JPS63296687A - バシラス・ツリンギーンシス型の微生物およびその創製方法 - Google Patents

バシラス・ツリンギーンシス型の微生物およびその創製方法

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JPS63296687A
JPS63296687A JP63100454A JP10045488A JPS63296687A JP S63296687 A JPS63296687 A JP S63296687A JP 63100454 A JP63100454 A JP 63100454A JP 10045488 A JP10045488 A JP 10045488A JP S63296687 A JPS63296687 A JP S63296687A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明＆工、昆虫病原性蛋白質及びバシラス・ツリンギ
ーンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓ　）型の微生物の収得法に関する。
従来の技術 合成殺虫剤及び特定の植物から単離された殺虫剤の他に
、細菌性殺虫剤が公知であり、該殺虫剤としては、１９
１５年以来公知のバシラス・ツリンギーンシス（Ｂ、ｔ
、　）の野生型及び種々の突然変異体内で形成される蛋
白質が該当する。
バフラスｍ６！好ましくない環境条件下では耐熱及び耐
乾燥性のアウトラスト段階（内生胞子）を形成する。し
かし、バシラス・ツリンギーンシスは胞子形成期中に付
加的に光学顕微鏡で明らかに観察可能なバラ胞子状の封
入体を形成し、該封入体はその結晶に類似した構造に基
づき簡単に結晶と称される。これらの蛋白質結晶は、　
Ｂ、ｔ、の毒性の原因となる（　Ａｎｇｕａ　１９５４
　）。これらは経口受入後に目標昆虫の腸のアルカリ性
環境内で溶解する。この場合、腸プロテアーゼ（Ｔｏｊ
ｏ　ｅｔ　ａｌ。
１９８５　）又は結晶会合プロテアーゼ（Ｔｕｒｋｅｙ
　ｅｔａｌ、　１９８５　）の作用により、なお正確に
は知られていない毒性分裂生成物（デルターエンドトキ
シン）が生成し、該生成物は最終的に腸の上皮細胞の溶
解を惹起する。デルタ−エンドトキシン作用の分子的機
構は未だ正確には知られていない。
多数の単離されたＢ、ｔ、菌株の今日通常の等級化は、
フラジェリン抗原の比較により行われる（Ｄｅ　Ｂａｒ
ｊａｃ及びＢｏｎｎｅｆｏｉ　１９７３　；　Ｄｅ　Ｂ
ａｒｊａｃ　１９８１　）。
その後、今日まで２２種類のＨ抗原群を区別することが
できる。更に、菌株はまたその病原型（Ｐａｔｈｏｔｙ
ｐ　）における作用スペクトルに基づいても分類される
。従来発見されたＢ、ｔ、単離体の９５％よりも多くは
斜方形の結晶でありかつ鱗翅類幼虫に対して有効である
（病原型Ａ）。病原型Ｂには、力類の幼虫に対する活性
及び丸形の不規則な結晶を有する変種がかつ病原型Ｃに
は甲虫類幼虫に対する活性及び平板状結晶を有する菌株
が包括されている。若干の結晶形成り、ｔ　、亜種〔例
えばトチギエンシス（ｔＯｃｈｉｇｉｅｍ８１１１　）
、クマントエンシス（ｋｕｍａｎｔｏｅｎｓｉｓ　）　
）に関しては、殺虫性作用は公知ではない（病原型ＮＤ
　）。更に、ｌ風＝’殺力活性を有する鱗翅類病原性菌
株も開示された。
これらの単離体は、鱗翅目特異的結晶（プロティンＰ１
：分子量約１３０，０００　）の他になお小さな卵形封
入体（プロティンＰ２：分子量約６５，０００　）を形
成し、該封入体は鱗翅類及び力類に対して弱い作用効果
を有する（イイズカ及びヤマモト１９８３　）。
血清型（５ｅｒｏｔｙｐ　）と病原型の相互関係ン持た
せることはできない。従って、例えば同一のフラジェリ
ン抗原（Ｈ８）を有する病原型Ａ、Ｂ及びＣ菌株が単屏
されている。
総てのＢ、ｔ、菌株において、１．５と＞　１５０　Ｍ
ｄＯ間の分子量を有する２〜１２個のプラスミドが検出
可能である（　Ｃａｒｌｔｏｎ及びＧｏｎｚａｌｅｎｚ
　１９８５　ａ　）。
カーリング実験（Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ｅｔ　ａｌ、　１
９８１　）、クロッシング実験（Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ｅ
ｔ　ａｌ、　１９８２　）及びクローニング実験（Ｇｏ
ｎｚａｌｅｚ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２　）により、多
