JPS63277636A

JPS63277636A - 徐放性ポリアミノ酸

Info

Publication number: JPS63277636A
Application number: JP62112940A
Authority: JP
Inventors: Makoto Iwatsuki; 誠岩月; Toshiro Hayashi; 林　寿郎
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1987-05-08
Filing date: 1987-05-08
Publication date: 1988-11-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、経皮吸収性の各種薬効成分や酵素を担持した
、衣類またはガーゼ、体内用癒着防止剤や再建材として
用いられる、徐放性ポリアミノ酸に関する。

従来の技術酵素固定化法の一つとして、比表面積の大きな高分子ポ
リアクロレイン表面に微生物す／ｆロチイン・す・母−
ゼ（ＬＰＬ　）を共有結合させることが既に知られてい
る。

しかし、従来の高分子に直接酵素を共有結合により固定
した場合、その触媒活性を求めると、表面酵素濃度の減
少に伴い比活性が低下する傾向がありた（林ら、　Ｐｏ
ｌｙｍｅｒ　Ｐｒ＠ｐｒｉｎｔ、　Ｊａｐａｎ、、　３
５＋５２２．　（１９８６）　’）。また、酵素の比活
性も小さくなり、固定化することによる酵素分子の構造
変性が示唆されていた。一方、ここで用いられた酵素担
体としてポリアクａレン・マイクロスフイアは生体適合
性に乏しく、実用に適しないものであった。

酵素固定化用担体として、生体内分解吸収性があり、抗
原性を示さず、すぐれた組織適合性を有する担体の開発
と共に、固定された酵素や薬効成分の活性低下を防止す
る技術の開発が要望されていた。

問題点を解決するための手段および作用本発明者らは、
上記の問題点を解決すべく鋭意研究を行なった結果、ア
ミノ酸重合体またはアミノ酸共重合体、就中コポリ（Ｌ
−グルタミン＠／Ｌ−ロイシン）ランダム共重合体が前
記担体としての目的に適い、かつ高分子と酵素との間に
生体適合性のよい中性アミノ酸またはそのオリゴペプチ
ドをスペーサとして介在させると、酵素の活性低下を防
止できることを見出し、本発明を完成するに至り九。

即ち、本発明は、中性アミノ酸とアミド結合しうる酵Ｘ
ｉたけ薬効成分を中性アミノ酸ｔｅはそのオリゴペプチ
ドを介してポリアミノ酸に担持させたことを特徴とする
徐放性ポリアミノ酸である。

本発明に用いられるポリアミノ酸としては、グルタミン
酸、ロイシン、アスパライン酸の重合体ま几は共重合体
が挙げられる。／ＩＪアミノ酸をガーゼ、衣類などに適
用するうえから繊維状の形態で使用するのが好ましく、
重合度は１００〜１００．０００、と＜ＩＣ２００〜３
０００（２）範囲が適当である。生体に適用し念場合に
、分解吸収性があり、抗原性を示さず、すぐれた組織適
合性を示す代表例は、Ｌ−グルタミン酸とＬ−ロイシン
の共重合体、とくにその５０：５０（モル比）の共重合
体である。

酵素または薬効成分をポリアミノ酸に担持するスペーサ
として使用する中性アミノ酸は、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン
を九はこれらのオリゴペチドから選ばれる。

酵素はアミン基を有するリポプロティン・リノ母−ゼ、
α−キモトリプシン、トリプシン、ペグシン、ノリタイ
ンなどが用いられ、薬効成分は殺菌剤、制癌剤、抗炎症
剤でアミノ基を有するものであればそのまま用いること
ができる。また、アミン基をもたない酵素ま九は薬効成
分でも、アきノ基を導入し、本来の作用ないし機能を損
４わないものであれば、スペーサを介してポリアミノ酸
に担持することができ、これらも本発明に包含される。

