JPS63157978A - 動物細胞を培養する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、少なくとも１つのホース状膜を含有するモジ
ュール中に、細胞が、少なくとも１つのホース状膜外空
隙中で水性培地中に存在し、少なくとも１つのホース状
膜の内部を通して細胞に栄養物の供給および代謝物の排
出が行なわれる、動物細胞を増殖および／または細胞か
ら所望の有価物を製出するために動物細胞を培養する方
法およびこれに適した装置に関する。

従来の技術 かかる方法は、英国４ＩＦｆ第１３９５２９１号明細書
から既に公知である。この明細誉は、手透過性毛管膜で
動物細胞ｌ培養し、該膜を通して細胞に栄養物および酸
素の供給および代謝物の排出が行なわれる方法ｙ１′記
載している。

この公知方法では、毛管膜が極めて迅速に細胞によシ完
全に櫟われる。その理由は細胞が膜赤面に付着し、それ
とともに直接氷面に付着している細胞の過剰供給および
不足供給、および毛管外空隙中に含有されているその他
の細胞の不良排出を惹起し、これにより培養に利用され
る毛管外空隙はほとんど有効に利用することができない
からである。

他の方法は、たとえは欧州特許出願公開第１５５２３７
号明細書または欧州特計出願公開第１３４８１３号明細
簀に記載されている。

発明Ｙ達成するための手段 は間接に、架橋物質を介して相互作用が行なわれ、毛管
外壁陣中で細胞はもはや自由に動けな互作用後の細胞の
明白な形態学または庄理学的変化（たとえば平坦化およ
び細胞伸張によシ付ｙ＃を必要とする細胞の場合のよう
に）に依存していてはならない。

本発明の範囲内では、貫通する中空室および任意の（つ
まりたとえは円形、楕円形または非対称の）横断面を有
する腺をホース状膜と呼称する。

本発明の範囲内では、ホース状膜の特殊な実施態様とし
ての毛管膜は、１５０〜３５００μｍの外径ならびに５
〜１０００μｍの範囲内の大体において均一な壁厚を有
する大体において環形の横断面を壱する〇 本発明のａ題は、動物細胞懸濁液から、利用しうる毛管
外モジュール空隙の十分な利用下に、付着の必要な細胞
および／または付着の必要のない細胞を培養し、増殖す
ることができ、ならびに細胞から所望の作用物質も製出
しうる方法を提供することである。

意外にも、毛管膜がよこ糸であり、織物糸がたて糸であ
る織物、編物等を使用する場合、殊に接種相中および後
に、細胞はたて糸に付着するので、毛管表面は細胞で覆
われないままで、妨げられない物質交換に利用されるこ
とが判明した。従って、たて糸は細胞の支持材料として
動く。こｆ′Ｌｒａ、殊に、よこ糸の間隔がよこ糸の直
径の０．５〜３倍である場合に百える。たて糸の間隔は
、とくにたて糸の直径の最低１．０倍および最高１００
倍であるべきである。よこ糸の迩径対たて糸の口径の有
利な比は、０．４〜２．０の間の範囲内である。

細胞の型により、細胞に有利に特定の電合体、たとえば
けん化アセチルセルロース、飽和ポリエステルおよび／
またはコポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリルニ
トリル、芳香族ポリアミド、ならびにケイ酸および炭素
に付着する。

細胞の支持材料を細胞型の付着に適合させるのは、細胞
の支持材料の糸ｌ被覆することによって達成される。被
覆物質としては、たとえば亜美化酵液が挙げられ、とく
に糸ｔポリウレタンで被覆する。

被覆に、たとえはフィブロネクチンまたはコラーダンの
ような生物学的物ＩＪｉ！Ｙ用いて実施することもでき
る。

膜材料の選択に］Ｌ賛なのは、培養基および一般的代謝
物の組成である。膜は該材料に灼して僅かな拡散抵抗ｙ
ａ１′形成丁べきでめり、これに反してたとえばモノク
ローナルな抗体または代謝物のような産生物に対する拡
散抵抗は高くなけれはならない。培養基は一般に低分子
物質として塩、ビタミン、炭水化物およびアミノ酸なら
びに血清ないしは代用血清ｌ含有する。

殊に再生セルロース（殊に銅アンモニア＃欲から再生さ
れたもの）からなる腺か昧セられた要求ン満たす。かか
る腺は、蒸気故国可能でもあり、これにより栄養物およ
び代謝物に対するａ過性は、腺Ｙ滅菌の間およびその彼
に湿った状態に保ては、損なわれることもない。蒸気滅
菌は、かかる系に普通に利用される酸化エチレン滅菌に
比して、モジュールを故国後にガス抜きする必要がなく
かつモジュール中に有毒残留物が期待されないという利
点Ｙ有する。

