ｅ３３２８
８複合体分子の前駆体成分を決定することができる。変
換する菌株に供給される成分または中間体を変更するこ
とによって、「生変換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
　ＪによってＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の新規な誘導体
を潜在的に発生することができる〔シアー（Ｓｈｉｅｒ
）　＋Ｗ、Ｔ、　、Ｋ、Ｌ、ジュニア−（Ｊｒ、）ライ
ンハート（Ｒ１ｎｅｈａｒｔ）およびり、ゴツトリーブ
（Ｇ　ｏｔｔｌｉｅｂ）、１９６９、プロシーデインダ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、　）　６３　：１９８−２０４］。ＬＬ−Ｅ３３２
８８複合体の場合において、生変換は、ＬＬ−Ｅ３３２
８８複合体の種々の成分が複雑な不安定な構造であるた
めに、新規な生産物を生産するために、ＬＬ−Ｅ３３２
８８複合体の化学的変法よりも容易な方法である。
遮断突然変異の特性づけの他の手段は、培養物にＬＬ−
Ｅ３３２８８複合体の既知の成分を供給することを包含
する。１つのこのような成分はシュードアグリコン（ｐ
ｓｅｕｄａｇｌｙｃｏｎｅ）　、すなわち、ラムノース
部分およびアミノ糖を欠＜ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体分
解生成物である。アミノ糖の損失は、生物学的活性の１
００倍の大きい減少を生ずる。シュードアグリコンをＬ
Ｌ−Ｅ　３３２８８複合体に変換する遮断突然変異の能
力は、遮断突然変異が遺伝子欠陥のためにシュードアグ
リコンの形成のために必須な反応を実施できないことを
示す。断片、例えば、シュードアグリコンを変更するこ
とによって、再び、生変換によって新規な生成物を生産
することが可能である。
また、遮断突然変異は形質転換におけるプラスミドＤＮ
Ａの受容体としてはたらくことができる。
野生型ＤＮＡのインサートを有するプラスミドＤＮＡで
遮断突然変異を補体化（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｉｎｇ
）することによって、生合成遺伝子をクローニングにす
ることが可能である。また、生合成遺伝子を他の有機体
中にクローニングすることが可能である。ストレプトマ
イセス・リビダンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔ。
ｍｙｃｅｓ　　１ｉｖｉｄａｎｓ）　　（以後Ｓ　、　
１ｉｖｉｄａｎｓと呼ぶ）は、いくつかの有用なりロー
ユングベクターの複製を支持する、よく特徴づけられた
宿主であるＬホブウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）　、Ｄ、　
Ａ、ら、１９８５、ストレプトマイセスの遺伝子操作（
Ｇ　ｅｎｅｔ　ｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ
　　５ｔｒｅｐｔｏｓｅｙｃｅｓ）　；実験室のマニュ
アル（Ａ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍ　ａｎｕａ
ｌ）　％ザ争ジョン・インズ・ファンディジョン（Ｔｈ
ｅＪｏｈｎＩ　ｎｎｅｓ　　Ｆ　ｏｕｄａｔｉｏｎ）　
、英国ノーウィッチ］０プラスミドＤＮＡ中に結合され
たＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａＤＮＡ断片のライブ
ラリーを調製し、Ｓ　、　ｌ　１ｖｉｄａｎｓを形質転
換し、そしてＬＬ−Ｅ３３２８８複合体を合成する形質
転換体についてスクリーニングすることができる。しか
しながら、単一のＤＮＡ断片上です生合成遺伝子のすべ
てをクローニングし、そして発現することは不可能であ
ることが明らかにされた。異質宿主中のＬＬ−Ｅ３３２
８８複合体の生産は、また、致死的であろう。前駆体分
子の遺伝情報を指定する遺伝子を同定することによって
、遮断突然変異がＬＬ−Ｅ３３２８８複合体に変換する
経路の部分をクローニングすることはいっそう容易であ
ることがある。生合成遺伝子をＳ。
１ｉｖｉｄａｎｓまたは大腸菌（以後Ｅ、ｃｏｌｉと呼
ぶ）中にクローニングする他の手段は、薬物耐性が生合
成遺伝子に結合されうるので、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合
体に対する耐性を選択することを包含する。
ポリケチドの生合成に関係することが知られている遺伝
子からのＤＮＡプローブ［マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒ
ｔｉｄａ）　、　Ｒ、ら、１９８６、工業微生物の遺伝
学に関する第５回国際シンポジウムのアブストラクト（
Ａ　ｂｓｔｒ、　　　Ｆ　１ｆｔｈ　　Ｉ　ｎｔｅｒｎ
ａｔ。
Ｓｙｍｐ、　　ｏｎ　　ｔｈｅ　　Ｇｅｎｅｔ、　　ｏ
ｆ　　（ｎｄｕｓｔｒｉａｌＭ　ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓ）、１６３ページ］を、また、使用して菌株ＮＲ
ＲＬ−１５８３９におけるのと同様な機能をもつ遺伝子
を同定することができる。
生合成遺伝子を直接同定できない場合、ＬＬ−Ｅ３３２
８８複合体が合成される生命環の時にのみ存在する転写
体についてスクリーニングすることができる；このよう
な転写体はＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の生合成経路の酵
素の遺伝情報を指定できる。このアプローチの変更は、
ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の生合成の時にのみ活性であ
るプロモーターを探し、プロモーターのプローブのプラ
スミドを利用することを包含する。最後に、ＬＬ−Ｅ３
３２８８複合体の生合成に関係する蛋白質を同定するこ
とが可能であり、そしてこの蛋白質を配列決定すること
によって、生合成遺伝子を含有するＤＮＡをスクリーニ
ングするためのわれわれ自身のプローブを設計すること
ができるであろう。
このような遺伝子のクローニングおよび発現は、経路を
明らかにし、そして究極的にそれをわれわれの利益のた
めに操作することを表わす。ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体
の生合成経路の律速酵素の遺伝情報を指定する遺伝子を
クローニングしかつ発現することによって、例えば、生
産物の収率を増加することができるであろう。Ｓ　ｔｒ
ｅｐｔｏ■ｙｃｅｓ属内のアクチノルホジン（ａｃｔｉ
ｎｏｒｈｏｄｉｎ）の誘導体について報告されているよ
うに［ホブウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）　、Ｄ、　／ｌ　
ら、１９８５、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　３１４
　：　６４２−６４４１　、このような遺伝子を他の微
生物に転移することによって、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合
体の新規な形態を生産することが可能であろう。ＬＬ−
Ｅ３３２８８複合体の生合成遺伝子をクローニングしか
つ転移することによって、ある有機体が、抗腫瘍機能を
保持するが毒性が低い薬物の新規な形態を生産すること
ができたならば、重要は進歩であろう。
われわれの計画の１つの重要な面は、有機体の生命環に
おける適切な時間において遺伝子を発現する能力である
。例えば、指数的成長相の間のＬＬ−Ｅ３３２８８複合
体の生合成遺伝子の発現は致死的であることがある。ク
ローニングした遺伝子の発現を調節する１つの方法は、
転写のレベルにおいて、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体が、
また、つくられる時間においてプロモーターとしてはじ
めて活性であるｌまたは２以上の遺伝子より前に存在す
るＤＮＡ配列を利用することである。したがって、この
ようなプロモーターの分離は、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐ
ｏｒａまたはＳ　ｔｒｅｐｔｏ＋１ｙｃｅｓにおける発
現系の確立において１つの重要な工程である。
Ｅ、ｃｏｌｉの操作した菌株におけるＤＮＡの損傷に応
答するβ−ガラクトシダーゼの誘導を含む感受性の生物
学的誘導アッセイ（Ｂ　Ｉ　Ａ）　、およびＬＬ−Ｅ３
３２８８複合体の異なる成分を分割する薄層クロマトグ
ラフィー系を、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の活性の検出
のために利用した。これらの系は、変更した性質をもつ
ものについて、多数の突然変異化した細胞をスクリーニ
ングしかつ特性づけるために必須であった。
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の突然変異誘発問題の突然変
異を分離するために、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９を突然
変異化することが必須であった。放線菌（Ａ　ｃｉｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のための普通の突然変異誘発の養
生法は、胞子を紫外線またはニトロソグアニジンのよう
な因子を処理することである〔デリック（Ｄｅｌｉｃ）
　、　Ｖ、　、Ｄ、　Ａ、ホブウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ
）およびＥ、Ｊ、−７レンド（Ｆ　ｒｉｅｎｄ）、１９
７０、突然変異の研究（Ｍｕｔ。
Ｒｅｓ、）９：１６７　１８２］−われわれは、胞子で
なく菌糸体の成長する培養物をこれらの因子で突然変異
化した。一般に、Ｎ−ニトロ−Ｎ−メチルーＮ−ニトロ
ソグアニジン（ＮＴＧ）（これはＤＮＡの複製フォーク
に最も強（作用する）を使用する突然変異誘発は、成長
する細胞中で増大される［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）　、
　　Ｊ　、Ｈ−，１９７２、分子遺伝学における実験（
Ｅ　ｘｐｒｅｉｍｅｎｔｓｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、コールド番スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、ニュ
ーヨーク、コールド・スプリング・ハーバ−〕。劣劣性
遺伝的節を有する突然変異の検出を保証するため、菌糸
体を、突然変異誘発および自然成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔ
ｈ）後、音波処理（機械的剪断）して、単一の遺伝子単
位を得た。
突然変異誘発のための成長培地は、ＧＥＲ［キム（Ｋｉ
ｌｌ）　、　Ｋ、　Ｓ、およびり、Ｙ、　リュー（Ｒｙ
ｕ）、１９８３、酵素および微生物の技術（Ｅｎｚ、　
　Ｍｉｃ、　　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　）　５　：　２７３
−２８０］であり、１００ミリモルのＴＥＳ（Ｎ−トリ
ス［ヒドロキシメチル］メチルー２−アミノエタンスル
ホン酸）を含有するＮＲＲＬ−１５８３９の比較的急速
な成長を支持する富んだ培地、ｐＨ７，６、であった。
この緩衝液はＮＴＧの添加のとき比較的高いｐｉ（を−
持するなめに添加した。このＮＴＧはｐＨ８付近におい
てより有効な突然変異厚である［デリック（Ｄｅｌｉｃ
）　＊　Ｖ、、Ｄ、　１．ホブウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ
）およびＥ、Ｊ。
フレンド（Ｆ　ｒｉｅｎｄ）、１９７０、突然変異の研
究（Ｍｕｔ、Ｒｅｓ、）９　：１６７−１８２１−指数
的成長相の間、オレンジ色顔料の生成前および菌糸体の
凝集前に、細胞密度をクレットーサンマーソン（Ｋ　１
ｅｔｔ　−Ｓ　ｕｍｍｅｒｓｏｎ）比色計で監視するこ
とができた。菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の培養物は、通
気が成長を改良するので、それらせ板を有するクレット
フラスコ中で成長させ、そして培養物は、また、菌糸体
の塊を破壊するために３個のガラスピーズ（４ｍｍ）を
含有した。
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の凍結した種子培養物を、Ｇ
ＥＲ培地の２５ｍ１の培養物に添加した。
細胞は３２℃において３００　ｒｐｍにセットした二ニ
ー・ブルンスウ（ツク（Ｎ　ｅｗ　　Ｂ　ｒｕｎｓｗｉ
ｃｋ）　Ｇ　７６振盪水浴中でインキュベーションした
。初期の接種は１５クレット単位（Ｋｌｅｔｔ　　Ｕｎ
ｉｔ）　　（緑のフィルター）であった。約２８時間後
、細胞は１１８クレット単位、または中指数的成長相に
成長した。細胞を遠心によって収穫し、そしてｌｌ１ｇ
／ｍｌのＮＴＧ、７０％のＧＥＲおよび１００ミリモル
のＴＥＳを含有するｌ　ＯｍＬ　ｐＨ７，６、中の再懸
濁した。この培養物を水浴中でインキュベーションし、
そして培養物のアリコートを遠心し、ＧＥＲ培地で３回
洗浄し、２つのＧＥＲ平板、および６５−１５培地［６
５−１５培地ｇ／ｌニゲルコースｌｏｇ、デキストリン
２０ｇ１酵母エキス５ｇ５Ｎ”アミンＡ５ｇ；　ＣａＣ
Ｏ５（ミシシッピーライン（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ　
　Ｌｉｎｅ）　）　Ｉｇｓ寒天１５ｇ５ｐＨ６，７−７
，０−水道水で構成した］または酵母デキストロース培
地［酵母デキストロース培地ｇ／ｌ：酵母菌エキス１０
ｇ１グルコースｌＯｇ。
寒天１５ｇ、　Ａｐｈ６　、８−水道水で構成した１の
各々の１つの斜面上に接種することによって成長させた
。
培養物の２＋＋＋１の試料を２．８分（２，８″）にお
いて取り出し、そして２本のミクロ遠心管内で遠心した
。試料を３回洗浄してＮＴＧを除去した。
他の試料を培養物から３５分、９１分および１６４分に
おいて取り出した。
菌糸体凝集体の多くの細胞の間で劣性突然変異を発現さ
せるために、発芽後成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）が必要
であった。われわれは斜面を接種した、なぜなら斜面は
単細胞の胞子の発育を支持するからである。突然変異化
胞子を究極的に使用して、遮断突然変異についてスクリ
ーニングした。胞子は形成するために数週間を要したの
で、われわれは、また、２ＧＥＲ平板で突然変異化試料
を同様によく生長させた。ＧＥＲ平板上で生長したいく
つかの細菌が発生した後、突然変異は多分分割して、菌
糸体内に小さい、遺伝的に相同な集塊を形成する。単一
の遺伝単位である菌糸体の断片を得るために、このよう
な菌糸体のｌ＋ｍｌを氷でジャケットしたミクロ遠心管
中のＧＥＲブロス中に再懸濁し、１４〜２５秒間音波処
理［ＭＳＥソニプレプ（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ）　ｌ　５０
音波処理装置、振幅１６ミクロン］し、そして菌糸体を
、顕微鏡観察で決定して、２〜３細胞の大きさに減少し
た。コロニー形成単位の測定は、また、音波処理時間の
最適化において有効であった；音波処理はコロニーを形
成するためのより多い単位を生成したが、また多少の断
片を殺した。音波処理時間の関数としてコロニー形成単
位の数を決定した；１４〜２５秒の範囲は最大のコロニ
ー形成単位の時間を越えていた。
２．８分および３５分からの菌糸体を４日間生長させ、
そして菌糸体の断片を調製し、そして１０００％に希釈
後ＧＥＲ平板上に接種した。音波処理した細胞またはし
ない細胞の残部をグリセロールで２０％の希釈し、そし
て−７０℃で貯蔵した。３０℃で４日間インキュベーシ
ョンした後、クローンをつまようじで最少培地の平板ま
たはＧＥＲ平板上に複製した。菌株ＮＲＲＬ−１５８３
９の価値ある栄養要求変異株の検出が得られるが、また
、これらのデータから突然変異誘発の頻度を測定するこ
とができた。最初に使用した最少培地に、１リツトルに
つき２０ｇのスクロース、１ｇの硫酸アンモニウム、Ｏ
，ＩｇのＦｅ５０．”　７ＨｘＯｓＯ０２ｇのＭ　ｇ　
Ｓ　Ｏ４・７　）１　ｚ　０１５ｇのＣａＣ０，（ミシ
シッピ・ライム）、０．０５ｇのに、ＨＰＯいおよび２
０ｇの寒天から成り、ｐＨ７，５に調節したリン酸塩を
添加した。後に、クローンを変性最少培地（Ａｕｘ培地
）中で試験することが、より容易であることを発見した
。この培地は、ミシシッピ・ライムの代わりにｌ／Ｉ　
Ｏ容量のＴＥＳ　　１ＭｐＨ７，５および７−７３ｇ（
’）ＣａＣ１ｚ・２ＨｚＯを使用し、コロニーを不明瞭
にする培地に不透明のグレーの色を与える。われわれの
結果は、栄養の汚染を含まないノウプル（Ｎ　ｏｂｌｅ
