JPS63177038A - 螢光分析機器の検定に用いる粒子標準品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 粒子または細胞分析に使用される市販の機器は多数ある
０粒子、特に生物学的粒子または細胞の特性は分析中ま
たは粒子が流水中を移動したり懸濁液中を運ばれる間粒
子が比較的安定したままである技法で決定され得る。フ
ローサイトメーター（流動細胞針ｇ１機）は知られてお
り、動いている粒子の特性を分析したり検出するのに役
立つ、典型的なフローサイトメトリー機器では、細胞や
他の生物学的粒子は液体流水中を流され、各粒子を、好
適なのは一時に、受容部位を通過させ、粒子の物理的ま
たは化学的特性を測定する０種々の信号は電気的、音響
的および放射性を含む粒子の種々の特性に関連して検出
され得るが、フローサイトメーターは通常機器を通過す
る粒子の分析には光学的信号による。多くの場合、分析
機器を静的または動的な状態のいずれかで粒子の分析に
使用するとしても、機器の使用を準備するのに予備的な
セットアツプ工程を通常必要とする。細胞または池の生
物学的粒子が極めて小さくてその粒子に関して検出され
る信号がしばしば低い場合、分析を行なう前に、試験結
果の信頼性を確実にするために機器の適当な検定を行な
うのが望ましい。 （従来技術） 生物学的粒子または細胞分析に有用な機器を検定するた
めの現行の技法は測定者の技術に強く依存する。換言す
ると、検定手順中に対照を調整し、適当な１Ｊ値を決定
し、実施される特定の試験毎に何種もの標準を保持する
ために検定者の判断および経験が必要である。実際に経
験を積んだ測定者は、使用前に機器を非常にうまく検定
できるとはいえ、適当な検定を達成したと感するにはこ
のような測定者は多くの感および熟考を強いられる。 例えば、フローサイトメーターのような機器の種々の光
学的要素を配列する場合、検定する人間は典型的には画
面またはＣＲＴを見て、種々の対照の調整とともに視覚
による判断によって機器が検定されたことを判断する。 もちろん典型的な視覚による検定技法を実行するときに
は、試験結果の再現性に妥協があり得る。 フローサイトメーターおよび他の生物学的粒子分析機器
は通常実際の分析を受けようとする粒子や細胞の型に似
た粒子で検定する。従って検定粒子は大きさ、容積、表
面特性、粒状性、色調の特ｆｆ１（細胞着色剤、染料、
免疫蛍光標識など）のような調べる粒子に似た特性を持
つように選択されるべきである。フローサイトメトリー
機器の過去および現行の検定手順は検定段階にニワトリ
赤血球細胞の利用を含む、ニワトリ赤血球細胞は検定手
順のいくつかの点では信頼できるけれど、やはりいくつ
かの光関連特性におけるスベ７トル不足のため完全に満
足という訳ではない。検定目的のための生物学的試料に
加えて、微細球状ビーズが細胞分析機器の検定に役立っ
ている。例えば米国特許第４，３３１，８６２号には粒
子計測機器の検定にラテックス物質からできたビーズの
使用が記述されている。フローサイトメトリー機器の検
定に特に使用される検定用ビーズは、フローサイトメト
リースタンダーヅコーボレイション（Ｆ　ｌｏｗ　Ｃｙ
ｔｏｍｅＬｒｙＳ　Ｌａｎｄａｒｄｓ　Ｃｏｒ１〕ｏｒ
ａｔｉｏｎ）、リサーチトライアングルパー２（Ｒｅｓ
ｅｉｉｒｃｌ＋　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ）、ノー
スカロライナから購入できる。 （発明が解決しようとする問題点） たとえ検定用ビーズの有効性が粒子分析機器の検定技法
を改善したとしても、また１ｌ１２Ｓが適当に検定され
たか否かを決めるのに測定者の悪がかなり必要である。 従って再現性ある試験結果を提供するだけでなく、現在
利用されている検定技法に伴なう熟考および怒による推
量を除去する検定手順を確立する必要および要請が未だ
にある９本発明が目指すのはこのような改善の実現に対
するものである。 （問題点を解決するための手段） 本発明の方法は、分析下の粒子から少なくとも１種類の
光関連信号を得るための機器を用いるためにこのような
機器を検定する方法であり、分析したい粒子に関連した
１個以上の既知特性を持つ検定粒子に入射光ビームをあ
てることからなる。 検定粒子からの光信号およびノイズ信号の両方を検出す
る。好ましくは、検定混合物中の蛍光粒子のような一方
の型の粒子から光信号を検出し、検定混り物中の非蛍光
粒子のようなもう一方の型の粒子からノイズ信号を検出
