JPS63271140A

JPS63271140A - 自動レ−ト分析法

Info

Publication number: JPS63271140A
Application number: JP10568187A
Authority: JP
Inventors: Kiyokazu Nakano; 中野　清和; Masayoshi Hirabayashi; 平林　正佳
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1987-04-28
Filing date: 1987-04-28
Publication date: 1988-11-09
Anticipated expiration: 2013-03-30
Also published as: JP2732448B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は同一測定セルを複数回数測定する自動分析装
置による検体のレート分析法に関する。

さらに詳しくは臨床生化学検査における血清、血漿、尿
のごとき生体液検体に含まれる着色または濁り成分によ
る分析過誤を少なくでき、さらに吸光度変化率が大きい
高値検体までも幅広く測定できるレート分析法に関する
。

（ロ）従来の技術レート分析法は、正確度においては原理的にエンドポイ
ント法よりも優れているが、適用を誤れば大きな分析誤
差を招くことになる。つまりレート分析法は反応速度が
定常状態（基質が十分に存在する状！１４）にあること
を前提として行われる方法であり、この条件が満足され
ない場合は大きな分析誤差が生じることを避けることは
できない。

従来これを避けるために予めレート分析の測定可能な吸
光度範囲を設定し、吸光度変化率測定がその範囲内にあ
ることを確認して分析がなされている。

（ハ）発明が解決しようとする問題点しかしながら、上記のごとく設定される吸光度範囲は実
検体中の着色成分、濁り成分などの影響（各実検体によ
り異なる）が考慮されていないので、非定常状態（基質
不足の状態）を定常状態と見誤ったり、定常状態を非定
常状態と見誤る虞れがあった。もちろん上記設定吸光度
範囲を狭くすることによりこれを回避ｊることかできる
が、この場合は着色成分や濁り成分を含まない検体につ
いても測定できる範囲を狭くしてしまうことになり実用
的でない。また、測定対象となる臨床検査項目には、測
定すべき範囲が非常に幅広いものがあり、例えば一般的
な項目であるＧＯＴ　（ＡＳＴ）酵素活性測定では、健
常者１０〜３０Ｕ＃に対して１０００〜数１０００Ｕ＃
もの値を有する患者検体が分析対象になることがある。

勿論１０〜数１０００Ｕ＃！までを高精度で同一分析条
件で測定することは不可能であり、数１０００ＵＺＱも
の超高単位検体については適当な検体反応液の吸光度チ
ェック値により「測定不可能」の判断を下し、適当な方
法（例えば希釈する等）で再分析しているが、検体によ
っては測定波長で吸収を示す成分や濁り成分を含む成分
を含有することがあり、上記のごとき超高単位検体であ
ることを正しく判定できないことが生じている。

この発明はかかる状況に鑑みなされたものであり、上記
のごとき定常状態を保持するレート測定可能な区間を最
大限に判定しかつ濁り成分等の影響を考慮した自動レー
ト分析法を提供しようとするものである。

（ニ）問題点を解決するための手段かくしてこの発明によれば、自動分析装置により所定時
間範囲内における検体反応液の所定時間毎の吸光度を測
定するレート分析法において、測定の始点および終点を
１波長測定で、その間を２波長測定で各々測定し、得ら
れる吸光度値のデータ列から検体反応液中の被挟物濃度
を演算する方法からなり、（ａ）上記始点でのデータを、１波長測定に基づいて予
め設定されたレート測定限界吸光度（Ｊ２）と比較し、（ｂ）上記比較によりレート測定限界内であると判定さ
れたものについて、さらに前記終点でのデータが、予め
設定されたレート測定限界吸光度（Ｊｌ）もしくは試薬
ブランク液の吸光度に基づいて修正された実効限界吸光
度（Ｊｌ’）で規制されるレート測定可能範囲内である
ときは、２波長測定全域（ｔＭ〜ｔＨ）のデータ列すべ
てから吸光度変化率を演算し、（ｃ）上記終点のデータがレート測定限界を越えるとき
は、２波長測定の開始点（１，）から少なくとも３点の
吸光度変化を、２波長測定に基づいて予め設定された実
質許容吸光度変化（Ｊ２）と比較し、（ｄ）上記比較に
より許容以内であると判定されたものについては、下記
条件；（△Ａ／ｌｎ　　ｔＭ）≧（Ｊ　ｔ／１Ｈ−ｔＨ）ただ
し、　△Ａ：２波長測定開始点（ｔＭ）から上記Ｊ、を
越えない最大吸光度変化ｔｎ：上記△Ａを与える２波長測定点を満足する場合は△Ａ　／　ｔ　ｎ　−ｔＭに基づいて
被挟物濃度を演算し、満足しない場合はレート分析不可
と判断することを特徴とする自動レート分析法が提供さ
れる。

