JPS63258591A - 配糖体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は配糖体の製造法に関し、更に詳しくは、糖の結
合様式がβ結合である配糖体を製造する方法に関する。

フェノール性化合物又はその誘導体を配糖化することに
より生じた配糖体は安定化する、親水性が増加する、生
理活性が変化する（解毒など）等の種々の点で元のアグ
リコンと異なった性質を獲得することになる。即ち、配
糖化は、有用物質への変換を図る上で、物質の化学修飾
の１方法である。又、リグニンを構成するフェノール性
化合物又はその誘導体を配糖化することにより、親水性
の増加によるリグニンの可溶化、リグニン分解物の毒性
軽減、リグニンの縮合阻害等の性質が付与され、紙・パ
ルプ工業分野においては、パルプの褪色防止効果が期待
される。

〔従来の技術〕

糖加水分解酵素は、加水分解反応とともに糖転移作用を
有することは古くから知られている。例えば、マルトー
スやセロビオース等の少＃Ｎ類に微生物あるいは植物の
生産する酵素を作用させると、糖転移反応によりオリゴ
糖が生成する（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ。

６５、　ｐ、１〜１２．１９５７、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ
、７３＋　ｐ、２９２〜２９５＋１９５９）。これらは
、糖の受容体が糖である例である。これとは異なり、糖
の受容体がフェノール性化合物又はその誘導体のような
糖を持っていないアグリコンのβ結合型の糖転移作用も
知られている（生化学４３．　　ｐ、２０５〜２１６．
１９５６　、Ｂｕｌｌ、　ｓｏｃ。

ｃｈｉｍ、　ｂｉｏｌ、３８．　ｐ、３６５〜３７５．
１９５６）が、糖供与体としては、ニトロフェニルグリ
コシド等のフェノールのグリコシドを用いたものである
。

一方、糖転移酵素を用いた例としては、クチナシ培養細
胞から部分精製した糖転移酵素によって、サリチルアル
コールをサリシンに配糖化した例（Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅ
ｄ、　ｐ、１０４〜１０８．１９８５）があるが、糖供
与体としては、ＵＤＰグルコースを用いたものである。

尚、化学合成による配糖体の製法もあるが、反応が複雑
で時間もかかるという欠点がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

微生物や植物体あるいはその酵素を用いて種々の糖転移
反応が知られているものの、糖の受容体がフェノール性
化合物又はその誘導体のような糖を持っていないアグリ
コンへのβ結合型の糖転移作用において、糖供与体が糖
のみからなる例は知られていない。

本発明は１、糖供与体としてβ結合を有するホロセルロ
ース、キシラン、セロビオースおよびグルコース等のセ
ルロース系糖質を用い、木材腐朽菌あるいはβ−グルコ
シダーゼにより上記アグリコンへのβ結合型の糖転移作
用を行うことを目的としている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、フェノール系化合物又はその誘導体を配
糖化する方法について鋭意研究した結果、糖供与体とし
てβ結合を有するホロセルロース、キシラン、セロビオ
ースおよびグルコース等のセルロース系糖質を用い、菌
体又は菌体の培養物又はその処理物又はβ−グルコシダ
ーゼによりフェノール性化合物又はその誘導体の配糖体
が生成することを見い出し本発明に至った。

以下本発明について詳述する。

イ）　菌体又は菌体の培養物又はその処理物による配糖
体の生成 本発明で使用される微生物としては、β−グルコシダー
ゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ等のβ
結合を有する糖質を分解する酵素を持つ微生物であれば
特に限定されないが、木材腐朽菌を用いることが望まし
い。木材腐朽菌としては、具体的には褐色腐朽菌である
チロミセス属に属する微生物〔例えばオオウズラタケ（
Ｔｙｒｏｍｙ−ｃｅｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ　ＩＦＯ３０
３３９，ＦＥＳ　０５０７）　）あるいは白色腐朽菌で
あるコリオラス属に属する微生物〔例えばカワラタケ（
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ　ｒＦ。

６４８２）　）などをあげることができる。また、菌体
の培養物又はその処理物としては、上記菌体の培養生成
物そのものならびに酵素反応に有利なようにこれを遠心
分離、濾過、洗浄、乾燥、摩砕、抽出などの適宜の処理
を施して得られる菌体摩砕物、精製酵素などをいう。こ
れらの微生物自体は公知のものであるが、これら微生物
の本発明における配糖化作用は本発明者らが初めて見い
出したものである。