酵素ま九は薬効成分をスペーサを介してポリアミノ酸に
担持するには次のようにして行うことができる。

ポリアミノ酸（ＦＡＡ　）をｐ−ベンゼンスルホン酸な
どの溶媒に分散させ、スペーサとしての中性アミノ酸ま
九はそのオリゴペプチド（ＮＡ）と反応させる０次に、
酵素を共有結合させるために、水溶性カルＭシイｉド（
ｗｓＣ）を添加し、低温下で反応させる（スキーム１）
。

（ＦＡＡ）ｎ（ＮＡ）ｍ−ＣＯＯＨ＋Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝＝Ｎ
−Ｒ’（ＷＳＣ）更に、ｐ−ベンゼンスルホン酸ヲ加えテ、生成した化合
物（１）を分散させ、化合物（１０を生成させる（スキ
ーム２）。

（ＰＡＡ）ｎ（ＮＡ）ｎｌ−Ｃ０ＯＨ＋（１）（ＩＱ　
　　　　　　　（スキーム２）更に、ｐ−ベンゼンスル
ホン酸を加えて化合物（ＩＯを分散させ、ｐ−ベンゼン
スルホン酸溶液に溶解したアミノ基を有する酵素または
薬効成分（ＮＨ２（−Ｅ））を反応させる（スキーム３
）。

（スキーム３）スペーサを介してポリアミノ酸に担持さｎた酵素は、中
性アミノ酸またはそのオリゴペプチドで構成されるスペ
ーサ部分が生体内でグロテアーゼにより徐々に切断され
ることにより、徐放されて作用系内に移動してその効果
を発揮すると共Ｋ。

担体のポリアミノ酸も上記グロテアーゼによシ生分解し
、やがて消失する。酵素に代えて薬効成分（薬剤）を担
持させた場合も同様である。

酵素または薬効成分をスペーサを介してポリアミノ酸に
担持させると、後述する実施例で明らかにするように、
その比活性の低下を防止すると共に、反復使用に対する
耐久性および耐熱性が向上し、声依存性が低下するので
、高い比活性を有し、持続的な効果を発揮する。

実施例以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ａ）　　リポプロティン・リパーゼ（ＬＰＬ　’）のコ
ポリ（Ｌ−グルタミン酸／Ｌ−ロイシン）　（ＧＬ）繊
維面への固定化：担体母試料のＧＬ織繊維調製は、その共１合体をＮＣＡ
法によシ合成し、繊維状に成形したγ−ＭＬＧ側鎖を脱
エステル化（ケン化）させて得た。

親水性繊維のデニールは１３０ｄ／１２本（１０，８ｄ
／ｕｎｉｔ）であり、Ｌ−グルタミン酸：Ｌ−ロイシン
ｚ　５０　：　５０　（ｍｏｌ／ｍｏｌ　）であった。

この担体母試料に次の手順でＬＰＬを固定化した。

（１）ＧＬ繊維約１．９を水洗乾燥した後、０．０５Ｎ
　−ＰＢＳ　（ｐ−ベンゼンスルホン酸）１０ＩＩＬｌ
中に分散させる。

（２３２０ｍ９　／　ｍｌ濃度のＷＳＣｌｏ、０５　Ｎ
　−ＰＢＳ　（ｐＨ＝４．７０）１０ｍを添加し、全体
を４℃に保ち、４５分間激しく攪拌しながら反応させる
（スキーム１、化合物（Ｄの生成）。