）寒天（Ｏｘｏｉｄ）をディ７コ（Ｄ　１ｒｃｏ）寒天
の代わり使用したとき、より明確であった。
第３ＮＴＧ時点について、発芽後成長する細胞を、コロ
ニーが合理的な大きさになるまで、８日間インキュベー
ションした。ＮＴＧによる９１分の処理は培養物につい
てより長い回収時間を生じた。非常に多数のものが殺さ
れた（下を参照）ので、コロニーを発芽後成長した菌糸
体の平板から直接複製し、次いで前述のように平板の培
養物を集めそして音波処理した。少なくともあるコロニ
ーについて、１つのみの細胞が平板培養した菌糸体の集
塊から生き残ったであろうことがもっともらしいと思わ
れた。小さい離散したコロニーのみを取り上げた。平板
から直接取り上げた集団は、生長しない突然変異ならび
にＧＥＲ平板上の野生型について富んでおり、それゆえ
より小さく、そして８日間のインキュベージジンの間離
数してとどまる可能性が存在した。個々のクローニング
を取り上げた後、上に概説したように、平板培養物を収
穫し、そして音波処理した。
ＮＴＧ突然変異誘発の結果 ＮＴＧによる突然変異誘発の頻度は、一般に、殺微生物
作用（ｋｉｌｌｉｎｇ）と相関関係をもつ［ミラー（Ｍ
　ｉ　ｌ　ｒｅｒ）、Ｊ、Ｈ，，１９７２、分子遺伝学
における実験（Ｅｘｐｒｅｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、コールド
嗜スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　
Ｓ　ｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬ　ａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）　、ニューヨーク、コールド令スプリング・ハ
ーバ−］。殺菌の劇的な増加はＮＴＧ処理の時間の増加
とともに起こることが明らかであった。３０℃において
４日の生長後、２゜８分の試料から平板培養した細胞は
ＧＥＲ平板上に菌叢を形成した；約５０００コロニーは
３５分のＮＴＧ処理後収穫した試料を含有する平板上で
生長し、約３００のコロニーは９１分の試料から生長し
、そしてちょうど３コロニーは１６４分の試料から生長
した。
栄養要求変異株のスクリーンの予備分析は、また、非常
に首尾よい突然変異誘発を示唆した。最少培地またはＧ
ＥＲ培地を含有する平板上のクローンの複製および再試
験後、最少培地上で生長できなかった突然変異を１系列
の平板上で試験して、栄養要求体を決定した［ディビス
（Ｄａｖｉｓ）　、Ｒ−Ｗ、　、Ｄ、ホトスティン（１
３０ｔｓｔｅｉｎ）およびＪ。
Ｒ，ロス（Ｒｏｔｈ）、１９８０、アドバンスト・バク
チリアル・ジエネチツクス（Ａ　ｄｖａｎｃｅｄ　　Ｂ
　ａｃｔｅｒｉａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、コール
ド・スプリング・ハ＋　ｔ＜−ｍラボラトリ−（Ｃｏｌ
ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ６ｒ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）　、ニューヨーク、コールド・スプリン
グ・ハーバ−１゜種々の時点からの栄養要求変異株を下
に列挙する。
２．８　　　　　４／３４９　１．１％　　　　芳香族
アミノ酸（Ａｒｏ）（２）、トリプトファン（１）、 ヒスチジン（１） ３５　　　　　５５／７６５７．２％　　　　Ａｒｏ（
４４）、ウラシル中アルギニン（４）、アデニン （１）、トリプトファン（１）、 不定（５） ９１　　　　　　９４／４００２３．５％　　　　Ａｒ
ｏ（６６）、トリプトファン（９）、不定（２）、試験
せず（１５） ９１”　　　　　　１２／１００１２．０％　　　　Ａ
ｒｏ（１１）、リジン（１）突然変異誘発の結果は、Ｎ
ＴＧＭ理の時間とともに増加した高い突然変異の頻度を
示した。単一の突然変異の選択と一致する大抵の突然変
異を明らかにすることができた。しかしながら、ウェル
は事実突然変異の顕著な集塊形成を観察した。より高度
に突然変異誘発されると、観察される突然変異のスペク
トルはより狭くなった。芳香族アミノ酸（Ａ　ｒｏ）の
生合成に影響を及ぼす突然変異は、はるかに主要なりラ
スであった。ＮＴＧは突然変異の「ホットスポット」を
、ことにＤＮＡ複製起源付近に、有することができるこ
とが知られている［グエロラ（Ｇｕｅｒｏｌａ）　、Ｎ
、　Ｊ　、　Ｌ、イングラハム（Ｉ　ｎｇｒａｈａｍ）
およびＥ、セルダーオルメド（Ｃｅｒｄａ　−０１ｍｅ
ｄｏ）、１９７１．ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２
３０　：　ｌ　２２］　ａわれわれは、Ａ　ｒｏ突然変
異の高い比率が突然変異の分布におけるこのような非対
称を反映したことに関心をもった。したがって、われわ
れは遺伝子の欠陥を誘発する第２の方法として紫外線を
使用しｔ；。
紫外線を使用する突然変異誘発 このグロトコールは、紫外線からの細胞の遮断を最小に
して、その突然変異誘発作用を減衰するように案出した
。細胞は透明溶液中に再懸濁し、ここで透明溶液は細胞
のすべてを暴露できるために十分に浅かった（　２　ｍ
ｍより小の深さ）。菌糸体内の他の細胞による細胞のか
げを克服するために、音波処理により菌糸体の集塊を２
〜３個の細胞の大きさに破壊した。別法は抱子の突然変
異誘発［ホブウッド（Ｈｏｐｖｏｏｄ）　、Ｄ、　Ａ、
ら、１９８５、ストレプトマイセスの遺伝子操作（Ｇ　
ｅｎｅｔ　ｉｃＭｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｓ
　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　；実験室のマニュアル（
Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）、ザ囃
ジョン◆インズ・ファンディジョン（ＴｈｅＪｏｈｎＩ
　ｎｎｅｓ　　Ｆ　ｏｕｎｄａｔｉｏｎ）　、英国ノー
ウ（７チ：デリック（Ｄｅｌｉｃ）　、Ｄ、　Ａ、ホブ
ウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）およびＥ、Ｊ、７レンド（Ｆ
　ｒｉｅｎｄ）、１９７０、突然変異の研究（Ｍｕｔ、
　Ｒｅ５＝　）　、９　：１６７−１８２１またはプロ
トプラストの突然変異誘発であった。突然変異誘発後、
培養をいくつかの細胞分割のための生長させて、劣性遺
伝的欠陥を含有する突然変異に菌糸体内の小さい細胞集
塊を形成させた。発芽後成長した培養を、再び音波処理
して単一の遺伝子単位を生成させ、そして栄養要求変異
株について試験した。
ＧＥＲ培地中の菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の生長する培
養から約５ＸＩＯ’の細胞を１０００％のスクロース中
で洗浄し、前述のように音波処理し、ペトリ皿中の２０
％のグリセロールのｌＯｎ＋１中に再懸濁し、２　、４
３／ｍ”／秒の紫外線（２５６ｎｍ）に暴露した。６０
．９０および１２０秒において、２．８ｍｌの細胞を細
胞懸濁液から取り、そして細胞を希釈し、そして発芽後
成長のためＧＥＲ平板上に接種した。紫外線処理した細
胞の未使用の部分を一７０℃において貯蔵した。グロト
コールの他の変法は音波処理しない細胞の紫外線突然変
異誘発を包含した。グリシンの存在下に生長する細胞は
より小さい菌糸体を含有することが観察されたので（多
分細胞壁へのグリシオンの作用のため）、０．１５％の
グリシンを含有するＧＥＲ培地中で生長した細胞を、ま
た、紫外線で処理した。４日後、コロニ形成単位を、次
に示すように、決定した。
６（１２−９ＸＩＯ’　４ＸｌＯ＠２ＸｌＯ’　　４Ｘ
ｌＯ’ｖ ９０秒８ＸｌＯ’　　ｌＸｌ０’　　ｌＸｌ０’　　２
．３ＸＩＯ”ｖ １２０秒　２ＸｌＯ”　　　ｌＸｌ０’　　　１．６Ｘ
ＩＯ’　　１．５ＸｌＯ’■ＩＶ 生存曲線を第１図に示す。音波処理した細胞について、
対数関係は生存について紫外線への暴露時間の関数とし
て観察し、そして殺微生物は非常に広い範囲に及んだ。
紫外線処理前の音波処理しなかった菌糸体について、殺
微生物作用は、多分かげ（ｓｈａｄｉｎｇ）のため、そ
れほど広い範囲にわたらなかった。より速い時点につい
て、音波処理しない菌糸体の生存は推定値を越えること
ある：菌糸体の集塊内の１つの細胞さえ生存する場合、
殺微生物作用は検出されない。
紫外線による殺微生物作用は突然変異誘発としばしば相
関関係をもつ［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）　、　Ｊ　。
Ｈ，，１９７２、分子遺伝学における実験（Ｅ　ｘｐｒ
ｅｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）　、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニューヨ
ーク、コールド・スプリング・バーバー］ので、これら
の集団は突然変異を含有するように思われた。各々につ
いての平板培養物を、発芽後成長した菌糸体をＧＥＲ培
地中にこすり落すことによって収穫した。紫外線処理前
に音波処理した細胞懸濁液について、９０秒間紫外線に
露出した細胞を使用した：紫外線で１２０秒間処理した
断片化しない菌糸体を収穫した。すべての場合において
、発芽後成長した菌糸体は音波処理によって断片した。
ＧＥＲ平板上で４日間インキュベーションした後、コロ
ニーをつまようじで最少寒天平板およびＧＥＲ平板上に
移すことによって生長についてスクリーニングした。４
つの突然変異化培養物について、次の栄養要求変異株の
比率が観察された＝ＧＥＲ中の生長および紫外線の音波
処理なし、Ｏ／３７０　（０，３％より少ない栄養要求
変異株）、ＧＥＲ中の生長および音波処理、３／２８５
（１％の栄養要求変異株）、ＧＥＲ＋グリシン中の生長
および音波処理なし、０／３８８　（０゜３％より少な
い栄養要求変異株）、およびＧＥＲ＋グリシン中の生長
および音波処理、ｌ／３１２（０，３％の栄養要求変異
株）。
音波処理は殺微生物作用および紫外線による突然変異誘
発の双方を増大したので、ＧＥＲ中で生長した細胞の突
然変異化培養物をスクリーニングい、そして紫外線前に
音波処理した。スクリーニングした１８２０の３８栄養
要求変異株の合計、または２．１％を観察した。栄養要
求変異株は３３のシスティンまたはメチオニン要求体、
３のヒスチジン要求体、ｌのスレオニン要求体、および
ｌの明らかにされない突然変異を示した。再び、突然変
異、この時有機イオウ（システィンまたはメチオニン）
の要求体のの集塊化が観察された。
栄養要求変異株および顔料突然変異の要約補充物質を含
むおよび含まない液状Ａｕｘ培地中ですべてのクラスを
表わす栄養要求変異株を生長させ、そしてすべての栄養
要求体を確証した。ＧＥＲ平板からの新鮮なコロニーを
洗浄し、５ｍｌのブロス中に再懸濁させ、そして２８℃
において通気のすぐれたローラードラムを使用してイン
キュベーションした。２つの突然変異誘発手順を一緒に
すると、紫外線誘発突然変異およびＮＴＧ誘発突然変異
の間の栄養要求変異株の唯一の重複はヒスチジン要求体
であった。
栄養要求変異株の使用は次を包含する。２つのクラス（
Ａｒｏ、およびウラシル−アルギニン要求体）は、後述
するプロトプラスト数台実験において使用した。Ｃ栄養
要求変異株の対立遺伝子は、所定の菌株またはコロニー
をマークし、そして汚染体から区別可能であることを保
証するとき価値がある。プラスミド上の栄養要求変異株
の突然変異を保証する野生型遺伝子をクローニングする
こおよび維持は、最少培地上で形質転換体を生長される
ことによって選択できた。有機イオウを要求する突然変
異は、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の各成分が４個のイオ
ウ原子を含有するので、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体を標
識するために有用であることがある。
突然変異の広いスペクトルは、非致死突然変異がわれわ
れの突然変異化集団中に見出されうるであろうことを示
唆した。ある種の栄養要求変異株、例えば、ＮＴＧ処理
した細胞のＡｒｏ突然変異が主要比率を占める理由は確
かでなはない。と９領域はＮＴＧのための突然変異のホ
ットスポット部位であろう。また、ａｒｏ突然変異がＮ
ＴＧ処理または発芽後成長の間に選択的利点を与えるこ
とがあ　。
りうる。あるいは、％領域は、ａｒｇ　Ｇ位置がＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中に存在するように、菌株ＮＲＲＬ
−１５８３９において高度に突然変異誘発性でありうる
［Ｊ、アルテンプフナ−（Ａ　１　ｔｅｎｂｕｃｈｎｅ
ｒ）ら、１９８４、モレキュラー・アンド・ジェネラル
・ジエネティックス（Ｍｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、）、１９５．１３４−１３８ページ］。また、栄
養要求変異株のクラスについて逆選択することが可能で
ある。少なくともＡｒｏｓ）リプドアアン、ヒスチジン
、スレオニンおよびリジンの栄養要求変異株について、
すべての補助物質を含有するＡｕｘ培地と反対に、必須
補助物質のみを含有するＡｕｘ培地中で細胞はより速く
生長した。多分、非必須アミノ酸は必須アミノ酸の摂取
を妨害し、生長を阻害するのであろう。スレオニンおよ
びヒスチジンの要求体は、野生型に比較して、ＧＥＲ培
地上の生長が非常に劣った。いずれの場合においても、
ＮＴＧ処理培養物および紫外線ＴＲ培養物の双方　゛を
他の所望の突然変異、例えば、遮断突然変異について試
験することが合理的であると思われた。
ＮＴＧＪ＆理細胞から観察された突然変異の１つの他の
クラスは顔料突然変異であった。菌株ＮＲＲＬ−１５８
３９の野生型コロニーは、ＧＥＲ平板上の数日間インキ
ュベーション後、オレンジ色をつくる。いくつかのコロ
ニーが、それ以上オレンジ顔料を生成しないＮＴＧ処理
細胞から観察さンジ顔料を生成しないＮＴＧ処理細胞か
ら観察された。ある突然変異コロニーは白色であり、そ
しであるものは黄色であった。このような突然変異にお
けるわれわれの初期の関心は、野生型培養物における顔
料の生成がほぼＬＬ＝Ｅ３３２８８複合体が生産される
時間に起こったという観察から由来した。しかしながら
、それ以上の実験は、顔料を生成する能力と薬物を生産
する能力との間に緊密な関係は存在しないことを示した
。なぜなら、これらの顔料突然変異はＬＬ−Ｅ３３２８
８複合　　。
体を生産する能力を維持したからである。これらの突然
変異は、野生型Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのＤＮ
Ａの挿入のために、顔料をつくる能力を回復したプラス
ミドの形質転換における受容体として有用であろう。顔
料の生成は一時的に制御されるので、このような遺伝子
からの調節部位の分離は調節された発現系を確立すると
き有用であろう。
遮断突然変異を分離するために、多くのコロニ−を迅速
にスクリーニングできるように、発酵条件を小型化した
。コロニーは１．５ｍｌの７３−３夏培地［７３−３１
培地＝１リツトルにつき２０゜０ｇのスクロース、０．
１ｇのＦ　ｅＳ　０４　”　７　Ｈｚｏ　ｚｏ、２ｇ（
７）ＭｇＳＯ，・７Ｈｔ０，２−５ｇ（１）ＣａＣＯｓ
（ミシシッピ・ライム）２．０ｇのマルコル・ペプトン
（Ｍａｒｃｏｒ　　Ｐｅｐｔｏｎｅ）　、５．０ｇの糖
蜜、０．１ｇのＫｌ、水道水で構成した］中に、２４ウ
エル（ｗｅｌｌ）の平板（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して
直接接種した。クイックスクリーン（ｑｕｉｃｋ　　５
ｃｒｅｅｎ）ニツイて、Ｅ、ｃｏｌｉテスター菌株を接
種しであるＢＩＡ平板上に、３μｌまたはｌＯμｌの培
養ブロスをスポツティングした。ＢＩＡ活性物質が野生
型培養物から３日以内に同定された。接種物は均一でな
かったので、培養物は１週耐全体にわたってインキュベ
ーションしてアーチファクトを排除した。
ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の特定の成分を観察するため
に、抽出法は、また、能率的にしなくてはならなかった
。クイックスクリーンによってＢＩＡ活性物質について
陽性であった培養物について、０．８ｍｌの培養物を３
２５μｌのアセトン／酢酸エチル混合物（８容量のアセ
トン１５容量の酢酸エチル）とマイクロ遠心管内で混合
し、多管ポルテクサ−（Ｖｏｒｔｅｘｅｒ）　　（Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　　
Ｉ　ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で２分間渦形成した。
遠心後、ｌ　ＯμｌをＴＬＣ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　　
