JPS63169987A - 改良された血栓溶解特性を有するハイブリッドプラスミノーゲン活性化物質およびそれを含有する医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組織型プラスミノーゲン活性化物質（ｔ−ＰＡ
）および単鎖形のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性
化物質（ｓｃｕ−ＰＡ）のハイブリッドである新規なプ
ラスミノーゲン活性化物質に関するものであり、このハ
イブリッドは改良された血　。

栓溶解活性を有する。本発明はまた、これらの新規のプ
ラスミノーゲン活性化物質の製造方法に関するものであ
り、更にこれらのプラスミノーゲン活性化物質を含有す
る医薬に関するものである。

いわゆるプラスミノーゲン活性化物質と呼ばれる酵素を
ヒトまたは動物に静脈注射した後、イン・ビボ（こおい
て血栓溶解作用が生じ得ることが知られている。この作
用は血中に存在するプラスミノーゲンの活性化に基づい
ており、その活性化は血管中のフィブリンを含有する血
餅の溶解を生じさせる一連の反応を開始させる。この反
応機構は複雑であり、使用されているプラスミノーゲン
活性化物質の型に依存して異なり得る。

プラスミノーゲン活性化物質は２つの型、すなわち組織
型プラスミノーゲン活性化物質（ｔ−ＰＡ）およびウロ
キナーゼ型プラスミノーゲン活性化物質（ｕ−ＰＡ）　
　とに分類しつる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活
性化物質は更憂こ二本鎖形（ｔｃｕ−ＰＡ）および単鎖
形（ｓｃｕ−ＰＡ）に分類しつる。

ｔ−ＰＡはプラスミノーゲンの活性化を起こし得るが、
フィブリンが無い場合よりもフィブリン存在下の方がず
っと効果的である。このことは活性化が主１こ血餅の近
くで起こっており、血餅を溶解し、一方では循環血中に
おいてはプラスミノーゲンの活性化はほとんど生じない
ことを意味している。ｔ−ＰＡはｔｃｕ　−Ｐ　Ａまた
は５ｃｕ−ＰＡに対する抗血清と反応しない。

ｔｃｕ−ＰＡはフィブリンが存在している場合およびフ
ィブリンの無い場合の両方において、血中のプラスミノ
ーゲンの活性化を誘導する。このことは、血餅を溶解し
得ることを意味するのみならず、循環血中のフィブリン
溶解系ゐ活性化が起こり、これによってフィブリノーゲ
ンの崩壊および出血傾向が生じることも意味する。

５ｃｕ−ＰＡは有効にプラスミノーゲンを活性化するが
、それはフィブリンを含有する血餅が存在する場合のみ
に限られる。活性化の機構が異なるという事実および５
ｃｕ−ＰＡが免疫学的にｔ−ＰＡとは無関係であるとい
う事実をこもかかわらず、５ｃｕ−ＰＡはｔ−ＰＡと同
様に循環血中におけるフィブリン溶解系をほとんど活性
化しない。これら三つのプラスミノーゲン活性化物質の
うち、ｔｃｕ−ＰＡは長い間医療におＧ′）で用いられ
ており、その間副作用が障害となっていた。

これらの活性化合物の最良の使用に関する多くの疑問点
が解決されないままであるけれども、それらのフィブリ
ン特異性はい（つかの動物モデルから予想される程、ヒ
トにおいては明白でないことが確定した。従って、より
高い特異的血栓溶解活性およびより良いフィブリン選択
性を有する血栓溶解剤の探求への道はまだ開かれている
。

改良された血栓溶解剤の開発のための１つのアプローチ
は、ｔ−ＰＡおよび５ｃｕ−ＰＡの両方のフィブリン−
特異性に関連する構造を含む）１イブリツドたん白質の
生産である。

ｔ−ＰＡのフィブリン特異性は主にそのフィブリンへの
親和性およびフィブリン表面における著しく増大したプ
ラスミノーゲン活性による。ｔ−ＰＡのフィブリン活性
に関与するｔ−ＰＡ中の構造は、その分子内のＮＨ２−
末端領域、たぶんフィンガー状領域および第二番目のク
リングル中に存在している。ｕ−ＰＡは、Ｌｙｓ１５８
−■１ｅ１５９ペプチド結合が無傷であるｓｃｕ　−Ｐ
　Ａ型においてのみフィブリン特異性を表す。フィブリ
ン特異性は末端の１４３アミノ酸の存在に依存せず、ま
た、Ｌｙｓ１５８−Ｌｙｓ１５９ペプチド結合の潜在的
な開裂にも依存しない。それ故、ｔ−ＰＡのＮＨ２−末
端領域およびｓｃｕ　−Ｐ　ＡのＣＯＯＨ−末端領域を
含み、ｕ−ＰＡへの転換が破壊されているハイブリッド
たん白質はｔ−ＰＡまたはｓｃｕ　−Ｐ　Ａよりもより
高いフィブリン選択性を有するであろうし、従ってより
良い血栓溶解剤となるであろう。

この仮定に基づき、ｓｃｕ　−Ｐ　ＡのｃＤＮＡフラグ
メント（１３６〜４１１，１３９〜４１１または１９５
〜４１１のアミノ酸を各々コード（暗号化）している）
に融合されたｔ−ＰＡのｃＤＮＡフラグメント（１〜６
７．１〜２１２または１〜３１３のアミノ酸を暗号化し
ている）の一時的な発現によって、ｔ−ＰＡおよびｕ−
ＰＡのハイブリッド分子がすでに作成されていた。これ
らの組換え産物は、プラスミンによる開裂により、ｕ−
ＰＡと非常に近い程度にプラスミノーゲンを活性化する
。このことは、ｔ−ＰＡ槽構造ｕ−ＰＡへの融合が酵素
の触媒活性を損わないことを示している。しかし、これ
らのハイブリッド分子の内の１つ（ｔ−ＰＡの１〜６７
とｓｃｕ　−Ｐ　Ａの１３６〜４１１）についてさらに
研究されたが、ｔ−ＰＡのフィブリン活性を取得せず、
ｓｃｕ　−Ｐ　Ａと比べてフィブリン選択性が改良され
ていないことが明らかとなった。