（３）遠心分離後、上澄液を除去し、０．０５Ｎ−ＰＢ
Ｓで２回洗浄を繰り返す。

（４）祈念に０．０５Ｎ−ＰＢＳ　５ゴを加えて、ＧＬ
　−ＷＳＣ（化合物■）を分散させる（スキーム２）。

（５）１０■／Ｉｄｏ１度のＬＰＬｌｏ、０５　Ｎ　−
ＰＢＳ　５　ｍｊを添加し、４℃で１２時間反応させる
（スキーム３）。

（６）遠心分離後、上澄液を除去し、０．０５Ｎ−ＰＢ
Ｓで２回洗浄を繰り返し後、凍結乾燥する。

（力　−２０℃の冷凍庫内で保存し、こｎをラベルＧＬ
　−ＬＰＬ　−１とする。

次に、担体母試料にトリグリシン（Ｇ（３））スペーサ
を介してＬＰＬを担持する場合の手順は、（１）〜（４
）は上記と同じで、（５）以下は次のとおりである。

（５５２０ｍ９７ｍ１ｐ度のトリグリシｙ（Ｇ（３））
１０．０５Ｎ−ＰＢＳ　５　ｒｎｌを添加し、４℃で６
時間反応させる。

（６）′　　遠心分離後、上澄液を除去し、０．０５Ｎ
−ＰＢＳで３回洗浄を繰り返す。

（７７このようにして、（ＧＬ）　−Ｇ　（３）　−Ｃ
０ＯＨ繊維を調製した後、再び前記（１）〜（７）を繰
り返し、（ＧＬ）　−Ｇ　（３）　−ＬＰＬ　−１を調
製し九。

以上の方法で得られ７’１−ＧＬ−ＬＰＬおよびＧＬ−
Ｇ　（３）　−ＬＰＬ試料の酵素固定化量をニンヒドリ
ン法により同定し友、その結果は表１のとおりであった
。

表　　１繊維　ＬＰＬ　　濃度試料’　　　　　（ｗ）　　　　（ｍ９）　　　（ｗｔ
−％）ＧＬ−ＬＰＬ−１３００，０２６６０，０８９Ｇ
Ｌ−ＬＰＬ−２３００，０２４６０，０８２ＧＬ−Ｇ（
３）−ＬＰＬ−１３００，０２２１０，０７４ＧＬ−Ｇ
（３）−ＬＰＬ−２３００，０１９６０，０６５ｂ）比
活性および相対比活性基質としてｐ−ニトロフェニルラウレート（ｐＮＰＬ　
）を用いて、固定化リノＩ−ゼ、ＧＬ　−ＬＰＬおよび
ＧＬ　−Ｇ（３）　−ＬＰＬＯ比活性ΔＥ（μ−ｍｏｌ
／ｍｉｎ／η−ＬＰＬ　）および相対比活性ＲＡ　（同
重量のｎａｔｌｖ・−ＬＰＬの比活性に対する一定化Ｉ
、ＰＬの比活性の比）を、次の操作に従って測定した。

酵素溶液（濃度０．２５ｗｔ％）基質溶液（２，５ｍＭ　ｐＮＰＬ　、　５０ｍＭアセテ
−）　（ｐＨ５゜６）２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−Ｚｏｏ　
）基質溶液（１，９ｄ）その結果を表２に示した。ＬＰＬを共有結合によすＧＬ
に固定化させると、比活性は約４０％まで低下し次、こ
れに対して、トリグリシン・スペーサＧ（３）を用いる
ことにより、比活性は７３％まで上昇した。これは、酵
素分子と担体表面との間に生成する結合点が、スペーサ
を介在させることによって多くなりすぎることがなく、
酵素分子の形態が自然の場合とあまり変化しないことに
よるものと解さｎる。本実施例は低分子基質の例である
が、高分子量の基質が関与する場合には、スペーサの存
在によって、立体障害による影響を生じ堆いという利点
が期待される。