する。検出された光信号とノイズ信号との比率を測定し
、この比率を記録する。その測定比率を機器の性能限界
の閾値を表わす先に決定された比率く以下、先決比率と
よぶ）と比較する。もし先決比率に到達しない場合、検
定粒子を入射光ビーム中に入れたまま機器操作を調整し
て、測定比率を先決比率に到達または超過させ、それに
よって機器は検定され、その後分析する粒子から光信号
を得るように検定されることを本方法は含む。 本発明のこの点の好適な実施層様では、フローサイトメ
トリー機器の検定にその方法を用い、それは試験すべき
粒子に関連した既知特性を持つ検定粒子を液体流水中で
流して、各検定粒子を実質的に一時に１個づつ入射光ビ
ームを通過させることを含む、検定粒子に関連する光信
号およびノイズ信号の両方を検出し、信号とノイズとの
比率を決定する。この比率は光信号とノイズ信号との間
の測定分離値として記録する。測定分離値を機器の限界
性能のための閾値を表わす先決の分離値と比較する。も
し先決の分離値に到達しない場合、機器の操作を調整し
て、測定分離値を先決分離値に到達させて、それによっ
て機器は検定され、ひきつづき分析する粒子からの光信
号を得る。 本発明のもう一つの観点は、粒子の２色蛍光分析を実行
するための機器の検定に使用するための試薬キットであ
る。そのキットは第１波長で蛍光を発光できる検定粒子
を持つ第１容器からなる。 第２容器は第２波長で蛍光を発光できる検定粒子を含有
する。第３容器は実質的に蛍光を発光できない検定粒子
を持っている。このキットまたは試薬はフローサイトメ
トリー機器を検定するための上述の方法に使用するのに
適している。 本発明の更にもう一つの観点は蛍光分析機器を検定する
ための粒子標準品に関するもので、該標準品は特定の蛍
光団と反応するまでは、自動蛍光を含めていかなる蛍光
も発光しない四酸化オスミウム固定ニワトリ赤血球から
なる。 本発明の原理によると、検定方法および物質は現行の既
知の使用されている検定技法へのかなりの改善法を提供
する０本発明は、検定標準品および／または先に決定さ
れて測定者が保有している闇値を使って粒子分析機器を
測定者が検定することを可能にする。好ましくは、機器
の限界性能を明示するための閾値は、検定標的がわかる
ように検定手順中測定者に表示される。ｒＸＪ値が達成
されるまで機器を調整およびチューニングすることによ
って、測定者は機器が実施される試験に正しく機能する
ことを確実にする。検定の感および視覚に依存する技法
は、本発明の検定手順によって不要とされ、検定誤差は
軽減または除去され、試験の再現性は高められる。本発
明の検定手順は、適正な検定が機器の光学系統の適正な
配列を確実にし、補正技法の実施によってスペクトルの
混会を補償し、そして特に粒子の免疫蛍光分析のための
機器の性能を最適にするために、機器の感度について測
定者に情報を提供するので、フローサイトメトリー機器
に特に適している０本発明の利点や特色はフルーサイト
メトリー以外にも及び、自動顕微鏡、蛍光顕微鏡、定量
顕微鏡、画像分析機などのような他の分析機器にも利用
できることを指摘すべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）から第１図（ｄ）はそれぞれ容積、側面散
乱、蛍光色１および蛍光色２の４種類のパラメーターの
チャンネルに対する事例数（カウント）を例示するヒス
トグラムのグラフ表示である；第１図にはさらに容積が
ノイズ事例や平均チャンネル統計に関連した結果であっ
て、側面散乱、蛍光色１および蛍光色２の平均チャンネ
ル目盛りには信号、ノイズ、分離および最小値をも例示
する。 第２図（ａ）は２色蛍光分析（ＰＬ２対ＦＬ１）の点分
布グラフ表示であり、第２図（ｂ）は蛍光分析に対する
側面散乱の点分布グラフ表示である；第２図は機器配列
目的へのチャンネル平均をも表示する。 第３図（ａ）は２色蛍光分析（Ｐ　Ｌ　２対ＦＬＩ）の
点分布グラフ表示であり、第３図（ｂ）は容積分析に対
する側面散乱の点分布グラフ表示である：第３図は更に
機器の光電子増倍管による蛍光色１（ＦＬｌ）、蛍光色
２（ｒ’Ｌ２）および側面散乱（ＳＳＣ）の分布のチャ
ンネル平均を表示する。 第４図（ａ）は未補正蛍光分析を例示する２色蛍光分析
（Ｆ　Ｌ　２対ＦＬＩ）の点分布グラフ表示である；第
４図（ａ）は蛍光色１で着色されていない分布と着色さ
れた分布との間の平均チャンネルの差異をも表示する；
第４図（ｂ）は補正された蛍光分析を例示する２色蛍光