くの菌株における結晶形成能力は、プラスミドによって
決定されていることが判明した。
この場合には、関与する遺伝子は１つ以上のプラスミド
（３０〜１５０　Ｍ（Ｌ　）上に存在することができる
。クロン化した結晶遺伝子での雑種形成でに、病原型Ａ
群内でデルタ−エントドキシ／遺伝子の大きな類似性が
生じた（　Ｌｅｒｅｃｌｕａ　ａｔ　ａｌ、　１９８２
　：Ｋｒｏｎｓｔａｄｔ　ａｔ　ａｌ、　１９８３　）
　０従って、デルタ−エンドキシム遺伝子のクロン化に
より、同一病原型の別の結晶遺伝子は極めて簡単に特異
的試料との雑種形成により見い出すことができる。この
ようにして、例えばＢ、ｔ、クルスタキＨＤ　−１内に
少なくとも３種類のデルタ−エンドトキシン遺伝子を検
出することができる（　Ｋｒｏｎｓｔａｄ及びＷｈｉｔ
ｅｌｅｙ１９８６　）。
Ｂ、ｔ、内のたいていのプラスミドの機能は知られてい
ない。結晶蛋白質遺伝子の他に、初めて２つの別のプラ
スミドコード化特性が記載されている。Ｔａｎ及びＦｉ
ｔｚ−Ｊａｍｅｓ　（１９８６）は、Ｂ、ｔ、イスラエ
レンシス内のファージ状粒子の形成を６８Ｍｄプラスミ
ドに配属させることができた。これらの粒子は胞子形成
期中にも形成され、かつデルタ−エンドトキシン結晶の
他に別の小さな封入体として観察可能である。最後に、
オザワ及びイワハナ（１９８６）によって“Ｂ、ｔ、ダ
ルムスタジエンシス内での６２　Ｍｄ−プラスミドに対
する結晶形成とβ−エキソトキシン形成（５ｅｂｅｓｔ
ａ　ｅｔ　ａｌ、　１９８１　）の結合が確認された。
Ｂ、ｔ、　菌株は生理学的にはバララス・セレウス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　）から区別不能である
（Ｂａｕｍａｎｎ　ｅｔ　ａ：Ｌ、　１９８４　）　。
土壌試料から単離されたＢ、セレウス菌株内には、Ｂ、
ｔ、において従来特性化された総てのＨ−抗原を見出す
ことができた（オウバ及びアイザワ１９８６　）。従っ
て、Ｂ、ｔ、とＢ、セレウスの間の若干の相違は、胞子
形成期中のデルタ−エンドトキシン結晶の形成である。
しかし、この特性はプラスミドカーリングによって容易
に失われることがある。従って、Ｂ、ｔ、はＢ。
セレウスの変種として見なすことができる。
種々の菌株の作用スペクトルは、同一の病原型内におい
ても著しく異なっている（　Ｋｒｉｅｇ　　及びＬａｎ
ｇｅｎｂｒｕｃｈ　１９８１　）　（、従って、最適な
昆虫駆除のためには、種類の異なったＢ、ｔ　、菌株を
使用することが重要である。種々異なったＢ、ｔ、変種
の生長特性は著しく異なっているので、各々の菌株に対
して固有の発酵至適化が必要である。従来、このことは
そのために必要な高いコストに基づいて成功しなかった
。この状況ン改良する１つの可能性レエ、生成菌株を使
用することと見なされ、その際にはその都度の要求に基
づき種々のデルタ−エンドトキシンを形成するために遺
伝情報が導入される。結晶プラスミドの転移は、従来Ｇ
’！Ｇｏｎｚａｌｅｚｅｔ　ａｌ、　（１９８２）によ
って見つけ出された共役に類似した機構によってのみ可
能であった。この方法を用いると、鱗翅類活性菌株のプ
ラスミドを高い率（８０％以下）でｃｒｙ　　−菌株、
しかもＢ、セレウスに転移させることができる。しかし
、プラスミドの転移は著しくクロスパートナ−に依存す
る。特定の交雑においてのみ、結晶形成の転移が検出可
能であるにすぎない。
デルタ−エンドトキシンの分子遺伝学的操作は、関与す
る遺伝子が一般にプラスミドに局限されていることによ
り簡単になる。既に多数の結晶遺伝子がＥ、コリ（ｃｏ
ｌｉ　）又はＢ、サブチリス（ｑｕｂｔｌｌｌｓ　）に
おいてクロン化されかつシーフェンス化された（　５ｃ
ｈｎｅｐｆ及びＷｈｉｔｅｌｅｙ　１９８１　：Ｈｅ１
ｄ　　ａｔ　　ａｌ、　　１９８２　　：　　Ｋ１１ｅ
ｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　　１９８２　　；５ｈｉｂａｎ
ｏ　　ｅｔ　　ａｌ、　　１９８５　　：　　５ｃｈｎ
ｅｐｆ　　ａｔ　　ａｌ、　　１９８５　　：Ａｄａｎ
ｇ　ｅｔ　ａｌ、　１９８５　）　。Ｂ、ｔ、でのデル
タ−エンドトキシン生成にとって特徴的であるのは、高
い発現率である（胞子化細胞の３０％まで）。Ｅ、コリ
又＆ＸＢ、サブチリスにおいては、発現はクロン化され
た遺伝子では著しく悪くなる。このことは例えばこれら
の微生物において種々異なった調節機構により説明可能
である。問題点を排除するためには、直接追、ツリンギ
ーンシス又＆ＸＢ、セレウス内のデルタ−エンドトキシ