この発明は、基質または生成物質の増減速度を、これら
の単位時間当たりの吸光度変化として測定する酵素活性
および基質のレート分析法において、１波長測定に基づ
い゛て基質不足に陥る境界レベルとして設定されたレー
ト測定限界吸光度（ＪｏおよびＪ２）および該Ｊ、に対
して試薬ブランクの吸光度を考慮して修正した実効限界
吸光度（Ｊ　ｌ’）並びに２波長測定に基づいて予め設
定された実質許容吸光度変化（Ｊ２）により、検体反応
液の着色・濁り成分の影響を除いた実質的に定常状態を
保持しうる最大限のレート測定区間を判定し、検体反応
液中の被検物濃度を定量するレート分析法であることを
特徴とする。

すなわち、レート測定の限界は１波長測定でもってレベ
ル設定され、レート測定については１波長測定よりも精
度の高い２波長測定のデータに基づいて行われる。この
２波長測定のデータは主波長測定値から副波長測定値を
差引いて求められる。

これによって検体反応液の着色・濁り成分等の影響、測
定セルのギズが排除され、実質的な吸光度変化が得られ
ることになる。この方法においては２波長測定に用いる
主波長と副波長のうち主波長を１波長測定時の波長とし
て用いることができる。

上記゛２波長としてぼ拘えばＧＯＴ酵素活性測定の場合
主波長３ＮＪｎｍ、副波長３７５ｎｍが挙げられる。

上記Ｊ、は、意図するレート測定区間、ここでは２波長
測定区間、において非定常状態になる程度の活性値を存
する高単位検体でできるだけ無色透明のものを選択し、
このものについて所定時間毎に１波長測定される吸光度
の経時的変化において定常から非定常に移行するときの
吸光度（Ａｃ２）をもってレート測定限界吸光度として
設定される。

上記Ｊ０は、非常にまれであるが、試料が超高単位を示
す場合にはレート測定開始直後において反応液中の基質
が不足することがあるので、これを判定する吸光度であ
り、Ｊ、および試薬ブランク液の１波長測定吸光度より
誘導される値である。

前記Ｊｔ’は、上記Ｊ、を設定したときの吸光度（Ａｃ
ｔ）から該測定位置における試薬ブランク液の１波長測
定の吸光度（Ａｂ２）を差引いた、実効的なレート測定
限界に対応する吸光度として設定されるものである。こ
れにより検体反応液の着色・濁り成分による影響が相殺
されることになる。

前記実質許容吸光度変化（Ｊ２）は、前記Ｊ、設定時の
高単位検体について、レート測定に用いる主波長と副波
長との２波長測定で得られる吸光度の経時的変化から、
定常から非定常に移行するときの限界吸光度（Ａｃｅ）
を求め、さらに該測定点での２波長測定の試薬ブランク
液の吸光度Ｑｂ２）を差引いた実質吸光度変化（Ａｃｔ
　　Ａｂｔ）を、２波長測定開始点（１Ｍ）において許
容される吸光度変化分に換算したものである。該換算の
方法については後述する実施例の記載が参照される。

この発明の方法において、上記Ｊｏ、Ｊ＋−Ｊ＋。

およびＪ、により、所定時間毎の測定から得られる吸光
度値のデータ列についてその始点および終点の１波長測
定値に対しては上記Ｊ０およびＪ、（またはＪ１′）に
よる判定が、また２波長測定値に対してはＪ、による判
定が行われる。すなわち、始点のデータ値がＪｏを満足
しかつ終点のデータ値がＪ、またはＪｌｏを満足する場
合は、２波長測定開始点（ｔＭ）から２波長測定終点（
七〇）までの吸光度変化がＪ、で設定される吸光度変化
内におさまり、従って２波°長測定全域（ｔＭ〜ｔＭ）
に渡って定常状態が保持されていることになり、この領
域のデータすべてを用いてレート分析されることとなる
。