分析（Ｐ　Ｌ　２対ＦＬＬ）の点分布グラフ表示である
；第４図（ｂ）は補正をした後、未着色分布と蛍光色２
分布（ＦＬ２）との間の平均チャンネル差異をも表示す
る。 本発明は多種類の形態における実施態様によって満足さ
れるが、本明細書には発明の好適な実施態様を図面を引
用して詳細に記述する。本明細書中の例は発明の原理の
典型と考えるべきであり、例示された実施態様に発明を
限定するつもりでないことは言うまでもない０発明の範
囲は特許請求の範囲およびそれらの均等範囲によって判
断される。 図面を直接参照する前に、以下に図面と共に記述される
検定技法は、フローサイトメトリー機器に関連している
ものである。特に記述されている典型的な検定手順は、
ベクトンデイッキンソンイムノサイトメトリーシステム
社（ＢｅｃｋｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｙｔｏｍｅＬｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウンテンビ
ュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ）、カリホルニアに
よって市販されているＦＡＣ３ＴＭ　分析器に関連して
いる。第１図のヒストグラムおよび第２〜４図の点分布
表示は検定操作中にＦＡＣ３分析器のスクリーンに見ら
れる典型的な表示である０本発明の原理に従って検定操
作を実施するための適当なソフトウェアは種々の検定操
作や機能を容易にするためにフローサイトメトリー機器
に供給され得る。 簡単に言えば、検定されるべきフローサイトメトリー機
器は、分析される粒子の液体流水を提供するためのノズ
ルまたは類似装置を含む。典型的には、粒子の液体流水
は鞘液で覆うことによって、流体力学的に収束させて、
粒子流液の流れに正しい角度で通常照射される入射光ビ
ームを通って流すことができるようにする。これらの粒
子が光ビームを通過する時、各粒子に伴なう光特性を検
出し得る。それ故、蛍光を測定するための光検出器１個
以上および１以上の方向における光散乱の吸収を測定す
るための光検出器などが含まれ得る。 これらの光検出器は光信号を電気信号に変換する光電子
増倍管（ＰＭＴ）を含む０粒子に伴なう光の検出に加え
て、粒子が穴（オリフィス）を通過するときに、電気的
インピーダンス測定が行なわれ得る。このインピーダン
ス測定は、粒子容積に関連し、よく知られたコールタ−
（Ｃｏｕｌｔｅｒ）の原理に基づいている。ＦＡＣ３分
析機では、以下に記述されるようにして検定されるが、
蛍光と光散乱（この場きは入射光ビームに対して粒子か
ら大体９０゜への散乱を測定する側面散乱）の２ＦＩ！
類の色を検出するためのＰＭＴが備えられている。ＦＡ
Ｃ３分析機は更に、粒子容積に伴なう電気的インピーダ
ンスの測定をも可能にする。従って粒子の４種類のパラ
メーターまたは特性を検出または測定できるが、それら
の全てのパラメーターは、試料中の粒子のこれらの特性
の測定においてこの機器を用いる前に検定しなければな
らない。 本発明の検定技法は、機器性能下限の閾値に基づいて検
定されることをその機器の測定者に知らせる。この最小
閾値から、粒子分析、特に免疫蛍・光測定を行なうため
の機器の感度がわかる０例えば側面散乱および容積に加
えて、記述されている特定のフローサイ１−メトり一機
器は２種類の色の蛍光、すなわち全体で４種類のパラメ
ーターの検出ができる。説明の都り上典型的な用途を例
にして述べれば、分析される粒子の第１の蛍光色は、Ｆ
ＩＴＣ着色細胞で代表されるフルオレセインでｆ５識さ
れた粒子に関連した緑色スペクトル領域であり；分析さ
れる粒子の第２の蛍光色は、ＰＥ着色細胞で代表される
フィコエリスリン標識粒子に関連した赤色スペクトル傾
城であろう。もちろん、望むならば、行なう試験および
分析される粒子または細胞によって池の蛍光団や標識剤
を用いることもできる。 測定者が、例えばその日の始めに、処方された試験用の
準６１のために機器のスイッチを入れる時、機器の光学
要素は配列されていないかも知れない。 もし実施される試験が白血球試料のような免疫系の粒子
を検査するためのデータ獲得に関連する場合、測定者は
機器がこれらの試験を行なうのに適当な感度に検定され
ているかどうかの確認を望むであろう０機器の感度性能
およびそれによって供給される結果を第１図に示す、第
１図の詳細を記述するにあたり、この感度試験は単に機
器が白血球や他の免疫系細胞や粒子のようなある型の粒