セルビオース添加培地におけるこれらの微生物のフェノ
ール化合物又はその誘導体の配糖化作用は、実施例２で
示すように、β−グルコシダーゼ活性と一致することか
ら、セロビオースを糖供与体とする配糖化反応はβ−グ
ルコシダーゼであると推定できる。一方、ブナ材ホロセ
ルロースあるいはキシラン添加培地におけるフェノール
化合物又はその誘導体の配糖化作用は、実施例３で示す
ようにセルラーゼあるいはキシラナーゼであると推定で
きる。

フェノール化合物又はその誘導体の配糖体の生成は実施
例２で示すようにある時間で最大値をとった後、配糖体
は徐々に減少して行く傾向が観察される。このことは、
配糖化作用が糖加水分解酵素であることを裏付けること
の他に、配糖体を生産するためには、反応を配糖体の最
大値の時間で停止させ、生産物を回収する必要があるこ
とを示している。

本発明で用いる微生物はデンプン系糖質およびセルロー
ス系糖質のいずれでも生育可能であるが、本発明におけ
るβ結合型の配糖化を行うためには、β結合を存する糖
質、特にセルロース系糖質添加培地で培養することが望
ましい。又、両者のＦＷを任意に混合しても良い。

即ち、実施例１，２．３に示す様に、セロビオース、ホ
ロセルロース、キシランがこれらの微生物にとって良い
栄養源になり、かつβ−グルコシダーゼ、セルラーゼ、
キシラナーゼ等の糖加水分解酵素を誘導的に生産すると
共に、これらのβ結合を有する糖質が配糖化反応の良い
糖供与体となっていることが判る。

糖受容体であるフェノール性化合物又はその誘導体の添
加方法は、培養前に培地中に添加する方法、培養中に添
加する方法、培養後培養物に添加し、所定時間反応させ
る方法、培養後閑体を除去した培養濾液に添加し、所定
時間反応させる方法のいずれでも良い。又、培養物中か
ら配糖化に関与する前記該酵素を分離し、使用しても良
い。

口）β−グルコシダーゼによる配糖体の生成微生物を用
いた配糖化作用を研究する過程で、配糖化作用は、糖加
水分解酵素によるものであることが推定されたため、次
に市販のβ−グルコシダーゼ（シグマ社、アーモンド起
源）を用いて研究を行った結果、以下の配糖体生成条件
を確立するに至った。

β−グルコシダーゼ（シグマ社、アーモンド起源）によ
るフェノール性化合物又はその誘導体の配糖化作用を行
う際、糖供与体としては、β結合ヲ有スるセロビオース
、メチル−β−Ｄ−グルコシドおよびグルコースを用い
ることができるが、特にセロビオースを用いると高い配
糖体生成率を得ることができる。さらに、セロビオース
濃度が高い程、又、アグリコンであるフェノール性化合
物又はその誘導体の濃度が高い程、高い配糖体生成率が
得られる。

尚、酵素添加量の増加とともに配糖体の最大収率に達す
る時間が短くなる傾向はあるが、最大収率はほぼ一定で
あり、経済的には、酵素添加量を少な目にし、反応時間
を長くすることが得策と考えられる。酵素の作用温度は
１０〜７０℃、好ましくは５０〜６０℃である。ｐＨは
この種の酵素を利用する通常の条件を採用することがで
きるが、好ましくはｐＨ５〜６の範囲である。尚、本発
明は種々のフェノール性化合物又はその誘導体に適用可
能である。その例を第１表に示した。

（来夏以下余白） 第　　　１　　　表 種々のフェノール配糖体の生成率 フェノール性化合物　　　配糖体生成率（％）バニリル
アルコール（ＶＡ）　　　　３２．３ベラトリルアルコ
ール（ＶＢ）　　　　２５．６シリンギルアルコール（
ＳＡ）　　　４０．１ホモバニリルアルコール（ＩＩＶ
）　　２４．４アポシノール（ＡＰ）　　　　　　　　
６．８コニフェリルアルコール（ＣＡ）　　２８．６〔
実施例〕 以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

下記の実施例におけるフェノール配糖体の定量は、高速
液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ社２０８Ｄ１カ
ラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ　００ｓガスクロ工業製、溶媒
は０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ３）ニアセトニト
リル＝８５７１５、流速０．８　ａ／／ｎ＋ｉｎ）を実
施し、ピーク面積より求めた。

