JPS63203697A - 新規ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■ 本発明は新規ＤＮＡに間する。更に詳細には、悪性化骨
髄細胞が生体外分化誘導物質の刺激により単球細胞に分
化する過程で産生されるｍＲＮＡに相補性あるＤＮＡ　
（以下、ｒｃＤＮＡＪと略記ずろ）と、その一部に該当
するサイモシンβ４ＤＮＡとに間する。前者のＤＮＡの
発現により産生されるポリペプチドは、ＩＩ瘍細胞等の
悪性化骨髄細胞を単球細胞に分化誘導する作用を有する
と考えられるので、腫瘍治療剤として１２立つ可能性が
ある、一方、サイモシンβ４は、免疫能を回層させると
報告されている口線ホルモンであるサイモシンの一種で
ある（「現代化学Ｊ１９８５年１２月号３４〜３日頁）
。

ＩＬ立止盃 悪性化骨髄細胞の細胞分化を誘導する因子としては、従
来より、活性型ビタミンＤ３、ジメチルスルホキサイド
、１２−０−テトラデカノイルフォルボール−１３−ア
セテート（以下、ｒＴＰＡＪと略記する）等の非蛋白性
低分子物質が知られている。しかし、悪性化骨髄細胞を
生体外誘導物質の刺激により単球！ｌ１１２！に分化す
る過程で同細胞により産生される物質の詳細は未だ、正
確には判明していない。

また、サイモシンをコードするＤＮＡについても未だ何
の報告もなされていない。

Ｈイ　　　　　　　　　　　−一 本発明により、次の塩基配列をコードする新規なりＮＡ
が提供される。

ＴＣＧ　　ＧＴＧ　　ＧＴＧ　　ＧＣＣＡＣＴＧＣＧ　
　ＣＡＧ　　ＡＣＣＡＧＡ　　ＣＴＴＣＧＣＴＣＧ　　
ＴＡＣＴＣＧ　　ＴＧＣＧＣＣＴＣＧ　　ＣＴＴ　　Ｃ
ＧＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＣＴ　　ＡＣＣＡＴＧ ＴＣＴ　　ＧＡＣＡＡＡ　　ＣＣＣＧＡＴＡＴＧ　　Ｇ
ＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＴＣＧＡＧＡＡＡ　　ＴＴＣＧＡ
Ｔ　　ＡＡＧ　　ＴＣＧＡＡＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡＧ　
　ＡＡＧ　　ＡＣＡＧＡＧ　　ＡＣＣＣＡＡ　　ＧＡＧ
　　ＡＡＡＡＡＴ　　ＣＣＡ　　ＣＴＧ　　ＣＣＴ　　
ＴＣＣＡ　、へ　Ａ　　　ＧＡＡ　　　ＡＣＧ　　　Ａ
ＴＴ　　　ＧＡＡＣＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＡ
Ａ　　ＧＣＡＧＧＣＧＡＡ　　ＴＣＧ。

この塩基配列は次のアミノ酸配列に対応する。

Ｓ　ｅ　ｒ−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ−Ａ　ｌ　ａ−Ｔｈ　
ｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−５ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−５ｅ　ｒ−５ｅ　ｒ−Ａ　Ｉ
　ａ−Ｔ　ｈ　ｒ−Ｍｅ　ｔ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｍｅ　　ｔ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ｇ　
　Ｉ　　ｕ−Ｉ　　ｌ　　ｅ−Ｇ　　ｌ　　ｕ−Ｌｙｓ
−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌ、　ｙ　　ｓ−
Ｌ　　ｅ　　ｕ−Ｌ　ｙ　　ｓ−Ｌ　　ｙ　　ｓ−Ｔ　
　ｈ　　ｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ
−Ａ　　ｓ　　ｎ−Ｐ　　ｒ　　ｏ−Ｌ　　ｅ　　ＩＩ
−Ｐ　　ｒ　　ｏ−５ｅ　　ｔ−Ｌｙｓ−Ｇ　　Ｉ　　
ｕ−Ｔｈ　　ｒ−１１ｅ−Ｇ　　ｌ　　ｕ−Ｇ　　Ｉ　
　ｎ−Ｇ　　Ｉ　　ｕ−Ｌ　ｙ　　ｓ−Ｇ　　ｌ　　ｎ
−Ａ　　Ｉ　　ａ−Ｇ　　Ｉ　　ｙ−Ｇ　　ｌ　　ｕ−
３ｅ　　ｒｅまた、上記の塩基配列のうちで、翻訳開始
コドンとしてのＡＴＧ（Ｍｅｔ）に続く次の塩基配列は
、既に知られているサイモシンβ４のアミノ酸配列に対
応する。