ンを調査することが所望される。Ｂ、ｔ、における適当
な転移法は存在しなかったので、このような実験は従来
は実施す□ることができなかった（　Ｃａｒｌｔｏｎ及
びＧＯｎＺａｌｅＺ１９８５　ｂ　：　Ａｒｏｎｓｏｎ
　ｅｔ　ａｌ、　１９８６　）。
発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、同じ微生物における多数のトキシンを
生産する能力を有する新規の菌株が発生するように、で
きるだけ総てのバシラス・ツリンギーンシス及びバララ
ス・セルウス菌株を転移させることができる、有効な転
移方式を見い出すことであった。自然の受容能力が不足
している場合にＤＮＡの受容を誘発する１つの方法は、
プロトプラスト形質転換（Ｂｉｂｂ　ｅｔ　ａｌ、　１
９７８　）である。
この方法を本発明による形質転換法の基礎とした。
プロトプラスト形質転換は、プロトプラスト融合（５ｃ
ｈａｅｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９７６　：　Ｆｏｄ
ｏｒ及びＡｌｆｌｊｌｄｉ１９７６　）から開発された
。細胞融合の際には、細胞膜の溶融により両者の親菌株
の細胞内容物の複合が達成され、その際遺伝子の再複合
及びプラスミドの新規分布が発生することができる。
課題を解決するための手段 従って１本発明の対象は、２種類もしくを工少なくとも
２槽類の、異なったトキシンな有する菌株のプロトプラ
スト融合により、遺伝的固定されてエンドトキシンを形
成する能力を有するバシラス・ツリンギーンシス型の微
生物を収得する方法であり、該方法は第１工程で細胞壁
を分解させ、第２工程で融合させかつ最後に細胞壁の再
生を再び励起することより成る。
本発明によれば、鱗翅類及び甲虫類の幼虫に対して高い
活性を有するバシラス・ツリンギーンシスの新規の菌株
が提供される。
該菌株＆！名名称クシラスツリンギーンシスＦ８−１を
有しかつドイツ微生物寄託機関（ＤＳＭ　）、Ｄ　−３
４００ゲツチンゲン在にＡ４０８２で寄託されている。
細胞のプロトプラスト化を達成するためには、まず細胞
壁を分解させる必要がある。この目的は浸透的に安定化
した緩衝液内でリソチームを用いて細胞を培養すること
により達成される。この場合、ポリエチレングリコール
の作用は正確には知られていない。本来の形質転換又は
融合後に、プロトプラストによって再び完全な細胞壁を
構成させねばならない（再生）。重要な１工程は、形質
転換又は融合したクロンの選択である。このために（工
、２つの可能性が存在する。間接的選択の場合には、プ
ロトプラストをまず適当な媒体で再生させる。引続き、
例えば選択媒体に刻印することにより行う。直接的選択
が有利である。この場合には、適当な条件を選択するこ
とにより選択したコロニーだけを再生媒体上で生長させ
ることができる。
現在公知の昆虫毒性Ｂ、ｔ、単離体は、そのデルタ−エ
ンドオキシムの作用スペクトルに基づき多数の病原型に
分類することができる。病原型Ａには、鱗翅類に対する
作用を有する菌株が属し、病原型Ｂには双翅類に対する
作用するものがかつ病原型Ｃには鞘翅類に対する作用ｌ
有するものが属する。
第　　１　　表 血清変種　　名　称　　　病原型　　　菌株例１　　　
　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　　　　Ａ　　　ＨＤ−
１、ＨＤ−２０３ａ　　３ｂ　　　　ｋｕｒｓｔａｋｉ
　　　　　　　　　Ａ　　　　　　ＨＤ−Ｉ　　　　Ｈ
Ｄ−７３５ａ　５ｂ　　ｇａｌｌｅｒｉａｅ　　　　Ａ
　　　ＨＤ−２９、ＨＤ−９５０６ｅｍｔｏｍｏｃｉｄ
ｕｓ　　　　　　Ａ　　　　　　ＨＤ−９６７？　　　
　ａｉｚａｗａ、ｉ　　　　　Ａ　　　ＨＤ−１３５，
ＨＤ−９８０８ａ　　８ｂ　　　ｍｏｒｒｉｓｏｎｉ　
　　　　Ａ、Ｂ１０　　　ＨＤ−１２、Ｂ工２５６−８
２（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ　　ＰＧ　　１４　）１１
　　　　　　ｋｙｕｓｈｕｅｎｓｉｓ　　　　　　　　
Ｃ１４１Ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ　　　　　　　ＯＡ６０
−１ＨＤ−５６７第１表は、選択した例の一覧表を示す
、血清型と病原型とは相関不能である。従って、例えば
病原型Ａ、Ｂ及びＣ菌株は同じフラジェリン抗原（Ｈ８
）で単離した。
従来の市販の製剤は、野菜及び果樹栽培並びに林業にお
いて有害となる鱗翅類を駆除するための若干の病原型入
−菌株にかつ右傾及びブユ類の幼虫を駆除するための病