実施例１ １００−三角フラスコに第２表に示す組成の培地１０−
を入れ滅菌したものに、フェノール性化合物又はその誘
導体として、バニリルアルコール（ＶＡと略）あるいは
ベラトリルアルコール（ＶＥと略）５ｍＭを無菌的に溶
解し、オオウズラタケ（Ｔｙｒｏ−ｍｙｃｅｓ　ｐａｌ
ｕｓｔｒｉｓ　ＦＥＳ　０５０７（Ｘ、Ａｏｓｈｉｍａ
　；　Ｐ−１３ｂ）、ＩＦｏ　３０３３９）あるいはカ
ワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉ−ｃｏｌｏｒ
　ＩＰｏ　６４８２）を接種後２５℃で静置培養した。

（来夏以下余白） グルコース　　　　　２．０ｇ （セロビオース　　　　２．０　ｇ　）ＮＨａＨｚＰ０
４２．Ｏｇ ＫＨｚＰＯ４０，６ｇ ｌｈｌｌＰＯｎＯ，４ｇ ＭｇＳＯ４・７１ｈＯＯ，５ｇ ＣａＣｌｚ　　　　　　　　　Ｏ，１ｇミネラル溶液　
　　　１ｒｎｌ ビタミン溶液　　　　５ｒｎ！ 蒸溜水　　　　　１０００　ｄ ｐＨ４，５ 、くミネラル溶液〉 ＦｅＳＯ４’　ＩＨｚＯＯ，ｌ Ｍｎ５Ｏ＊　”　４−６８ｚ０　　　０．ｌＺｎ５Ｏｎ
　’　７１１ｚＯＯ，０５ ＣＯＣ１４・６１１ｚ０　　　　０．０ＩＣＩＪＳＯ４
・５Ｈ！０　　　　０．０１〈ビタミン溶液〉 塩酸チアミン　　　　　　　６０ 塩酸ピリドキシン　　　　　５ パントテン酸カルシウム　　５ ニコチン酸　　　　　　　　５ ｐ−アミノ安息香酸　　　　　５ 葉酸　　　　　２．５ リボフラビン　　　　　　　　２．５ ＤＬ−チオクト酸　　　　　　　２．５ビオチン　　　
　　　　　　　１ 所定期間培養後、菌体は濾別し培養濾液を得た。

培養濾液の一部を用い、残存糖の定量および各種酵素活
性の測定、さらにＨＰＬＣによりフェノール化合物の検
策を行った。

糖はグルコースとセロビオースの２種を用い、糖源添加
をコントロールとした。第１図にＶＡにオオウズラタケ
を作用させた際の培養初期（６日目）の培養濾液のＨＰ
ＬＣチャートを示した。セロオース培地では、媚態添加
やグルコース培地ではみられない高極性物！（第１図の
ビークＡ）の生成が認められた。第２図にＶＥにオオウ
ズラタケ、カワラタケを接種した際の５日目の培養濾液
のＨＰＬＣチャートを示した。ＶＡの場合と同様に、Ｖ
Ｂにおいても両画において高極性物質（第２図のピーク
Ｂ）の生成がセロビオース培地において顕著に認められ
た。

そこで、培養条件をスケールアップし、培養濾液からの
これらの成分の単離を試みた。

３０−の三角フラスコに培養液（セロビオース２％）１
０−をとり、オオウズラタケあるいはカワラタケを接種
し、７日間静置培養した。別にＩＰ三角フラスコに１０
０−の培養液（セロビオース２％）を調製し、ＶＡある
いはＶＥを１％溶解し、先の７日間培養した菌体を培養
液ともども無菌的に移し、２５℃で静置培養した。ＶＡ
にはオオウズラタケ、ＶＥにはオオウズラタケおよびカ
ワラタケを培養した。各条件とも５ケの１１三角フラス
コを用いた。１０日間培養後、５ケの培養液を合わせ、
菌体を濾別後各条件５００ｒｂｌの培養濾液を得た。

培養濾液は湯浴中で５分間煮沸後濾過し、濾液はクロロ
ホルム、さらにｎ−ＢｕＯＨで抽出した。ｎ−ＢｕＯＨ
抽出液は減圧留去し、少量のエタノールに溶解後、カラ
ムクロマト　（ワコーゲルＣ−２００，ＣＨＣｌ：１／
ＥｔＯＨ＝　３／１）および分取ＴＬＣにより精製し、
配糖体を単離した、得られた化合物は、元素分析、ＦＤ
ＭＳ、’Ｈ−ＮＭＲ，”Ｃ−ＮＭＲにより同定した。