子を分析するのに適切に検定できるかどうかを決めるた
めの確認試験であることは言うまでもない。 もし感度試験の結果が機器の最小性能のための閾値が満
足されたときは、機器は適切に検定されたことを意味し
、その後機器を粒子分析に用いるのに機器を更に調整し
たり、配列したり、チューニングする必要はない、しか
し信頼性のある測定のためには、通常さらにいくらかの
調整をして機器を検定する必要があるので、第１図の表
示に関して感度を決定する前に、測定者は以下の第２−
４図に関して説明される！！Ｊ整および検定工程を保証
することを希望するかも知れない、以下の説明において
、感度の決定およびそれを達成する方法をまず第１図の
表示をもとに記述する。 本手順を始めるには、測定者は本発明の検定粒子を使用
する。各容器に好ましくは異なったプラスチック微細球
形またはビーズを有する３個の容器を含む試薬キットが
供給される。好適な形としては、これらの種々のビーズ
はゼラチン、０．１％ツイーン２０および防腐剤として
０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ
）に保持する。 約５ミクロンの直径のフルオレセインＩ［ｌｌ（Ｆ　Ｉ
ＴＣ）ビーズを第１容器に用意する。約５ミクロンの直
径のフィコエリスリン標識（ＰＥ）ビーズを第２容器に
用意する。約４．５ミクロンの直径の非標識ビーズを第
３容器に含める。その３個の容器の各々のビーズの濃度
は約１０６粒子／ｍｌである。 滅菌ＰＢ３３ｇ＋１にＦＩＴＣ，ＰＲおよび非標識ビー
ズの３１１類の試薬を１滴ずつ添加して１　：１　：１
の比率に混合して試料管を作製する。混合物の入ったこ
の試料管を次にＦＡＣ８分析機に入れて、実質的に一時
に１個の粒子を入射光ビームに通過させる既知の方法で
測定する。 容積、光散乱および２種類の蛍光決定因子に関する信号
の検出に加えて、各パラメーターへのノイズ信号もその
機器で検出される。第１図はヒストグラムの型式で与え
られる４つのパラメーターの機器画面への表示を表わす
、ヒストグラムのＹ軸は粒子カウント数であり、Ｘ軸は
データ獲得を行なう間の電気的チャンネル数である。記
述されている実施態様では、種々のヒストグラムのＸ軸
に沿って２５５チヤンネルが存在する。ヒストグラムは
対数目盛りの相関で記録または表示することにより、ノ
イズと信号との間のヒストグラムピークの分離を一定の
差異として視認できるが、実際には直線的比率として表
わされるのが好ましい。 より詳しくは、光関連信号は側面散乱、ＦＩＴＣおよび
ＰＥに関してそれぞれ第１図（ｂ）、（ｃ）および（ｄ
）に示されている。まず第１［Ｕ（ｂ）を見ると、側面
散乱信号は曲線１２で示され、ノイズは領域１４で示さ
れる。同様に第１図（ｃ）ではＦＩＴＣ信号は曲線１６
で示され、ノイズは領域！８で示される。 第１図（ｄ）ではＰＥ信号は曲線２０で示され、ノイズ
は領域２２内に示される。第１図（ａ）に示される容積
に関しては、容積信号は曲線２４で示され、ノイズ検出
はノイズ事例数としてヒストグラムの下に示される。 散乱および蛍光の光関連信号、すなわち第１図（ｂ）　
、　（ｃ）および（ｄ）に関して、実際の光信号とノイ
ズ信号との間に分離または差異があることがわかる。上
述のように、信号とノイズとの間の分離は対数目盛で計
算するのが好ましいが、信号のノイズへの比率はヒスト
グラムのＸ軸に直線的差異として表わされる。それ故、
ヒストグラムを見る時に、散乱、ＦＩＴＣおよびＰＥに
関して信号とノイズのピークの間の間隔や分離を容易に
認識できる。 蛍光分析についての第１図（ｃ）および（ｄ）のヒスト
グラムでは、実際に測定されているものは前述の試薬に
よって与えられるような非標識ビーズに比較した標識ビ
ーズの平均蛍光強度間の分離量である。それ故、第１図
（ｃ）では曲線１６はＦＩＴＣでｍ識されたビーズの平
均蛍光強度を表わし、曲線１８は検定目的に使用された
試薬混合物中の非標識ビーズの結果として生じるノイズ
強度を表わす。 同様に第１図（ｄ）では曲線２０はＰＥで標識されたビ
ーズの平均蛍光強度を表わし、曲線２２は検定のために
試薬混合物によって与えられる非標識ビーズからのノイ
ズの平均強度を表わす、このように、Ｆ　Ｉ　ＴＣ９％
識ビーズ、ＰＥｆｆ１ｌ識ビーズおよび非標識ビーズの
等しい割合の単一の試薬混合物を与えることによって、
２色蛍光分析ｌ＼の機器の検定は容易に達成され得る。 第１図（ｂ）で表わされるような側面散乱信号に関して