原型Ｂ菌株に係る。
特に農業栽培において使用する際には、公知の菌株もし
くハトキシンは常に完全には満足されない。利用者にと
って公知の、特に合成有効物質に対する有用な選択性を
与えるためには、改善された特性、即ち特定の有害刺激
体に対する高い活性、例えば多数の鱗翅類に対する拡大
された活性スペクトル及び／又は例えば鱗翅類及び鞘翅
類の幼虫に対する組合わされたスペクトルな有する新規
の菌株が見い出されねばならない。
各々個々の単離体は狭い作用スペクトルを有しているに
すぎないので、多数の殺虫スペクトルからの組合せによ
り新規の菌株を作ることができるはずである。
複合菌株の特性は、その２種類の個々菌株の単離な混合
物の生産及び使用に関して優れているべきである。
総てのＢ、ｔ、菌株においては、１．５と）　１５０　
Ｍｄの間の分子量を有する２〜１２個のプラスミドが検
出可能である（　０ａｒｌｏｎ　、　Ｇｏｎｚａｌｅｓ
　、　　１９８５’　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｉ　’　ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ）（、カーリング実験（Ｇｏｎｚａｌｅｓ　ｅ
ｔ　ａｌ。
１９８１、’　Ｐｌａｓｍｉｄ　’　５３５１　ｆｆ　
）及びクロッシング実験（Ｇｏｎｚａｌｅｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、　１９８２、’　Ｐｒｏｃ、Ｎｏｔｌ、’Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９．６９５１　ｆｔ　）及び
クローニング実験（Ｍｅ　Ｌｉｎｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、
　１９８５、’　　Ａｐｐｌ。
Ｅｎｖｉｒｏｎｍ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　’　　５
０，６２０　ｆｆ　）によれば、多くの菌株において結
晶形成能力はプラスミドフード化されていることが判明
した。この場合には、関与せしめられる遺伝子は１つ以
上のプラスミド（３０〜１５０　Ｍｃｌ　）上に存在す
る。
クロン化した結晶遺伝子での交雑実験は、病原型Ａ群の
範囲内でデルタ−エンドＩ・キシン遺伝子の大きな類似
性を生じた（　Ｌｅｒｅｃｌｕｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９
８２、’　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　’　
　１８６．３９］　ｆｆ　：Ｋｒｏｎｓｔａｄｅｔ　ａ
ｌ、　１９８３、’　、ｒ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　“
、１５４　．４１９ｆｆ）。
遺伝子のクローニングにより、特異的試料での交雑によ
って同−病原型の別の結晶遺伝子を、見い出すことがで
きる。
このようにして、例えばＢ、ｔ、　Ｖａｒ、　Ｋｕｒｓ
ｔａｋｉ（ＨＤ−１）内に少なくとも３個のデルタ−エ
ンドトキシン遺伝子が検出された（　Ｋｒｏｎｓｔａｄ
　。
Ｗｈｉｔｅｌｅｙ　１９８６、Ｇｏｎｅ　４３　．２９
　ｆｆ　）。
Ｂ、ｔ、菌株は、生理学的に＆ＸＢ、セレウスから区別
不可能である（　Ｂａｕｍａｎｎ　ｅｔ　ａ：Ｌ、　１
９８４　）　ｏ土壌試料から単離されたＢ、セレウス菌
株内に、従来Ｂ、ｔ、で特徴化されたＨ−抗原を見つけ
出すことができた（オオバ、アイザヮ１９８６、Ｊ、　
Ｂａ５ｉｃ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２６．１８５　ｆｆ　）ｏ従っ
て、Ｅ、ｔ、とＢ２Ｏ２の間の唯一の差異は、胞子形成
中のデルタ−エンドトキシン結晶の形成にある。
Ｅ、ｔ、から単離されるプラスミドの転移は、種々の研
究論文に公開された。たいていの場合には、遺伝子又は
遺伝子断片が表現されるホストとしては、Ｅ、コリ（米
国特許第４４４８８８５号明細書、ヨーロッパ特許第０
６３０３９号明細書、ヨーロッパ特許出願９３０６２号
、ヨーロッパ特許出願第１８６３７９号）が該当する。
しかし又、Ｂ、メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　
）及びＢ、サブチリスにおいても、例えばＢｔｌ−）キ
シの表現が可能である（ヨーロッパ特許第１９５２８５
号）。