ハイブリッド分子についての継続研究の結果、ｔ−ＰＡ
のブイプリン特異性とｓｃｕ　−Ｐ　Ａの活性を結合し
た機構を発現する／％イブリッド分子が得られた。これ
はハイブリッド分子が改良されたフィブリン選択性と、
より特異的な血栓溶解活性を同時に表わす状態で提供さ
れた最初のものである。好ましい具体例としては、ｔ−
ＰＡの１〜２６３のＮ　Ｈ２−末端アミノ酸と、ｓｃｕ
　−Ｐ　Ａの１４４〜４１１のＣＯＯＨ−末端アミノ酸
をフレーム内に含んでいるハイブリッド分子である（第
１図）。また、本発明者らはイン・ビトロの血漿中にお
いてはこのハイブリッド分子はｓｃｕ　−Ｐ　Ａと比較
してより高い特異的血栓溶解活性およびより良いフィブ
リン選択性を有することを発見した。さらに、同様のハ
イブリッド分子も浸出物上のフィブリン含有互生物に対
してフィブリン溶解活性を有する。正常以下の血液循環
によりひき起こされる無緊張性の傷（ａ、ｔｏｎａｌｗ
ｏｕｎｄｓ　）に対しても有益な効果が期待されている
。

ｔ−ＰＡのＮＨ２−末端アミノ酸に関して、フィンガー
領域のアミノ酸（１〜４４または４５のアミノ酸）およ
び第二番目のクリングル頭載のアミノ酸（１７８〜２６
１または２６２のアミノ酸）か少なくとも存在していな
ければならないことに注意すべきである。２つのクリン
グルが一列に並んで存在していてもよい。ｓｃｕ　−Ｐ
　ＡのＣＯＯＨ−末端アミノ酸中において、アミノ酸１
４８からはじまるアミノ酸が少なくとも存在しなければ
ならない。このペプチド鎖はアミノ酸１４４またはアミ
ノ酸１３６まで増加するのが好ましい。

本発明は改良されたフィブリン特異性を有するこれらの
新規なハイブリッドプラスミノーゲン活性化物質の合成
方法、そのようなハイブリッドプラスミノーゲン活性化
物質を暗号化しているキメラｃＤＮＡの構築方法、これ
らのｃＤＮＡ分子を発現させることができる哺乳動物細
胞系、これらの細胞系の培養液および抽出物の精製方法
および血栓症患者の治療のための医薬組成物およびその
製造方法に関するものである。

医薬組成物を製造する擾こは、ハイブリッドプラスミノ
ーゲン活性化物質を、既述した用途６ご用いるに適した
あらゆる医薬上許容され得る賦形剤と混合する。さらに
、これらのハイブリッドプラスミノーゲン活性化物質に
近い他のプラスミノーゲン活性化物質を混合して相乗活
性を生じさせることもできる。その効果が優れているの
で医薬組成物は、静脈注入用液剤の形をとることが好ま
しい。

本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

メラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ　）の条件づけ（ｃｏｎｄ
ｉｔｉｏｎｅｄ）培地からｔ−ＰＡを精製した。既知の
グアニジニウムチオシアネート抽出／リチヮムクロライ
ド沈殿法を用いてＢｏｗｅｓヒトメラノーマ細胞から総
ＲＮＡを単離した。オリゴ−ｄＴクロマトグラフィーに
よってポ’）　Ａ＋’ｍＲＮＡ　を調製した。既知の方
法によってオリゴ−ｄＴでプライムしたｃＤＮＡを合成
し、λｇｔｌｌ　にてクローンした（Ｔ、Ｖ、ヒューン
（Ｈｕｙｎｎ　）ら、λｇｔｌｏおよびλｇｔｌｌＤＮ
Ａクローニング技術：プラクテイカルアプローチ、ＪＲ
Ｃ出版、オックスフォード（１９８４））。

ｔ−ＰＡｃＤＮＡの相補鎖を示す部分的に重なり合つた
２つのデオキシオリゴヌクレオチドを化学的≦こ合成し
た。

５’　−ＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴ
ＧＴＡＣＴｒＣＴＣ−３’および ５’−ＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＡＣＡＣＧＡＡＡＴＣＴＧ
ＡＧＡＡＧＴＡＣ−３’上に示したこれらの２つの鎖を
アニールし、Ｅ、コリ（大腸菌）ＤＮＡポリメラーゼエ
のクレナヮフラグメント（最終濃度０．１ユニット／＋
ｍＱ、ベーリンガーマンハイム）およびｄＧＴＰ％ｄＴ
ＴＦ’およびｄＡＴＰ（各々２００μＭ、ファルマシア
、ウプサラ、スウェーデン）および２５０μＣｉ（α−
２２Ｐ）ｄＣＴＰ（５，０ＯＯＣｉ／ミリモル）（二ニ
ー・イングランド・ヌクレア、ボストン、ＭＡ）を廟い
て充填し、〜１０　ｃｐｍ／μｇの比活性を有する４９
ヌクレオチドの長さのプローブを作成した。このプロー
ブはｃＤＮＡ配列の３６６から４１６までのヌクレオチ
ドに対応する（Ｄ、ペニカ（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）ら、ネ
ーチャー、３０１，２１４−２２１（１９８３））。こ
のプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを
行った。

陽性のプラーク（λｔ　−ＰＡ４　　およびλｔ−ＰＡ
８）からのｃＤＮＡをｐＵｃ１８と共にスプライシング
してｔ−ＰＡを暗号化している隣接したｃＤＮＡ配列を
得た。次にｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ配列をＭ１３ｍｐ１８ま
たはＭ１３ｍｐ１９にサブクローンしくＣ，ヤニツシュ
ーペロン（Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　）ら、Ｇｅ
ｎｅ　３３．１０３−１１８（１９８５））、ジデオキ
シヌクレオチド鎖末端法により配列決定した。

全長のｓｃｕ　−Ｐ　ＡをコードしているｃＤＮＡ配列
を含むｐ　ＵＣｓｃｕ　−ＰＡを以下の様にして得た。

グアニジニウムインチオシアネート抽出／塩化すチヮム
沈殿法によって、総ＲＮＡをＣＡＬＵ−３細胞から分離
した。オリゴ−ｄＴセルロースクロマトクラフィーによ
ってポリＡ”ｍＲＮＡ　を調製した。オリゴ−ｄＴでプ
ライムしたｃＤＮＡを合成し、λｇｔｌｌにクローンし
た。

５ｃｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡの相補鎖である２つの部分的に
重なり合ったデオキシオリゴヌクレオチドを化学的に合
成した。

５　’−ＧＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＣ
ＣＣＧＧＡＣＴおよび５’−ＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＴ
ＧＧＴＣＴＧＴＡＴＡＧＴＣＣＧＧＧ上に示す２つの鎖
をアニールし、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼＩのフレナ
ラフラグメント（最終濃度０．１ユニツト／μｌ）およ
びｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰ（２００μＭ）お
よび２５０μＣｉ（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰを用いて充填
し、〜１０８ｃｐｍ／μｇの比活性を有する４９ヌクレ
オチドの長さのプローブを合成した。