６０Ｆ２５４、Ｅ　Ｍ　　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）上にスポ
ツティングし、そして前述のようにクロマトグラフィー
にかけたが、ただしその時間はちょうど２０分であった
。ＴＬＣ後、ＢＩＡ平板上でＬＬ−Ｅ３３２８８複合体
の成分を検出するために十分な活性物質は、有機相の小
さい体積内に抽出できた。突然変異を貯蔵するために、
すべての培養物の６０μｌの試料を９６ウエルの平板の
ウェル中で、４０μｌの５０％のグリセロールに添加し
、そして−７０℃で凍結した。
ＢＩＡ活性についてクローンをスクリーニングすること
によって、いくつかの潜在的に興味ある非生産性誘導体
が得られた（第２図）。劣った生長または二次代謝に影
響を及ぼす多面発現に関係する外因的理由で、ＬＬ−Ｅ
３３２８８複合体を生産できなかった突然変異を迅速に
排除しようと゛　した。顔料突然変異がＢＩＡ活性生成
物をつくったので、オレンジ顔料の生産はＬＬ−Ｅ３３
２８８複合体の生産と緊密に関連性がないことをわれわ
れは既に決定した。しかしながら、顔料の生産は、野生
型において、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体と同時に起こる
。全面生長に生長できない、および／またはオレンジ顔
料をつくることのできない、非生産性体を廃棄した。３
５分間ＮＴＧで突然変異化しそして音波処理した細胞か
ら誘導し、試験した２４０クローンの全面生長に生長し
たｌＯの非生産性突然変異を分離した。３５分間ＮＴＧ
で突然変異化し、次いで胞子形成した細胞の、試験した
２４０クローンから、６つの非生産性体が得られ、そし
て紫外線で突然変異化した４８０から１つが得られた。
ＬＬ−Ｅ　３３２８８複合体の成分の変更したプＢＩＡ
活性物質を生産したクローンを、上に概説したＴＬＣ板
を使用するスクリーニングによって、ＬＬ−Ｅ３３２８
８複合体の成分について試験した。ＬＬ−Ｅ　３３２８
８複合体の成分の変更したプロフィルを表わす突然変異
の収集のＴＬＣを第３図に示す。
ＤＲ４１４と呼ぶ菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の１つの突
然変異は、ＮＲＲＬ−１５８３９からのデルタ成分と同
時に移動するただ１つの可視の成分を生産する。他のも
の（ＤＲ１１２２）は、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９によ
って生産される主要成分であるベータ成分をつくらない
。いくつかのもの（ＤＲ８２３、ＤＲ１３１０％ＤＲ１
５２３）は、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９より速く移動す
る成分のよりかなり多くを生産する。これらの突然変異
の４つは、発芽後成長後音波処理したＮＴＧ突然変異化
細胞からのものであり、そして他のものは胞子形成した
ＮＴＧ突然変異化細胞からのものである。これらの突然
変異がＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の新規な誘導体を生産
するかどうか、あるいは菌株ＮＲＲＬ−１５８３９がま
た生産する少量成分のより多くをつくるかどうかを、わ
れわれは知らない。新規な生成物が１または２以上の突
然変異によってつくられる場合、それらは非常に価値が
ある種類の特性（すなわち、減少した毒性）を示しうる
であろう。それらが特定の成分、例えば、ＤＲ４１４に
ついてデルタを強調する場合、それらはこの成分を分離
するとき有用でありうるであろう。
遮断突然変異によるＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の同時合
成 所定の突然変異がＬＬ−Ｅ　３３２８８複合体の経路に
おいて特異的に遮断されることを立証するために、混合
した培養物からの生産物についてアッセイした。２つの
突然変異がＢＩＡ活性物質を同時合成することができた
場合、１つの突然変異は第２突然変異の欠陥を克服する
前駆体を提供できるであろう。下の線図は直線の生合成
の経路である： 酵素１　　　　酵素２　　　　酵素３ 化合物Ａ−−化合物Ｂ−−−化合物Ｃ−→酵素４ 化合物Ｄ　−Ｌ　Ｌ　−Ｅ　３３２８８突然変異Ｄ４６
は酵素２中に欠陥を含有し、したがって活性生産物をつ
くることができないであろう。ＤＲ４３が酵素ｌ中に遺
伝的欠陥、この経路におけるより速い段階、を含有する
と仮定する。
菌株ＤＲ４６が中間体を生産し、そしてそれを生長培地
中に分泌する場合、菌株ＤＲ４３は酵素２．３および４
を含有するので、菌株ＤＲ４３は中間体を取り上げ、そ
れを最終生成物に変換するであろう。化合物Ｂを取り上
げることによって、ＤＲ４３はその遺伝的に欠陥のある
遺伝子生産物（酵素ｌ）をバイパスする。
２つの突然変異の菌株によるＢＩＡ活性物質の同時合成
は、各々がＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の生合成通路にお
いて特異的に遮断されることを、明白に立証しない。突
然変異は、例えば、実際に栄養的欠陥を含有するが、栄
養要求変異株の大部分のクラスは少なくとも多少の生産
物をつくる。
（アデニン要求体および２つのクラスの明らかにされな
い突然変異のみが試験した栄養要求変異株のＢＩＡ活性
物質を生産できなかった。）他の可能性は、１つの突然
変異がＬＬ−Ｅ　３３２８８複合体の必須糖成分を生産
することができないということである。このような欠陥
は栄養要求変異株としてはっきり現われないが、欠陥は
生長培地にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体に対して特異的で
ある化合物よりはむしろ糖を補充することによって、軽
減できるであろう。しかしながら、ＬＬ−Ｅ３３２８８
複合体の経路において特異的に遮断される突然変異は、
不安定な中間体、あるいは分泌または摂取されないもの
を生産する場合、同時合成できないであろう。
われわれは、各突然変異をＧＥＲ培地中で飽和に生長さ
せ、洗浄し、モして５×濃縮培養物を一７０℃において
２０％のグリセロール中で貯蔵することによって、前記
突然変異の接種物を調製した。次いで、５μｌの所定の
突然変異に５μｌの他の突然変異を接種するか、あるい
は１Ｏｐｌの単一の突然変異を２４ウエルの平板中の７
３−３１生産培地のウェル中に接種した。１週後、培養
物　゛をＢＩＡ平板上にスポツティングしてＬＬ−Ｅ３
３２８８複合体を検出した。突然変異ＤＲ４３の同時合
成の１例を第４図に示す。単独で生長した菌株ＤＲ４３
はＢＩＡ活性物質を生産しないが、いくつかの他の突然
変異とともに生長した菌株ＤＲ４３はＬＬ−Ｅ３３２８
８複合体を同時合成し　　・た。同時合成の要約を第５
図に示す。２つの突然変異が同時合成する場合、それら
は明確な補体化群中に存在する；それらが同時合成でき
ない場合、それらは経路において同一の段階に影響を及
ぼす突然変異を含有するか、あるいは異なる機能に影響
を及ぼすが、前述の理由で補足することができないであ
ろう。
同時合成の結果は、すべての非前駆体が少なくとも２つ
の他の突然変異とともに同時合成することを示した。１
７の突然変異のうちで、突然変異の音波処理する能力に
基づいて、あるいは他の突然変異との明確な同時合成パ
ターンに基づいて、１１の補体化群を観察した。期待さ
れるように、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体中に存在するよ
うな複雑な分子について、少なくとも４０の生化学的段
階が含まれるであろう。
究極的には、われわれは興味ある突然変異に焦点を合わ
せた。い（つかの突然変異は漏出突然変異（ＤＲ９１，
ＤＲ５８、ＤＲ１１２、ＤＲ１９４）であることを明ら
かにし、そして漏出突然変異によって生産されれる活性
物質の少量は引続く実験を妨害したので、それらの漏出
突然変異を追跡しなかった。さらに、ＤＲ１７２は栄養
要求性であったので、広範には検査しなかった。４つの
菌株は同一の大きい補体化群のもの、であっｔ；ので、
直接の考慮から除外し、そしてそれらを容易に区別する
ことができなかった。
液体培養における同時合成実験は、１対のどの突然変異
がある化合物を分泌し、そしてどの突然変異が化合物を
活性生成物に変換するかを決定できなかった。分泌体お
よび変換体を区別するために、細胞は０．５％の低融点
アガロース（Ｓ　ｅａｋｅｍ）を含有する半固体マトリ
ックス中の生産培地上にスポツティングして、最大の拡
散を可能とした。
突然変異の培養物を対で互いに隣接させてスポツティン
グした。１週の生長後、各スポットは寒天表面からコロ
ニーを剥し落すことのよって収穫し、そして細胞を２０
μｌのアセトン−酢酸エチル（１／　ｌ　Ｓｖ／　ｖ）
で処理した。３μｌの酢酸エチル相をＢＩＡ平板上にス
ポツティングした。より強いシグナルを生産した対の突
然変異は変換体であり、そして他方の菌株は分泌体であ
ると思われた。ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体は寒天中で拡
散するので、結果は明確ではない。平板上のすべてのコ
ロニーが検出可能な物質を同時合成するわけはない。な
お、われわれは次の対の突然変異を予備的に決定するこ
とができた： 分泌体　　　　　変換体 ＤＲ２１０ＤＲ４３ ＤＲ１１８ＤＲ４３ ＤＲ５８ＤＲ４３ ＤＲ１７１２ＤＲ４３ ＤＲ１３１６、ＤＲ４３ ＤＲ４６ＤＲ４３ ＤＲ４３ＤＲ１５１０ ＤＲ１２３ＤＲ４６ ＤＲ５８ＤＲ４６ ＤＲ１７１２ＤＲ４６ ＤＲ１３１６ＤＲ４６ ＤＲ１２３ＤＲ１３１６ ＤＲ１１８ＤＲ１５１０ 変換する菌株が分泌する突然変異より速く遮断されると
仮定すると、遺伝的順序を生合成経路について確立する
ことができる。ＬＬ−Ｅ３３２８Ｂ複合体の経路の仮の
地図は、それらの遮断に従つう突然変異の順序は次の通
りである。
ＤＲ１５１０→ ＤＲ４３→ＤＲ４６→ ＤＲ１３１６→ ＤＲＩＯ１４→ ＤＲ５８→ＤＲ１７１２→ ＤＲ２１０−・　・　・　・ ＬＬ−Ｅ　３３２８８複合体 突然変異ＤＲ４３は、詳細に検査するためにとくすぐれ
た候補であることが明らかになった。それはいくつかの
異なる突然変異と同時合成し、実験は突然変異ＤＲ４３
が通常変換する菌株であることを示唆した。したがって
、ＤＲ４３は、多分、経路において早期の遺伝的欠陥を
含有する。ＤＲ４３（変換体）およびＤＲ４６（分泌体
）が同時生長するとき、平板上に最も明瞭な輪郭が観察
された。　　′ 突然変異の菌株ＤＲ４６の生存しうる培養物は、アメリ
カン・サイアナミド・カンパニーの医学研究部（Ｍｅｄ
ｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｃｈＤｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎＣｙａｎａｍｉｄ　　Ｃ０ｍ１）ａｎＹ、ｌ
Ｐ　ｅａｒｌ　　Ｒ１ｖｅｒ、　Ｎ　ｅｗＹ　ｏｒｋ）
によって維持されている。さらに、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔ
ｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
１２３０１　　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ、　
　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。
Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、　Ｓ　、　Ａ、　２０８５２
）に１９８７年３月６日に受託されており、そしてその
永久収集物に加えられている。このような受託所によて
、それは表示ＡＴＣＣ−５３５９１を割当てられている
。このような培養物の利用は、本願の係属中、それに対
して権限を与えられた特許および商標の局長によって、
３７　　Ｃ，Ｆ、Ｒ，＠ｌ。
１４および３５　　Ｕ、Ｓ、ＣＩＪ１２２の規定に従い
決定され、そしてこのような培養物についての公衆への
利用に対するすべての制限は本願が許されたとき最終的
に排除される。
ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の生合成の中間体の特性づけ 突然変異ＤＲ４６は突然変異ＤＲ４３がＢＩＡ活性物質
に変換する中間体を分泌すると思われたので、中間体の
少なくと多少は菌株ＤＲ４６の培養物の上澄み中に見出
されるであろう。次いで、菌株ＤＲ４６からの細胞不合
補助物質を加え戻し、菌株ＤＲ４３に活性物質を生産さ
ることが可能であろう。このような実験の成功は中間体
の安定性に依存する；それが非常の安定である場合、菌
株ＤＲ４３およびＤＲ４６を一緒に生長させて同時合成
を検出することが必要であろう。
推定上の中間体は菌株ＤＲ４６の培養物の上澄み中に見
出されるであろう。あるいは、それは主として細胞の内
側に存在することがある。菌株ＤＲ４６培養物の異なる
成分を菌株ＤＲ４３の培養物に補充して、これらの可能
性を区別することを決定した。中間体の分泌時間は未知
であるので、菌株ＤＲ４６の５つ時間を決めた培養物の
混合物を調製した。７３−３１生産培地中で１，２．３
．４および６日の生長後、５つの５嘗ｌの培養物を収穫
した。上澄みと細胞沈殿物との混合物を調製した。細胞
沈殿物の混合物を１０ｍ１のＨ，Ｏ中に再懸濁し、そし
て合計１７分間音波処理した（１５秒／分の音波気運、
氷のジャケット付き、ＭＳＥＳｏｎｉｐｒｅｐ　　ｌ　
５０．１５ミクロン）。はんのわずかの細胞は無傷にと
どまった。音波旭理物を遠心して破片を除去し、そして
ろ過滅菌した。ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体はほとんど酢
酸エチル抽出液中に見出され、そして水中に非常には可
溶性でないので、沈殿物を酢酸エチルで抽出する。酢−
酸エチル抽出物を乾燥し、そしてエタノール中に再懸濁
した。
菌株ＤＲ４６の培養物を２４ウエルの平板中に接種し、
１．２または３日後、菌株ＤＲ４６混合培養物の成分を
添加した。４日の生長後、ＢＩＡ活性は培養物をスポツ
ティングすることによって試験した。（大きい体積の菌
株ＤＲ４６培養物の上澄みをウェルに添加するとき、一
定体積を維持するために・、等体積の菌株ＤＲ４３培養
物を遠心し、そして沈殿物を加え戻した。）ＤＲ４３に
よるＢＩＡ活性物質への変換後、菌株ＤＲ４６の１５０
μｌの上澄みは検出すべき十分な補体化物質を含有した
。菌株ＤＲ４６からの上澄みの７５０μｌは、少なくと
もＤＲ４３およびＤＲ４６の同時合成と同程度によく、
菌株ＤＲ４３を補足した。
１．７ｎａｌの等価量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）の細胞
の音波旭理物はほぼ１５０μｌの上澄みと同程度によく
補足し、中間体は主として培養物の上澄み中に存在し、
そして細胞の内側には存在しないことを示した。菌株Ｄ
Ｒ４６細胞の８■ｌの等価量からの酢酸エチル抽出物（
１０μｌの濃縮抽出物）は検出可能に補足しなかった。
菌株ＤＲ４６によって生産される補体化因子（ｃｏｍｐ
ｌｅｍｅｎｔｉｎｇ　　ｆａｃｔｏｒ）は主とし培養物
の上澄み中に見出されたので、われわれの努力をそこに
集中させた。菌株ＤＲ４６培養物からの上澄みの１．３
■ｌを１または２日間インキュベーションし、菌株４６
培養物からの１３０μｌの上澄みを３．４および６日間
インキュベーションし、ウェル中で２日間生長後の菌株
ＤＲ４３の培養物に添加し戻した。第４日に、試料をＢ
ＩＡ平板上にスポツティングして、補体化因子が上澄み
中に存在するかどうかを決定した（第６図′）。ＢＩＡ
の応答を精確に観察するために、未希釈、ｌ／３に希釈
、およびｌ／ｌ　Ｏに希釈した培養の試料の３μｌをＢ
ＩＡ平板に適用した。補体化因子はインキュベーション
したＤＲ４６培養物からの１３０μｌの上澄み中に検出
されず、因子は第１日からの菌株ＤＲ４６の上澄みから
検出され、そして第２日までに肉眼で検出可能な量の補
体化因子が検出された。上澄み中の補体化因子の濃度は
、第３日までに実質的に増加し、そして第４ＥＩにピー
クに到達した。菌株ＤＲ４６培養物の上澄み中の補体化
因子の出現は、野生型においてつくられるＬＬ−Ｅ３３
２８８複合体の出現と並行する。野生型におけるＬＬ−
Ｅ３３２８８複合体の場合におけるように、補体化因子
は生長の終り後の生命環において合成される（下を参照
）。一時的な合致は、補体化因子がＬＬ−Ｅ３３２８８
複合体の特異的前駆体であり、そして、例えば、生長お
よび飽和期の間に合成される糖でない、という概念と一
致する。さらに、７３−３Ｉ培地（ヒスチジンおよびロ
イシンを添加した）中で生長させたＳ、１ｉｖｉｄａｎ
ｓ　　Ｔ　Ｋ　５４からの上澄みは、菌株ＤＲ４３に補
体化因子を提供しない。
補体化因子の化学的性質は、また、それが単糖ではなく
、むしろ疏水性領域と親水性領域とをもつ前駆体である
ことを示す。補体化因子は、酢酸エチルの添加後、有機