このテーマの別の研究論文としては、以下の文献を採用
することができる：　５ｃｈｎｅｐｐ　、　Ｗｈｉｔｅ
ｌｙ１９８１　　’　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　
Ａｃａｃｌ、　　Ｓｃｉ　　’　　ＵＳＡ　　７８　２
８９３ｆｆ　：　Ｋｒｏｎｓｔａｄ　ｅｔ　ａ〕、、　
１９８３、’　、Ｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１５４．４１９　ｆｆ　：　Ｈｅ１ｄ　ｅｔ　ａｎ、　
１９８２、’　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　’　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ　、　ＵＳＡ　
７９．６０６５　ｆｆ　：Ｋ１１ｅｒ　ａｔ　ａｈ　　
１９８２　　、　　’　　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　　
に　１、９１ｆｆ０ しかし、Ｅ、コリ及びその他のホストにおいては、クロ
ン化された遺伝子の表現は、胞子形成された細胞の３０
％までの高いデルタ−エンドトキシン生産が特徴的であ
るオリジナルのホストであるＢ、ｔ　、に比して一般に
悪い。
そこで以下には、遺伝情報を゛両指向性的に転移させる
ことができるプロトプラスト液体系を開示する。−次融
合生成物は倍数細胞であり、該細胞内には両者の親菌株
から成る全ＤＮＡが存在する。
単相の安定な細胞内での分離後には、両親から成るプラ
スミドの混合物が存在する。高い率で、結晶形成能力が
一方の親から他方の親に転移されたクロンが見つけ出さ
れる。
融合のための前提条件は、細胞のプロトプラスト化であ
る（　５ｃｈａｅｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９７６、
’　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　’　　Ａｃａｄ、　Ｓｃ：Ｌ、　ＵＳＡ　
７９．２１５１　ｆｆ　；　Ｆｏｄ、ｅｒ　。
Ａ１ｆ８１ｄｉ　１９７６、’　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　　’　　ＡＣＩＬ（１，Ｓｃｉ。
ＵｄＡ　７３　２１４２　ｆｔ　）。細胞壁の分解は、
浸透的に安定化しｔこ緩衝液内でリソチームを用いて細
胞を培養することにより達成される。
融合はポリエチレングリコール（ＰＥＧ　）の高濃縮に
より惹起する。融合が完了した後に、プロトプラストか
ら再び完全な細胞壁を構成させることが必要である（再
生）。
重要な１工程は、融合したクロンの選択である。
その際には２つの方法が存在する。間接的選択では、プ
ロトプラストをまず適当な媒体内で再生させ、引紐ぎ例
えば選択媒体にスタンピングすることにより選択を行う
。直接的選択が有利である。
この場合には、適当な条件を選択することにより選択し
たクロンだけを再生媒体で生長させることができる。
選択を簡単にするために、栄養要求変異性及び非病原的
ｃｒｙ″″−突然変異体を構成させかつ形質転換を用い
て抗生物質マーカーを含有する表型を構成させた。
原理的には、前記技術を用いてあらゆる考えられ得るデ
ルタ−エンドトキシン組合せを構成することができ、こ
のことは生物学的に変化した幅広い、より活性の特性を
もたらすことができる。
以下の菌株を、例えば供与体として利用することができ
ろ： ヘ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ト　　０ト　
　　　　　　　　　■　　　　　　［Ｆ］　　ωへ　　
　　　　−ト　　　　　　　　　　ヘ　　　　　　Φ　
　■目　１　　　　　目　　　　　目　　　目　目工 円　　　　円 ｃ６　　　ｄ　　　ｄ　　　ｅ６　　　づ　　　ｄ頃　
　−へ　　ｅＱ　　　の　　寸　　寸　　寸　　膿　　
Ｑ　　　　トへ　　　　　　　　　　　　　　　　目１
７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ｖａｒ、ｔｏｈｏｋｕｅｎｓｉｓ１８
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ｖａｒ、ｋｕ＋ｎａｍｏｔｏｅｎｓｉｓ１９　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｖａｒ、　ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ２１　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ｙａｒ、ｃｏｌｍｅｒｉ−Ｖａｒ、ｗｕｈａｎｅｎｓｉ
ｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＡＴＯＯ２
９２０３Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ　　Ａ
ＴＯＣ１４７０にれらの菌株は一般に入手可能である。
前記菌株は、受容体としても適当である、しかし又例え
ば バララス・サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　
　　ＤＳ　１１４０２バシラス・セレウス　　　　　　
　ＡＴＯＯ２１２８１ＤＳＭ　３１３５１ Ｅ、コリ バララス・マガテリウム（Ｂ、　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ
　）を使用することもできる。
処理すべきビオトープの生態毒性学的負荷を最小に低下
させるもう１つの可能性は、このプロトプラスト融合に
よって得られた菌株の無胞子突然変異体を培養すること
である。無胞子性の例は、例えばヨーロッパ公開特許第
５９４６０号明細書又はヨーロッパ特許第１７８１５１
号明細書に記載されている。
実施例 実施例　１ 以下の表は、種々異なった特性をプロトプラスト融合に
より転移させた構成菌株の選択を示す。
表示のもの＆工、結晶形成を行う菌株に制限されている
。
菌　株　　　　　　　　　　生物学的作用効果病原型Ａ
　病原型Ｃ ＨＤ　−２ｃｒｙ　ｔｈｕｒ　（ｗｉｌｄｔｙｐ）　　
　　　　　　＋　　　　　−ＨＤ−２ｃｒｙ−− ＨＤ　−２２ｃｒｙ　Ｘ　ＨＤ　−２ｃｒｙ　ｔｈｕｒ
、　　　　　　＋＋（Ｄ　−２ｃｒｙ−Ｘ　ｌ（Ｄ　−
７３ｃｒｙ　１ｃｕｒｓｔａ）ｃｉ　　　　＋Ｂｌ　２
５６−８２　ｃｒｙ　ｔｅｎ　（ｗｉｌｄｔｙｐ）　　
　　　　　　　　　　　＋ＨＤ−２ｃｒｙ−Ｂｌ　２５
６−８２　ｃｒｙ　ｔｅｎ　（７３２−１３）　　−＋
７３２−１３　Ｘ　ＨＤ　−２ｃｒｙ　ｔｈｕｒ、　（
Ｉ１１８−１）　　　　　　＋　　　　　＋Ｉ（Ｄ　−
２ｃｒｙ−ＸＨＤ　−８ｃｒｙ　ｇａｌ、　（Ｆ１９−
．３０）　　＋　　　　　−Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ　ＨＭ　
７−　１ Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ　ＨＭ７−Ｉ　Ｘ　ＨＤ−８ｃｒｙ　
ｇａｌ、　（Ｆ１２−］）　　＋＋　　　　−Ｂ、ｃｅ
ｒｅｕｓ　ＨＭ７−Ｉ　ＨＤ−２ｃｒｙ　ｔｈｕｒ、　
（Ｆ４−３）　　　＋Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ　ＨＭ７−Ｉ　
ＨＤ−７３ｃｒｙ　ｋｕｒｓｔａｌｃｉ　（ＦＩＯ）　
　＋　　　　　一実施例　２ 下記表は、種々の媒体ＳＴＭＬ　１ＭＭＬ及びＳＭＭＰ
Ｂ４／Ｌ内でのプロトプラスト化に関するＢ−ｔ、菌株
の感度に関する一覧表を示す。
ＳＴＭＬ　　ＭＭＬ　−、ＳＭＭＰ　Ｍ／ＬＢｌ　　２
５６−８２　　　　　　　　　＋＋　　　　　＋＋Ａ　
　　　　＋ＡＡ　　６０　　　　　　　　　　　　　　
　＋＋ＰＧ　１４　　　　　　　＋＋　　　＋Ａ　　　
−／＋ＨＤ８ＰＯ１９４＋＋　　　　　＋＋Ａ　　　　
　　−ＨＤ７０３０　　　　　　　　　　　＋＋　　　
　　＋＋　　　　　　　＋ＭＤＩ　　　　　　　＋＋　
　　＋＋　　　　−／＋ＨＤ　　２　　Ｄ　　２６　　
　　　　　　　　＋＋　　　　　　＋　　　　　　　＋
＋Ｂ、Ｏ，ＤＳＭ　３１　　　　＋＋　　　＋＋　　　
　−／＋実施例　３ 以下の表は、菌株ＨＤ　２の栄養要求変異種間の同族融
合の例を示す。
表：菌株ＨＤ　２　（ツリンギーンシス変種）の栄養要
求変異種間の同族融合 親： １受容体“Ｄ６−４　　　　　　ｎｅｔ”−１ａｒｇ＋
、Ｓｍｒ、　Ｔｃ”、ｃ　ｒｙｓ−１供与体”Ｄ１２（
ｐＥＣｌ、６）　ｍｅｔ＋、ａｒｇ−１Ｓｍｓ、　Ｔｃ
ｒ、　　ｃｒｙｓ＋融合率、　Ｔｃ　Ｓｍ　　コロニー
２．０％原栄養株コロニー１．２％ Ｔｃ　Ｓｍ　　コロニーめ分析 ｍｅｔ　　　ａｒｑ　　　ｃｒｙｓ　　　　割合（％）
＋　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　２５