は、ノイズが実際に検出されて、ノイズと信号との間の
分離値を測定し得る。第１図（ｂ）の領域１４で表わさ
れるノイズは蛍光信号で生ずるような非標識細胞による
ものではないのでこれが必要であ゛る。この図では、側
面散乱（ＳＳＣ）ノイズは関連のない信号で誘発され、
ノイズのための対照信号を生ずる。従って、対照信号を
生じさせるたｙ）に、ＰＬ２信号が任意に選択されてい
る。フローサイトメｔ・り一機器でＰＬ２基準を調整し
て、機器を通る事例速度（または粒子の流速）を容積、
ＦＬＩおよびＰＬ２に関するデータを得るときの事例速
度の約２倍にすることによって、ノイズを側面散乱信号
に導入する。この手段によってノイズが側面散乱信号中
に生じて、ノイズと散乱信号との間に直線化された分離
量が決定され得る。 ヒストグラム型式で好ましく与えられるグラフ表示に加
えて、検定される機器の画面にはデジタル読み出しの型
式で結果を表示するようにプログラムすることもできる
。検定手順を含めて、機器の。 ためのソフトウェアは蓄留されたデータに関する情報を
供給するように容易にプログラムすることができる。そ
れ故第１図ではヒストグラム、の下に、ノイズ事例およ
び平均チャンネル信号が測定昔によって読めるように容
積結果がデジタル読み出し型式で記録されている。ＦＡ
Ｃ９分析機のような８１器の検定では、容積平均チャン
ネルは容積ヒストグラム、のほぼ真中の目盛のはずであ
る。真中の目盛を読むということは粒子が流れるオリフ
ィスが正しく選択され、機器の容積基準が適切に設定さ
れていることを示す、５００以下のノイズ事例レベルは
機器が適切に設定されていることを意味する。 第１図の画面には第１図（ｂ）　、　（ｃ）および（ｄ
）の各ヒストグラムに関連したデジタル読み取り値も表
示する。ＳＳＣ，ＦＬＩおよびＰＬ２の種々のパラメー
ターを信号、ノイズ、分離、最小およびロットＩＤの読
み取りと共に表示する。ロットＩＤおよび最小値は相互
に関連している。機器に検定用ビーズの混合物を入れる
前に、測定者は検定手順を規定するプログラムにロフト
ＩＤ番号を入力する。検定用ビーズは種々の蛍光光度、
強度などを含む変化しやすい性質を持つので、機器の検
定はこれらの変化しやすい性質を考慮に入れねばならな
い。従ってとのロットＩＤ番号の検定用ビーズを用いる
かに依存して、種々の分離値が最小機器性能のための最
小または閾値として予め確立されている。ソフトウェア
を前もってプログラムし得るので、ロットＩＤ番号を検
定手順の最初に測定者がプログラムに入れさえすれば先
決の最小分離値が確立されて第１図のディスプレーに表
示される。 第１図（ｂ）　、　（ｅ）および（ｄ）のそれぞれのヒ
ストグラムに関連した側面散乱、ＦＬＩおよびＰＬ２の
信号およびノイズに対する平均中央チャンネル値が第１
図の底部に表示されている。例えば、側面散乱信号は１
９２の平均チャンネル中央値を持つことが表示され、こ
れに対してノイズの平均チャンオ・ル中央値は１６であ
る。これらの信号およびノイズ結果の間の分離は１７６
と記録される。側面散乱信号のために先に決定された最
小分離値は１６０である。この最小側面散乱分離値は、
機器が側面散乱測定を確実に行なうために十分検定する
ための目標の水準である。それ故、実際に測定された分
離は１７６であるので最小を越えている。従ってその機
器は側面散乱を検出信号とするその後の粒子試験を検定
できるとみなされる。 信号、ノイズおよび分離の平均チャンネル中央値のデジ
タル表示はＦＬＩおよびＰＬ２信号についても提供され
る。第１図の例に示されるように、ＦＬＩおよびＰＬ２
の両方の分離値は最小分離値を越えているので、機器が
これら２種類の信号についても適切に検定されているこ
とを測定者は容易に判断できる。上述の検定手順のソフ
Ｆ・ウェアは、対数目盛で信号とノイズとの比率を検定
するが、画面上ではピークが相互に離れ、それ故解釈す
るのに便利なように間隔をあける直線性（常数）を基に
して比率を表示する。散乱や蛍光の光関連信号の多くま
たは全てが先に決められた最小以下の分離値と測定され
た場合には、適切な検定のなめに更に機器を：ＰＩｍし
なければならない。第２゜３および４図は機器性能を最
適にするように光学的要素を配列するためにこの検定調
整を実施し、ＰＭＴ２１ｉ１１１を行ない、粒子の２色
蛍光分析におけるスペクトルの混合や重複を補正する際
のＦＡＣ８ＡＣ８分析機表示を例示する。 光学的要素を１＆適な性能のために適切に配列されたこ
とを確実にするために機器を調整するには、上述の試薬