上記において１波長測定される終点のデータ値がＪ、ま
たはＪｌｏを満足しない場合は、２波長測定開始点（ｔ
Ｍ）からの吸光度変化の絶対値がＪ。

を越えない範囲で最大になる測定点（ｔｎ）を選択し、
さらにこの２波長測定区間（ｔＭ〜ｔｎ）の吸光度変化
（八Ａ）から求まる吸光度変化率の絶対値。

１ΔＡ　ｌ　／　ｔｎ−ｔＭが２波長測定全域（ｔＨ−
ｔ、ｉ）に対するＪ、で定まる吸光度変化率、　Ｊ　ｔ
　／ｌＮ−ｔＭ以上になるときには、ｔＭ〜ｔｎが定常
状態を保持したレート反応区間と判定され、このように
レート測定区間を短縮してレート分析されることとなる
。

従ってこの発明の方法において、測定不可能である超高
単位検体については、１波長測定による始点での吸光度
がＪ。を越える場合、２波長測定開始点から少なくとも
３点の吸光度変化がＪ、を越える場合および上記のごと
き吸光度変化率、１△Ａｊ／ｌｎ　　ｔＭが、ｙ、＝’
／ｌｎ　　ｔＭよりも小さい場合の各場合にその旨判定
されることとなる。

（ホ）作用この発明によれば、所定時間範囲内で測定の始点および
終点を１波長測定で、その間を２波長測定で各々測定し
て得られる吸光度値のデータ列は、まず予め１波長測定
により設定されるレート測定限界吸光度（Ｊ０）でもっ
てすでに始点において基質不足による非定常状態である
かどうかが判定される。定常状態と判定されたデータ列
はその終点が実効限界吸光度でもって定常状態かどうか
が判定される。該終点が定常状態と判定されたものにつ
いては、２波長測定全域のデータ列がレート分析に用い
られる。しかし上記終点が非定常状態と判定されたとき
は、２波長測定開始点から少なくとも３点までの吸光度
変化が、予め２波長測定により設定された実質許容吸光
度変化以内のものを選択することにより、まずこの間で
非定常状態に陥っているものが排除される。上記選択さ
れたものについて、２波長測定開始点からの吸光度変化
が上記実質許容吸光度変化以内でかつそのときの吸光度
変化率が、２波長測定全域に対する実質許容吸光度変化
で定まる吸光度変化率以上を与えるデータ列までが、定
常状態下でのデータ列と判定され、このデータ列により
レート分析される。

以下実施例によりこの発明の詳細な説明するが、これに
よりこの発明は限定されるものではない。

（へ）実施例自動分析装置により所定時間範囲（ｔｉ＝ｔＮ、＋、た
だし等間隔時間に設定）内における２試薬法による酵素
活性測定で、比較的長い時間一定の吸光度変化を示す例
について説明する。

（ｉ）　　分析条件〔測定波長〕第２試薬（Ｒ２）分注（ｔＭ）直後の測定開始点（ｔｉ
）・・・λ１２波長測定区間（ｔＭ〜ｔｘ）　　　　・・・　λ１／
λ。

測定終了点（ｔＮ、ｌ）　　　　　　　　　　　　λ１
〔測定データ〕検体反応液の吸光度ｔｉ　　　・・・・・・ＡｉＬＭ〜ｔＮ・・・・・・Ａｓ〜ＡＮＬＨ＊Ｈ・・・・・・ＡＭや、試薬ブランク液の吸光度・・・・・・Ｒ−ＢＬＫまただ
し、λ、は主波長、λ、は副波長である。

（１１）　　レート測定限界吸光度（ＪＯおよびＪ２）
、実効限界吸光度（Ｊ１′）および実質許容吸光度変化
（Ｊ２）についてＪ、の決定第１図に示すごとく２波長測定区間（ｔ＋−ｈ）内にお
いて非定常状態になる程度の高単位検体でかつできるだ
け無色透明のものを選択し、このような検体についての
１波長（λ２）測定を上記所定時間範囲（試薬添加時：
ｔＭから測定終了時：　ｔＮ）内について行い、この範
囲の時間列上に表れる吸光度変化（ｍＡＢ　Ｓ／ｆｆ１
ｉｎ）　（イ）に基づいて、定常から非定常に移行する
ときの境界吸光度（ｍＡＢＳ）をＪｌとして決定する。