このプローブはｃＤＮＡ配列の９３１〜９７９ヌクレオ
チドに対応している（Ｗ、Ｅ、ホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ
　）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３　、９２３
−９２９、（１９８５））　、次にプラークのハイブリ
ダイゼーションを行った。

第二番目に特異的にプライムしたｃＤＮＡライブラリィ
−を、λｇｔｌｌ　内において、最初の鎖のｃＤＮＡ合
成を開始させるために後で述べたデオキシオリゴヌクレ
オチドを用いて調製した。３つの重なったＣＤＮＡクロ
ーンを一緒ｌζスプライシングして、ｓｃｕ　−Ｐ　Ａ
の全長を暗号化している隣接したｃＤＮＡ配列を合成し
た。

実施例３　　ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ　ハイブリッドｃ　Ｄ
ＮＡｖｇ　１９９までのアミノ酸をコードしている）ヲ
ＢａｍＨＩで消化したＭ１３ｍｐ１８にライゲートして
Ｍ１３ｉｍｌを得た。次に末端Ｍｅｔ−３５〜Ｌｅｕ４
１１のアミノ酸をコードしているｐＵＣｔ−ＰＡの５ｓ
ｔＩフラグメント（−２０〜１４２２ヌクレオチド）を
ｓｃｕ　−Ｐ　Ａ　配列の上流のＭ１３ｉｎｔｌの５ｓ
ｔＩ部位にライゲートしてＭ１３ｔ−ＰＡｓｃｕ−ＰＡ
を得た（第２図参照）。

ｔ−ＰＡおよびｓｃｕ　−Ｐ　Ａ配列の両方とも、この
ＤＮＡ分子中では同じ方向性を有する。Ｍ１３　ｔ　−
ＰＡ−ｓｃｕ−ＰＡ　の単鎖鋳型ＤＮＡおよび合成デオ
キシオリゴヌクレオチド欠失プライマー５’　−ＣＴＧ
ＡＡＡＴＴＴｒＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡ−３’　
にュー・イングランド・バイオラポズ）、これはｔ−Ｐ
Ａの５ｅｒ２６０〜Ｔｈｒ２６３アミノ酸およびｓｃｕ
　−Ｐ　ＡのＬ　ｅｕ　１４４．、、Ｇ１ｎ１４７　（
Ｔｈｒ２６３　）アミノ酸に対するコドンに相補的であ
る、を用いてインビトロでの特定部位の突然変異誘発に
よりｔ−ＰＡコドンＴｈｒ　２６３およびｓｃｕ　−Ｐ
　ＡコドンＬｅｕ　１４４のＤＮＡスプライシングを行
った。燐酸化したデオキシオリゴヌクレオチド（２００
ｎｇ）を鋳型（１ｐｇ＞と共にトリス−Ｈ（Ｊ！緩衝液
（５０ｍＭ、ｐＨ７，８）、ＭｇＣｆｆ２　（１０ｍＭ
　）およびＤＴＴ（２０ｍＭ）中にて６５℃において５
分間加熱し、段階的に室温および０℃に冷却してアニー
ルした。ＡＴＰが濃度０．４ｍＭ、ｄＮＴＰｓを濃度０
．０５ｍＭ　　となるまで加えて最終容量を５０μｅと
した。Ｔ４　Ｄ　Ｎ　Ａ　’Ｊガーゼ（４００Ｕ）　　
およびＥ、コリＤＮＡポリメラーゼＩのタレナラフラグ
メント（５ユニツト）を加えた。

１４℃における１時間のインキュベーションの後、得ら
れたＤＮＡをＥ、コリＪＭＩＯＩ細胞をトランスフェク
トするのに用いた。

ＭｇＣｆｆ２　（１０ｍＭ　）およびＤＴＴ（５ｍＭ）
を含有するトリス−ＨＣｆｆ緩衝液（７０ｍＭ、ｐＨ８
，０）中において（α−３２Ｐ）ＡＴＰ（１００μＣｉ
）およびＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニツ
ト）を反応混合物（２０μｌ）中で３０分間３７℃にて
インキュベーションすることにより、欠失プライマーを
比活性（１０８ｃｐｍ／μｇ）に放射性標識（ラベル）
した。次に、このラベルしたプローブをブラークツ１イ
ブリダイゼーシヨンに用いて、Ｍ１３ｔ−ＰＡ／ｕ−Ｐ
Ａ　のスプライシングされたＤＮＡを同定した。

ＮａＣｌ１（０，９Ｍ）　、　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　４
０界面活性剤（０，５％）、Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ（ＩＸ
）、ＥＤＴＡ（６ｍＭ）、ピロ燐酸ナトリウム（１ｍＭ
）　、ＡＴＰ（０，１ｍＭ）およびＥ、コリｔＲＮＡ（
０，２Ｑ／ｍＱ）を含有するトリス−ＨＣ／ＪＣ／性（
０，（１５）Ｍ、ｐＨ７，５）　　中、２２℃にて１晩
ハイブリダイゼーシヨンを行った。ニトロセルロースフ
ィルターを４９℃のＮａＣ＃（７５ｍＭ）中で数回洗液
を変えて１時間洗浄し、−晩、Ｘ線フィルムにさらした
。

ｔｉ性のハイブリダイゼーションのシグナルを示すプラ
ークを選択し、ジデオキシヌクレオチドの配列決定によ
って望ましくないＤＮＡの欠失を証明した。

最終的な発現プラスミドは２段階で組立てられた。ｔ−
ＰＡ配列の５ｅｒ１〜Ｔｈｒ２６３および５ｃｕ−ＰＡ
配列のＬｅｕ１４４〜Ｇｌｕ１６３をコードしているＭ
１３ｔ−ンドヌクレアーゼフラグメント、およびｐ　Ｕ
　Ｃ５ｃｕ−ＰＡ　　の、Ｐｈｅ１６４〜Ｌｅｕ４１１
．５ｃｕ−ＰＡｃＤＮＡの３′−非翻訳配列の７８ヌク
レオチドおよびｐＵｃ１８ポリリンカーの残りをコード
している部分的ＥｃｏＲＩ−３ｓｔＩ　制限エンドヌク
レアーゼフラグメントＢｇ　１ＩＩ−３ｓｔＩで消化し
たｐＵｃｓｃｕ−ＰＡにライゲートした。