キットの第１容器からＦＩＴＣ標識ビーズを用いて検定
を実施することができる。滅菌ＰＢＳ　１麿ｌにＦＩＴ
Ｃビーズ試薬を１滴加えてＦＩＴＣ標識ビーズ懸濁液の
試験管を用意する０次にこの試験管をＦＡＣ３分析機に
装着して、検定用ソフトウェアと組合せると画面に第２
図に示されるような点分布図が表示される。第２図（ａ
）はＦＬ２対ＦＬＩを示し、第２図（ｂ）は側面散乱（
ＳＳＣ）対ＦＬＩを示す０点分布図の下にはＦＬＩ。 ＦＬ２およびＳＳＣの信号のチャンネル平均に関するデ
ジタル情報が表示されている。まず第２図（ａ）に関し
ては言及すれば、緑色（ＦＩＴＣ）ビーズの点分布が表
示の中央付近に位置すると、検定が達成される０点分布
がこの位置に移動するようにＩａ器の蛍光ＰＭＴ＠圧を
調整する０点分布図の下に表示されたＦＬＩおよびＦＬ
２信号平均に関して述べれば、測定者はこれらの信号を
最大にすることによって検定を確かなものにする。集光
レンズ制御のような機器の光学的要素をこれらの信号の
平均が最大になるように調整し、しかも、これらがほぼ
同時に最大になるようにすべきである。 最大付近になると、第２図（ａ）に表示される点分布は
測定音によってできるだけ隙間のないようにされる。第
２　［ｇ　（ｂ）および点分布図の下に示されるＳＳＣ
信号平均に関して述べれば、通常前もって決められた目
標値が検定のための目標である。 例えば、ＦＡＣ３分析機では、ＳＳＣ信号チャンネル平
均の目標は約１９０である。この目標値を達成するため
、ＳＳＣ信号平均が約１９０に到達するまで、測定者は
機器の側面散乱（ＳＳＣ）ＰＭＴ電圧をｒｆＡｕする。 光学的要素またはＰＭＴのその他の調整もＳＳＣ信号平
均を目標水準に到達させるのに必要でありうる０点分布
およびデジタル読み取り数の両者は、測定者が適当な光
学的配列に機器を検定する手助けをする。 光学的配列と同様にして、光電子増倍管（ＰＭＴ）も検
定手順中に調整されうる。第３図はＰＭＴ調整に関連し
た典型的な点分布図を示す、第３図（ａ）はＰＬ２対Ｆ
Ｌ１の点分布図であり、第３図（ｂ）は側面散乱（ＳＳ
Ｃ）対容積の点分布図である。ＰＭＴ調整を行なうべき
かどうかの決定には、測定者は上述とは異なる検定粒子
を用いて手順を行なう、このＰＭＴ調整の場合、測定者
は滅菌ＰＢＳＩＭ１に上述の試薬キットの非標識ビーズ
容器から１滴の非標識ビーズを添加して、非標識ビーズ
懸濁液を用意する０次にこの非標識ビーズの試験管をＦ
ＡＣＳ分析機に装着し、検定用ソフトウェアと組きせる
と、画面に第３図に示されるような点分布図が表示され
る０点分布図に加えて、第３図はＦＬＩ、ＰＬ２および
ＳＳＣの３種類のパラメーターの分布のチャンネル中央
平均値を表わす３つの数字も表示される。検定粒子をコ
ントロールされた一定の速度で機器中に流しながら、測
定者はＦＬ１平均、ＦＬ２平均およびＳＳＣ平均の値を
前もって決めた目標値に合せる。ＦＬＩおよびＦＬ２平
均の両方に、前もって決められた目標は例えば３０付近
に設定され、もしその値が達成されない場合、測定者は
画面に表示されるＦＬＩまたはＦＬ２のチャンネル平均
ができるだけ３０近くに設定されるまで機器の各蛍光１
または蛍光２のＰＭＴ電圧′Ａ整をする。同様にして、
ＳＳＣ平均の目標を例えば１９０に設定する。もしこの
水準が晟初に表示されない場合、測定者は画面に表示さ
れるＳＳＣのチャンネル平均ができるだけ１９０近くに
設定されるまで機器の光散乱のＰＭＴ電圧調整をする。 もちろん、これらの平均値は典型的な目標値を意味する
ものであって、機器設計、実施する試験やその他の要素
によって変１ヒし得ることは言うまでもない、もしチャ
ンネル平均の満足な値を達成できない場ｈ、測定者は第
２図に関連して記載した機器の配列手順に戻らねばなら
ない。 ＰＭＴを調整して機器の光学的要素の配列を行なった後
、機器の検定を達成するにはもう一つの調整を行なう。 この追加された調整は、２色蛍光分析を行なう場合にお
けるスペクトルの混合や重複の補正に関連する。この手
順は望ましくない緑色信号を赤色（ＰＥ９色）集団から
除去し、望ましくない赤色信号を緑色（ＦＩＴＣ着色）
集団から除去して、蛍光補正のための調整を果す。 蛍光補正手順を行なうには、上述の感度試験に関してｆ
ト成したものと同様の検定粒子の試験管で始めるのが好
ましい、この試験管は滅菌ＰＢＳ３ｗｌに上述容器から
ＦＩＴＣ，ＰＥおよび非標識ビーズの各々１滴ずつを添
加することによりその３種類の試薬の１　：１　：１混