殊に、培養基中の高分子物質の含分によるかまたは代謝
物の場合に高い透過性が必要であるときには、倣孔性合
成夏合体からなる腺も有利に使用される。これらの腺に
おける最大平均孔径は、とくに０．０５〜０．２μｍ′
″Ｃあり、この場合平均孔径はマーシャル・ノルツアー
法（ＭＡＲ８ＨＡＬＬ　、　　Ｊ、　Ｃ，、ＭＥＬＴＺ
ＥＲ，’Ｉ’、　Ｈ，。

’　Ｂｕｌｌ、　ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　ＤｒｕｇＡ８
８００．、　　”第３０巻、第２１４頁（１９７６年）
〕を用いて測定される。かかる腺に動物細胞乞フィルタ
ーのように保持する。さらに、かかる膜は良好なガス透
過性をも七するので、かかる膜によって細胞の酸素供給
乞行なうこともできる。酸素供給を改良するために、セ
ルロース毛管糸のほかに同時に、大体において酸素供給
に役立つ他の膜毛管糸を使用することもできる。このた
めには、微孔性合成膜のほかに、たとえはシリコーン毛
管膜のような典型的なガス膜も適当である。従って、本
発明の特別な１実施態様においては、異なる型の腺毛管
糸を交互配置で含有する織物または編物が有利である。

一般に、織物または織物は巻き上けてモジュールケーシ
ング中へ入れ、端部にポリウレタンを流体密に鋳型する
。この場合、出来上ったモジュール中に、毛管膜は大体
において互いにかつケーシング軸に対して平行である。

織物または編＠ハた１こんでモジュール中に入れ、医い
て同様にポリウレタンな密封のため鋳型することもでき
る。もう１つの方法は、長方形の化ジュールゲージング
を使用し、この中へ織物または編物からなる層を入れ、
同様に端面仙」でたとえはポリウレタンを流体密に鋳型
することである。

好ましくは、織物層の間へスペーサを挿入する。

このスペーサは、織物、１ｉｉｉ　？ｆＪ　％糸群、フ
リース、ポリウレタン被檄小球、繊維またはフオーム層
ケーシングにおける分離継ぎ目全体ン流体密に注屋密制
することによって、モジュールが蒸気滅菌可能でありか
つ蒸気滅菌の際に流体密のままであるという有利な性質
が住じる。適当な滅菌方法（たとえば西ドイツ国特許第
２８１１５５１号明細誉から公知のような）を使用する
ことによって、有効な細胞培養にとり重要な長時間の滅
菌状態を簡単に証明できる。

既に上述したように、動物細胞は特定の形成物に異なる
強さで付着し、この場合これにはなかんずく形成物の化
学組成および／または構造が決定的でおる。被覆によっ
て、細胞の付活性を１１Ｉｌｉ１ｍすることができる。

その化学組成および／またはその構造および／またはそ
の被覆に基づき細胞の付着に対し良好な適性を示す形成
物は、細胞に対する支持材料でおり、この場合形成物に
堆積物、織物、編物、フリース、小球、繊維もしくに糸
群または発泡材料からなっていてもよい。それで、本発
明の有利な実施態様は、スペーサが細胞の支持材料であ
ってもよいことから明らかである。それとともに、改良
された供給に基づき細胞が有利に付着しかつ成長する定
義された間隔も規定されている。

増殖および／筐たは細胞からの所望の有価物の製出のた
め動物細胞を有効に培養するには、栄養物の良好な供給
が必歎である。これを確実にするため、本発明方法では
とくに制御・コントロールユニットを用いて供給および
／または排出を監視する。

汚染安全な試料採取のために、三路弁の形の装置を使用
し、ｌ弁を２つの連続する試料採取実施しかつ制御・コ
ントロールユニットによって監視される全システム中へ
組込むことができる。

上述した方法は、有利に動物および人間の細胞（遺伝学
的変異細胞およびハイブリドーマ細胞を含む）に適用さ
れるが、植物および微住物細胞（バクテリアおよび糸状
菌）の培養にも適当である。

本発明方法の実施のためには、ホース状膜が化ジュール
構造形式に、大体において互いに平行でかつ大体におい
て直線状に配置されており、その端部が管端板に支持さ
れており、本発明によりホース状膜の間にセルの支持材
′ＩＰ＋が配置されており、毛管膜および細胞の支持材
料がマット状に配置されており、毛管膜がマットのよこ
糸であり、細胞の支持材料がマットのたて糸であｐ１マ
ットか膜束に巻上げられていて、膜束がケーシング中に
配置されてお９１ケーシングのすべての分離継ぎ目が外
方へ流体密にポリウレタンで密封されている装置が過当
である。