ｔ−ＰＡｃＤＮＡの５′−非翻訳配列を含み、ｔ−ＰＡ
のアミノ酸Ｍｅ　ｔ　”’　〜Ａ　ｒｇ−”をコードし
ているｐＵＣｔ−ＰＡ　のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼフラグメント、ｐｌｎｔｌの
Ｂｇｌ　ｌｌ−５ｓｔＩ　制限エンドヌクレアーゼフラ
グメント（ハイブリッドアミノ酸５ｅｒ１〜Ｌｅｕ５３
１および３′−非翻訳配列の７８ヌクレオチド）および
ｐ　Ｓ　Ｖ３２８　ＤＨＦＲの５ｓｔＩ−Ｈ４ｎｄＩＩ
ＩベクターフラグメントをライゲートしてｐＳＶｔ−Ｐ
Ａ／ｕ−ＰＡＤＨＦＲを得た（第２図）。

ｐＳＶｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＤＨＦＲプラスミドＣ５ｆｉ
ｇ）をＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞を
トランスフェクトするために用いた。これらの細胞はベ
ルギーのジエント大学のＷ、ファイアース（Ｆｉｅｒｓ
）から得た。この細胞を既知の燐酸カルシウム共沈法を
用いてトランスフェクトした。

ＤＨＦＲ＋細胞を単離し、ＥＬＩＳＡ分析法を用いて低
分子量のｕ−ＰＡに関連した抗原の分泌番こついて監視
した。

大規模な合成を行い、その間に血清不含の培地中での連
続的な２日間のインキュベーションの後調整培地を３回
収獲した。

／　ｕ　−Ｐ　Ａハイブリッドたん白質の精製ハイブリ
ッドたん白質を、亜鉛でキレート化したセファロースを
用いたクロマトグラフィーにかけ、不溶化した、ｔ−Ｐ
Ａのフィブリンへの結合を破壊するネズミのモノクロー
ナル抗体（ＭＡ−ＩＣ８）に免疫的１こ吸着させること
によって精製した。調整培地（約１５リツトル）を、Ｎ
ａＣｎ（０，３Ｍ）およびＴｗｅｅｎ　８０　（０，０
１％　）およびアプロチニン（１０Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍＱ）
を含むトリス−ＨＣ／緩衝液（０，０２Ｍ。

ｐＨ７，５）であらかじめ平衡化しておいた亜鉛キレー
ト化セファロースのカラム（５Ｘ２５α）に、４℃にお
いて、流速２５０　ｍ（！／ｈｒで適用した。このカラ
ムを平衡化した緩衝液で洗浄し、イミダゾール（５０ｍ
Ｍ）を含む緩衝液を用いて溶離した。アルギニン（０，
４Ｍ）、クエン酸緩衝液（０，０８Ｍ、ｐＨ５゜０）お
よびアプロチニン（４０Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍＱ）　２．５ｍ
ｆｆ１を含有するチューブに、７．５　ｍＱのフラクシ
ョン（画分）を集めた。ＥＬＩＳＡ＋こより測定したｕ
−ＰＡに関連する抗原は、主要なたん白質のピークと事
実上一致するピークにおいて溶離した。

亜鉛キレート化カラムの、ｕ−ＰＡを含むフラクション
のプールの半分を免疫吸着カラム（０，９ｘ　７ｍ）を
用い、流速８　ｍＱ／　ｈｒにてクロマトグラフィーに
かけた。このカラムをＴｗｅｅｎ　８０　（０，０１％
）およびアプロチニン（１０Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍｆＬ）を含
有するＮａＣ１（０，３Ｍ　）、トリス−ＨＣ召緩衝液
（０，０２Ｍ、　ｐＨ７，５）を用いて洗浄した後、Ｋ
ＳＣＮ（２Ｍ）を含有する同じ緩衝液を用いて溶離した
。アルギニン（０，４Ｍ）、クエン酸緩衝液（０，０８
Ｍ　１ｐＨ５，０）、アプロチニン（４０Ｋ　Ｉ　Ｕ１
０＋１りを２．５　ｍＱ含むチューブ内にフラクション
（７，５ｍｆｆ）を集めた。これらのｕ−ＰＡに関連す
る抗原を含むフラクションをプールし、Ｔｗｅｅｎ８０
（０，０１％）およびアプロチニン（１０Ｋ　Ｉ　Ｕ／
ｄ）を含むＮａＣ５（０，３Ｍ　）−アルギニン（０，
１Ｍ）−？エン酸緩衝液（０，０２Ｍ、ｐＨ５，０）に
対して透析した。

この亜鉛キレート化セファロースを用いた精製段階の回
収率は８５％であり、容積の縮小率は７５倍であった。

免疫吸着クロマトグラフィーによりｕ−ＰＡ関連抗原は
総容量（１０ｍＡ）中に３．０■得られた。この精製段
階での精製係数（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆａｃｔｏ
ｒ　）は２４倍であり、体積の縮小率は１０倍となった
。全体としてのｕ−ＰＡ関連抗原の収率は５３％であり
、調整培地１リツトルあたり、精製された物質が４２０
ｐｌ得られた。アプロチニンを濃度１０　Ｋ　Ｉ　Ｕ／
ｍｌ！　　になるよう細胞培養培地に加え、精製の間緩
衝液を用いた場合、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡハイブリッドた
ん白質のほとんどすべてがｔ−ＰＡ／ｓｃｕ；’ＰＡの
形で得られた。

精製したｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドは非還光
条件下、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上において２本の帯（バンド
）として移動したが、還元条件下においては約Ｍｒ　７
０，０００を有する単一の主要な帯として移動した。非
還元化ゲル上に見られた二本の帯の両方はｕ−ＰＡに対
する抗血清およびｔ−ＰＡに対する抗血清に対していず
れも免疫学的に活性であった。

ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドのアミノ酸成分は
第１表に示されている。観察されたアミノ酸成分は既知
のｔ−ＰＡ／ｓｃｕ／−ＰＡハイブリッドの配列から誘
導したものき一致している。

フィブリンプレート上の比活性は５ｃｕ−ＰＡについて
は１６０，０００１　Ｕ／ｗＩｇ　であり、ｔ−ＰＡ＋
ｃついｒは５０，０ＯＯＩＵ／Ｍ９であるの（こ比べて
ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドについては１７５
，０ＯＯＩＵ／■であり、ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡハイ
ブリッドについては２０５．０ＯＯＩＵ／ｑであった。