ＡＴＧ　　ＴＣＴ　　ＧＡＣＡＡＡ　　ＣＣＣＧＡＴ　
　ＡＴＧ　　ＧＣＴ　　ＧＡＧ　ＡＴＣＧＡＧ　　ＡＡ
Ａ　　ＴＴＣＧＡＴ　　ＡＡＧＴＣＧ　　ＡＡＡ　　Ｃ
ＴＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧＡＣＡ　　ＧＡＧ　　ＡＣＣ
ＣＡＡ　　ＧＡＧＡＡＡ　ＡＡＴ　　ＣＣＡ　　ＣＴＧ
　　ＣＣＴＴＣＣＡＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＣＧ　　ＡＴ
ＴＧＡＡ　　ＣＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＡＡＧ
ＣＡ　　ＧＧＣＧＡＡ　　ＴＣＧ 」Ｌ肌」Ｌ檀」ｉ 本発明の新規なりＮＡは、悪性化骨髄細胞を生体外分化
誘導物質で刺激して単球細胞に分化する過程て産生され
るｍＲＮＡと相補的である。

悪性化骨髄細胞としては、白血病細胞、及び、成熟した
又は未成熟の骨髄細胞を人為的に悪性化したもの等が該
当する。白血病細胞は、白血病にかかっている動物の血
液等から通常の方法で得ることができる０例えば、ヒト
前骨髄性白血病＋ａ抱［ＨＬ−６０（ＡＴＣＣＣＣＬ２
４０）：ネイチａｐ　（Ｎａｔｕｒｅ）　、ユニ立、３
４７頁、１９７７年）］、ヒト慢性骨髄性白血病纏細胞
Ｋ６６２ニブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　、土工、３２１頁
、１９７５年；Ｕ−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）
：インド、　ジエイ、　キャンサー（Ｉｎｔ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　、上１，５６５頁、１９７６年
］、ヒト急性骨髄性白血病細胞［ＫＧｌ：サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、ユ立立、１１５３頁、１９７８年
；ＭＬ−１，キャンサー　レス　、　　（（ａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、）　＊土ユ、５１５２頁、１９８３年：　Ｃ
ＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）：キャンサー
（Ｃａｎｃｅｒ）　−−Ｌ」−１５５２〜５２９頁、１
９６５年：　ＨＰＢ−ＭＬＴ　：イントウ、　ジエイ、
　キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　、　
１上、　１６６頁・１９７８年：　ＨＰＢ−ＡＬＬ　：
インド、　ジエイ６キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａ
ｎｃｅｒ）　、−エ」−１１６６頁、１９７７年：　Ｔ
ＡＬＬ　：ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）　＋ｍ、　８４３
頁、１９７７年；　ＲＰＭ　ｒ　−８４０２ニジエイ、
ナツル、キャンサー　インス）　　、　　　　（Ｊ、　
　　Ｎａｔｌ、　　　Ｃａｎｃｅｒ　　　Ｉｎ５ｔ、）
　　　、　−「Ｌ−」５−１　１１　　頁　、１９７５
年］等がある。

成熟した又は未成熟の骨髄細胞を人為的に急性化させる
方法も通常の方法でよい［オーストジェイ、イクスビ、
パイオル、メドウ、サイ。

（Ａｕｓｔ、　Ｊ、ＥＸｌｌ、　Ｒｉｏｔ、　Ｍｅｄ、
　Ｓｃｉ、）　、エエ、２８７頁、１９６６年）０例え
ば、骨髄細胞をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン等の変異原物質に曝す、Ｘ線、紫外線、γ
線等を照射する、或いは、レトロウィルス等で形質転換
する等の方法がある。

生体外分化誘導物質も既に知られており、悪性化骨髄細
胞と接触するとそれをマクロファージ、顆粒球の単球細
胞に分化誘導する作用を持つ非蛋白性物質である。ヘミ
ン、アクチノマイシンＤ、ヘキサメチレンアクラシノマ
イシンＡ、テレオシジン、マイトマイシンＣ１ブレオマ
イシン、プロピオン酸、酢酸ナトリウム、カダベリン、
ツニカマイシン等が該当する。

分化誘導された細胞からｍＲＮＡを得る方法も既に知ら
れている通常の方法でよい［ジエイ。

バイオケム、　　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　、立
上、１９０１頁、１９７７年）、すなわち、生体外分化
誘導物質で分化誘導した悪性化骨髄細胞と、同物質で刺
激していない悪性化骨髄細胞とを得、それぞれからｍＲ
ＮＡ［刺激膿胞から得たｍ　ＲＮ　ＡをＩｎｄ（＋）Ｒ
ＮＡ、未刺激ｗｓ＠から得たｍ　ＲＮ　Ａを１ｎｄ　（
−）ＲＮＡとする］を得る。それぞれのｍＲＮＡから、
逆転写酵素等を使って単鎖ｃＤＮＡ　［Ｉｎｄ　（＋）
ＲＮＡから得たｃ　Ｄ　Ｎ、ＡをＩｎｄ　（＋）ＤＮＡ
％Ｉｎｄ　（−）ＲＮＡから得たｃＤＮＡをＩｎｄ　（
−）ＤＮＡとする］、所望により二本鎖ｃＤＮＡを得た
後、 Ｉｎｄ　（＋）ＲＮＡとＩｎｄ　（−）ＤＮＡとを、又
、Ｉｎｄ　（＋）ＲＮＡとｒｎｄ　（＋）ＤＮＡとをそ
れぞれ接触させて、Ｉｎｄ　（−）ＲＮＡとはハイブリ
ダイズせず、Ｔｎｄ　（＋）ＲＮＡのみとハイブリダイ
ズするｃＤＮＡ画分をＩｎｄ（＋）ＤＮＡから分別する
。このｃＤＮＡ画分を、必要により二本鎖ｃＤＮＡとす
る。得られたｃＤＮＡ画分には、前記したアミノ酸配列
をコードするｃＤＮＡが含まれている。或いは、Ｉｎｄ
（＋）ＤＮＡ及び、所望により更にＩｎｄ（−）ＤＮＡ
をそれぞれ、例えば、大腸菌内で増殖し得るベクターに
常法で挿入後、大腸菌ｍｍ内でそれぞれのＤＮＡを増殖
させる。