相中に分配されず、等体積の第２ブタノールを上澄みに
添加したとき、補体化因子の約１／２は第２ブタノール
相中に入った。
ｎ−ブタノールを上澄み七混合したとき、補体化因子の
約１／３はｎ−ブタノール中に見出された。
われわれは、菌株ＤＲ４６の大きい培養物から補体化因
子を分離するために使用できる方法を開発した。補体化
因子はアンバーソーブ（ａｍｂｅｒｓｏｒｂ）ＸＡＤ−
２ビーズ（Ｒｏｈ＋ｓ　　ａｎｄ　　Ｈａａｓ）に吸着
する。それは８０％のメタノールでほとんど完全に溶離
される。この方法の規模を３００リツトルの発酵器から
補体化因子を分離できるまで大きくした。菌株ＤＲ４６
の培養物をろ過し、そして発酵の上澄みをＸＡＤ−２ビ
ーズの３０リツトルのカラムに適用する。補体化因子の
大部分はカラムに保持され、次いでこれを５０％の水−
メタノールの混合物で溶離する。凍結乾燥後、補体化因
子を逆相カラムクロマトグラフィーにより、ＬＨ２０ま
たは０１８マトリツクスを使用して、さらに精製した。
菌株ＤＲ４３およびＤＲ４６が同時生長したとき、ＬＬ
−Ｅ３３２８８複合体のベータ成分のみがつくられた（
第７＠参照）。菌株ＤＲ４３の培養物に補体化因子を補
充したとき、同一の結果が観察された。これらの観察お
よび補体化因子の化学的性質に基づき、われわれは補体
化因子が、糖、ならびにベンゼン環（疎水性領域に寄与
する）を含有すると推測する。
ＬＬ−Ｅ３３２８８のシュードアグリコン（ｐｓｅｕｄ
ｏａｇｌｙｃｏｎｅ）断片は、ラムノース誘導体および
アミノ糖を欠く。アミノ糖の損失は、生物学的活性の１
００倍の損失を生ずる。精製されたシュードアグリコン
を３つの遮断突然変異、菌株ＤＲ４３、ＤＲ４６および
ＤＲ１３１６、の７３−３１培地に、６０時間の培養後
、添加した。各場合において、遮断突然変異は、第７図
に示すように、シュードアグリコンをＬＬ−Ｅ３３２８
８複合体に変換することができた。こうして、各菌株は
アミノ糖誘導体およびラムノース誘導体をつくり、そし
てそれらをシュードアグリコン断片（またはシュードア
グリコンの一部）に結合する能力を保持した。各突然変
異について、シュードアグリコンは遺伝的遮断をバイパ
スするか、あるいはそれを克服した。
プロトプラスト化、再生および遺伝子の転移プロトプラ
スト化（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｎｇ）は、一般に、細
胞壁をリソチームで消化することによって達成される。
生長培地ヘゲリシンを添加すると、多分細胞壁のペプチ
ドグリカン中へのグリシンの取り込みのため、アクチノ
ミセテス（Ａ　ｃｔ　ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のプロト
プラスト化をしばしば促進する。
プロトプラスト化の手順の例は参考書に収集されている
［ホブウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）　％　Ｄ　、　Ａ　、
ら、１９８５、ストレプトマイセスの遺伝子操作（Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　　Ｍｎ１ｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；実験室のマニュアル（Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、ザ・ジョン・イ
ンズ・ファンディジョン（ＴｈｅＪ　ｏｈｎ　　Ｉ　ｎ
ｎｅｓ　　Ｆ　ｏｕｎｄａｔｉｏｎ）　、英国ノーウ（
７チ］。
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９をプロトプラスト化するため
に、−７０℃で２０％のグリセロール中で貯蔵した、１
夜の５×濃縮の細胞の２５０〜５００μｌを、０．１５
％のグリシンおよび２０ミリモルのＣａＣ１ｔを含有す
るＧＥＲ培地（ｌリットルにつき、３ｇの牛肉エキス、
５ｇのトリプトン、Ｉｇのデキストロース、２４ｇの可
溶性澱粉および５ｇの酵母エキス、ｐＨ７，６［キム（
Ｋｉｎ）　、Ｋ。
Ｓ、およびり、Ｙ、リュー（Ｒｙｕ）、１９８３、酵素
および微生物の技術（Ｅ　ｎｚ、　　ａｎｄ　　Ｍ　ｉ
ｃ。
ＴｅｃｈｎｏＬ　）　５　：　２７３−２８０］　）に
２８℃において接種した。細胞を４８〜６０時間生長さ
せ、そしてオレンジ色の顔料が現わ、れた後８時間まで
インキュベーションを続けた。すぐれたプロトプラスト
化には激しい通気が必須であることがわかったので、細
胞は２０　Ｏｒｐｍにセットした床振盪器上の２５０ｍ
１のバッフル付きビーカー内テ生長させた。３個のガラ
スピーズ（約４ｍ■の直径）の添加は塊状化を防止し、
そして培養物の生長およびプロトプラスト化を促進した
。
細胞を３２０　Ｏｒｐｍで１０分間遠心することによっ
て収穫した。沈殿を５０ｏ＋１の１０．３％のスクロー
スで洗浄し、そして再び遠心した。沈殿を２ｍｇ／ａｘ
のリゾチーム（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍまたはＳ　ｉｇｍ
ａ）を含有するプロトプラスト化緩衝液の４＋ｍｌ中に
再懸濁した。プロトプラスト化緩衝液は、ｐＨが７゜６
であった以外、Ｌ緩衝液［ホブウッド（Ｈｏｐｖ。
ｏｄ）　、Ｄ、　Ａ、ら、１９８５、ストレプトマイセ
スの遺伝子操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｍｎ１ｐｕｌａｔ
ｉｏｎ　　ｏｆ３　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　；実験
室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａ
ｎｕａｌ）　、ザ争ジ３ンーインズ・ファンディジョン
（Ｔｈｅ　　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｉ　ｎｎｅｓ　　Ｆｏｕｎ
ｄａｔｉｏｎ）　、英国ノーウィッチ］に類似した。Ｐ
緩衝液【キム（Ｋｉ■）、Ｋ、Ｓ、およびり、Ｙ、　リ
ュー（Ｒｙｕ）、１９８３、酵素および微生物の技術（
Ｅｎｚ、　　ａｎｄ　　Ｍｉｃ、　　Ｔｅｃｈｎｏｌ、
　）　５　：　２７３−２８０１の変更した形態を、ま
た、使用した：ＭｇＣ１，は２５ミリモルであり、モし
てＣａＣ１，を５０ミリモルにし、そして再びｐＨを７
．６にした。細胞は１〜２時間３０℃でインキュベージ
腸ンした。プロトプラスト化の程度は相対照顕微鏡（ｐ
ｈａｓｅ　　ｃｏｎｔｒａｓｔ　　＋ｉ＋１ｃｒｏｓｃ
ｏｐｅ）で監視した。
菌糸体はプロトプラストの発現を阻害することがあるの
で、リゾチーム処理した培養物のほとんど大部分がプロ
トプラスト化してしまうまで待つごとが有利であった。
われわれは一般に９５％より多いプロトプラスト化を観
察した；細胞の８０％より少なくかプロトプラストであ
った場合、培養物を使用しなかった。プロトプラスト化
時間が２時間を越えた場合、われわれは有効な再生（ｒ
ｅｇｅｎｅｒａｔ　１ｏｎ）を観察しなかった。すべて
の場合において、プロトプラスト化後、ＭｇＣ１，およ
びＣａＣｌ２の最終濃度を、それぞれ、２５ミリモルお
よび５０ミリモルに調節し、そして体積をわれわれの変
更したＰ緩衝液中で３＋ｉｌにした。プロトプラストを
菌糸体から分離するために、記載されるように［ホブウ
ッド（Ｈｏｐｖｏｏｄ）　、Ｄ、　Ａ、ら、１９８５、
ストレプトマイセスの遺伝子操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　
Ｍｎ１ｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）；実験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）、ザ・ジョン・インズ・フ
ァンディジョン（ＴｈｅＪ　ｏｈｎ　　Ｉ　ｎｎｅｓ　
　Ｆ　ｏｕｎｄａｔｉｏｎ）　、英国ノーウ（−／チ］
、調製物をまず変更したＰ緩衝液ですすいだ後、綿を通
してろ過した。あるいは、変性Ｐ緩衝液ですすいだ後、
孔大きさ５ミクロンのシュレイヒア−（５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ）およびシュネル・スパータン（Ｓｃｈｎｅｌｌ
　　５ｐａｒｔａｎ）フィルターを通してろ過した。
プロトプラストは再生培地上に接種することによって再
生し〔キム（Ｋｉｎ）　、Ｋ、Ｓ、およびり。
Ｙ、リ−Ｌ−（Ｒｙｕ）、１９８３、酵素および微生物
の技術（Ｅｎｚ、　　ａｎｄ　　Ｍｉｃ、　　Ｔｅｃｈ
ｎｏｌ、）５　：　２７３−２８０１　、ただしスクロ
ースの最適濃度は０．１５モルであることがわかった。
軟質寒天中にプロトプラストを重ねることによって、再
生効率は改良された。プロトプラストは、３０℃で１０
日ないし２週のインキュベーション後に、再生して可視
のコロニーを形成した。
再生条件の変更をいくつか試みたが、成功しなかった。
菌糸体はスクシネートおよびグリセロールＧ：　高イ濃
度で耐えることができないので、スクシネートおよびグ
リセロールは浸透圧安定剤として無効であった。好まし
い炭素源であるスクロースは浸透圧安定剤として必要で
あったので、別の単素源の存在は、多分、再生培地中に
おける炭素の利用を変更しないであろう。他の窒素源、
０゜５％の酵母エキスまたは０．５％のＮＺアミンをア
スパラギンの代わりに使用した。アスパラギンを含有す
るわれわれの再生培地に比較して、合理的な頻度にもか
かわらず、ムコイドのコロニーのみが観察された。コロ
ニーは、顕微鏡において、Ｌ形態を含有するが、菌糸体
を含有しないことが明らかであった。さらに、コロニー
は浸透圧安定剤を含有する培地上で複製しなかった。明
らかに、プロトプラストの再生は、生長制限窒素源を含
有する培地において増大した。われわれは、また、浸透
圧安定剤としてスクロースを含有するＧＥＲ培地上でプ
ロトプラストを再生する試みをし、そして多少の無機質
を添加した。再び、ムコイドのコロニーが合理的頻度で
生長したが、それらは、また、Ｌ形態であることがわか
った。
次は典型的な成功した実験である。細胞を、前述のよう
に、収穫し、そしてリゾチームで処理した。３０℃で１
．５時間後、顕微鏡観察によって推定して、細胞の約９
５％はプロトプラストであった。ペトロッ７−ハウザー
（Ｐ　ｅｔｒｏｆｆ　−Ｈｏｕｓｅｒ）計数室を使用し
て、プロトプラストの濃度は２゜９　Ｘ　１０　’／ｍ
ｌであると決定された。培養物を５ミクロンのフィルタ
ーによっておだやかにろ過した。プロトプラストのみ、
および約１％の小さい菌糸体の断片が顕微鏡で観察され
た。プロトプラストの力価は２．３５ＸｌＯ’／ｍｌで
あった。プロトプラストを変更Ｐ緩衝液中で希釈し、そ
して再生培地上に配置した。培養物を、また、スクロー
スを欠く再生培地上に配置して、プロトゲラスト化しな
かった細胞を測定した。なぜなら、プロトプラストは浸
透圧安定剤の不存在下に溶菌するであろからである。３
日後、数個のコロニーは希釈率が低い接種物について、
０．１５モルのスクロースを含む平板または含まない平
板について見ることができた。これらのコロニーは、多
分、プロトプラスト化されていない細胞を表わすであろ
う、、１週後、より多くのコロニーはプロトプラストの
再生のために見ることができた。１１日後、はとんどす
べての生存すφプロトプラストは可視のコロニーを形成
した。
０．２モルの　豊艶　　コロニー　コロニー　　’ｌＪ
％スクロース　　　　　　　　　／ｙａ（１−５Ｘ　１
０−’　　　３９４　　８Ｘ　１０’　　　　　０．３
％−５Ｘ　ｔｏ−’　　　　１２　　２Ｘ　１０’　　
　　　０．９％＋　　５Ｘ　１０−”　　　３２４０　
　６．５Ｘ　１０’　　　　２．８％＋　　５ｘｌＯ−
１５０１ｘｌＯ’　　　　　４．２％０．２モルのスク
ロースが菌糸体の生長を阻害してさえ、スクロースの添
加はプロトプラスト培養物の生存を増大した。したがっ
て、スクロースを含有する培地中の生存の増大はプロト
プラストの再生の増大のためである。われわれの１〜４
％の再生の頻度は形質転換系について合理的である。
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の誘導体間の遺伝子の交換を
立証するために、２つの栄養要求変異株間のプロトプラ
ストの融合を試みた。菌株ＤＲ２２６は生長のためにウ
ラシルおよびアルギニンを要求し、これに対して菌株Ｄ
Ｒ１４６は芳香族アミノ酸、パラ−アミノ安息香酸およ
びパラ−ヒドロキシ安息香酸を要求する。両者の突然変
異は１つの生化学的反応（ウラシル−アルギニン要求体
についてカルバモイルホスフェートの生産および芳香族
アミノ酸の要求体についてシキミ酸の経路の生産）に影
響を及ぼす単一の遺伝的欠陥を含有することがある。２
つの突然変異のプロトプラストを融合することによって
、われわれは野生型細胞の再生を観察しようとした。
細胞を前述のようにプロトプラスト化した。１００μｌ
のＤＲ２２６をマイクロ遠心管中で１００μｌのＤＲ１
４６と混合した。１０秒間の遠心後、上澄みを注ぎ出し
、そしてプロトプラストを上澄みの残りの滴の中におだ
やかに再懸濁した。
０．８ｍｌの５０％のプロピレングリコール溶液（ＰＥ
Ｇ　　１０００、Ｂ　ａｋｅｒ）を、前述の変更したＰ
緩衝液に添加した。プロトトロ−７について選択するた
めに、０．０１％のカサミ酸を欠く最少再生培地を使用
した。なぜなら、再生の頻度はカサミ酸の存在下または
不存在下にほぼ同一であることがわかなからである。浸
透圧安定剤を含有しないか、あるいは０．２モルのスク
ロースを含有する最少再生寒天培地上に５０μｌの融合
したプロトプラストを載せた。また、対照としてプロト
プラスト化前の培地の等体積を配置した。４週後、次の
コロニーが観察された。
ＤＲ１４６菌糸体　　　０ ＤＲ２２６菌糸体　　　ｌ ＤＲｌ　４６および ＤＲ２２６菌糸体　　　１　　　　　　３０菌糸体の中
のプロトトロープの数は事実上０であり、これに対して
プロトプラスト化、２回の培養および融合後、小さいが
有意な量のプロトトロープが再生した（観察された最大
の再生頻度は４％である）つ栄養要求変異株のプロトト
ロープへの融合は、ＮＲＲＬ−１５８３９の誘導体内で
遺伝子を転移する能力を立証する。今や、突然変異を１
つの菌株から他の菌株へ転移させることが可能である。
われわれは、ＮＲＲＬ−１５８３９内の内因性プラスミ
ドを検出しなかった。Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ
はＳ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓに関係づけられ、そして
いくつかのＳ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのプラスミドを
入手することができる。したがって、われわれは、Ｓ　
ｔｒｅｐｔｏｍＶＣ６Ｓのよく特徴づけられたプラスミ
ドが菌株ＮＲＲＬ−１５８３９中で、また、複製するで
あろうという希望をもって、その誘導体を構成すること
を決定した。
Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのプロモーターのグローブ
プラスミドｐｌＪ４８６は、多コピーグラスミド上にチ
オストレプトン耐性遺伝子を含有する。そのレプリコン
はＳ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ内に広い宿主範囲を有す
るｐＩ　Ｊ　Ｉ　Ｏｌから誘導するので、ｐｌＪ４８６
はＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのプラスミドのため
のすぐれた出発点であると思われた。菌株ＬＬ−Ｅ３３
２８８はＧＥＲ培地または最少寒天培地中で少なくとも
５００μｇ／ｍｌのチオストレグトンに対して部分的に
抵抗性であるので、チオストレプトン耐性遺伝子は有用
ではなかった。しかしながら、ｐｌＪ４８６は、また、
他の潜在的に有用な遺伝子、すなわち、ａｐｈｌｌと呼
ぶトランスボゾンｔｎ５からのカナマイシン耐性遺伝子
を含有する。しかしながら、ａｐｈｌ　Ｉ遺伝子はプロ
モーターを欠き、それゆえ非常に低いレベルで発現され
る。プロモーターは、ａｐｈｌｌのための解読領域より
上流のポリリンカー中に断片をクローニングし、Ｓ。
１１ｖｉｄａｎｓを形質転換し、そしてカナマイシン耐
性について選択またはスクリーニングすることによって
同定できる。ａｐｈｌｌ遺伝子を「活性化」するために
、２つの理由で菌株ＮＲＲＬ−１５８３９からのＤＮＡ
断片を挿入した０Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａから
誘導されたプロモーターは、グラスミド誘導体がＳ、　
１ｉｖｉｄａｎｓから菌株ＮＲＲＬ−１５８３９中に転
移されるとき、ａｐｈｌｌの発現を推進するほとんどの
機会を与えるであろう。また、Ｍｉｃｒ。
ｑｏｎｏｓｐｏｒａから誘導されたＤＮＡ配列は、プラ
スミドのレプリコンが菌株ＮＲＲＬ−１５８３９中で機