ＮａＣ１（０，３Ｍ　）、アルギニン（０，２Ｍ’）お
よび１ｗｅｅｎｓ　ｏ　（ｏ、ｏ　ｉ％）を含むクエン
酸緩衝液（０，０２Ｍ　、　ｐＨ５，０）中のｔ　−Ｐ
Ａ／　５ｃｕ−ＰＡ　ハイブリッド溶液をＮａ（Ｊ！　
（０，０３８Ｍ）　、Ｔｗｅｅｎ８０（０，０１％、最
終濃度２、ＯｌＩＭ）を含むトリス−ＨＣｇ緩衝液（０
，０５Ｍ、　ｐＨ８，４）中にて３倍に希釈し、プラス
ミン（最終濃度３０−９０　ｎＭ　）を用いて３７℃に
て処理した。

時間を定めた間隔において（０〜３０分）、５μ召を回
収し、Ｓ−２４４４を濃度０．３ｍＭで含む同じ緩衝液
（８００μｅ）に加えた。ウロキナーゼ活性を４０５　
ｎｍにおける吸収を測定することにより決定し、国際的
な比較製品（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｆｅｒ
ｅｎｃｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　）　（６６／４６　
）と比較してＩＵで表わした。この処理の終わりにおけ
るハイブリッド分子の形を還元後の５ＤＳ−ＰＡＧＥ（
１２％）で調べた。

ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡ　ハイブリッドの比活性は３４
０１Ｕ／ｑであった。プラスミンは時間依存的に、１−
ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドを、アミド分解活性を
有するウロキナーゼに転換した（第３図参照、Ａ＝特異
的アミド分解活性、Ｂ一時間（分））。最大の転換の結
果、ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドに対する比活
性約３３，０ＯＯＩＵ／＃に相当するアミド分解活性が
もたらされた。ウロキナーゼによるＳ−２４４４の加水
分解においてはアルギニン（０，ＩＭ）の影響は観察さ
れなかった。

プラスミン（モルを基本として３％）と共に３０分間、
３７℃にてインキュベーション後、ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−
ＰＡハイブリッドが単鎖形分子から二本鎖分子へと完全
に転換していることが５ＤＳ−ＰＡＧＥ憂こよって示さ
れた。

ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドによるプラスミノ
ーゲンの活性化を過剰の基質の存在下において測定した
。ＮａＣｎ　（０，０３８Ｍ）　、Ｔｗｅｅｎ８０　（
，０，０１％）およびＳ２２５１（１ｍＭ）　　を含有
するトリス−ＨＣ１緩衝液（０，０５Ｍ　、　ｐＨ７，
４）中で種々の濃度のプラスミノーゲン（最終濃度０．
２５〜２μＭ）と共に３７℃Ｅこおいて、ｔ−ＰＡ／５
ｃｕ−ＰＡ　ハイブリッド（濃度２５ｎＭ）をインキュ
ベーションした。４０５　ｎｍにおける吸収から、プラ
スミンの生成を決定し、３〜４分かけて監視し、プラス
ミン検量線と比較してｎＭで表した。

ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡ　ハイブリッド（最終濃度２５
ｎＭ）　によるプラスミノーゲン（最終濃度１０〜９５
μＭ）の活性化をＮａＣ１（０，０３８Ｍ　）およびＴ
ｗｅｅｎ８０　（０，０１％）を含むトリス−ＨＣｇ緩
衝液（０，０５Ｍ。

ｐＨ７，４）中で３７℃においてプラスミノーゲンをイ
ンキュベーションすることにより測定した。異なった時
間間隔（０〜６分）において生成したプラスミンを、サ
ンプルを２００倍に希釈した後、Ｓ−２２５１（最終濃
度０．３ｍＭ）を用いて測定した。

インキュベーション時間に対して生じたプラスミン濃度
をプロットすることにより、初期活性化速度を得た。

ｔ　−ＰＡ／　ｔｃｕ−ＰＡ　（最終濃度１．２５　ｎ
Ｍ　）を加える前にＮａＣ＃　（０，０３８Ｍ　）およ
びＴｗｅｅｎ　８０　（０，０１％）を含むトリス−Ｈ
Ｃ４緩衝液（０，０５Ｍ　、　ｐＨ７，４）　中、ＣＮ
Ｂｒで消化したフィブリノーゲン（０，２５または０．
５０ＭＭ）と共にプラスミノーゲン（最終濃度１．５μ
Ｍ）を３７℃でインキュベーションして、ｔ−ＰＡ／１
ｃｕ−ＰＡ　　によるプラスミノーゲンの活性化速度に
対するフィブリンの効果を評価した。サンプルを２０倍
に希釈した後、生成したプラスミンを測定した。

ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドによるプラスミノ
ーゲンの活性化はミカエリス−メンテンの速度論に従う
（第４Ａ図参照、Ｃ＝初期活性化速度（Ｖ）の逆数およ
びＤ；プラスミノーゲン活性化濃度の逆数）。アルギニ
ン（０、ＩＭ）によるプラスミノーゲン活性化速度への
影響は観察されず、プラスミンによるＳ−２２５１の加
水分解速度によっても観察されなかった。これらのライ
ンウェーパー−バーク・プロットからＫｍ＝２．２μＭ
　　およびに２＝０．００１３Ｓ−１が得られた（　ｒ
＝０．９９８）。

ｔ　−ＰＡ／　ｔｃｕ−ＰＡハイブリッドによるプラス
ミノーゲンの活性化はミカエリス−メンテンの速度論に
従った（第４Ｂ図、図中、ＥおよびＦは第４Ａ図におけ
るＣおよびＤに対応する）。Ｋｍ＝８５ｐＭおよびに２
＝５Ｓ−１（ｒ＝０．９９９　）。

プラスミノーゲンとｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡハイブリッ
ドのインキュベーション混合物にＣＮＢｒで消化したフ
ィブリノーゲンを加えると活性化速度が著しく増加した
（第５図参照、Ｅ＝プラスミン濃度、Ｂ＝待時間。

ＮａＣ１（０，０３８Ｍ）　、Ｔｗｅｅｎ８０　（０，
０１％）およびＢＳＡ（１１９／ｍＱ）を含むトリス−
ＨＣｌ緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ７゜４）中のヒトフィ
ブリノーゲン（最終濃度０〜３．３　Ｑ／ｒｎＱ　）を
５ｃｕ−ＰＡ、　ｔｃｕ−ＰＡ、　ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−
ＰＡ％ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ（最終濃
度５０〜１００　ｎｉｌ／ｍＱ　）と混合した。この混
合物にトロンビンを最終濃度２０　ＮＩＨユニット／　
ｒｎＱまで加えて凝固させた。３７℃にて１分間インキ
ュベーションした後、Ｄ−Ｉ７？ｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
ＣＨ２ＣＡ’　（最終濃度１０μＭ）を加えてトロンビ
ンを不活性化してウロキナーゼの不活性化を防ぎ、この
サンプルを遠心分離（１分間、１０，０００　、Ｆ　）
　ｔ、た。上清中のＵ−ＰＡまたはｔ−ＰＡに関連する
抗原の濃度を前記のＥＬＩＳＡ分析により決定した。