表　　２　　（３７℃ｅＦＪ（５，６）Ｎａｔｉｖｅ　
　ＬＰＬ　　　　　　　　　２．２５　　　２．１５４
．５０　　　２．４０６．７５　　　２．４３９．００　　　２．４６Ａｙ、　　　　　２．３６　　　　　１．０００ＧＬ−
ＬＰＬ−１８，５７，５４１，０１０，４２８５，３４
，７００，９８０，４１５Ａマ、　　　　　１．００　　　　　０．４２２ＧＬ−
ＬＰＬ−２６，７５，４９０，９４０，３９８４，８３
，９４０，９２０，３９０Ａマ、　　　　　０．９３　　　　　０．３９４ＧＬ−
Ｇ（３）−ＬＰＬ−１７，７５，６７１，７７０，７５
０５，２３，８３１，６７０，７０８Ａマ、　　　　　１．７２　　　　０．７２９Ｃ）反復
使用時の耐久性固定化酵素を実用化するうえで、反復使用時の耐久性あ
るいは寿命が基本的な因子となる。そこで、そｎぞれの
試料について、同一条件下において（ｂ）項参照）、所
定量の固定化ＬＰＬを反応容器中でｐＮＰＬ加水分解を
行わせ、遠心分離後上澄液を分取し、ΔＥの測定を行っ
ｔ６次いで、−回ずつ０．０５Ｎ−ＰＢＳ（ＰＨ５，６
）で洗浄し、遠心分離を行い、その後再び同一条件下で
新しいｐＮＰＬ基質溶液を添加して反応させるという操
作を繰り返し比。

その結果を表３に示しｔ、まｔ、第１図はＧＬ−ＬＰＬ
　−１についての反り回数とＲＡ（第１回目反応を１０
０％とする相対量）との関係を示すグラフである。

第１図から明らかなように、ＧＬに直接固定化されたＬ
ＰＬは１６回反復使用しても実質的な比活性低下は見ら
れない、一方、Ｇ　Ｌ　−Ｇ　（３）　−ＬＰＬ　−１
の場合も、表３に示すとおり、１０回反復使用で、ｌＯ
％程度の減良を示すに過ぎない。

表　　　３ＧＬ−ＬＰＬ−Ｉ　　ＧＬ−Ｇ（３）−ＬＰＬ−１１１
，０１１００，０１，７７１００，０２１，００９９，
０１，７１９６，６３０，９７９６，０１，６６９３，８４０，９９９８，０１，７０９６，０５０，９８９７，０１，６８９４，９６０，９５９４，１１，６４９２，７７０，９４９３，１１，６６９３，８８０，９６９５，０１，７２９７，２９０，９３９２，１１，６４９２，７１００，９２９１，１１，６０９０，４１１０，９４９
３，１１２０，９５９４，１１３０，９０８９，１１４０，９１′９０．１１５０．９３９２．１１６０．９２９１．１ｄ）耐熱性および一依存性バイオリアクターなどの設計に際し、その目的によって
反応系の温度や−の最適条件が設定されるから、前記反
復使用時の耐久性と共に、熱安定性および一依存性を予
め知ることが重要である。

そこで、熱安定性評価として、所定量のＮａｔｉｖｅあ
るいは固定化ＬＰＬを、ｐＨ５，６０のＱ、　Ｑ　５　
Ｎ−ＮＢ５中で所定温度において１時間浸漬した後、反
応系を３７，０℃に急冷し、直ちにｐＮＰＬ溶液を添加
して比活性を測定した。表４および第２図は、それぞれ
の場合について、１５℃の値を基準として得られたＲＡ
値の前処理温度依存性を示したものである。

表　　　４Ｔ（匂　　ΔＥ　　　％　　　Ｔ（０ΔＥ　　チ１１５
２．３６１００．０１５１．０３１００．０２２２２．
３５９９．６２２１．０１９８．０３３０２．３１９７
．９３２１．００９７．５４３５２．２３９°４．５４
００．９８９５．６５４０１．９９８４．３４５０．９
３８９．９６４５１．５１６４．０５００．７２７０．
３７５０１．１０４６．６５５０．５４５２．６８５５
０．５０２１．２６００．３７３６．０９６００．０７
３．０６５０．２１２０．１１０７０００７００．１０
９．７第２図から明らかなように、ＧＬ−ＬＰＬはｎａｔｉｖ
ｅ−ＬＰＬに比べて熱安定性の向上が認められ、６０℃
においてもなお３６係のＲＡ値を与えている。