単離したピークＡのＦＤＭＳでは３１６（Ｍ”）、１３
７のイオンピークがみられることからＶＡのグルコース
付加物（ＶＡ−Ｇｌｃと略す）と推定された。１３Ｃ−
ＮＭＲの結果から、グルコースのＣ−１とＶＡのアルコ
ール性ＯＨ間の結合が示唆されたことから、ＶＡ−Ｇｌ
ｃはＶＡのグルコース配糖体（バニリルーβ−Ｄ−グル
コシド）と同定された。ピークＢのＦＤＭＳでは３３６
（Ｍａ、１５１のイオンピークがみられることがらＶＥ
のグルコース付加物（Ｖ　Ｅ　−Ｇｌｃと略す）と推定
され、１３Ｃ−ＮＭＲの結果から、ＶＥのグルコース配
糖体（ベラトリル−β−Ｄ−グルコシド）と同定された
。

実施例２ 実施例１で培養した各培養濾液中のＶＡ−Ｇｌｃ、ＶＢ
−Ｇｌｃ生成量をＨＰＬＣにより定量した。第３図にオ
オウズラタケによるグルコースあるいはセロビオース培
地におけるＶ　Ａ　−Ｇ　ｌｃ、　Ｖ　Ｅ　−Ｇｌｃ生
成量の経時変化を示した。いずれもセロビオース培地で
配糖体の生成が顕著に認められた。■Ａ−Ｇｌｃの場合
、すでに培養２日目で生成し、８日目まで急速に増加す
るが、さらに培養を続けると急速に減少した。最大生成
量は０．４３ｍＭに達し、ＶＡ添加量の８．６％に相当
した。一方、ＶＥ−Ｇｌｃの場合もほぼ同様の傾向を示
し、培養９日目で最大生成量の０．３４ｍＭとなり、Ｖ
Ｂ添加量の６．８％に相当した。第４図にカワラタケに
よるＶＥ−Ｇｌｃ生成量の経時変化を示した。培養７日
目で最大生成量０．２２ｍＭに達し、添加したＶＥの４
．４％に相当した。

培養濾液のβ−グルコシダーゼ活性を測定したところ、
予想されたようにセロビオース添加培地において顕著な
活性が認められ、培養６日目に最大の活性を示した。

実施例３ 実施例１で示した培養において、グルコース又はセロビ
オースのかわりにキシランあるいはブナ材から調製した
ホロセルロースを各々２％培地中に添加し、同様の配糖
化実験を行った。以下いずれも培養６日後に培養濾液の
分析を行った。尚、いずれの場合も添加したフェノール
性化合物又はその誘導体の約４０％が配糖化されていた
。ホロセルロース添加培地にオオウズラタケを接種した
培養濾液中には、ＶＡ−ＧｌｃあるいはＶＥ−Ｇｌｃが
それぞれ少量検出された他、配糖体の大半はＶＡ−Ｇｌ
ｃあるいはＶＥ−Ｇｌｃより極性の強い別のフェノール
性化合物およびその誘導体の配糖体として検出された。

同様にキシラン添加培地にオオウズラタケを接種した培
養濾液中には、ＶＡ−ＧｌｃあるいはＶＥ−Ｇｌｃと極
性の異なるフェノール性配糖体が検出された。ホロセル
ロース添加培地にカワラタケを接種した培養濾液中には
ＶＥ−Ｇｌｃが少量検出された他、配糖体の大半はＶＥ
−Ｇｌｃより極性の強い別のフェノール性化合物の誘導
体の配糖体として検出された。キシラン添加培地にカワ
ラタケを接種した培養濾液中にはＶＥ−Ｇｌｃと極性の
異なるフェノール性化合物の誘導体の配糖体が検出され
た。

実施例４ 市販のβ−グルコシダーゼ（シグマ社、アーモンド起源
）を用いてフェノール性化合物およびその誘導体の配糖
化を試みた。

■　糖の種類の影響 ＶＥを酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．３）に溶解（５ｍＭ）後
、種々の１１　（、グルコース、セロビオース、メチル
−α−Ｄ−グルコシド、メチル−β−Ｄ−グルコシド、
いずれも１０％添加）の存在下３０℃でβ−グルコシダ
ーゼを作用させ、その生成物について検討した。糖とし
てセロビオースを溶解した酵素反応液をＨＰＬＣにより
分析したところ、ＶＢ−Ｇｌｃと同一の保持時間にピー
クが認められた。実施例■と同様の方法で単離を試み、
ＶＥ−Ｇｌｃであることを確認した。第５図に種々の糖
存在下でのＶＥ　　Ｇｌｃのβ−グルコシダーゼによる
合成の結果を示した。セロビオースおよびメチル−β−
Ｄ−グルコシドにおいて反応開始後急速な生成がみられ
、約２時間で最大となった。ゲルコールにおいてもセロ
ビオースの約１７５の生成が見られた。２時間以降さら
に反応を続けると、一旦生成した■Ｅ−Ｇｌｃは加水分
解を受け、徐々に減少し２４時間後には、はぼグルコー
スと同様の生成量となった。