第６図（Ｆ＝残存している抗原、Ｇ＝フィブリン）はｔ
−ＰＡ、ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドおよびよ
り少ない程度であるが、ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡハイブ
リットがフィブリンに対して特異的な親和性を有してい
ること、そしてこれは５ｃｕ−ＰＡまたはｔｃｕ−ＰＡ
によっては表されないことを示している。

クエン酸塩処理したヒト血漿中に！ｖ！濁した、１２５
Ｉ−フィブリン標識ヒト血漿血餅から成る系において、
５ｃｕ−ＰＡ、ｔｃｕ−ＰＡ、　ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−Ｐ
Ａ。

ｔ−ＰＡ／１ａｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡの相対的なフィ
ブリン特異性を測定した（　Ｃ，ザマーロン（Ｚａｍａ
ｒｒｏｎ　）ら、トロンボ・ヘモスト（Ｔｈｒｏｍｂ、
　Ｈａｅｍｏｓｔ、　）、５２．１９−２３，１９８４
）。凝固速度分析を用いてフィブリノーゲン濃度を測定
した。あらかじめ３７℃の血漿中で酵素を４時間インキ
ュベーションした後、血漿血餅を加えて、血漿中のプラ
スミノーゲン活性化物質の相対的安定性を測定した。放
射性同位体およびフィブリノーゲン分解物の両方の放出
を調べた。

試験を行ったプラスミノーゲン活性化物質のすベルした
血餅の濃度依存性の溶解を誘導した（第７図、Ｈ＝溶解
、■＝残存しているフィブリノーゲン、Ｊ＝暗時間単位
は時間））。血餅溶解は、ｔ−ＰＡおよびｔ　−ＰＡ／
　ｔｃｕ−ＰＡ　ハイブリッドについて、フィブリノー
ゲンの高度の分解と関連していた。ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−
ＰＡ　ハイブリッドはｓｃｕ　−ＰＡよりも有意により
高い特異的血栓溶解活性を有していた。プラスミノーゲ
ン活性化物質を血漿と共にあらかじめインキュベーショ
ンした結果、ｔ−ＰＡおよびｔ−ＰＡ／　ｔｃｕ−ＰＡ
　ｔ’イブリッドのフィブリン溶解能は阻害されたが５
ｃｕ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッド
のフィブリン溶解能は阻害されなかった。あらかじめイ
ンキュベーションすることにより、血餅の存在下に得ら
れるフィブリノーゲン溶解に匹敵するフィブリノーゲン
溶解がひき起こされた（第８図参照、ここにＨ１■およ
びＪは第７図における意味と同じである）。

Ｍｒ　　　　　：分子量 ｕ−ＰＡ　　　　：ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活
性化物質 ｔｃｕ−ＰＡ　　　：二本鎖ｕ−ＰＡ ｓｃｕ−ＰＡ　　　：単鎖ｕ−ＰＡ ｒｓｃｕ　−Ｐ　Ａ　　　：哺乳類細胞系でのｔＤＮＡ
の発現によって得られた組換え５ｃｕ−ＰＡ ｎｓｃｕ−ＰＡ　　　：ヒト肺腺癌細胞（ＣＡＬＵ−３
）の調整培地から精製された天然ｓｃｕ　− ＰＡ ｔ−ＰＡ　　　　：組織型プラスミノーゲン活性化物質 ｒｔ−ＰＡ　　　：哺乳類細胞系でのｃＤＮＡの発現に
よって得られた組換えｔ−ＰＡ ｎｔ−ＰＡ　　　　：ヒトメラノーマ（Ｂｏｗｅｓ　）
細胞の調整培地から精製された天然ｔ−ＰＡ ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ：　Ｌｙｓ１５８−１１ｅ１５９ペ
プチド結合が無傷のまま、または開裂されている、 ｔ−ＰＡのアミノ酸５ｅｒ１〜Ｔｈｒ２６３と、ｕ−Ｐ
Ａのアミノ酸Ｌｅｕ１４４〜Ｌｅｕ４１１とを含有する
組換え融合タンパク 質。

ｔ−ＰＡ／　５ｃｕ−ＰＡ：無傷のＬｙＳ１５８−Ｉｌ
ｅ１５９ペプチド結合をもつｔ　−ＰＡ／　ｕ−ＰＡ ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡ：　Ｌｙｓ１５８−１１ｅ１５
９ペプチド結合が開裂されているｔ　−ＰＡ／　ｕ−Ｐ
Ａ Ｓ−２４４４：ピログルタミルーグリシルーアルギニン
ーｐ−ニトロアニリン Ｓ−２２５１：　Ｄ−バリル−ロイシル−リジン−ｐ−
ニトロアニリン Ｄ−ｒｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃ１：　Ｄ−イン
ロイシル−プロリル−アルギニンクロロ メチルケトン ■Ｕ　　　　：国際単位 ＫＩＵ　　　　　：カリクレイン阻害物質単位ＳＤＳ　
　　　　ニドデシル硫酸ナトリウムＰＡＧＥ　　　　：
ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＤＴＥ　　　　　ニジ
チオエリスリトールＤＴＴ　　　　　ニジチオスレイト
ールＰＥＧ　　　　　：ポリエチレングリコールＥＬＩ
ＳＡ　　　　：エンザイムリンクトイムノンルベントア
ツセイ ＣＨＯ細胞　：チャイニーズノ＼ムスター卵巣細胞ＤＨ
ＦＲニジヒドロ葉酸還元酵素 ＢＳＡ　　　　　：牛血清アルブミン ｄＮＴＰ　　　　：デオキシリボヌクレオシド　トリフ
オスフェート フィンガー　：ｔ−ＰＡのＮＨ２末端領域であって、フ
ィブロネクチンのフィブリンへ の親和性に関する該フィブロネク チンのフィンガ一様領域とホモ口 −ガスな領域。