能できなかった場合、相同的再組換えによって、プラス
ミド誘導体の維持の別のモードを可能とするであろう。
プラスミドは、記載されているように〔ホブウッド（Ｈ
ｏｐｖｏｏｄ）　、Ｄ、　Ａ、ら、１９８５、ストレプ
トマイセスの遺伝子操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｍｎ１ｐ
ｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｗａｙｃ
ｅｓ）　；実験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）　、ザ・ジョン鳴インズ・フ
ァンディジョン（Ｔ　ｈｅ　　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｉ　ｎｎ
ｅｓＦ　ｏｕｎｄａｔｉｏｎ）　、英国ノーウィッチ］
、Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ　　Ｔ　Ｋ　５４　／ｐｉ　Ｊ
　４８６から、Ｎａ０Ｈ−ＳＤＳを使用するアルカリ性
溶菌および酸性にアセテートを使用する中和によって、
次いでＣｓＣ１密度勾配遠心［マニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）　、Ｔ、、Ｅ、Ｆ、７リトシ（Ｆ　ｒｉｔｓｃ
ｈ）およびＪ、サムブロック（Ｓ　ａｍｂｒｏｃｋ）、
１９８２、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、：！−／ｌ／ドー２プリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、ニュ
ーヨーク州、コールド・スプリング・ハーバ−〕によっ
て調製した。次いで、精製したプラスミドを独特Ｂａｍ
ＨＩ　　’部位で消化し、フェノールで抽出し、そして
酢酸アンモニウムおよびエタノールで沈殿させた。線状
プラスミド分子を子牛腸アルカリ性ホスファターゼで処
理して、ベクターとベクター末端との結合を防止した。
酵素を加熱キリング（ｋｉ　ｌ　ｌ　ｉｎｇ）およびフ
ェノール抽出によって不活性化な。酸性化Ｎａアセテー
トおよびエタノールで沈殿させた後、ベクターをＴＥ緩
衝液（１０モリモルのトリスｐＨ８，１ミリモルのＥＤ
ＴＡ）中に再懸濁して結合のために準備した。すべての
酵素はベーリンガー◆マンハイム（Ｂ　ｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）からのものであり、そして
すべての反応はペーリンガー・マンハイムが推奨するよ
うにして実施した。Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａの
染色体のＤＮＡを、記載されるように［ホブウッド（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ）　、Ｄ、　Ａ。
ら、１９８５、ストレプトマイセスの遺伝子操作（Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　　Ｍｎ１ｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；実験室のマニュアル（Ａ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）、ザ・ジョン
・インズ・ファンディジョン（ＴｈｅＪ　ｏｈｎ　　Ｉ
　ｎｎｅｓ　　Ｆ　ｏｕｎｄａｔｉｏｎ）　、英国ノー
ウィッチ］、リゾチーム−ＥＤＴＡ、プロイテナーゼに
１ＳＤＳ、およびフェノール−クロロホルム抽出を用い
て分離した。イソプロパツール沈殿後、ＤＮＡ調製物を
１ｍｌのＴＥ中に再懸濁させた。培養物のストリーク（
ｓｔｒｅａｋ）はそれが純粋であることを明らかにした
。
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９から調製した染色体ＤＮＡを
ＢａｍＨＩおよび５ａｕ３Ａｌで消化し、そして断片を
０．５μｍの直線化ｐＩＪ４８６ベクターに結合した。
インサート対ベクターのモル比は３であった。１６℃で
１夜結合した（ベーリンガー・マンハイムの酵素および
方法）後、このＤＮＡを記載するように使用してＳ、１
ｉｖｉｄａｎｓ菌株ＴＫ５４を形質転換した。５ａｕ３
Ａ１インサートに結合したｐＩＪ４８６について、結合
したＤＮＡの０．２５μｇをＴＫ５４のプロトプラスト
に添加し、これらをＲ５平板上に接種し、そして２８℃
で３０時間インキュベーションした。平板をｌ／ｌＯ体
積の１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＲ５軟
質寒天で覆った。ＢａｍＨＩインサートに結合したｐＩ
Ｊ４８Ｂについて、結合したＤＮＡの０．５μｇをＴＫ
５４のプロトプラストに添加し、そしてアリコートを２
つの平板上に接種した。示されているように、一方をカ
ナマイシンで覆い、そして他方をオーバーレイ（ｏｖｅ
ｒ　１ａｙ）中の５００μｇ／＋ｎｌのチオストレプト
ンで覆った。
後者の平板について、チオストレプトンの添加後、７１
のコロニーが生長した。カナマイシンで覆った平板につ
いて、細胞の菌叢は平板のほとんどの上で生長した。平
板のパッチ（ｐｉｔｃｈ）から、単一のコロニーを分離
した。示した薬物を含有する最少培地上にコロニーを複
製したとき、次の結果が観察された。
ＢａｍＨＩ断片 Ｂａｇ）（Ｉ断片 カナマイシンで直接選択したコロニーの多くは、アーチ
ファクトであった。形質転換体Ａにおいて、わずかに５
つのコロニーがチオストレプトンに対して抵抗性であっ
た。チオストレプトン感受性コロニーは真の形質転換体
でないと、われわれは推定した。形質転換体Ｂはより有
効であった。４５の推定上のカナマイシン耐性形質転換
体のうちで、４３はまたチオストレプトンに対して耐性
であった。チオストレプトンで選択した５６のコロニー
（形質転換体Ｃ）のうちで、５４は再試験したときチオ
ストレプトン耐性であることが示され、これらのうちで
、３４は少なくとも限界的にカナマイシン耐性であり、
はとんどのインサートがａｐｈＩＩの発現を命令するプ
ロモーターを含有することを示唆した。
カナマイシンおよびチオストレプトンに対して抵抗性の
コロニーがプラスミドを含有することを示すために、２
０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する平板上のコロニ
ーの大きさによって判定して、最もカナマイシン耐性で
あった１７のコロニーからプラスミドを分離した。１０
は形質転換体Ａからのものであり、１はは形質転換体Ｂ
からのものであり、そして６はは形質転換体Ｃからのも
のであった。プラスミドのミニプレプ（ｍｉｎｉｐｒｅ
ｐ）はプラスミドの調製について前述したように調製し
たが、ただしミニブレプは記載するように規模を小さく
した。プラスミドは各調製物においてアガロースゲルの
電気泳動によって観察した。コロニーの少なくとも１４
はｐｌＪ４８６の対照より大きいプラスミドを含有し、
カナマイシン耐性がａｐｈｌｌ遺伝子の前のＭ　ｉｃｒ
ｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのＤＮＡインサートのためである
ことを示唆した。インサートの大きさは、５つのクロー
ンについて、制限分析によって、１５Ｋｂｐ（プラスミ
ドｐＰＰ４）、１．８Ｋｂｐ（プラスミドｐＰＰ８）　
、０．７Ｋｂｐ。
０．７Ｋｂｐおよび０．４Ｋｂｐ（プラスミドｐＰＰ１
４）であると決定された。カナマイシンに対してして最
も耐性であり、プラスミドｐＰ　Ｐ　４、ｐＰＰ８およ
びｐＰＰ１４を有する、３つのクローンを、２００μｇ
／ｍｌのカナマイシンおよびチオストレプトンを含有す
るＲ５寒天培地上で、および２０μｇ／ｍｌのカナマイ
シンを含有する最少平板上で生長させた。
これらの３つのプラスミド中のＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐ
ｏｒａのインサートの存在は、シュレイヒア−（Ｓ　ｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュエル（ｓ　ｃｈｕｅｔｌ
）におけるようにして、サザン分析によって確証された
（第８図）　＠　ＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのＤＮ
ＡおよびＳ−１ｉｖｉｄａｎｓＴＫ５４の染色体ＤＮＡ
をＢａｍＨＩで消化し、０．５％のアガロースゲルに適
用し、そしてアルカリ中で変性した。ＤＮＡをニトロセ
ルロースのフィルターに移し、これをニック翻訳（ＮＥ
Ｎニック翻訳キット）によってα−３！Ｐ−ｄＣＴＰで
標識した精製したｐＰ　Ｐ　８のＤＮＡのプローブ（０
，５μｇ）とハイブリダイゼーションした。
約１０　’ｃｐＩ１１のプローブをフィルターと４２℃
においてハイブリダイゼーションさせた。最後の洗浄は
５５℃において０．ｌＸ５ｓｃによって実施した。レー
ンｌは対照であり、ＢａｍＨｌで制限したｐＰＰ８の１
５０μｇへのプローブのハイブリダイゼーションを示す
。プローブは２つの帯にハイブリダイゼーションする；
ｌ−８Ｋｂｐのインサートの帯、および６−２Ｋｂｐで
ある、直線のｐｌＪ４８６を表わすより大きい帯。レー
ン２において、ＢａｍＨＩで制限した２、５μｇのＭ　
ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのＤＮＡを適用した。１．
８Ｋｂｐの帯は明瞭に見ることができ、Ｍ　ｉｃｒｏｍ
ｏｎｏｓｐｏｒａの染色体中のその存在を示す。Ｓ　、
　１ｉｖｉｄａｎｓのＤＮＡを含有するレーン３はシグ
ナルを与えず、１．ｇＫｂｐ＋ｔｓ。
１ｉｖｉｄａｎｓのゲノムから誘導されないことを示し
ている。ｐＰＰ４を使用して同様な実験を実施した。
プローブをＢａｍＨＩで消化したＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏ
ｓｐｏｒａのＤＮＡヘハイブリダイゼーシッンしたトキ
、２つのＢａｍＨＩの帯が観察され、そしてＳ、　１ｉ
ｖｉｄａｎｓのＤＮＡでは帯は観察されず、ｐＰＰ４が
８゜５Ｋｂｐまで付加したＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏ
ｒａからのＢａＩＩＨ１断片の２つを含有することを示
している。
ｐＰＰ１４をプローブとして使用したとき、ＢａｖａＨ
ｌで切断したＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのＤＮＡ
をプロービングしたときにのみ、帯が再び観察され、Ｓ
。
１ｉｖｉｄａｎｓのＤＮＡでは観察されなかった。した
がって、すべての３つの場合において、ａｐｈｌｌ遺伝
子の発現を活性化するＤＮＡインサートは、菌株ＮＲＲ
Ｌ−１５８３９から誘導された。
プラスミドｐＰＰ４、ｐＰ　Ｐ　４、ｐｐ　Ｐ　８およ
びｐＰＰ１４を宿主Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ　　ＴＫ５
４中に配置し、そして１９８７年３月６日にアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクシ理ン（Ａ　ｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅ　　ＣｕＨｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ、　　ｌ　２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ
、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＩＪ。
Ｓ、Ａ、２０８５２）に受託され、そしてその永久収集
物に加えられた。ｐｐ　Ｐ　４は、このような受託所に
よって、菌株表示ＡＴＣＣ−６７３４３を割当てられ、
そしてｐＰＰ１４は、このような受託所によって、菌株
表示ＡＴＣＣ−６７３４１を割当てられた。このような
培養物の利用は、本願の係属中、それに対して権限を与
えられた特許および商標の局長によって、３７　　Ｃ，
Ｆ、Ｒ。
９１．１４および３５　　Ｕ、Ｓ、Ｃ，目１２２の規定
に従い決定され、そしてこのような培養物についての公
衆への利用に対するすべての制限は本願が許されたとき
最終的に排除される。
菌株ＬＬ−Ｅ３３２８８の形質転換 プラスミドｐＰ　Ｐ　８はカナマイシンに対する耐性を
付与しかつ相当の大きさく１．８ｋｂｐ）のインサート
を含有するので、これを使用してＮＲＲＬ−１５８３９
のプロトプラストを形質転換した。
われわれの原理的説明は次の通りであった。ｐｒＪ４８
６のレプリコンは菌株ＮＲＲＬ−１５８３９中で複製す
ることができなかった場合、プラスミドはなおＭ　ｉｃ
ｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａの染色体中への相同組換えによ
って維持されうるであろう。より小さいインサートをも
つグラスミド（すなわち、ｐＰＰ１４）は組換えを行う
傾向がより少ないであろう。プラスミドｐｐ　Ｐ　４の
インサート（８，５Ｋｂｐ）はそのプラスミドの大きさ
を劇的に増加したので、プラスミドｐＰ　Ｐ　４は魅力
的選択に劣るように思われｔ；。Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏ
ｓｐｏｒａが未修飾の異質ＤＮＡを消化量ることができ
ない制限系を含有する場合、それは多分ｐｐ　Ｐ　８よ
りいっそう厳しくこのような大きいプラスミドを制限す
るであろう。
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９のプロトプラストを、前述の
ように、リゾチーム処理に従い５ミクロンのフィルター
を使用して調製した。プロトプラストは、Ｓ　ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓの形質転換について使用したもの〔ホブ
ウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）　、Ｄ　、　Ａ　、ら、１９
８５、ストレプトマイセスの遺伝子操作（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　　Ｍｎ１ｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　５ｔｒｅｐｔ
ｏ＋ｍｙｃｅｓ）；実験車のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）　１ザ、ジョン、イ
ンズ・７アンデイシ３ン（ＴｈｅＪ　ｏｈｎ　　Ｉ　ｎ
ｎｅｓ　　Ｆ　ｏｕｎｄａｔｉｏｎ）　、英国ノーウ（
−／チ］に類似するプロトコールを使用して、ｐＰＰ８
のプラスミドＤＮＡを使用して形質転換した。
３．４ＸｌＯ”のプロトプラストを含有する１００μｌ
を１０秒間遠心（マイクロ遠心機）し、沈殿物をデカン
テーションし、そしてプロトプラストを上澄みの残留す
る滴中に注意して再懸濁した。
１８μｌのｐＰＰ８（４μｇ）を添加し、次いで１００
μｌのＴ緩衝液中の２５５のＰＥＧ　　１０００を添加
した。対照を平板培養して再生の頻度を示し、そして形
質転換混合物の大部分を０．１５モルのスクロースを有
する４ＲＭ平板上にオーバーレイした。
形質転換体は、１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを軟質
寒天の１／１０体積で平板をオーバーレイ（ｏｖｅｒ　
１ａｙ）することによって選択した。しかしながら、薬
物をいつ添加すべきかは不明瞭であった。薬物耐性が良
好に発現される前におよび／または脆いプロトプラスト
が再生する前に、カナマイシンを速く添加し過ぎる場合
、形質転換体は生存しえないであろう。カナマイシンを
最適な時間後に添加した場合、プラスミドが菌株ＮＲＲ
Ｌ−１５８３９中で安定に維持されえない場合、あるい
は菌糸体がプロトプラストの再生を阻害する場合、形質
転換体は検出されえないであろう。したがって、われわ
れは２回でカナマイシンのオーバーレイ（ｏｖｅｒ　１
ａｙ）を添加することを決定した；２８℃における１日
のインキュベーション後、および６日後。６つのコロニ
ーを１日後にオーバーレイした平板から生長し、そして
平板を６日後にオーバーレイしたとき、１２７コロニー
が生長した。コロニーは、カナマイシンを含有しないか
、あるいは１または５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有
するＧＥＲ平板上で複製させた。カナマイシンの存在下
に良好に生長した１７のコロニーを、５０．１５および
５μｇ／ｍｌの薬物を有する平板で再試験し、そしてカ
ナマイシンに対するそれらの耐性はそれらがプラスミド
を含有しうろことを示唆した。さらに、これらのコロニ
ーはチオストレプトン（ＧＥＲ平板中で５００　Ｐｇ／