．６−　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　３．６＋　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　＋　　　　　　　　　　４８．８＋　　　
　　　　　＋　　　　　　　　　　−１，２＋９．８ −１．２ ＋−＋９．８ 例　　４ 以下には、プロトプラスト融合のための操作経過を略記
する。
１）細胞の親を培養液５ｆｆ１７！中で培養する（自己
分解段階又は超後培養）。
２）細ｍをプロトプラスト化緩衝液１−中に再懸濁させ
る。
３）２８℃で２ｈ培養する。
４）　　ＳＭＭＰ媒体中でプロトプラストを２回生長さ
せる。
５）プロトプラストをＳＭＭＰ媒体０．５　ｒｎｌ中に
再懸濁させる。
６）融合バッチの製造： プロトブラスト１供与体’　０．２７！＋プロトプラス
ト′受容体０．２− ３ＭＭ緩衝液中の５０％のＰＫＧ　Ｏ，３ｄ７）室温で
５分間培養する。
８）　　ＳＭＭＰ媒体５−を加えかつプロトプラストを
遠心分離する。
９）プロトプラストをＳＭＭＰ媒体１．５コ中に再懸濁
させる。
１０）　　プロトプラストを２８°Ｃで５ｈ培養する。
１１）　　３ＭＭ緩衝液中の希釈剤を調製しかつアリコ
ートを再生寒天上に載せろ。
実施例　５ 以下の表は、結晶形成特性を転移させる異種菌株間の融
合の例を示す。
表：異種菌株間の融合 融合Ｆ６ ｓｒ　　　　　　＋ １供与体“：　ＨＤ　７３−３０（ｐＢｏ　１６）　ｍ
ｅｔ、　　ａｒｇｌＳｔ、　Ｔｃ１ｃｒｙｓ−＋ｒＳ １受容体’　：　ＨＤ　２　Ｄ６−４　　　　ｍｅｔ、
　ａｒｇ、　５ｔ１Ｔｃ、　　ｃｒｙｓ融合率、　Ｓｔ
　　、　Ｔｃ　　コロニー０．５％７’Ｌｚ　　）当す
（７）Ｓｔｒ、　Ｔｃｒフｏニー：　　１０実施例　６ 以下の表は、異なった結晶形成能力を有する２種類のＨ
Ｄ　−２突然変異体を組合せた融合の例を示す。
気供与体’　：　Ｆ　３２−１９　　　　ｍｅｔ　、　
ｐｕｔ　、　　ｃｒｙ　ｔｅｎ１受容体“：　ＨＤ−２
Ｄ　１０　　　ｍｅｔ　、　ｐｕｔ　、　、ｃｒｙ　ｔ
ｈｕｒ。
融合率二〇、７％ 原栄養性コロニー：　）　１００　／プレートコロニー
（７６）の顕微鏡調査 病原型Ａ結晶　　　２６．３％ 病原型Ｃ結晶　　　　７．９％ Ａ＋Ｃ結晶　　　　６５．８％ 実施例　７ 以下の表は、Ｂ、ｔ、プロトプラストとＢ、ｃ、プロト
プラストの融合例を示す。
融合Ｆ１２ １供与体“：Ｂ、ツリンギーンシスＨＤ　８　Ｋ４−３
（ｐＢｏ　１６） 東受容体“二Ｂ、セレウスＵＭ　７−１　（ｐ（ＩＭ　
１９４）−＋ｒｓｒ　　　　　　＋ ｈｉｓ、ｎｉｃ、　Ｓｍ、　Ｔｃ、　Ｃｍ、　ｃｒｙｓ
Ｔｃ　Ｓｍ　　のコロニーの分析 ＋ ｈｉｓ−１ｎｉｃ　　、　　Ｃｍ　、　ｃｒｙｓ　　　
４＋ ｈｉＢ−１ｎｉｃ　　、　（１！ｍ　、　　ｃｒｙｓ　
　　５ｈ１８−１ｎｉｃ　　、　　Ｃ！ｍ　　、　　ｃ
ｒｙｓ’″　　２ｈｉｓ”’、ｎｉｃ　　、　Ｃｍ　、
　　ｃｒｙｓ−２適用実施例 以下の表に、種々異なった融合した菌株の生物学的作用
効果をまとめて示す。
実験は以下のようにして実施した： ａ）フ゛ルテリラ・マクリペニス（Ｐｌｕｔｅｌｌａｍ
ａｃｕｌｉｐｅｎｎｉ８　：アオムシ）食餌及び接触実
験 キャベツの若葉を、試験物質の水性製剤中に３秒間浸漬
しかつ水０．５−で湿めらした円形フィルタに載せてプ
ラスチックビー力に入れた。次いで、２〜３段階の１０
匹の幼虫を葉に付着させた。
判定は食餌法で行いかつ実験開始の３日後の死亡率を調
べた。
ｂ）スボドプテラ・リドトラリス（５ｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ１１ｔｔｏｒａｌｉｓ　　：　　Ａｇｙｐｔ−Ｂａｕ
ｍｗｏｌｌｅｕｌｅ　　）人工的培養基での飼育実験 飼育は、１００−のプラスチックピーカ内で、有効物質
を液状で慎重に混合した標準培養基約５０ｍ１で行なっ
た。各濃度毎に、１０個のビー力に長さ１０〜１２開の
幼虫（Ｉ、３）ｇ入れた。
観察は一般に成虫が羽化するまで行なった。
Ｃ）アエデス・ニジブチ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ
　：黄熱病媒介力） 接触及び食餌実験 ２５０ゴのプラスチックビー力２５０　ｍｇに２３℃の
水道水２００−を充填しかつ２０匹の力の幼虫（Ｌ２）
′？：入れた。その後、試験物質を容器に入れかつ２４
時間後死亡率を調べた。
ｄ）レブチオタルサ・デセムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏ
ｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ　：コロラド甲