一方、酵素の触媒活性が−に強く依存することは酵素反
応の特徴であるが、酵素の固定化により一依存性に変化
が見られることが多数報告されている。

そこで、表５および第３図に、それぞれの場合について
、−７，９における最高の比活性を基準（１００％）と
したときのＲＡ値の一依存性を示した。

表　　　５１５．６２３６７４．９５．６１．０１８３．１２６．
０２．６５８４．１６．０１．０８　Ｂ９２３６．６２
．８９９１．７６．６１．１５９５．０４７．４３．０
９９８．１７．４１．２０９９．０５７．９３．１５１
００．０７．９１．２２１００．０６８．６２．９５９
３．７８．６１．２０９８．５７９．０２．５４８０．
６９．０１．１７９６．２８９．８１．５４４８．９９
．８１．００８２．８第３図から明らかなように、ｎａ
ｔｉマ・−ＬＰＬではｐＨ７，９０を最適−とする比較
的鋭敏な一依存性を示すのに対し、ＧＬ　−ＬＰＬの場
合は、ｐＨ−ＲＡ曲線が巾広くなシ、とくに−の大きい
領域において大きなＲＡ値が維持される。これは、ＬＰ
Ｌの固定化によシー変化がよる＃素のコンホメーシ璽ン
変化がある程度抑制されるためと解される。また、高−
領域で高ＲＡ値が維持されるのは、酵素の共有結合化反
応によシ、−ＮＨＸ基が相対的忙減少し、酵素近傍での
環境がよシ酸性に傾き、この影響を打消すための考えら
れる。

発明の詳細な説明し比ように、本発明の徐放性ポリアミノ酸は、酵
素または薬効成分を担持する担体（中性アミノ酸スペー
サおよびポリアミノ酸）が、生体内分解吸収性を示し、
しかも抗原性がなく、すぐれた組織適合性をもっと共に
、酵素または薬効成分がスペーサの介在によりて高す比
活性を維持し、その耐久性、耐熱性および一依存性に関
してすぐれた安定性を示す。し比がって、経皮吸収性を
有する殺菌剤などの外用薬剤を担持した病人用下着や／
’Ｆジャマ等の衣類、外用ガーゼとして、また、癒着防
止材や再建材等の体内用メッシェとして安全に使用する
ことができ、医療技術の向上に大きく貢献することが期
待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例に係るＧＬ−ＬＰＬ−１の反復
使用回数と比活性（ＲＡ）との関係を示すグラフ、第２
図は固定化ＬＰＬの温度依存性を示すグラフ、第３図は
固定化ＬＰＬの一依存性を示すグラフ、である。第２図および第３図において、○（曲線１）はＧＬ−Ｌ
ＰＬ−１を、・（曲線２）はｎａｔｉｖｅ　−ＬＰＬを
、それぞれ表わす。

Claims

【特許請求の範囲】１）中性アミノ酸とアミド結合しうる酵素または薬効成
分を中性アミノ酸またはそのオリゴペプチドを介してポ
リアミノ酸に担持させたことを特徴とする徐放性ポリア
ミノ酸。２）中性アミノ酸が、グリシン、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、セリンまたはスレオニンである特許請求
の範囲第１項の徐放性ポリアミノ酸。３）酵素が、リポプロテイン・リパーゼ、α−キモトリ
プシン、トリプシン、ペピシンまたはパパインである特
許請求の範囲第１項の徐放性ポリアミノ酸。４）薬効成分がアミノ基を有する殺菌剤、制癌剤または
抗炎症剤である特許請求の範囲第１項の徐放性ポリアミ
ノ酸。５）ポリアミノ酸が、グルタミン酸、ロイシン、アスパ
ラギン酸の重合体またはこれらの共重合体である特許請
求の範囲第１項の徐放性ポリアミノ酸。６）ポリアミノ酸が、重合度１００〜１００，０００の
ものである特許請求の範囲第１項の徐放性ポリアミノ酸
。