ｍｌ）にわずかにより抵抗性であるように見えた：カナ
マイシン耐性のクローンは、野生盤コロニーより１日前
にチオストレプトンの存在下の生長しｔ；。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下に生長した６つ
のコロニーのために、プラスミドのミニプレプを５μｇ
／ｍｌのカナマイシンを含有するＧＥＲ平板培養物から
つくった。２５μｍのプラスミドの調製物のｌＯμｌを
０．７％のアガロースゲルに適用した。われわれのミニ
プレプにおける染色体の帯は顕著であったが、プラスミ
ドの帯が存在するかどうかを述べることは困難であった
。プラスミドのｐＰ　Ｐ　８はわれわれのカナマイシン
耐性菌株中に存在したが、コピーの数はＳ、　１ｉｖｉ
ｄａｎｓにおけるよりも低いことが考えら、れた。また
、バクテリアの染色体中に組込んだ後、プラスミドの配
列が維持されることがありえた。われわれの検出の可能
性を増加しかつこれらの２つの可能性を区別するために
、サザン転移（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ　　ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ）を実施し［シュレイヒアー（Ｓ　ｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ）およびシュエル（Ｓ　ｃｈｕｅｌｌ）法１を実施し
、そして親プラスミド、ｐＩＪ４８６、をプローブとし
て使用した。
サザンハイプリダイゼーションを第９図に示す。
レーンｌおよび２は、フィルターの固定された、ｐＰ　
Ｐ　８精製プラスミドおよびＳ、　１ｉｖｉｄａｎｓ菌
株ＴＫ５４／ｐＰＰ８　　ＤＮＡのミニプレプを含有す
るニブローブにハイブリダイゼーションした２つのＤＮ
Ａ帯が存在し、これらは共有的に閉じた円の形態および
ニツクド（ｎｉｃｋｅｄ）プラスミドの形態に対応する
。着色したゲルを検査すると、転移前に、スーパーコイ
ルド（５ｕｐｅｒｃｏ　ｉ　１ｅｄ）プラスミド帯より
明瞭に上に存在する、染色体ＤＮＡ帯の位置が示された
。レーン３において、われわれの推定上のＳ　ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓの形質転換体からの主要なシグナルは、
Ｓ　、　１ｉｖｉｄａｎｓからのｐＰ　Ｐ　３の共有的
に閉じた円と同一の位置に存在する。こうして、ｐｐ　
Ｐ　８は菌株ＮＲＲＬ−１５８３９中で自律的に複製し
、そして組込まれない。
Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのプラスミドのミニプ
レプを、また、ＢａＴｏ）Ｉｔで制限し、これは１．８
Ｋｂｐのインサートを解放し、ｐｌＪ４８６の線状の形
態を生ずるであろう。そのゲルのサザンは第１Ｏ図に示
されている。レーンｌは、ＢａｍＨＩで切断し、そして
標識したｐｌＪ４８６でプロービングした、ｐＰＰ８の
精製したプラスミド調製物を示す。レーン２は、菌株Ｎ
ＲＲＬ−１５８３９のＤＮＡをこのゲル中で展開したと
きのシグナルを示さない。
レーン３において、Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａの
ミニプレプからのＤＮＡを、ゲル電気泳動前に、Ｂａｍ
ＨＩで切断した。このプローブはｐｌＪ４８６に相当す
る帯とハイブリダイゼーションし、形質転換体中のプラ
スミドの存在を確証する。
Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａの形質転換体からの他
のプラスミドのミニプレプを使用して、Ｓ、　１ｉｖｉ
ｄａｎｓＴＫ５４をチオストレプトン耐性に形質転換し
た。
３つのチオストレズトン耐性コロニーが得られた。
プラスミドを１つのクローンから調製し、そしてアガロ
ースゲルの電気泳動はｐＰ　Ｐ　８の大きさのプラスミ
ドを明らかにした。チオストレプトンおよびカナマイシ
ンの耐性を与えるＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａから
のプラスミドの回収は、われわれが形質転換体を分離し
たことを、独立に確証する。
け われわれの本来の目標は、Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏ
ｒａから誘導された、前述のプロモーターを明らかにす
ること、および菌株ＮＲＲＬ−１５８３９によってされ
た開始部位が、比較的よく特性づけられた、有機体であ
るＳ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　１ｉｖｉｄａｎｓの
それに類似するかどうかを示すことであった。予期され
ない、潜在的に非常に有用な性質を有する１つのＤＮＡ
配列がＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａから得られたこ
とが、だんだん明らかになった。このＤＮＡ断片は、２
つのタイプの多数のプロモーターを含有する。
一方のプロモーターは生長する細胞中で主として活性で
あり、活性はカナマイシン耐性を要求することによって
選択した。さらに、この断片は３つのプロモーターのク
ラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を含有し、これらのプロモ
ーターは、細胞が休止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　　ｐ
ｈａｓｅ）に入った時および薬物ＬＬ−Ｅ３３２８８複
合体が生産される時、最も活性である。ここで、われわ
れは、プロモーターを有する断片より下流に所定の構造
遺伝子、またはそのより小さい誘導体を配置することに
よって、生命環の特定の時に遺伝子を発現するように、
遺伝子の発現を調節することができる。ある種の遺伝子
を休止期の間においてのみ発現することは有利であろう
。なぜなら、対数期の間にある遺伝子が発現される場合
、それは致命的でありうるからである。例えば、ＬＬ−
Ｅ３３２８８複合体の生合成経路の一部である酵素の遺
伝情報を指定する構造遺伝子は、薬物がつくられる時に
のみ、その酵素の活性が現われるように、われわれのＤ
ＮＡ配列の後に配置できるであろう。
プラスミドｐＰ　Ｐ　４、ｐＰ　Ｐ　８およびｐＰＰ１
４のすべては、ａｐｈｌｌ遺伝子の前に挿入された、菌
株ＮＲＲＬ−１５８３９から誘導されたＤＮＡを含有す
ることが、サザン分析によって示された（第８図）、Ｄ
ＮＡの配列はＳ、　１ｉｖｉｄａｎｓ中のａｐｈｌｌ遺
伝子の発現を促進するので、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９
からＲＮＡを分離し、そして転写を測定することによっ
て、Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ中のそれらのプロ
モーターの活性を検査することを決定した。
細胞の凍結した種子培養物を５０ｍ１のＧＥＲ培地（３
／１０００希釈）中に接種し、６０時間インキュベージ
ａシン後培養物を凍結した培地と混合し、３分間１００
００　ｒｐｎ＋で遠心し、そして細胞の沈殿物を使用す
るまで一７０℃で貯蔵した。
ＲＮＡの劣化を防止するために、細胞は急速に収穫しそ
して急冷した。沈殿物をグアニジウムイソチオシアネー
ト（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ　　１ｓｏｔｈｉａｃｙａｎａ
ｔｅ）溶液中に再懸濁し［チルブライン（Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎ）、Ｊ、Ｍ、ら、１９７９、生化学（Ｂ　ｉｏｃｈ
ｅｍ、　）　１８　：　５２９４−５２９９］　、そし
てソニプレプ（Ｓ　ｏｎｉｐｒｅｐ）　１５０　（Ｍ　
Ｓ　Ｅ　）中で１６ミクロンのパワー（ｐｏｗｅｒ）で
合計１〜２分間音波旭理した；細胞の少なくとも９０％
が微視的観察によって溶解された。ＲＮＡはＣｓＣ１の
クッシ腫ン（ｃｕｓｈｉｏｎ）を通す遠心によって分離
し［ターペン（Ｔｕｒｐｅｎ）　、Ｔ、　Ｈ，およびＯ
，Ｍ、グリｙ４ス（Ｇ　ｒｉｆｆｉｔｈ）、１９８６、
生物技術（Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　、４　：
　ｌ　ｌ　−１５１、フェノール−クロロホルムで抽出
し、エタノール沈殿させ、そしてエタノール沈殿物とし
て一２０℃において、あるいは水中で一７０℃において
貯蔵した。ｐＰＰ４、ｐｐ　Ｐ　８およびｐＰＰ１４の
インサートによってコード（ｃｏｄｅ）される内因性転
写体を同定するために、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９から
のＲＮＡをホルムアルデヒドを含有するアガロースゲル
に適用し［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、Ｔ、　
、Ｅ　。
Ｆ、フリトシ（Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ）およびＪ、サムブｏ
　−７り（Ｓ　ａｍｂｒｏｃｋ）、１９８２、分子クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｔｏｎｉｎｇ）　
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ
ｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）　、ニューヨーク州、コールド・スプ
リング・ノ＼−バー１、フィルターに移し、そして標識
したｐＰＰ４、ｐＰＰ８およびｐＰＰ１４に対してハイ
ブリダイゼーションした（ノザン分析）。
第１１図は最初のノザン実験である。２つの転写体、４
５０および３７５塩基長さ、はｐＰＰ１４のプローブに
対してハイブリダイゼーションする。ｐＰＰ１４は２つ
の明確な転写体に対してハイブリダイゼーションしたの
で、転写の調節に関係する、少なくとも２つのシグナル
がＭ　ｉｃｒｏｍｏｎ。
５ｐｏｒａのＤＮＡインサート内に存在したように思わ
れた。この断片は２またはそれよい多いプロモーター（
転写の開始に必須な部位）、またはプロモーターおよび
転写停止部位を含有しえたであろう。
０．４ＫｂｐのＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのＤＮ
Ａインサート内の転写開始部位を精確に同定するために
、次に、ｌ系列のＳｌヌクレアーゼ転写マピイングの研
究を開始した。０．４ＫｂｐのインサートをｐＵＣ１９
、Ｅ、ｃｏｌｉのベクター、中にサブクローニングした
。ここで、ポリリンカーのＢａｍＨＩＩ■部位、および
ａｐｈｌｌに隣接するＢａｍＨ１部位を利用し、そして
Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＪＭ８３（ＮｅｗＥ　ｎｇｌａｎｄ　
　Ｂ　１ｏｌａｂｓ）をアンピシリン耐性に形質転換し
た。（Ｓａｕ３Ａ１断片をｐＩＪ４８６のＢａｍＨ１部
位中に結合したとき、１つのＢａｍＨＩ部位を再びつく
った。）得られる断片、ｐｐ　Ｅ　Ｃ１４と表示する、
を引続く標識実験のための使用した。断片をＢａｍＨＩ
部位のキナーゼ処理によって標識しくベーリンガー・マ
ンハイムの酵素および反応条件）、そしてＢａｍＨＩ　
１１酵素で消化し、そして一本領のプローブを分離した
［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、Ｔ　、　、Ｅ　
、　Ｆ　、フリトシ（Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ）およびＪ、サ
ムブロック（Ｓ　ａｍｂｒｏｃｋ）、１９８２、分子ク
ローニング（Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌ。
ｎｉｎｇ）　、コールド拳スゲリング拳ハーバ−・ラボ
ラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏ
ｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ。
ｒｉｅｓ）　、ニューヨーク州、コールド・スプリング
・ハーバ−］。過剰のプローブを菌株ＮＲＲＬ−１５８
３９から、あるいはＳ　、１ｉｖｉｄａｎｓ　　Ｔ　Ｋ
　５４／ｐＰ　Ｐ　ｌ　４からのＲＮＡＬｆ）ＩＯμｇ
とハイブリダイゼーションし、そしてハイブリダイゼー
ションした試料を、概説されいるように［ブロシウス（
Ｂ　ｒｏｓｉｕｓ）、Ｊ、、Ｒ，Ｌ、ケイト（Ｃａｔｅ
）、Ｒ，バールムラター（Ｐ　ｅｒｌｍｕｔｔｅｒ）、
１９８２、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー　（Ｊ　、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　）、
１５７　：　９２５０−９２１０１．３００単位／ｍｌ
の最終濃度でＳｌヌクレアーゼ（ペーリンガー・マンハ
イム）で処理した。エタノール沈殿した後、試料をゲル
の電気泳動およびオートラジオグラフィーによって分析
した。
第１２図は、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９のＧＥＲ培養か
らのＲＮＡがハイブリダイゼーションし、モしてＳｌヌ
クレアーゼ消化からのプローブを保護することを示す。
４つの明らかな開始部位が検出された；Ｂａｍ）ＩＩ末
端からほぼ１５０ｂｐの１つの開始部位、およびＢａｎ
＋Ｈ１末端から約２２５ｂｐの３つの開始部位のクラス
ター。明らかなように、このＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐ
ｏｒａＤ　Ｎ　Ａ断片内に同一方向の転写のための多数
の開始部位が存在する。ＲＮＡを、また、Ｓ、　１ｉｖ
ｉｄａｎｓ　　ＴＫ５４／ｐＰＰ１４のＧＥＲ培養らら
調製し、グローブに対してハイブリダイゼーションさせ
、そして転写マツピング分析すると、開始部位は２つの
種において同一でであることが示された。１つの追加の
開始部位は、明らかに、Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ中で発
生し、これはＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａにおいて検
出されず、ｓｉヌクレアーゼ部位から約１７０ｂｐに存
在する。転写のパターンは２つの種において非常に類似
するので、ｓ。
１ｉｖｉｄａｎｓにおけるプロモーターの活性を選択す
るアプローチは有効である。
転写の開始部位ならびに有用な制限部位を示す、０−４
Ｋｂｐの地図は第１３図に示されている。下流のプロモ
ーター（Ｐ２と表示する）と３つの上流のプロモーター
（ＰｌａＳ　ＦｉｂおよびＰｌｃと表示する）との間の
間隔は、ノザン分析を用いて観察されたＲＮＡ間の間隔
（第１１図）とほぼ同一であった。こうして、０．４ｋ
ｂｐの断片は共通の３″末端を有する転写のだめのいく
つかの開始部位を含有するように思われた。他の鎖を標
識し、そしてＳ　、　１ｉｖｉｄａｎｓのＲＮＡとハイ
ブリダイゼーションしたとき、検出可能な転写は検出さ
れず、発散する方向におけるプロモーター活性は示され
なかった。
ＰｉおよびＰ２からの転写をノザン分析によって観察さ
れた２つの帯と関係づけるために、次の実験を実施した
。０．４ｋｂｐのインサートの中央において５ｓｔｌｌ
部位を利用することによって、ｐＵＣ１Ｑ中への０．４
ｋｂｐの配列の下位断片（ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）を
含有するｐＰＥｃ１４の誘導体を構成した。上流部分Ｃ
Ｐｉクラスターを含有する）は、Ｐｓｔｌおよび５ｓｔ
ｌｌで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ベーりンガー
・マンハイム）でプランティング（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）
　Ｌ、　［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、Ｔ　、
　、Ｅ　、　Ｆ　、フリトシ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）および
Ｊ、サムブロック（Ｓ　ａ＋ｎｂｒｏｃｋ）、１９８２
、分子クローニング（Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｔ。
ｎｉｎｇ）　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ
　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ。