Ｉｎｄ　（＋）ＤＮＡを有する大腸菌のうちで、Ｉｎｄ
　（−）ＤＮＡとはハイブリダイズせず、Ｉ　ｎ　ｄ　
（＋）　ＤＮＡとのみハイブリダイズする株を選別する
。得られた株は前記アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
を有する。或いは、Ｉｎｄ（＋）ＲＮＡを適宜分画し、
蛋白に翻訳させ、各分画について、ＲＮＡの産物の活性
の有無を調べろことによりｍＲＮＡを一旦濃縮し、１縮
されたｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを調製しても、前記ア
ミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを得ろことができる。

このｃＤＮＡＩｔｔ！！！つてプラスミドｐＨＨＬＴ−
３を調製し、Ｐｓｔｌで処理する。得られた約５３０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を回収し、ついて、制限＠ＭＨｉ　ｎ　
ｆ　Ｉ　’ｔ’ｇ＆理して、約２２０ｂｐのＰｓｔｌ／
Ｈｉｎｆｌ断片と約３ｔｏｂｐのＨｉｎｆＩ／Ｐｓｔｌ
断片とを回収する。前者のＰｓｔｌ／Ｈｉｎｆｌ断片を
制限酵素Ｍｎｆｆ１ｌ（米国ニューイングランドバイラ
ボス社製）で切断して約１３０ｂｐのＭｎｆｆ１ｌ／Ｈ
ｉｎｆＩ断片を導、これをさきほどのＨｉｎｆｌ／Ｐｓ
ｔｌ断片と連結すると、サイモシンβ４の塩基配列を・
コードするＭｎｔｌ／Ｐｓｔｌ断片が得られろ。

悪性化骨髄細胞を培養して、目的のｍＲＮＡを産生せし
めるには通常の培地を用い、通常の方法で培養すればよ
い、用いられる培地としては、ローズウェル・パーク・
メモリアルφインスティテユー　ト　ｌ　６４０　培地
　（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ　　Ｐａｒｋ　　Ｍｅｍｏｒｉａ
ｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　１６４０　　：　　以下ｒＲＰ
ＭＩ−１６４０Ｊと略記する）が好適であるが、他にダ
ルベツコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ　Ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｗ）　、イーグ
ル基礎培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｎ＋Ｅｓ５
ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｕｉｓ＋）　、クリック培地（Ｃ
ｌｉｃｋ　Ｍｅｄ−ｉｕｍ　）など既知の細胞増殖培地
でもよい、これらの培地には、胎児ウシ血清（以下ｒＦ
Ｂｓ」と略記する。）や新生児ウシ血清、ウマ血清を添
加して用いるのが望ましい。

悪性化骨髄細胞の培養は通常、１〜５Ｘ１０６個／　ｍ
　ｅの細胞密度で３５〜３８℃にて４〜６％炭酸ガス気
流中で行なう、悪性化骨髄細胞を上記培地で増殖させ全
細胞数を、望ましくは、１×１０’個にした後、ＴＰＡ
等の生体外分化誘導物質と３０分、１時間、４時間、１
２２時間及び２４時間接触させて、分化誘導を開始させ
る。このような！Ｉ胞をｍ　ＲＮ　Ａ抽出用細胞とする
。

得られたＤＮＡを用いて所望のポリペプチドを得るには
、このＤＮＡ＠適当なベクターＤＮＡに発現されろよう
組み込み、得られた組換えＤ’ＮＡを用いて、動物細胞
、酵母、枯草菌、大Ｉｌｌ菌等の微生物等の宿主を形質
転換し、発現を誘導する。

本発明のＤＮＡを、ベクターＤＮＡに発現可能なように
絹み込むには、よく知られているように、プロモーター
配列（通常オペレータ配列の下流に存在している）とそ
の下流にシャイン・ダルガルノ配列（以下、ｒＳＤ配列
」と略記する）を有するベクターＤＮＡのＳＤ配列の下
流に本発明のＤＮＡを組み込むか、ベクターＤＮＡに本
発明のＤＮＡを組み込んだ後に、その上流にブロモーダ
配列（通常オペレータ配列も）及びＳＤ配列を挿入すれ
ばよい、紐換えＤＮＡ技術により外来遺伝子の遺伝情報
を微生物細胞内で発現せしめろ方法は、「遺伝子組換え
実用化技術（４）Ｊ　（１９８３年）（サイエンスフォ
ーラムン土）、「モレキュラー　クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊ　（１９８２年）［
ゴールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ）Ｊ、「絹換え
遺伝子の細胞への導入と発現Ｊ　（１９８３年）（共立
出版株式会社）、等に一般的に記載されている。