虫） 食餌及び接触実験 若いジャガイモの葉の打抜き片を３秒間試験物質の水性
製剤中に浸漬しかつ次いでパレット区画（打抜き片−葉
／区画）に配置し、次いで１区画毎に予め体重をはかっ
たコロラド甲虫の幼虫（Ｌ３）を入れた。繰返し回数は
ｎ＝１０であった。評価は食餌実験の３日後に幼虫の体
重変化（ｒＩｑ）及び死亡率ＨＤ−８Ｋ４−３　＝　Ｂ
、ｔ、ガルレリア＋ｐＢｃ！　＋　ｐｃ　１９４（病原
型Ａ） Ｂ、ｃ、　Ｄ　Ｉ　　、＝　Ｂ、セレウスｈｉｓ　　５
ｔｒＦ　１２−１　　＝　ＨＤ　８　ｃｒｙ　ｇａｌと
融合したＢ、セレウス（病原型Ａ） Ｆ　４−３　　＝　ＨＤ−２ｃｒｙ　ｔｈｕｒと融合し
たＢ、セレウス（病原型Ａ） Ｂｌ　２５６−８２　＝　Ｂ、ｔ、テネプリオニス（病
原型Ｃ）Ｆ　８−１　　＝　ＨＤ−２Ｄ　１０　ｃｒｙ
　ｔｈｕｒと融合したＦ　３２−１３　ｃｒｙ　ｔｅｎ
　（病原型Ａ−）−０）使用した培養溶融の表示 例　　１ プロトプラスト化緩衝液の組成は、例えば以下のとおり
であった： １）ＳＴＭ：サツカロース０．５Ｍ、）リス３０ｍＭ。
ＭｇＯ１２・６　Ｈ２Ｏ（ｐＨ８，０）　５　ｍＭ２）
　　ＳＴＭＬ　：リソチウム０．５■／ゴを有するＳＴ
Ｍ３）ＳＭＭ：サッカロース０　＊　５　Ｍ　、Ｎａ　
２−マレイン酸塩２０　ｍＭ、　　ＭｇＣｌ２　（ｐＨ
６，５０）　２０　ｍＭ４）　　ＭＭ　：　Ｎａ２−マ
レイン酸塩２０　ｍＭ　、　ＭｇＯ１２（ｐＨ６，５）
　　２０　　ｍＭ ５）ＭＭＴＪ：リソチーム５＋＋ｖ／ｄｋ有するＭＭ６
）　　ＳＭＭＰ　：同じ容量の２　Ｘ　ＳＳＭと４×抗
抗生物質体３をオートクレーブ処理によって合した。
７）　　ＳＭＭＰ　Ｍ／Ｌ：ミュータノリシン１００Ｏ
Ｕ／ｍ及びリソチーム１１ｎ９／−を有するＳＭＭＰ例
　　２ プロトプラストを再生するだめの媒体の組成は、例えば
以下のとおりである： カゼインペプトン　　　　１０　　ｆ 酵母抽出物　　　　　　　５１ グリツース　　　　　　　　５２ Ｍａｉｌ　　　　　　　　　　　　２　　ｔクエン酸Ｎ
ａ　　　　　　　　２　１ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２００，５？ （ｉａＣ１４・２Ｈ２００，４ｆ サッカロース（ｐＨ７，０）　　　　３４０　　　？ゼ
ラチン　　　　　　　　２５２ で　　ん　　粉　　　　　　　　　　　１５　２寒　　
天　　　　　　　　　　　２５　　　ｆＲＯＩ　：クロ
ルアンフエニフールｌｐｇ／ｒｎｔＶ　有ＹるＲ ＲＯ２：　クロルアンフエニフール２μｇ、／　ｍｔ’
ｔ　有するＲ ＲＴＣｌ　：テトラサイクリン１５μｇ／−及びクロル
アンフエニフールｌμｇ／ｒｎｔヲ有スルＲ例　　３ 脱脂した大豆粉　　　１０．ＯＶ／１ ジャガイモでん粉　　　５．０　５’／１酵母自己分解
物　　　　２．０　　？／ｌ無水に、ＨＰｏ、　　　　
　　１．０　　ｆ／ｌＭｇ５Ｏ，−７Ｈ２Ｏ０，３ｆ／
１ ０ａＣｉ１２　・６　Ｈ２Ｏ０，０８ｆ／ｌＭｎＣｌ２
−４　Ｈ２Ｏ０，０５ｆ／１０ｕＣ１、０，００５ｆ／
ｌ ＺｎＣｌ２　　　　　　　　０．００５　？／ｌＦｅ０
１３　　　　　　　　０．００５　Ｐ／１殺虫剤として
使用するには、本発明により得られた殺虫剤として有効
な製剤もしくはトキシンに自体公知方法で通常の添加物
（担持物質、助剤、湿潤剤等）を加えかつ適当な適用形
に転化する。
そうして調製した殺虫剤は、噴霧粉末、懸濁液の形で、
顆粒その他として使用することができる。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）バシラス・ツリンギーンシスＤＳＭ４０８２及び
    その昆虫病原性蛋白質を合成する突然変異体。
  2. （２）バシラス・ツリンギーンシスＤＳＭ４０８２。
  3. （３）２種類もしくは少なくとも２種類の、異なつたト
    キシンを有する菌株のプロトプラスト融合により、遺伝
    的固定されてエンドトキシンを形成する能力を有するバ
    シラス・ツリンギーンシス型の微生物を収得する方法に
    おいて、第１工程で細胞壁を分解させ、第２工程で融合
    させかつ最後に細胞壁の再生を再び励起することを特徴
    とする、昆虫病原性蛋白質の収得法。
JP63100454A 1987-04-25 1988-04-25 バシラス・ツリンギーンシス型の微生物およびその創製方法 Expired - Lifetime JP2627425B2 (ja)

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