ｒｌｅｓ）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・
ハーバ−］、そして結合してｐＰ　Ｅ　Ｃ２を形成する
ことによって欠失させた。０．４　ｋｂｐの断片の下流
部分（Ｐ２を含有する）は、ｐＥｃ１４を５ｓｔｌｌお
よびＳ　ｍａ　Ｉで消化し、次いでプランティングおよ
び結合してｐＰＥＣｌを形成することによって欠失させ
た（第１３図）。予測は、Ｐｌを含有するｐＰＥｏｌは
ノザンにおいてより大きい転写体とのみハイブリダイゼ
ーションするであろうということであった。Ｐ２を含有
するｐＰ　Ｅ　Ｃ２は両者の転写体にハイブリダイゼー
ションするであろう。２つの転写体が重複しない場合、
ｐＰＥｃｌおよびｐｐ　Ｅ　Ｃ２の各々は１つの帯にの
みハイブリダイゼーションするであろう。事実、ノザン
を実施するとき、標識したｐＰ　Ｅ　Ｃ２は両者の転写
体に対してハイブリダイゼーションし、そしてｐＰＥｃ
ｌはまさにより大きい転写体に対してハイブリダイゼー
ションした。こうして、すべてのデータは重複する転写
体と一致する。
より大きい転写が、Ｐｌａ、ＰｌｂおよびＰｌｃからの
開始と一致する、ＲＮＡの調製における多数の帯を実際
に含有するかどうかを見るために、高い分解能のノザン
実験を実施した。Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎ。
５ｐｏｒａからのＲＮＡの試料を、７モルの尿素を含有
する５％のアクリルアミド１０．２７％のビスゲルに適
用した。電気泳動後、ＲＮＡをニトロセルロース上に電
気ブロッティングし、そして標識したｐＰＰ１４のＤＮ
Ａでプロービングした。第１４図は、プローブｐＰＰ１
４に対してハイブリダイゼーションするより大きい転写
体を１より多い成分に分解できることを示す。多数の大
きい転写体はＲＮＡ調製において検出可能であるので、
多数のプロモーター、Ｐｌａ、ＰｌｂおよびＰｌｃ。
はＳ１ヌクレアーゼの消化のアーチファクトであると思
われない。
Ｐｌａ、ＰｌｂおよびＰｌｃのための開始部位の位置を
説明するために、ＤＮＡをＰ２より下流のＡ　ｖａ　１
部位から、マクサム−ギルバートの方法［マクサム（Ｍ
ａｘａ＋ｍ）　、Ａ、　Ｍ、およびＷ、ギルバート（Ｇ
　ｉ　１ｂｅｒｔ）、１９８０、Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　
Ｅ　ｎｚｙｓｉｏｌ、　、６５　：　４９９　５６０１
によって配列決定した。ＰＩの分析のため、ＤＮＡをＨ
ｐａＩＩ／ＮｃｉＩ部位から配列決定した。ＤＮＡを読
鎖についてキナーゼ処理し、そして解読鎖についてＤＮ
Ａポリメラーゼのクレノー断片（ベーリンガー・マンハ
イムの酵素および反応条件）を充填することによって標
識した。ＰＩおよびＰ２の開始部位は、配列決定ゲルに
よるＳｌ消化から保護された断片を一直線にすることに
よって明らかにした（第１５図）。０．４ｋｂｐ断片の
配列の一部を、プラスミドｐＥｃｌおよびｐＥＣ２のサ
ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の配列決定（ＩＢＩキット）に
よって決定した。
多数のプロモーターを使用して同一の下流のＲＮＡを転
写したので、これらのプロモーターの異なる利用がＭ　
ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａの生長環の明確の時期の起
こるかどうかを決定した。菌株ＮＲＲＬ−１５８３９を
添加したホスフェート（Ｋ、ＨＰＯ４を０．０５％に）
を含有する７３−３１培地中で生長させ、そして生長を
ＤＮＡアッセイによりヘキスト（Ｈｏｅｃｈｔ）　３３
２５８試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して記載さ
れているようにして監視した［マクコイ（ＭｃＣｏｙ）
　、ＫＷ、Ｆ、およびＬＢ。
Ｈ，オルソン（Ｏ１ｓｏｎ）、１９８５、アプライド・
アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（
Ａ　ｐり１　、　　Ｅ　ｎｖｉｒｏｎ−Ｍ　１ｃｒｏｂ
ｉｏｌ　、　）、４９：８１１−８１７３゜［同様な生
長曲線は、蛋白質を測定し、バイオ−ラドＣＢ　Ｉ　０
−ＲＡＤ■）を使用することによって得られた。］菌株
ＮＲＲＬ−１５８３９の培養物を、また、われわれが開
発した最少生産培地中で生長させた（Ａｕｘ、に２ＨＰ
Ｏ，を０．０５％に添加し、Ｋｌを０．０１％に添加し
、そしてＴＥＳ緩衝液のｐＨは７．０であった）。
培養物の生長曲線は第１６図に示されている。
この図面に示されているように、対数的生長相の終了徒
歩なくとも６時間まで、ＢＩＡ活性は検出されなかった
。標識したｐＰＥｃｌ４をグローブとして使用した、こ
れらの時点についてのＲＮＡのノザン分析は、第１７図
に示されている。第ル−ンは、対数的に生長する細胞か
ら分離したＲＮＡを含有するｉＰｌから出発したより大
きい形質転換体の非常にわずかが検出され、モしてＰ２
からの３７５塩基の形質転換体のわずかかが検出された
。細胞を休止期において漸進的に遅く収穫するとき、Ｐ
ｌからのより大きい転写体はかなりいっそう顕著となり
、これに対してＰ２からの３７５塩基の転写体はわずか
に減少した（レーン２〜３）。興味あることには、Ｐｌ
から由来する転写体の卓越性は生長培地中のＬＬ−Ｅ３
３２８８複合体の出現と並行する。最少生産培地中で生
長する細胞からのステイシド（ｓｔａｇｅｄ）　ＲＮ　
Ａを使用して（第１７図）、あるいはステイシドＲＮＡ
のＳ１ヌクレアーゼ転写のマツピングの研究から実質的
に同一の結果が観察されｔ；。ＰＬから由来する発現の
増加は、対数期に比較して、休止期の間において少なく
とも１０倍であると、われわれは推定する。
Ｐ２プロモーターは、また、調節を受けるように思われ
る。菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の細胞をＧＥＲ培地中で
生長させるとき、Ｐ２の発現は、対数的生長相の間にお
いて、７３−３Ｉ培地または最少生産培地中で生長させ
た細胞についてより顕著であった（データは示されてい
ない）。ＧＥＲ培地中の定常期間、Ｐ２からの転写は増
加し、これに対してＰ２かもの転写は生産培地中で生長
した細胞について減少した（第１７図）。ＧＥＲ中で冨
んだ窒素を含有する補助物質は、生産培地に比較して、
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９においてＰ２からの発現のこ
れらの差を説明できる。
Ｐ２のプロモーターは、これらの生産培地中で生長する
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９について、対数生長相の間に
おいてのみ転写に有意に寄与するので、われわれはＰＩ
のみあるいはＰ２のみを含有するプラスミドを構成する
ことを決定した。プラスミドｐＰＥＣ１をＨａｅｌｌｌ
およびＥｃｏＲＩで消化し、そしてＰｌａ、Ｐｌｂおよ
びＰｌｃを含有する断片をｐｌＪ４８６、Ｓ　ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓからのプロモーター−プローブプラスミ
ド、中に、そのＨａｅＩ　Ｉ　ＩおよびＥｃｏＲ１部位
を使用して挿入し、このプラスミドをｐｓＬｌと表示す
る。同様に、ｐｐ　Ｅ　Ｃ２をＢａｍＨＩおよびＨａｅ
ｌ　Ｉ　Ｉで切断し、そしてｐＩＪ４８６のＢａｍＨＩ
およびＨａｅｌ１１部位中に結合することによって、Ｐ
２を含有する断片を得、このプラスミドをｐＳＬ２と表
示する。
これらの構成体をつくることによって、ＰＩおよびＰ２
からのプロモーターの活性を評価した。
ａｐｈｌｌ遺伝子の前における下位断片の挿入はカナマ
イシン耐性（ＲＭ平板上で４０μｇ／ｍｌまで）をＳ　
、　１ｉｖｉｄａｎｓ　　Ｔ　Ｋ　５４宿主に与えるこ
とを発見した。Ｓｔ転写マツピング分析は、この構成体
中のＰ２の開始部位がｐＰＰ１４のＰ２開始部位と同一
であることを示す。
Ｐ２のみを含有するインサートは有意のプロモーター活
性を有するという事実は、より短い転写体がＰＩから由
来する転写体の処理から生ずるという可能性を排除する
。、定常相の間の誘導がなお１０倍であるかどうかを見
るためにＰ２の不存在下のＰｉのプロモーター活性を決
定する。データは、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９において
、および３−１ｉＶｉｄａｎｓの形質転換体において、
Ｐ１プロモーターが一時的に調節されることを示す。
Ｅ、ｃｏｌｉ中の菌株ＮＲＲＬ−１５８３９ゲノムグー Ｅ、ｃｏｌｉ中でＮＲＲＬ−１５８３９のＤＮＡの２つ
のゲノムのライブラリーを構成した。ゲノムのＤＮＡを
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９から調製し、モジて５ａｕ３
Ａｌ制限エンドヌクレアーゼ（べ一リンガー・マンハイ
ム）で部分的に消化した。消化したＤＮＡを大きさで分
画して、クローニングにおける大きいインサートについ
て最大にした（＞１０ｋｂ）。スクロース勾配の遠心に
よって分画したＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅ
ｗＥ　ｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　１ｌａｂｓ）のＢａ＋＋＋
Ｈ１部位中に結合し、モしてＥ、ｃｏｌｉ菌株Ｋ　８０
２　（Ｎｅｗ　　ＥｎｇｌａｎｄＢ　１ｌａｂｓ）をア
ンピシリン耐性に形質転換した。
Ｅ、ｃｏｌｉ宿主菌株の選択は、形質転換の高い頻度を
保証するために極めて重要であることが発見された。３
０００の組換えクローンが得られ、平均のインサートの
大きさは１４ｋｂｐであっｔこ。
あるいは、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９からのＤＮＡをア
ガロースゲルの電気泳動によって大きさで分画し、そし
てこのＤＮＡをプラスミドｐＫＫ２３３−２の誘導体（
Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）のＢｇ１１１部位中に結合し、
前記プラスミドはポリリンカーの挿入によって修飾した
。このベクターは誘導可能なｔｒｃプロモーターを含有
し、そしてＥ、ｃｏｌｉ中のＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐ
ｏｒａのＤＮＡの発現を可能とする。
平均インサート大きさが１０ｋｂであるプラスミドを含
有するほぼ３０００のクローンが得られた。
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９のＤＮＡを分離し、ＢａｍＨ
Ｉ制限酵素で消化し、そしてアガロースゲル上でサザン
ハイプリダイゼーション分析のため分画した。　Ｓ、　
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　　Ａ３　（，２）のａｃｔ　Ｉ
およびａｃｔ　Ｉ　Ｉ遺伝子から誘導したポリヶチドの
プローブ、ＰＩＪ２３４５およびｐｌＪ２３４６［Ｆ、
マルバーチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）ら、１９８６、
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテイツクス
（Ｍｏｌｅｃ、　　Ｇｅｎ、　　Ｇｅｎｅｔ、　）　、
２０５．６６−７３ページ］を、ニック翻訳によって標
識した。約２．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片はａｃｔ１プ
ローブと交差ハイブリダイゼーションした。
生理学的研究 ＬＬ−Ｅ　３３２８８複合体の生産を支持する規定培地
の開発は、薬物の生産に影響を及ぼす生理学的因子を研
究するための機会を提供する。菌株ＮＲＲＬ−１５８３
９の生長のために好適な炭素源はスクロースまたはグル
コースである。好適な窒素源はアンモニウムである。最
少培地を交換し、そしてそれが別の炭素源および窒素源
を含有するとき、薬物の生産が観察された。と（にアン
モニウムの濃度が低いとき、細胞の質量につき、より多
くの薬物が生産された。アンモニウム、プロリンまたは
アルギニンに比較したとき、グルタメート（１％まで）
は薬物の生産のためによりすぐれた窒素源であった。し
たがって、窒素源の性質はＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の
生産において重要な役割を演する。炭素源の性質は重要
生に劣る。
発明者らはＳ、ルカニア（Ｌ　ｕｃａｎｉａ）氏［二ニ
ージャーシイ州ニューブルンスウィック、Ｅ、１スクイ
ツグ（Ｓ　ｑｕｉｂｂ）　］にチオストレグトンの提供
に対して感謝する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の集団の生存を紫
外線処理の関数として示し、次の凡例を使用する：（・
）；−生長培地中のグリシン／子紫外線処理前の音波処
理、（０）；＋グリシン／子音波処理、（×）；−グリ
シン／−音波処理、（△）：＋グリシン／−音波処理。 第２図は、非生産性突然変異のスクリーニングを示し、
ここでクローンを１．５ｍｌの７３−３１生長培地中に
接種し、そして２８℃で１週間インキュベーションし、
発酵ブロスの各々のｌＯμｌをＢＩＡ板上にスポツティ
ングし、そして矢印は非生産性発酵のスポットを指す。 第３図は、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の突然変異誘導体
によって生産されたＬＬ−Ｅ３３２８８複合体のＴＬＣ
およびバイオオートグラフィーを示す。 第４図は、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の遮断突然変異に
よるＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の同時合成を示し、ここ
で突然変異菌株ＤＲ４３を７３−３夏生長培地中で単独
で生長させるか、あるいは他の突然変異誘導体と同時生
長させ、そして発酵ブロスをＢＩＡ活性について試験し
た。 第５図は、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の１７の遮断突然
変異によるＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の同時合成を示し
、次の凡例を使用する：（＋）、ＬＬ−Ｅ３３２８８複
合体の同時合成：（−）、検出可能な同時合成の不存在
；　（＋／−）　、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体のわずか
に検出可能な生産、補体群は垂直の実線で示されている
。 第６図は、突然変異菌株ＤＲ４６の培養によって生産さ
れた補体因子の時間過程を示し、ここで菌株ＤＲ４６の
７３−３１培養の無菌の上澄みを示した時間に調製し、
このような上澄みの１．３ｍ１（第１日および第２日）
または１３０μｌ（第３日、第４日および第６日）を菌
株ＤＲ４３の７３−３■培養に添加し戻し、ＬＬ−Ｅ３
３２８８複合体への補体因子の変換をＤＲ４３の３μｌ
の試料をＢＩＡ板上にスポツティングすることによって
測定した。 第７図は、遮断突然変異によるＬＬ−Ｅ３３２８８複合
体のシュードアグリコン断片のＬＬ−Ｅ３３２８８複合
体の補体への変換を示し、ここでシュードアグリコン（
Ｐａ）を７３−３１生長培地中で２日間インキユベーシ
ミンした後示す菌株へ添加し戻し、さらに１日後、ＬＬ
−Ｅ３３２８８複合体を抽出し、補体をＴＬＣによって
分離し、そしてバイオオートグラフィーによってアッセ
イした（ＰａおよびＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の種々補
体の位置を示す）。 第８図は、サザーンハイブリダイゼーションによるＭ　
ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａインサートの検出を示し、
ここでアガロースゲルの電気泳動（０，８％、ＴＢＥ緩
衝液）後、次の試料をニトロセルロース紙上に固定し、
そして標識プラスミドｐＰＰ８でプロービングし、次の
凡例を使用した：レーン１、ＢａｍＨＩで消化したＳ　
、　１ｉｖｉｄａｎｓ染色体ＤＮＡ　。 レーン２、Ｂａ＋ｎＨＩで消化したＬＬ−Ｅ３３２８８
染色体ＤＮＡ　；レーン３、ＢａｍＨｌで消化したｐＰ
Ｐ８；サザンプロットをｐＰＰ８でプロービングし、そ
して１．８ｋｂｐのインサートがＮＲＲＬ−１５８３９
ＤＮＡからのものであることを示す。 第９図は、サザンハイプリダイゼーションによるＮＲＲ
Ｌ−１５８３９のカナマイシン耐性の形質転換体中の自
律的プラスミドｐＰＰ８の検出を示し、次の凡例を使用
した：レーン１、カナマイシン耐性形質転換体のプラス
ミドのミニプレグＤＮＡ：レーン２、Ｓ、　１ｉｖｉｄ
ａｎｓからのプラスミドのミニプレグＤＮＡ　、レーン