大腸菌を宿主として用いた場合の例を実施例に示す。

又、酵母を宿主として用いろ時は、以下のようにするこ
とができる。

アルコール脱水素酵素（ＡＤＨＩ）のプロモーターを挿
入したプラスミドベクターｐＭＡ５６［ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅＬＬＬＪＬ、３４７〜３５０頁（１９８２年
）］は、プロモーター下流にＥｃｏＲ１部位を有してい
るため、本発明のＤＮＡを、ｐＭＡ５６のＡＤＨＩプロ
モーター下流のＥｃｏＲ１部位にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ
Ｉリンカ−１Ｐｓｔｌ／ＥｃｏＲＩリンカ−を用いて挿
入すればＡＤＨＩプロモーターの支配になり、酵母で発
現可能となる。

又、抑制酸性フォスファターゼ（ＰＨ０５）ブモーター
を有するｐＡＭ８２［ブロシーデイングオン　ナショナ
ル　アカデミ−サイエンスオン　ニーニスニー（Ｐｒｏ
ｃｉ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ　、　Ｓ　、　Ａ　、　）ｕ　、　　１〜５頁（１９
８３年）］は、ＰＨ０５プロモーター下流にＸｈｏ　ｆ
部位を有するため、本発明のＤＮＡをｐＡＭ８２のｐＨ
０５プロモーター下流のＸｈｏ　１部位にＢ　ａ　ｍ　
ＨＩ　／　Ｘ　ｈ　ｏ　１リンカ−１Ｐｓ　ｔ　Ｔ／Ｘ
ｈｏ　Ｉリンカ−を用いて挿入すればＰＨ０５プロモー
ターの支配になり酵母で発現可能となる。

又、枯草菌を宿主として用いても、以下のようにして本
発明のＤＮＡの遺伝情報を発現させることかでざる。

バルチス　サブチリス　マーバース（［１Ｂ（ｉｌｌｕ
ｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｓ）株の有するα−
アミラーゼププローター有するｐＴＵＢ２ａ５　Ｃジー
ン（Ｇｅｎｅ）、１土、１４Ｂ頁（１９８５年）は、プ
ロモーター及びシグナルペプチドの下流にＨｉｎｃ［１
部位を有しているため、例えば、本発明のＤＮＡをｐＴ
Ｕ８２８５のＨ４ｎｃ１１部にシグナルペプチドのアミ
ノ酸フレームと合うようなＨ４ｎｃＴＩ／ＢａｍＨＩリ
ンカ−１Ｈｊｎｃ　Ｔ　Ｉ／Ｐｓ　ｔ　Ｉリンカ−を用
いて挿入してやればα−アミラーゼプロモーター支配を
うけ枯草菌でも発現可能となる。

形質転損された宿主細胞が生産したポリペプチドは、以
下のようにして分離、精製できる。

宿主ｍ胞を遠心分離などによって集め、超音波あるいは
リゾチームなどの処理方法を用いて細胞を破砕する。こ
のとき低張液を用いるが、ＳＤＳなどの界面活性剤や塩
酸グアニジンなどの蛋白変性剤を共存させたほうがよい
結果が得られる場合もある。細胞破砕液は遠心分離にけ
し上清液をえる。

このようにして得られる目的のポリペプチドを含む破砕
上清液を通常の蛋白質の精製法に準じて精製する。即ち
、塩基性陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラ
フィー、塩析法、透析法、ゲル濾過法、疎水クロマトグ
ラフィー、高速分子篩りａマドグラフィー、電気泳動法
等を順次又は適宜絹み合わせることによって精製される
。

陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう前に、前処理
として限外濾過膜て低分子物Ｎを除去することが望まし
く精製効果を上げることが出来る。

陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶液は透析
後、濃縮してゲル濾過に付す、ゲル濾適用坦体としては
セファデックスＧ−７５、Ｇ−１００（ファルマシア社
製）、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−２
００（ファルマシア社製）、バイオゲル（ＢｉｏＨｅｌ
）　Ｐ　−１００（バイオラッド辻１１）及びトーヨー
パールＨＷ−５０、ＨＷ　−５５（東洋曹達工業社製）
等が使用される。ゲル濾過に使用する緩Ｆ＃Ｉ液はｐＨ
６，０〜９．０のトリス−ＨＣｔまたはリン酸緩衝液で
あり、吸着を防ぐ目的で０．２〜０．５ＭのＮａＣｆｆ
１等の塩類を添加して使用することが望ましい。

又、陰イオン交換クロマトグラフィーで得られたポリペ
プチド活性溶液は疎水クロマトグラフィーで精製するこ
ともてきる。この場合にはブチルート−ヨーパール６５
０（東洋曹達工業社製）等を坦体とし、硫安、ＮａＣ１
等の塩類を用いて目的のポリペプチドを溶出せしめる。

ゲル濾過あるいは疎水クロマトグラフィーで精製したポ
リペプチド含有液は、次いでモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ　　Ｈ
Ｒ５１５カラム（ファルマシア社１１）、高性能陰イオ
ン交換体カラム）を使用するファルマシアＦ　Ｐ　Ｌ　
Ｃ（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ。

Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システムによる高性能陰イ
オン交換体クロマトグラフィーに付し、精！！標品な得
る。

この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィーの条件は
陰イオン交換クロマトグラフィーの場合と同じである。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例 （り悪性化骨髄細胞であるヒト前骨髄性白血病細胞（Ｈ
Ｌ−８０）をＩ　Ｘ　１０’個／　ｍ　ｔの！Ｉ＠濃度
で１０％牛脂児血清を有するＲＰＭ　Ｉ　−１６４０培
地２０００ｍｆｆ１　（複数）に懸濁し、ファルコン社
製回転培養瓶に入れ、細胞数がＩ　Ｘ　１０９個以上に
なるまで３７℃で培養をつづけた。ついで、遠心操作に
より細胞［１ｎｄ（−）Ｓ胞と称する］を集めた。別途
、ＨＬ−６０を上記と同様な方法により細胞数がＩ　Ｘ
　１０Ｑ個以上になるまで培養し、ついで培地にＴＰＡ
を最終濃度！５μｇ　／　ｍ　ｔになるように添加して
、更に４Ｂ！間培養を行なった。得られた細胞をＩｎｄ
（＋）細胞と称する。

（２）このようにして得られたＩｎｄ（＋）細胞及びＩ
ｎｄ（−）細胞（各々約Ｉ　Ｘ　１０９ｍ胞）をそれぞ
れＰＢＳ溶液２００ｍｆｆ１に懸濁し、細胞を遠心によ
って２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるＳＤ
Ｓ　（０，２５％）、ジエチルビロカーボネー）　（０
，５％）、ポリビニル硫酸（２０ｕ　ｇ　／　ｍ　ｔ　
）を含むＲＮＡ抽出用Ｊ　ＩＩ　ｉｈ　ｊａ［５０ｍＭ
のトリス−ＨＣｆｆｌ　（ｐＨ８，３）、１０ｍＭのＭ
　ｇ　Ｓ　Ｏａ、１００　ｍＭのＮａＣ１゜２０ｍＭの
ＥＤＴＡ、３５ｕｇ／ｍｌのスペルミジン１５０ｍ！に
懸濁した。ついで懸ｉ１ｉ夜にＮＰ−４０を０．５％に
なるように添加し、テブロンホモジナイザーを用い、１
０ストロークにて細胞を破壊した。その後、１０，００
０Ｘｇて１分間の遠心を行ない、上清を得た。上清に３
０ｍＮのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，５）　、２０ｍＭ
のＥＤＴＡ及び０．２５％のＳＤＳで飽和したフェノー
ル／クロロホルム（１：　１）を上清と等ｆｌ添加し、
１０分間激しく攪拌した後、３，０００Ｘｇで１０分間
の遠心分離を行ない上清を得た。この操作を３回行ない
、最後に、上清にクロロホルム、イソアミルアルコール
７毘合液（２４：１）を加えて遠心を１デない上清を得
た。

この上清に２５倍容のエタノールを加えてＲＮＡを沈澱
させた。沈澱物を分離し、滅菌水１５ｍＬを添加して、
ＲＮＡｌ３液を得た。ＲＮＡ溶液によりｍ　ＲＮ　Ａ画
分を分離するために、ポリ（Ｕ）セファロースを用いて
、カラムクロマトグラフィーを行った。吸着は５０ｍＭ
）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）（０，１ＭのＮａＣ１，
０，１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．５％のＳＤＳを含む）
溶ｉαにＲＮＡを溶解して行ない、溶出はホルムアミド
で行なった。溶出されたｍ　ＲＮ　Ａ画分は、それぞれ
１　ｏｏａｇ位であった。Ｉｎｄ（＋）＠胞により得ら
れたｍＲＮＡをＩｎｄ　（＋）ＲＮＡ。

Ｉｎｄ（−）細胞より得られたｍ　ＲＮ　ＡをＩｎｄ（
−）ＲＮＡと称する。

（３）各Ｓ’μｇのＩｎｄ　（＋）ＲＮＡ、Ｉｎｄ（−
）ＲＮＡより、それぞれ以下のようにしてｃＤＮＡｔｔ
ｌｌ製した。

５０ｍＭ）リスーＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７，５）、３０ｍ
ＭのＮａＣｌ！＋６ｍＭのＭｇＣｌ２゜５ｍＭのジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ　（ｄＣＴＰは３ａｐラベ
ルしたものを含む）、０．７５μｇのオリゴ（ｄＴ）＋
。、２μｇのｍＲＮＡ及び１５単位のＡＮＶ逆転写酵素
［ジエイ、ダブリュ、ビアド（Ｊ、　Ｗ、Ｂｅａｒｄ）
社ｍｌ］を混ぜ、４２℃に９０分間保った０反応液から
ｍ　ＲＮＡを除くために、反応液にＮａＯＨ溶液を加え
て、０．３Ｎ　　ＮａＯＨとし、室温に１５時間置き、
次いで溶液を中和して、セファデックスＧ−５０カラム
に通した、これにより約ＩＪｊｇの単鎖ｃＤＮＡを得た
。得られた単鎖ｃ　ＤＮＡのうちＩｎｄ（−）ＲＮＡよ
り得たものをＩｎｄ（−）ＤＮＡとする。　　Ｅ　ｎ　
ｄ　（＋）　ＲＮＡより得たものは、ＤＮＡポリメラー
ゼ１等を用いて二本鎖ｃＤＮＡとし、これをＩｎｄ　（
＋）ＤＮＡとした。