タリングル　：プラスミノーゲン（５）、プロトロンビ
ン（２）、ｔ−ＰＡ　ｆ２１およびｕ−ＰＡ　（１１に
生じているトリプルループを形 成ｆるジスルフィド結合。

ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドのアミノ酸成分Ａ
ｓｘ　　　　　　　４７　　　　　　４５Ｔｈｒ　　　
　　　　３１　　　　　　３３Ｓｅｒ　　　　　　　４
８　　　　　　４８Ｇｌｘ　　　　　　　６０　　　　
　　５２Ｐｒｏ　　　　　　　３３　　　　　　２７Ｇ
ｌｙ　　　　　　　４４　　　　　　４４Ａｌａ　　　
　　　　２５　　　　　　２８Ｖａｔ　　　　　　　１
６　　　　　　２２Ｍｅｔ　　　　　　　７　　　　　
　　　Ｂ１１ｅ　　　　　　　１６　　　　　　２３Ｌ
ｅｕ　　　　　　　３５　　　　　　３５Ｔｙｒ　　　
　　　　２５　　　　　　２７Ｐｈｅ　　　　　　　１
６　　　　　　１６Ｈｉ　ｓ　　　　　　　１４　　　
　　　１５Ｌｙｓ　　　　　　　２７　　　　　　２８
Ａｒｇ　　　　　　　３３　　　　　　３２値は２回の
測定の平均値であって、配列中のアミノ酸数４８３につ
いて規格化されており、ＣｙｓおよびＴｒｐは除外して
（これらは測定されていない）表わされている。

説明文 第１図　ヌクレオチド配列およびそれを翻訳した、ｔ−
ＰＡのＮＦ２−末端アミノ酸（１〜２６３）および５ｃ
ｕ−ＰＡのＣＯＯＨ−末端アミノ酸（１４４〜４１１）
のそれぞれに対応するアミノ酸配列。

第２図　欠失突然変異誘発に使用される様々なプラスミ
ドおよび発現ベクターの組立ての物理的地図。細い線は
バクテリアの配列であり、白抜きの箱はｔ−ＰＡｃＤＮ
Ａ配列を表し、十の印のついた箱は５ｃｕ−ＰＡ配列で
あり、黒い箱はＳＶ４０の初期プロモーター／エンハン
サ−領域を表し、斜線をひいた箱はワサギ″β−グロビ
ン遺伝子３′−非翻訳領域を示し、ポリアデニル化シグ
ナルを含み、さらに、斑点をつけた箱はマウスＤＨＦＲ
ｃＤＮＡを表す。制限エンドヌクレアーゼ部位は、Ｂ　
：ＢｇｌＩＩ、Ｅ　：　ＥｃｏＲｌ、Ｈ：　Ｈｉｎｄ　
ＩＩＩ％Ｓ　：　５ａｕ３ＡＩ　、　Ｓｓ：５ｓｔＩで
示されている。

開始コドンおよび停止コドンは上に線が引いてあり、−
緒にスプライシングされたアミノ酸残基に対するコドン
は下線を引いたアミノ酸として示しである。下線を引い
たプラスミド部分はＭ１３ｔ−ＰＡ−ｓｃｕ−ＰＡを組
立てるのに使用された制限フラグメントを示し、点線で
示されている部分は発現プラスミドＰＳＶｔ−ＰＡ／ｕ
−ＰＡＤＨＦＲを組立てるのに使用されたフラグメント
を示している。

第３図　プラスミンを用いたｔ−ＰＡ／５ｃｕ−Ｐａの
処理 プラスミン（最終濃度、３０ｎＭ（・）、６０ｎＭ（Ｉ
Ｉ）または９０ｎＭ（蟲））をｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡ
　ハイブリッド（２，０μＭ）に加えた後に生成したウ
ロキナーゼ様アミド溶解活性をＩＵ／智で表した。

第４図　ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡ（Ａ）またはｔ−ＰＡ
／１ｃｕ−ＰＡ（Ｂ）によるプラスミノーゲン活性化の
ラインウェーバ−・パークプロット。

第５図　ｔ　−ＰＡ／　ｔｃｕ−ＰＡ　ハイブリッド（
１，２５ｎＭ）によるプラスミノーゲン活性化に対する
ＣＮＢｒで消化したフィブリノーゲンの効果。

（・）：存在せず、（”）：０．２５μＭおよび（１）
二〇ＮＢｒ ０．５０μＭＡＣ消化したフィブリノーゲン第６図　フ
ィブリン血餅への結合っ 白抜きの印：　ｕ−ＰＡ　ＥＬＩＳＡを用いて測定した
残りの抗原、黒塗りの印：　ｔ−ＰＡＥＬＩＳＡを用い
た測定。

（ｏ）：　５ｃｕ−ＰＡ、（ロ）：ｔｃｕ−ＰＡｉ（Ｉ
Ｉ）：ｔ−ＰＡ；（蟲、ａ）：　ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−Ｐ
Ａ　ハイブリッド；（ｙ、ｖ）：ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−Ｐ
Ａ　ハイブリッド。ｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡに関連する
抗原の濃度はフィブリノーゲンをトロンビンで誘導して
血餅とした後に上清において測定された。

第７図　ヒト血漿に浸した１２５■−フィブリン標識ヒ
ト血漿血餅の溶解。

Ａ：５ｃｕ−ＰＡ；Ｂ：　ｔｃｕ−ＰＡ；Ｃ：　ｔ−Ｐ
Ａ／５ｃｕ−ＰＡ漬Ｄ：　ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡ；Ｅ
：　ｔ−ＰＡｓｃｕ−Ｐ’Ａ（＠　：８　；マ：１６；
ム：２４；・：３２；来＝４８逼番：　６４　Ｉ　Ｕ／
ｍＱ） ｔｃｕ　Ｐ　Ａ　（”　：　５　；マ：１０暮ム：２０
；・：３０；米：４０ＩＵ／＋ｎＱ） ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡ　（■：３；マ：６；ム：９；
・：１２：米：１８；◆：　２４　Ｉ　Ｕ／ｍ１） ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡ（−：５；マフ１０；ム：１５
ｉ＠：２０ＩＵ／［ｎｆｆ１） ｔ　−ＰＡ（ｓ　：　２　；マ：　４　；　ｈ　：　８
　；　＊　：１６　Ｉ　Ｕ／ｍＱ　）第８図　プラスミ
ノーゲン活性化物質を血漿と共にあらかじめインキュベ
ーションすることが血栓溶解性に及ぼす影響。

Ａ：　５ｃｕ−ＰＡ；Ｂ：　ｔｃｕ−ＰＡ；Ｃ：　ｔ−
ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡ；Ｄ：　ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡ ｓｃｕ−ＰＡ（”：０　；マ：１６；・：３２；米：４
８；◆：６４Ｉ　Ｕ／ｒｄ　） ｔｃｕ−ＰＡ（マ：１０；＾：２０；・：３０；米：４
０ＩＵ／＋ｒｃＭ）ｔ−ＰＡ／５ｃｕ−Ｆ’Ａ（＠：Ｏ
；’：６；Ａ：９；・：１２；米：１８ＩＵ／ｄ） ｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡ（−：５ｉマ：ｒｏ、ム：１５
；・：２０ＩＵ／ｄ）