３、Ｓ　、　１ｉｖｉｄａｎｓからのＣｓＣ１精製した
プラスミドのプレグＤＮＡ。 プラスミドのＤＮＡは、アガロースゲルの電気泳動（０
，７％、ＴＢＥ）後、標識プラスミドｐｒＪ４８６でハ
イブリダイゼーションすることによって検出した。 第１０図は、Ｂａ＋ｍＨＩ制限酵素で消化後における、
菌株ＮＲＲＬ−１５８３９のカナマイシン耐性形質転換
体中のプラスミドの配列の検出を示し、ここでＤＮＡ試
料をＢａｍＨｌで制限し、そしてアガロ−・スゲルの電
気泳動（０，７％、ＴＢＥ）後、プラスミドｐｌＪＪ８
６とノｈイブリダイゼーシ這ンし、次の凡例を使用した
：レーン１１カナマイシン耐性形質転換体菌株ＮＲＲＬ
−１５８３９からのＤＮＡ　、レーン２、菌株ＮＲＲＬ
−１５８３９のＤＮＡ　、およびレーン３、Ｓ、　１ｉ
ｖｉｄａｎｓ　　ＴＫ５４／ｐＰＰ８のＤＮＡ。 第１１図は、Ｍ　１ｃｒｏｎ＋ｏｎｏｓｐｏｒａ菌株Ｎ
ＲＲＬ−１５８３９のノザーン分析を示し、ここで合計
のＲＮＡを、ここに記載するように、ＧＥＲ培地中で６
０時間生長させたＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａから
分離し、ｌＯｐｇのＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロ
ースゲル中で電気泳動し、ニトロセルロースに移いニッ
ク翻訳したｐＰＦ’１４でプロービングし、２つの主要
な転写体、４５０ｎｔおよび３７０ｎｔ、を検出し、そ
して、さらに、リポソームのＲＮＡへのバックグラウン
ドのノＸイブリダイゼーションを観察する。 第１２図は、Ｓｌヌクアーゼ保護によるｐＰＰ１４中の
転写開始部位のマツピングを示し、ここでＲＮＡをＢａ
ｍＨＩ部位において標識したｐＰＥＣ１４からの一本領
グローブに７１イプリダイゼーシヨンし、そして試料を
Ｓｌヌクレアーゼで消化し、次いで８％のアクリルアミ
ド／７モルの尿素の配列決定ゲル上で電気泳動し、次の
凡例を使用した：レーン１１未消化のプローブ；レーン
２、ＲＮＡなし：レーン３．４．５：それぞれ１３およ
び１０２ｇのＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのＲＮＡ
　、レーン６．７．８：形質転換しないか、あるいはｐ
ｉＪ４８６またはｐＰＰ１４で形質転換したＳ　ｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　　１ｉｖｉｄａｎｓ　　Ｔ　Ｋ　５
４から分離したＲＮＡのｌＯｐｇ；およびレーンＡおよ
びＢはＨａｅｌｌＩまたはＨｉｎｆ　Ｉで切断したｐｈ
ｉ−ｘ１７４ＤＮＡの分子量マーカーである。 第１３図は、ｐｐ　Ｐ　１４中に含有されるＭｉｃｒｏ
ｍｏｎｏｓｐｏｒａ　　Ｄ　Ｎ　Ａのインサートの制限
地図、Ｓｌヌクレアーゼ保護によって決定した転写開始
部位の位置を示す。 第１４図は、ｐＰ、Ｅｃ１４にハイブリダイゼ−ジョン
する転写体の高い分離能力のノザーン分析を示し、ここ
でＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａＰ　　ＲＮ　Ａ　（
１０μｇ）を５％のアクリルアミド／７モルの尿素を含
有する０、２７％のビスアクリルアミドゲル上で分画し
、ジーン・スクリーン・プラス膜（Ｇ　ｅｎｅ　　Ｓ　
ｃｒｅｅｎ　　Ｐ　ｌｕｓ　　＋ａｅｍｂｒａｎｅ）　
　（＝　ニー−イングランド・ニュークリア）に製造業
者が推奨するエレクトロブロッティングによって移した
。 第１５図は、ｐＰＰ１４のためのプロモーターを含有す
るＭ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａのＤＮＡ断片の存在
しうるＤＮＡ配列を示し、ここでＤＮＡ配列はマクシマ
ムおよびビルバートの方法およびサンガーにより決定し
、そしてマクシマムーギルバートの配列決定に使用しか
つ同一ゲル上で電気泳動した同−ＤＮＡ断片のＳＬヌク
レアーゼ保護によって、プロモーターの位置を決定した
。 第１６図は、菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の生長曲線およ
びＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の出現を示し、ここで細胞
の塊は、７３−３１培地（・）または最小生産培地（Ｘ
）中で生長した菌株ＮＲＲＬ−１５８３９の培養におけ
るＤＮＡの蓄積についてアッセイすることによって測定
し、矢印はＬＬ−Ｅ３３２８８複合体の最初の出現を示
す。 第１７図は、ｐＰＥｃ１４ヘハイブリダイゼーションす
る転写体の進展的発現を示し、ここでＭｉｃｒｏｍｏｎ
ｏｓｐｏｒａ培養から分離したＲＮＡのｌＯμｇを、第
１１図に記載するように、ノザーンプロッティングによ
って分析した。Ａニア３−３１培地、試料は１７．３０
．４１５３．７０および９２時間に採取した（レーン１
〜６）；Ｂ：最小培地、試料は３０．４１，５３．７０
および９２時間に採取した（レーン１〜５）；およびＣ
：ＧＥＲ培地、試料は１９．２８．４３および５１時間
に採取した（レーン１〜４）。 特許出願人　アメリカン・サイアナミド・カンパニー７
面の浄７！ｙ（内容にｔ−更なし） −〇　　　　　　ソリ　　　　　　＋ｚリ　抄ＦＩＧ、
　８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ＩＯ Ａ１１１＄４１６Ｆ１ｍ ＦＩＧ、Ｉ２ −馨 ＧＡπ↑式αμＴＧＴＱＴＧＣ就ＣＣロＪπロ礒ＧＣＡ
ＣＧＱＣＴＴＧ　ＡＴ匡就ＴαＩに鳥ｘ１０礒υ＾「π
Ｔαｖｗｔ　ｃａａ叡真迫ａａ　ｃｃｃｃｃにｊｆｉｃ
　ＴＣＣＡＴＣｍ　ｆｌＧｃ伐ＴＴ　（ｉＧｃＧＴｃｃ
ＡＧｃ　ＧＧＣＴＴｆｉＴＡＱＡ５ｔｌｌ 町論■ 出 ＧＡＩ：ＧＡ匡繻ｒ閤冨ムに砿儲１絋α国になＥに就就
就ＣαＮ論鴎釘質Ｅα〜１臨鴬１［Ｔ　　　　　　　　
　　　　　　　Ａ鴨！ＡＴＩ；ＡＡｅＧＧＴｔｉ　Ｃ１
；ｈＥｃＫＷａｃ　ＡＡＴＧＣＴ＠Ｃ国ｍＴαｓｕｍ。 １ａｄｌ ム　１！１．層 １１８４８　　略 Ｓ、１中 ｌｆｆ１１４１ ｃｍ　ａｔｌＫ 手続補正書彷幻 昭和６３年６月９日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第４９８９７号 ２、発明の名称 マイクロモノスポラのための遺伝子系 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　アメリカン・サイアナミド・カンパニー４、代理
人　〒１０７ ５、補正命令の日付　昭和６３年５月３１日（発送日）
６、補正の対象 図面の簡単な説明の欄及び図面 ７、補正の内容 （１）明細書第１０１頁第１２行に「を示し、」とある
を「を示す写真であり、」と訂正する。 （２）明細書第１０１頁末行に「示す。」とあるを「を
示す写真である。」と訂正する。 （３）明細書第１０２頁第３行に「を示し、」とあるを
「を示す写真であり、」と訂正する。 （４）明細書第１０２頁第１５行に「を示し、」とある
をｒを示す写真であり、」と訂正する。 （５）明細書第１０３頁第６行に「を示し、」とあるを
「を示す写真であり、」と訂正する。 （６）明細書第１０３頁第１５行に「を示し、」とある
を「を示す写真であり、」と訂正する。 （７）明細書第１０４頁第９行に「を示し、」とあるを
ｒを示す写真であり、」と訂正する。 （８）明細書率１０４頁末行に「を示し、」とあるを「
を示す写真であり、」と訂正する。 （９）明細書第１０５頁第１θ行に「を示し、」とある
を「を示す写真であり、」と訂正す番。 （ｌＯ）明細書第１０６頁第１行に「を示し、」とある
を「を示す写真であり、」と訂正する。 （１１）明細書第１０７頁第２行に「を示し、」とある
を「を示す写真であり、」と訂正する。 （１２）明細書第１０８頁第５行に「を示し、」とある
を「を示す写真であり、」と訂正する。 以上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、プラスミドｐＰＰ４（ＡＴＣＣ−６７３４３）、 ２、プラスミドｐＰＰ８（ＡＴＣＣ−６７３４２）、 ３、プラスミドｐＰＰ１４（ＡＴＣＣ−６７３４１）、 ４、炭素、窒素、ヨウ素および無機塩類の適当な源を含
    有する水性培地中で、￥マイクロモノスポラ・エキノス
    ポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｕｐｏｒａ　ｅｃｈｉｎｏ
    ｓｐｏｒａ）￥種￥カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓ
    ｉｓ）￥ＤＲ４６（ＡＴＣＣ−５３５９１）を好気的に
    発酵し、そしてそれから補体因子を分離するによって生
    産されたことを特徴とする補体因子。 ５、炭素、窒素、ヨウ素および無機塩類の同化可能な源
    を含有する水性培地中で好気的に発酵しとき、補体因子
    を回収可能な量で生産できることを特徴とする、微生物
    ￥マイクロモノスポラ・エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏ
    ｎｏｓｕｐｏｒａ　ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）種カリケ
    ンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）￥ＤＲ４６（ＡＴＣ
    Ｃ−５３５９１）を含む培地。
JP63049897A 1987-03-06 1988-03-04 マイクロモノスポラのための遺伝子系 Pending JPS63313589A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US022455 1987-03-06
US07/022,455 US5024948A (en) 1985-10-17 1987-03-06 Genetic system for micromonospora

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS63313589A true JPS63313589A (ja) 1988-12-21

Family

ID=21809689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63049897A Pending JPS63313589A (ja) 1987-03-06 1988-03-04 マイクロモノスポラのための遺伝子系

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5024948A (ja)
EP (2) EP0499292A1 (ja)
JP (1) JPS63313589A (ja)
KR (1) KR880011338A (ja)
IL (1) IL85181A (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2886547B2 (ja) * 1988-07-26 1999-04-26 協和醗酵工業株式会社 ノイラミニダーゼの製造法
US5288696A (en) * 1990-09-07 1994-02-22 New England Biolabs, Inc. Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase
EP3065780A1 (en) 2013-11-04 2016-09-14 Pfizer Inc. Anti-efna4 antibody-drug conjugates

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57179196A (en) * 1981-04-28 1982-11-04 Takeda Chem Ind Ltd Plasmid and its preparation
JPS6047684A (ja) * 1983-08-23 1985-03-15 Tanabe Seiyaku Co Ltd プラスミドおよびその製法
DE3588213T2 (de) * 1984-11-16 1999-09-30 American Cyanamid Co Antitumorale Antibiotika (Komplex LL-E-33288)
US4935340A (en) * 1985-06-07 1990-06-19 Eli Lilly And Company Method of isolating antibiotic biosynthetic genes

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents

Also Published As

Publication number Publication date
KR880011338A (ko) 1988-10-27
IL85181A0 (en) 1988-07-31
EP0334970A3 (en) 1989-12-13
EP0334970A2 (en) 1989-10-04
IL85181A (en) 1992-11-15
EP0499292A1 (en) 1992-08-19
US5024948A (en) 1991-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5824513A (en) Recombinant DNA method for producing erythromycin analogs
KR920006350B1 (ko) 항생물질 생산력의 증진 방법
EP0238892A2 (en) Cloning vectors for streptomyces and use thereof in macrolide antibiotic production
JP2000515390A (ja) 新規ポリケチド誘導体およびそれを製造するための組換え方法
Demain et al. Strain improvement for production of pharmaceuticals and other microbial metabolites by fermentation
CA2080583A1 (en) Erythromycin derivatives
JP2002505881A (ja) スピノシン殺虫剤生産のための生合成遺伝子
EP0915981B1 (de) Isolierung der biosynthesegene für pseudo-oligosaccharide aus streptomyces glaucescens gla.o und ihre verwendung
JP2023012549A (ja) 改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株およびその使用
AU652766B2 (en) Cloning of the biosynthetic pathway genes for chlortetracycline production from streptomyces aureofaciens and their expression in streptomyces lividans
US5589385A (en) Cloning of the biosynthetic pathway for chlortetracycline and tetracycline formation and cosmids useful therein
CN101802168A (zh) 非天然型抗生素的制造方法
JPS63313589A (ja) マイクロモノスポラのための遺伝子系
JPH04211382A (ja) プラーク阻害表現型を付与するｄｎａ配列
CN112409372B (zh) 玉红霉素类似物、制备方法及其应用
KR100882692B1 (ko) 부테닐-스피노신 살충제 생산을 위한 생합성 유전자
CN110305881B (zh) 一种聚酮类化合物neoenterocins的生物合成基因簇及其应用
US20120015404A1 (en) Gene cluster for thuringiensin synthesis
US8207321B2 (en) Method of obtaining idolocarbazoles using biosynthetic rebeccamycin genes
US6210935B1 (en) Staurosporin biosynthesis gene clusters
JPH0753592A (ja) エレファマイシン耐性変異体
US5776735A (en) Process for dienone macrolides
CN117024611B (zh) 寡糖类抗生素everninomicin高产菌株的构建及活性的应用
KR101327798B1 (ko) 아글루코반코마이신을 생산하는 미생물
KR20130097538A (ko) 해양 미생물 하헬라 제주엔시스의 제주엔올라이드 생합성 유전자 클러스터