そして、末端転移酵素で約２０個のｄＣ鎖を付加したＩ
　ｎ　ｄ　（＋）　ＤＮＡと、ＰｓｔＩ処理した後、約
２０１１１のｄＧ鎖を付加したｐＢＲ３２２とをアニー
リングさせた後、通常の方法で大ＩＩ菌へ導入した。得
られた形質転換株５．０００個をニトロセルロース上で
生育させた後、Ｉｎｄ（＋）ＤＮＡ、［ｎｄ　（−）Ｄ
ＮＡをプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション
を行なった。

Ｉｎｄ　（）ＤＮＡにはハイブリダイズせず゛、Ｉｎｄ
　（＋）ＤＮＡにのみハイブリダイズするコロニーを分
離し、１７７個のコロニーを得た。更に、これら１７７
個のコロニーからプラスミドＤＮ、へをアルカリ−５Ｄ
Ｓ法で分離した後、Ｉｎｄ（＋）ＤＮＡ、Ｉｎｄ　（−
）ＤＮＡを用いてサザンハイプリダイゼーションを行い
、Ｉｎｄ（＋）ＤＮＡのみにハイブリダイズするプラス
ミドを選択した。このプラスミド（ｐ）ＩＨＬＴ−１と
称する）は前記アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを有
する。このプラスミドを有する大ＩＩＩ菌ＬＥ３９２は
、微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ−Ｐ７６３４として
寄託されている−　ｐＨＨＬＴ−１が前記アミノ酸をコ
ードするｃＤＮＡを有することは、次のようにして再確
認した。

ＨＬ−６０を（１）に示す方法で培養した。細胞数がＩ
　Ｘ　１０’になったとき、ＴＰＡを１５１１ｇ／　ｍ
　Ｌになるように添加し、培養を更につづけ、ＴＰＡ添
加後、１時間［１−１ｎｄ（＋）細胞］、１２時間［１
２−１ｎｄ　（＋）細胞］、２４時間［２４−１ｎ　ｄ
　（＋）細胞］にそれぞれ細胞を集めた。１−１ｎｄ　
（＋）ＩＩ胞、１２−１ｎｄ　（＋）細胞、２４−１ｎ
ｄ　（＋）細胞より（２）に示す方法によりｍＲＮＡを
分離した６分離されたｍＲＮＡ　［１−１ｎ、ｄ　（＋
）ＲＮＡ、１２−１ｎｄ　（＋）ＲＮＡ、２４−１　ｎ
ｄ　（＋）ＲＮＡＩとｐＨＨＬＴ−ＩＤＮＡとをハイブ
リダイズさせた。　ｐｔｉＨＬＴ−ＩＤＮＡと１−１ｎ
ｄ　（＋）ＲＮＡとは全然ハイブリダイズせず、１２−
１　ｎｄ　（＋）　ＲＮＡ、２４−１ｎｄ　（＋）ＲＮ
Ａとは同程度にハイブリダイズした。

（４）ｐＨＨＬＴ−１をＰｓｔｌを用いて切断し、５％
アクリルアミドゲル電気泳動により約１８０ｂｐの大き
さに相当するＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ切断を３２
ｐにてラベルした後、（１）、　（２）及び（３）の記
載の方法で得たＩｎｄ　（＋）ＤＮＡライブラリーとハ
イブリダイズさせ、約５５０ｂｐのＤＮＡ断片（ｐＨＨ
Ｔ−２）を得た。

このＤＮＡ切断は、（１）及び（２）の方法で得た４−
Ｉ　ｎ　ｄ　（＋）ｍＲＮＡ中の、４．３ｋｂ及び７０
０ｂｐのｍＲＮＡのみにハイブリダイズした。

ｐＨＨＬＴ−１をＰｓｔｒを用いて切断し、上記と同様
にしてｐＨＨＬＴ−３を得た。このプラスミドはＦＥＲ
Ｍ−Ｐ４Ｏ１０として微生物工業技術研究所に寄託され
ている。

Ｍａｙａｍ−Ｇｉ　Ｉｂｅｒ　を法で決定した、ｐＨＨ
ＬＴ−３のＰｓｔ１部位へ挿入されたＤＮＡの塩基配列
のうち、ｐｏｌｙｄＧ及びｄＣの配列を除いた部分の配
列を、添付図面に示す、この部分配列のうちの更に一部
である、次の塩基配列をコードするＤＮＡの発現により
産生されるポリペプチドは、ｌ！瘍！Ｉ胞等の悪性化骨
髄細胞を単球細胞に分化誘導する作用を有すると考えら
れる。