【図面の簡単な説明】

第１ａ、１ｂおよびＩＣ図はｔ−ＰＡ／５ｃｕＰＡハイ
ブリッドをコードしているヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列、第２図は本発明の発現ベクターおよびその組
立てに用いられるプラスミドの物理的地図、第３図はｔ
−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡハイブリッドのウロキナーゼ様ア
ミド溶解活性へのプラスミンの影響を示すグラフ、第４
ａおよび４ｂ図はそれぞれｔ−ＰＡ／５ｃｕ−ＰＡ（Ａ
）またはｔ−ＰＡ／１ｃｕ−ＰＡ（Ｂ）によるプラスミ
ノーゲン活性化作用のラインワエーバー・パークプロッ
トを示すグラフ、第５図はｔ−ＰＡ／ｌｃｕハイブリッ
ドによるプラスミノーゲン活性化に対するＣ　Ｎ　Ｂ　
ｒ消化フィブリノーゲンの影響を示すグラフ、第６図は
フィブリン血餅への結合状態を示すグラフ、第７図はヒ
ト血漿に浸した、　　■標識ヒト血漿血餅の溶解状態を
示すグラフ、第８図はプラスミノーゲン活性化物質をあ
らかじめ血漿とインキュベーションすることと、血栓溶
解性との関係を示すグラフである。 特許出願人　　　　　リュー−バーン・リサ→・アンド
・デベロップメント・り一°°ゼ・−ット・ワエー（外
１名） 代　理　人　　　弁七青　山　葆（外１名）ＦＩＧ、　
３ Ｂ　　　　　　　　　　　　　（ｍ団）ＦＩＧ　　５ ’　　（ｍ＋ｎｌ ＦＩＧ、　ｔ。 ＦＩＧ、４ｂ Ｆ　　　ｊｕＭ−’１

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト組織型プラスミノーゲン活性化物質のフラグ
   メントおよびヒトのウロキナーゼ型プラスミノーゲン活
   性化物質のフラグメントをコードしている融合ｃＤＮＡ
   の発現によつて得られるプラスミノーゲン活性化物質で
   あつて、ｔ−ＰＡのフイブリン親和性と単鎖の形のウロ
   キナーゼ型プラスミノーゲン活性化物質のフイブリン特
   異性および／または二本鎖の形のウロキナーゼ型プラス
   ミノーゲン活性化物質の酵素活性を組合せたことを特徴
   とするプラスミノーゲン活性化物質。
2. （２）血漿環境中にて血餅溶解の改良されたフイブリン
   特異性を有する第１項に記載のプラスミノーゲン活性化
   物質。
3. （３）組織型プラスミノーゲン活性化物質の少なくとも
   ＮＨ＿２−末端領域の部分と、単鎖の形のウロキナーゼ
   型プラスミノーゲン活性化物質の少なくともＣＯＯＨ−
   末端領域の部分とを融合して得られたハイブリツド分子
   である第１項または第２項に記載のプラスミノーゲン活
   性化物質。
4. （４）組織型プラスミノーゲン活性化物質のＮＨ＿２−
   末端アミノ酸１〜２６３を単鎖の形のウロキナーゼ型プ
   ラスミノーゲン活性化物質のＣＯＯＨ−末端アミノ酸１
   ４４〜４１１と融合した第３項記載のプラスミノーゲン
   活性化物質。
5. （５）第１図に示されたペプチド鎖を有する第４項記載
   のプラスミノーゲン活性化物質。
6. （６）改良されたフイブリン特異性を有する翻訳産物を
   生成する暗合配列を含んでいる組換えＤＮＡ分子。
7. （７）組織型プラスミノーゲン活性化物質の少なくとも
   ＮＨ＿２−末端領域の部分と単鎖の形のウロキナーゼ型
   プラスミノーゲン活性化物質の少なくともＣＯＯＨ−末
   端領域の部分とをフレーム中で融合した暗号配列を含み
   、改良されたフイブリン特異性を有する翻訳産物を生成
   する第６項に記載の組換えＤＮＡ分子。
8. （８）組織型プラスミノーゲン活性化物質のＮＨ＿２−
   末端アミノ酸１〜２６３とフレーム内で融合した単鎖の
   形のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化物質のＣＯ
   ＯＨ−末端アミノ酸１４４〜４１１をコードしている第
   ７項記載の組換え分子。
9. （９）第１図に示したヌクレオチド配列を含んでいる第
   ７項記載の組換えＤＮＡ分子。
10. （１０）第６〜第９項のいずれかに記載のＤＮＡ配列を
    含んでいる哺乳類発現ベクター。
11. （１１）第１０項記載の組換えＤＮＡ分子を含んでいる
    、トランスフエクシヨンされた哺乳動物セルライン。
12. （１２）第１１項記載のセルラインの細胞抽出液または
    細胞培養液からプラスミノーゲン活性化物質を得る、第
    １項〜５項のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化
    物質を製造する方法。
13. （１３）亜鉛キレートセフアロース、リジン−セフアロ
    ース、ＳＰ−セフアデツクス、ゲルろ過ベンズアミジン
    −セフアロース、組織型プラスミノーゲン活性化物質に
    対して又はウロキナーゼ型活性化物質に対して惹起させ
    た不溶化ポリクローナルまたはモノクローナル抗体また
    はそれらの組合せ物を用いたクロマトグラフイーによつ
    て該培養液または該抽出物からプラスミノーゲン活性化
    物質を単離する第１２項に記載の方法。
14. （１４）活性治療物質として用いられる、第１項〜第５
    項のいずれかに記載の融合ｃＤＮＡの発現によつて得ら
    れる物質。
15. （１５）血栓溶解活性物質として用いられる第１項〜第
    ５項のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化物質。
16. （１６）第１項〜第５項のいずれかに記載の融合ｃＤＮ
    Ａを発現して得られた物質と医薬上許容され得る賦形剤
    とを含んで成る医薬組成物。
17. （１７）第１項〜第５項のいずれかに記載のプラスミノ
    ーゲン活性化物質と医薬上許容され得る不活性な賦形剤
    とを含んで成る血栓溶解活性を有する医薬組成物。
18. （１８）第１６項記載の医薬組成物を含んでいる静脈注
    入用液剤の形の第１７項に記載の血栓塞栓症治療剤。