Ｊ、の決定第２図に示すごとく、上記高単位検体および試薬ブラン
ク液（例えば試料として生理的食塩水を使用する）につ
いて２波長（λ、／λ２）測定を上記Ｊｌの決定時と同
様に測定して吸光度の経時変化（ロ）を求め、高単位検
体の反応過程が定常状態から非定常状態へ移行する吸光
度（Ａｃ）と、この測定位置における試薬ブランク液の
吸光度（Ａｂ）（Ａ　ｂ＃　Ｒ−ＢＬＫ２）を求め、試
薬添加時（ｔＭ）、２波長測定開始時（ｔＭ）および３
点目の２波長測定点（１＋、＋。２）について近似的に
比例計算して、ｔＭ点での前記Ｊ、までの許容吸光度変
化として、次式により算出される。

Ｊ　ｔ　＝　（Ａｃ−Ａｂ）　・（（ｔＭ、ｔ　　ｔＭ
）／　（ｔＭ、ｔ　　ｔＭ））Ｊｏの決定先に求めたＪｌｑ試薬試薬ブランク液長波長測定吸光度
Ｒ−ＢＬＫ２）とから、「Ｊ、の決定」と同様に考え、
次式により算出される。

Ｊ　、　＝　Ｊ　、＋　（Ｒ−ＢＬＫ２−　Ｊ　ｔ）・
（（ｔＭ−ｔ　　ｔｉ）／（１＋、１−１．））Ｊ＋’の決定Ｊ、’＝Ｊ、±（Ａ　ｉ　−Ｒ−ＢＬＫ２）（ただし、
＋：基゛質濃度に注目して吸光度変化を見ているとき、
−二生成物濃度に注目して見ているとき）次にこれらのＪｏ、Ｊｌ、Ｊ＋’、Ｊｔ判定を第３図に
示した各種検体反応液（ａ＝ｅ）の反応タイムコースで
説明する。これらの反応タイムコースは上記分析条件に
より得られたデータ列に基づいて作成されたものであり
、・は１波長測定吸光度、◎は２波長測定吸光度、×は
Ｊｏ、　、Ｔ＋、　Ｊｒ”、　Ｊｔ判定で超高値域の吸
光度と判定された値をそれぞれ示す。

まず、各データ列の始点（ｔｉ）における検体反応液の
吸光度ＡｉをＪｏと比較する。その結果Ｊ０≧Ａｉを示
すデータ列は既に非定常状態を示しているので、「測定
不可能」の表示（換言すれば超高値の表示）がなされる
（（ａ）の場合に相当）。

一方Ｊ　ｏ　＜　Ａ　ｉであるデータ列については、２
波長測定開始点から３点までのデータからの吸光度変化
ＩＡｘ−＊−ＡＭｌを実質許容吸光度変化（Ｊ２）と比
較する。この結果、Ｊ　＊　＜　ＩＡ　Ｍ−ｔ−Ａ　ｓ
ｌを示すデータ列についてはたの区間（ｔ、４〜ｔＭ＋
ｇ）　内で非定常状態になっていることが示されている
ので、上記と同じく「測定不可能」の表示がなされる（
（ｂ）の場合）。

なお、上記過程の手前で実効限界吸光度（Ｊｌ’）を次
のようにして算出しておく。

Ｊ　ｒ’　＝　Ｊ　ｔ　＋　（Ａ　１−Ｒ−ＢＬＫ２）
（ただし、Ａ　ｉ＜　Ｒ−ＢＩＪ２のときＪ１°＝Ｊ１
）Ｊ！≧ｌＡＭ−ｔ　　ＡＭｌを示すデータ列について
は、該データ列の終点（ｔＩ４．ｔ）におけるデータ値
（八〇、２）を、既に算出されているＪｌｏと比較し、
Ｊｌｏ＜　Ａ　Ｎ　、□であるデータ列については、２
波長測定全域（ｔＭ〜ｔＭ）について定常状態が保持さ
れており、従って次式による吸光度変化率、△Ａ／△ｔ
　＝　（Ａ　Ｎ−Ａ　Ｍ）／　（ｔＮ−ｔＭ）に基づい
て被検初濃度が演算される。