ＴＣＧ　　ＧＴＧ　　ＧＴＧ　　ＧＣＣＡＣＴＧＣＧ　
　ＣＡＧ　　ＡＣＣＡＧＡ　　ＣＴＴＣＧＣＴＣＧ　　
ＴＡＣＴＣＧ　　ＴＧＣＧＣＣＴＣＧ　　ＣＴＴ　　Ｃ
ＧＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＣＴ　　ＡＣＣＡＴＧ ＴＣＴ　　ＧＡＣＡＡＡ　　ＣＣＣＧＡＴＡＴＧ　　Ｇ
ＣＴ　、ＧＡＧ　　ＡＴＣＧＡＧＡＡＡ　　ＴＴＣＧＡ
Ｔ　　ＡＡＧ　　ＴＣＧＡＡＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡＧ　
　ＡＡＧ　　ＡＣＡＧＡＧ　　ＡＣＣＣＡＡ　　ＧＡＧ
　　ＡＡＡＡＡＴ　　ＣＣＡ　　ＣＴＧ　　ＣＣＴ　　
ＴＣＣＡＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＣＧ　　ＡＴＴ　　ＧＡ
ＡＣＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＡＡ　　ＧＣＡＧ
ＧＣＧＡＡ　　ＴＣＧ。

（５）ついで、このｐＨＨＬＴ−３をＰｓｔｌで処理し
、約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ついで、制限
酵！ｆｅＨｉｎｆｌで処理して、約２２０ｂｐのＰｓｔ
ｌ／Ｈｉｎｆｌ断片と約３１０ｂｐのＨｉｎｆｌ／Ｐｓ
ｔｌ断片とを回収した。前者のＰｓ　ｔ　Ｉ／Ｈｉｎｆ
　Ｉ断片を制限酵素Ｍｎｆｆ１ｌで切断して約１３０ｂ
ｐのＭｎｌ！Ｉ／ＨｉｎｆＩ断片を得、これをさきほと
のＨｉｎｆｌ／Ｐｓｔ■断片と連結して、サイモシンβ
４の塩基配列をコードするＭｎｆｆ１ｌ／Ｐｓｔｌ断片
をえた。

ＢａｍＨＩリンカ−で処理し、ついで制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断して、４４０ｂｐのＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌ断片
を得た。

この断片を、プラスミドベクターｐＵｃ５４０（）７ツ
マシフ社より市販されているプラスミドベクターｐＵｃ
ｅのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１部位に、同じく同社より市
販されているｔａｃプロモーターを有するプラスミドｐ
ＤＲ５４０のＥｃｏｌ／ＢａｍＨＴ断片をクローニング
したものである）のＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌ断片（３，１
ｋｂ）に挿入してｐＵｃ５４０ＴＨβ、（３，５ｋｂ）
を得た。プラスミドｐＵｃ５４０ＴＨβ４はＳＤ配列の
下に制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ部位を有している。従っ
て、このＢａｍＨ１部位に外来遺伝子を挿入すると、イ
ソプロピルβ−ローチオガラクトピラノシド（以下ＩＰ
ＴＧと記す）の添加によってのみ、その外来遺伝子の発
現が可能となる。

そこで上述のプラスミドを有する大腸菌Ｊ　Ｍ２Ｏ３を
アンピリジン５０μｇ／ｍｌを含む１×ＹＴ培地くバク
トドリブトン　０．８％、バクトイ−ストエクストラク
ト　０．５％、　ＮａＣｆｆ１０．５％）で３７℃で前
培養した後、アンピリジン５０　ｕ　ｇ／ｍ　Ｌを含む
Ｉ　ＸＹＴ培地１００　ｍ　ｌを含む５００ｍ！坂ロフ
ラスコに１％植菌し、同様に３７℃で培養し、０Ｄ６６
゜＝０．３に達した時にＩＰＴＧをＩｋ終濃度２ｍＭに
なるように添加し、更に培養を続けた。このようにして
得られた大腸菌を遠心分離機によって集め、Ｉ　ＸＰＢ
Ｓ（ＮａＣ２０，８％、ＫＣｉ　　Ｏ，０２”。

ＫＨａ　Ｐｏ−０，０２％、Ｎａ２　ＨＰＯ４０゜１１
５％）でｆｃ淳後、再び１０ｍＬの１×ＰＢＳに懸濁し
、超音波で大ＩＩ菌を破砕した。その一部を用いて、サ
イモシンβ、の分子量約５０００　（ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動による）に該当する分子量をも
つ蛋白質の存在を確認した。

１１立豆１ 本発明により、悪性化骨髄細胞が生体外分化誘導物質の
刺激により単球！Ｉ＠に分化する過程で産生されるｍＲ
ＮＡに相補性ある新規なり　Ｎ　Ａと、その一部に該当
する新規なサイモシンβ、ＤＮＡとが提供される。前者
のＤＮＡの発現により産生きれるポリペプチドは、腫瘍
細胞等の悪性化骨髄細胞を単球細胞に分化誘導する作用
を有すると考えられるので、腫瘍治療剤として役立つ可
能性がある。一方、後者のＤＮＡは、免疫能を目張させ
ると報告されている胸腺ホルモンであるサイモシンの一
種であるサイモシンβ４を発現するＤＮＡである。