合物として用意される。 この試験管が分析機器に装着されると、検定手順用のソ
フトウェアブログラノ、と組合わされて、画面は第４図
（ａ）に見られるような非補正蛍光を表わす点分布図を
即時に表示する。第４図（ａ）に表示された３つの分離
した点の集団は非着色、緑色着色および赤色着色検定ビ
ーズを表わす、非着色ビーズはスクリーン上で領域２８
として例示される左下部角の正方形の内側に位置するの
が典型である。赤色＜Ｆ’Ｅ＠色）ビーズは領域３０と
して示される非着色集団の上方部位に位置するのが典型
である。緑色集団は領域３２として示される非着色集団
の右側部位に位置する。蛍光補正が機器によって与えら
れるまで、領域２８．３０および３２の位置は近似だけ
である。第４［２１（ａ）の点分布図の下にはＦＬ１補
正およびＦＬ２補正のデジタル表示がある。 もしこれらのデジタル値が零または零近くの値として変
動しない場合、蛍光補正のための調整を行なわねばなら
ない。 画面に記録される補正値ができるだけ零に近づくまで、
機器のＦＬＩ補正およびＰＬ２補正を調整することによ
って、２色蛍光分析のための補正をする。調整を行った
後、補正値は牢の上方と下で等しく変動及び変化するは
ずである。ＦＬＩ補正に関して、補正された値は非着色
集団の平均横軸チャンネルと緑色着色集団の平均横軸チ
ャンネルとの間の差を表わす、ＦＬＩ補正調節を機器で
調整して画面上の値が零に近ずくと、点分布図の緑色集
団３２は第４図（ｂ）で見られるように、水平軸に平行
な水平軸について非着色集団２８と等しくなるまで下方
向に移動するはずである。 同様の方法で、画面上のＦＬ２補正の次に記載されてい
る平均チャンネル差異は、非着色と赤色着色集団の平均
垂直チャンネルの相異を表わす。 ＰＬ２補正調節を機器で調整して画面上の値が零に近ず
いた時、点分布図の赤色集団３０は第４図（ｂ）に示さ
れるように垂直軸に平行な垂直軸について−Ｉｌ′着色
集団２８と等しくなるまで垂直に移動するはずである。 ＦＬＩおよびＰＬ２調節のこれらの調整は、赤色集団か
ら不要な緑色信号の集団を電気的に差し引くこと、およ
び緑色集団から不要の赤色１３号の集団を電気的に差し
引くことによって蛍光Ｆｉｌｌ正を達成する。コンピュ
ータープログラムによって零に設定された画面上の蛍光
補正の前もって決められた値が満たされると補正は達成
される。 もし満足なまたは目標の設定を達成できない場合、測定
者は上で説明されたような配列およびＰＭＴ調整手順に
戻る！ｚ・要がある。 配列、ＰＭＴ謂整および蛍光補正が達成されると、測定
者は第１図に基づいて上述した感度試験に戻る。もし検
定される各パラメーターについて最小分離値を達成すれ
ば、測定者は実施せんとする試験が適切に検定されてい
るという十分な信頼を持ってその機器の使用に移ること
ができる。 ここに記述された検定手順に利用される検定粒子に関し
ては、標準品として稚々の粒子が使用し得る０例えば分
析を受ける実際の粒子と同様の特性を持つか、または持
つように処理され得る粒子または細胞のような生物学的
試料を用いることができる。この方針に沿うと、ニワト
リ赤血球は適切な選択技法で使用され得る。ニワ１へり
赤血球細胞を修飾した形態の粒子は粒子標準品として使
用され得る。特に蛍光で標諏した四酸化オスミウム固定
ニワトリ赤血球細胞は、生物学的細胞と同様の大きさの
散乱特性を持つので、粒子標準品として役立つ、更に四
酸化オスミウム固定化は細胞の自己蛍光を消す、これら
の細胞をビオチン化して、既知の方法でアビジンに結き
された蛍光団と反応させる。細胞に結合したアビジン複
合体の蛍光は細胞上の四酸化オスミウムによって消され
ることはない、アビジンに結合される特定の蛍光団は細
胞表面着色に特色をもつスペクトル性を持つ、多種類の
蛍光団が下記のものを含めて複合体に使用し得る。 本発明の検定粒子として最も好適なものはプラスチック
ｒ；＆細球状ビーズである。このようなビーズは大体均
一の直径に仕上げて、蛍光団や他の色素標識剤が表面結
合するための好適な表面特性を有し得る。実質的に球状
のビーズは０．５と２０ミクロンの間の直径（最も好ま
しくは２と８ミクロンの間）を持つように作製して、こ
れらの検定用ビーズを白血球と同程度の大きさにする。 ビーズは通常は充実体として作製されるがリボゾームや
他の微小担体のような中空や小胞にもできる。更にビー
ズは本発明に従って作用するためには完全な球形である
必要はない、ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよび
他のラテックス物質がビーズの成形に使用することがで
き、ポリビニルクロリド、ポリプロピレンなとのような
他のプラスチック物質も利用することができる。上述の
ビーズへのフルオレセインやフィコエリスリン［１１の
池に、本発明用の蛍光標識剤としてアロフィコシアニン
、テキサスレッド、ローダミン、ローダミン型化合物お
よびその他の蛍光着色剤も使用できる。機器の検定用の
これらの試薬のキットの作製では、標識あるいは非標識
のビーズは１０’からｉ　ｏ　ａ　ＩＭ子／ａｉｌ（好
ましくは少なくとも１０′粒子／屑ｌ）の範囲のイ農度
で存在するようにビーズを水中分散物として供給するの
が好ましい。 検定手順をフローサイトメトリー機器を具体的な例とし
て上述したが、本発明はこれに限定されるものではない
、実際、本発明の検定手順は移動粒子のみならず非移動
粒子を分析する機器にも適用できる０画像分析機ととも
に蛍光、自動および定ｉｔ顕Ｖ＆鏡のような種々の頴微
鏡も本発明に従って検定することができる。 従って、本発明は分析中の粒子から少なくとも１種類の
光関連信号を得るための機器を、使用する前に検定する
ための方法および物質を提供する。 本発明は適当なソフトウェアを使用して、機器で特定の
光関連パラメーターを検定することを決定するために満
たさねばならない信号のノイズへの比率の最小値を表示
することができる。直線性目盛での差異としての信号の
ノイズへの比率を記録することによって、測定者に便利
になるばかりでなく当て推量、目分量への依存や誤差が
実質的に減少または排除される。本発明の技法および物
質は臨床診断的応用にもすばらしい確実性を与える。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）ないしくｄ）は、夫々粒子容禎、側面散乱
、蛍光色１および蛍光色２と、粒子カウント数との関係
を示すヒストグラフであり、第１図（ａ）ないしくｄ）
の下方の文字は、上記ヒストグラフと組合せて本発明に
係る機器を検定するために該機器の表示装置に上記しス
トグラフと共に表示された情報の一例を図示したもので
ある。 第２図（ａ）は２色蛍光分析における蛍光１と蛍光２の
関係を示ず点分布グラフであり、第２１Ｊ（ｂ）は蛍光
１と側面散乱の関係を示す点分布グラフであり、第２図
（ａ）および（ｂ）の下方の文字は、上記点分布グラフ
を利用して本発明に係る機器を検定するために必要な情
報の一例が機器の表示部に表示された状暦を図示したも
のである。 第３図（ａ）は２色蛍光分析における蛍光１と蛍光２の
関係を示す点分布グラフであり、第３図（１１）は粒子
容積分布に対する側面散乱の関係を示す点分布グラフで
あり、第３図（、）および（ｂ）の下の文字は、上記点
分布グラフを利用して本発明に係る機器を検定するため
に必要な情報の一例が機器の表示部に表示された状態を
図示したちのある。 第４図（ａ）は、未補正状態の機器での蛍光分析におけ
る蛍光１と蛍光２の関係を示す点分布グラフであり、第
４図（ｂ）は、補正後の機器での蛍光分析における蛍光
１と蛍光２の関係を示す点分布グラフであり、第４図（
ａ）および（ｂ）の下方の文字は、上記点分布グラフを
利用するために有用な情報の一例が機器の表示部に表示
された状態を図示したものである。 （ａ）　　　　　　　　　　　　　　　（ｂ）（Ｃ）　
　　　　　　　　　　　（ｄ）ＦＬｌ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛍光標識した四酸化オスミウム固定ニワトリ赤血
   球細胞からなることを特徴とする蛍光分析機器での検定
   に用いるための粒子標準品。
2. （２）四酸化オスミウム固定ニワトリ赤血球細胞がビオ
   チン化されている特許請求の範囲第１項記載の標準品。
3. （３）ビオチン−四酸化オスミウム固定ニワトリ赤血球
   細胞がアビジンと蛍光団との複合体を含む特許請求の範
   囲第２項記載の標準品。
4. （４）複合体の蛍光団がフィコエリスリンである特許請
   求の範囲第３項記載の標準品。
5. （５）複合体の蛍光団がフルオレセインである特許請求
   の範囲第３項記載の標準品。
6. （６）複合体の蛍光団がアロフィコシアニンである特許
   請求の範囲第３項記載の標準品。
7. （７）複合体の蛍光団がローダミンである特許請求の範
   囲第３項記載の標準品。
8. （８）複合体の蛍光団がテキサスレッドである特許請求
   の範囲第３項記載の標準品。