またメチル−α−Ｄ−グルコシドでは全＜　ＶＥ−Ｇｌ
ｃの生成は認められなかった。

■　セロビオース濃度の影響 ＶＢの酢酸緩衝溶液（５ｍＭ）にセロビオース添加量を
変化させ酵素反応を行った結果を第６図に示した。セロ
ビオースの濃度の増加とともに配糖体の収率はほぼ直線
的に増加し、反応液に対し４０％の添加量では１６％に
達した。

■　フェノール性化合物およびその誘導体の濃度の影響 ＶＥの濃度を変化させた際の配糖体の収率の変化を第７
図に示した。大きな収率の変化は認められなかったが、
高濃度はど収率は増加する傾向がみられた。

■　β−グルコシダーゼ添加量の影響 β−グルコシダーゼ添加量を変化させた際の配糖体収率
の変化を第８図に示した。酵素添加量の増加とともに最
大収率に達する時間が短くなる傾向はみられるが、最大
収率はほぼ一定であった。

■　反応温度の影響 ＶＥ−Ｇｌｃの酵素合成における反応温度の影響を第９
図に示した。６０℃までは温度の上昇とともに顕著な収
率の増加が認められるが、それ以上になると酵素の変性
、失活がみられ、配糖体の収率は大きく減少した。

■　フェノール性化合物およびその誘導体の種類の影響 以上ＶＥ−Ｇｌｃの酵素合成における種々の反応条件に
ついて検討し、今回検討した範囲内で配糖体収率が最も
高い条件を次のように設定した。フェノール性化合物お
よびその誘導体の濃度：　５０ｒ＊ＦＩ、セロビオース
：５０％、β−グルコシダーゼ：２．５単位酢酸緩衝液
、反応温度：６０℃、反応時間：２時間、これらの条件
下で、種々のフェノール性化合物（ＶＡ、ＶＥ、ＨＶ、
ＡＰ、ＳＡ、ＣＡ、）（７）配糖体の合成を試みた。生
成した配糖体は、ＶＡ、ＶＥと同様の方法で単離を試み
た。各フェノール配糖体の生成率の結果を第１表に示し
た。尚、各フェノール配糖体は全てβ−グルコシド結合
であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＶＡのオオウズラタケ処理における培養濾液の
ＨＰＬＣ分析（２８０ｎｍ）のチャートを示す図、第２
図はＶＥのオオウズラタケ及びカワラタケ処理における
培養濾液のＨＰＬＣ分析（２Ｂ０　ｎｎ＋）のチャート
を示す図、第３図はオオウズラタケによるグルコース或
いはセロビオース培地におけるＶＡ−Ｇｌｃ、ＶＥ−Ｇ
ｌｃ生成量の経時変化を示す図、第４図はカワラタケに
よるグルコース或いはセロビオース培地におけるＶＥ−
Ｇｌｃ生成量の経時変化を示す図、第５図はＶＥ−Ｇｌ
ｃ生成量に及ぼす糖の種類の影響を示す図、第６図はＶ
Ｅ−Ｇｌｃ生成量に及ぼすセロビオース濃度の影響を示
す図、第７図はＶＥ−Ｇｌｃ生成量に及ぼＶＥ濃度の影
響を示す図、第８図はＶＥ−Ｇｌｃ生成量に及ぼβ−グ
ルコシダーゼ添加量の影響を示す図、及び第９図はＶＥ
−Ｇｌｃ生成量に反応温度の影響を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フェノール性化合物又はその誘導体及びβ結合を有
   する糖供与体からなる被処理物を菌体又は菌体の培養物
   又はその処理物或いはβ−グルコシダーゼで処理するこ
   とにより配糖体を生成せしめることを特徴とする配糖体
   の製造方法。 ２、フェノール性化合物又はその誘導体がバニリルアル
   コールである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、フェノール性化合物又はその誘導体がベラトリルア
   ルコールである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、フェノール性化合物又はその誘導体がシリンギルア
   ルコール、ホモバニリルアルコール、アポシノールおよ
   びコニフェリルアルコールから選ばれた少なくとも１種
   からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、β結合を有する糖供与体がグルコース、セロビオー
   スおよびメチル−β−Ｄ−グリコシドから選ばれた少な
   くとも１種からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、β結合を有する糖供与体がホロセルロース又はキシ
   ランのいずれかである特許請求の範囲第１項記載の方法
   。