しかしながら、Ｊｌ”≧Ａ　Ｍ　ｏ　ｒであるデータ列
については、２波長測定全域についての定常状態が保証
されていないため、Ｊ、≧ｌ　Ａ　ｎ−Ａ　ｓｌ　（Ｍ
　＋２≦ｎ≦Ｎ）を満足する測定データＡｎを与える２
波長測定点（ｔｎ）を選択し、さらにｔＭからｔｎまで
の吸光度変化率、　ｌ　Ａ　ｎ　　Ａ　Ｍｌ／　（ｋｎ
　　ｔＭ）がＪ。

／（ｔＭ−ｔＭ）で定まる吸光度変化率以上の場合には
、ｔＭ〜ｔｎの２波長測定区間が定常状態保持区間と判
定され、この区間での上記吸光度変化率に基づいて被検
初濃度が演算される。また、ｌＡｎ　　Ａｓ！／（ｔｎ
　　ｔＭ）＜　Ｊ　ｔ／　（ｔＮ−ＬＭ）の場合には、
このデータ列については「測定不可能」の表示がなされ
る。

なお、上記判定の過程をフローチャートで表仕ば第４図
のごとくである。ただし、該図において（ａ）〜（ｅ）
の各記号は上記説明の各記号に対応する。

以上の方法により、定常状態を保持している２波長測定
区間が正確に選択されかつその区間について吸光度変化
率に基づいて被検初濃度が演算されることとなる。

（ト）発明の効果この発明によれば、定常状態を保持する区間を判断し、
この区間についての吸光度変化率から被検初濃度が演算
されるので、高精度でレート分析が行える。またこのこ
とから超高単位検体を低単位検体と見誤る虞れがなくな
り、レート分析法の信頼性を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＪｏ、Ｊ、決定の方法を説明するグラフ図、第
２図はＪ、決定の方法を説明するグラフ図、第３図はこ
の発明の詳細な説明する各種のり応タイムコースを示す
グラフ図、第４図は第３図の説明に対応するフローチャ
ート図である。第１図第２図測友ａ＋＃Ｉ刊第４図

Claims

【特許請求の範囲】１、自動分析装置により所定時間範囲内における検体反
応液の所定時間毎の吸光度を測定するレート分析法にお
いて、測定の始点および終点を１波長測定で、その間を
２波長測定で各々測定し、得られる吸光度値のデータ列
から検体反応液中の被検物濃度を演算する方法からなり
、（ａ）上記始点でのデータを、１波長測定に基づいて予
め設定されたレート測定限界吸光度（Ｊ＿０）と比較し
、（ｂ）上記比較によりレート測定限界内であると判定さ
れたものについて、さらに前記終点でのデータが、予め
設定されたレート測定限界吸光度（Ｊ＿１）もしくは試
薬ブランク液の吸光度に基づいて修正された実効限界吸
光度（Ｊ＿１′）で規制されるレート測定可能範囲内で
あるときは、２波長測定全域（ｔ＿Ｍ〜ｔ＿Ｎ）のデー
タ列すべてから吸光度変化率を演算し、（ｃ）上記終点のデータがレート測定限界を越えるとき
は、２波長測定の開始点（ｔ＿Ｍ）から少なくとも３点
の吸光度変化を、２波長測定に基づいて予め設定された
実質許容吸光度変化（Ｊ＿２）と比較し、（ｄ）上記比
較により許容以内であると判定されたものについては、
下記条件：（△Ａ／ｔｎ−ｔ＿Ｍ）≧（Ｊ＿２／ｔ＿Ｍ〜ｔ＿Ｎ）
ただし、△Ａ：２波長測定開始点（ｔ＿Ｍ）から上記Ｊ
＿２を越えない最大吸光度変化ｔｎ：上記△Ａを与える２波長測定点を満足する場合は△Ａ／ｔｎ−ｔ＿Ｍに基づいて被検物
濃度を演算し、満足しない場合はレート分析不可と判断
することを特徴とする自動レート分析法。