【図面の簡単な説明】

図面は、ｐＨＨＬＴ−３のＰｓｔ１部位へ挿入されたＤ
ＮＡの塩基配列のうち、ｐｏｌｙｄＧ及びｄＣの配列を
除いた部分の配列を示す。 ＴＣＧ　　　ＧＴＧ　　　ＧＴＧ　　　ＧＣＣＡＣＴＣ
ＧＣＴＣＧ　　　ＴＡＣＴＣＧ　　　ＴＧＣＴＣＣＴＣ
ＣＧＣＴ　　　ＡＣＣＡＴＧＡＴＧ　　　ＧＣＴ　　　
ＧＡＧ　　　ＡＴＣＧＡＧＡＡＡ　　　ＣＴＧ　　　Ａ
ＡＧ　　　ＡＡＧ　　　ＡＣＡＡＡＴ　　　ＣＣＡ　　
　ＣＴＧ　　　ＣＣＴ　　　ＴＣＣＣＡＧ　　　ＧＡＧ
　　　ＡＡＧ　　　ＣＡＡ　　　ＧＣＡＧＧＣＧＴＧ　
　　ＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＡ　　　ＣＡＡ　　　ＧＣ
Ａ　　　ＴＴＧ　　　ＣＣＴＴＴＴ　　　ＴＡＧ　　　
ＣＴＧ　　　ＴＴＴ　　　ＡＡＣＧＡＧ　　　ＧＴＴ　
　　ＧＧＡ　　　ＴＣＡ　　　ＡＧＴＧＣＣＣＣＴ　　
　ＴＴＣＡＣＡ　　　ＴＣＡＣＧＡ　　　ＡＧＧ　　　
ＣＣＧ　　　ＣＧＣＣＴＧＴＡＴ’ＣＴＡ　　　ＴＣＴ
　　　ＧＧＣＴＧＧＣＴＴ　　　ＧＣＡ　　　ＴＧＴ　
　　ＴＧＧ　　　ＴＧＡＧＧＡ　　　ＡＧＡ　　　ＡＧ
Ｔ　　　ＧＧＧ　　　ＧＴＧＣＴＡ　　　ＧＡＧ　　　
ＴＡＡ　　　ＡＡＣＣＡＡＣＣＴ　　　ＧＣＡ　　　Ｇ
ＧＣＴＧＴ　　　ＡＡＴＴＧＣＣＡＴ　　　ＴＴＴ　　
　ＴＴＴ　　　ＴＴＴＡＡＴ　　　ＴＡＴ　　　ＴＧＧ
　　　ＡＡＴ　　　ＧＣＡＧＣＡ　　　ＡＡＴ　　　Ａ
ＡＡ　　　ＡＡＧ　　　ＴＴＴＧＣＧ　　　ＣＡＧ　　
　ＡＣＣＡＧＡ　　　ＣＴＴＧＣＣＴＣＧ　　　ＣＴＴ
　　　ＣＧＣＴＴＴＴＣＴ　　　ＧＡＣＡＡＡ　　　Ｃ
ＣＣＧＡＴＡＡＡ　　　ＴＴＣＧＡＴ　　　ＡＡＧ　　
　ＴＣＧＧＡＧ　　　ＡＣＣＣＡＡ　　　ＧＡＧ　　　
ＡＡＡＡＡＡ　　　ＧＡＡ　　　ＡＣＧ　　　ＡＴＴ　
　　ＧＡＡＧＧＣＧＡＡ　　　ＴＣＧ　　　ＴＡＡ　　
　ＴＧＡＴＡＴ　　　ＧＣＡ　　　ＣＴＧ　　　ＴＡＣ
ＡＴＴＴＴＣＴＴＡ　　　ＴＴＴ　　　ＴＡＣＴＴＣＴ
ＴＴ　　　ＧＴＡ　　　ＡＧＡ　　　ＴＧＣＡＡＡＴＴ
Ａ　　　ＡＡＴ　　　ＧＡＣＴＧＴ　　　ＧＣＴＡＡＧ
　　　ＡＡＣＴＡＣＴＧＡ　　　ＣＡＡＣＣＴ　　　Ｔ
ＴＣＣＣＡ　　　ＴＣＴ　　　ＧＴＣＣＡＧ　　　ＧＧ
　　Ａ　　ＡＧＧ　　　ＡＡＡ　　　ＧＡＡＡＧＧ　　
　ＡＡＧ　　　ＡＡＧ　　　ＴＧＧ　　　ＧＧＴＧＧＡ
　　　ＣＧＡ　　　ＣＡＧ　　　ＴＧＡ　　　ＡＡＴＧ
ＣＴ　　　ＧＧＣＣＣＡ　　　ＡＧＧ　　　ＴＧＴＧＣ
Ａ　　　ＧＴＴ　　　ＴＡＡ　　　ＴＣＡ　　　ＧＡＧ
ＴＧＴ　　　ＴＣＡ　　　ＡＡＴ　　　ＧＡＴ　　　Ｔ
ＴＴＣＡＡ　　　ＴＴＴ　　　ＴＴＴ　　　ＴＡＡ　　
　ＴＡＴＡＡＡＡ、ＡＣ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の塩基配列をコードするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】
2. （２）次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】