本発明を略示した図面につき若干の実施例で詳述する。

第１図は、ホース状［１および細胞の支持材料２ン刹す
る堆積物としての平面形成物の構造図示す。

第２図には、織物としての平面形成物を示し、この場合
ホース状膜１はよこ糸を形成し、細胞の支持材料２はた
て糸を形成する。

第６図に、ホース状膜１および細胞の支持材料２が網目
を有して結合されている編物の形の平面形成物を示す〇 第４１ＷＵ、モジュール中へ組み込０ために使用される
ような、巻上げられた形のマットとしての平面形成物を
示す。この場合、よこ糸としてホース状膜を有し、たて
糸として支持材料を有する有利な実施例では、巻上げら
れた状態でホース状膜が曲は応カケ受けていないエント
レスマットの簡単な製造か可能であることは明らかであ
る。それとともに、膜材料として、曲げ応力を全くまた
は僅かしか吸収しえないような物質も適当である。

第５図に、ホース状膜１ならびに細胞の支持材料２が交
互に配置されよこ糸として構成されている平面形成物を
示す。それとともに、マット中の細胞の支持材料として
、曲げ応力を全くまたは僅かしか吸収しえないような物
質の使用も可能である。この場合、たて糸は、原則的に
たて糸材料として使用するのに適当である限υ、任意の
他の材料からなっていてもよい。

第６図は、大体において塊状横断面ン有しないホース状
膜１を示し、該腺は細胞の支持材料２とともに平面形成
物に加工されている。例として、平らにされた円形横断
面を有するホース状膜が図示されているか、同様に他の
任意の、非対称または不規則な横断面形も使用できる。

さらに、本発明を下記の実施例につき詳述する。

支持材料を有する毛管膜モジュールとして、ヤユプ。７
ア：／（。ＵＰＲＯＰ□Ａえ■）中を糸および炭素繊維
〔テナツクス（’Ｉ’ＥＮＡＸ［Ｆ］）〕約３６００本
を備えたモジュールを使用した。この化ジュールを用い
て得られた結果を、約１３００本のキュプロファン中空
糸を含有し、他に一致するモジュールを使用した対照実
験の結果と比較した。

Ｘｉのモジュールは、内径１４ｍｍ、有効長さ約１５０
罰のシリンダ状実験用モジュールであり、モジュールケ
ーシングに適当な接続Ｓを儒えていた。充填度はそれぞ
れ約３０％であった。

従って、約１６ｒＩＬｌの毛管性容積が生じた。

モジュール製造には、キュプロファンＱ’１ｌｌ（制御
モジュール用）ないしはキュプロファン中空糸と交互配
置の炭素繊維（支持材料モジュール用）とを適当なたて
糸を用いて結合してマツ）Ｙつクク、をいて束にしてモ
ジュールケー隙 シングに入れた。毛管外空預（ＥＫＲ）ン毛管内ｓ（Ｉ
ＫＲ）に対して密到するのにモジュール端ｓｔボリウレ
タ／で注型することによって行なった。

双方のモジュール’ｋ、Ｌ９２９細胞〔マウス線維芽細
胞の細胞（ＭＮｕｓ　−ＦｉｂｒＯｔ）ｌａ８ｔｅｎ　
−ｚｅｌｌｉｎｉθ）〕の培養のために使用した。

細胞はモジュールの毛管外２ｚ中で培養した初期細胞密
度は、それぞれＩ　Ｘ　１０６細胞／１であった。ＥＫ
Ｒ中で培地として、アールの塩（ｇａｒ１ｅ’ａ　−８
ａｌｚｅ　）を有する最小重要培地イーグル（変性）　
（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用した
が、その炭酸水素す）　ＩＪウム濃度は２．２ｇ／ノで
ありかつこれに非１要アミノａｌ（ＦＩＯＷＩ、ａｂｏ
ｒａｔｏｒ１ｅｓ社、４１６−８１０の１００倍濃縮液
）１チおよび胎児の子牛血清１０チン添加する。

培養の間、培地（ＥＫＲに対するような組成、しかし血
清添加なし）１．５〜１．３１ン、１００ｍ　／　ｍｉ
Ｈの流量で、モジュールの毛管内を所を通して循環路で
ボンデによシ圧送した。この場合、この培地（ＩＫＲ培
地〕の酸素含量、温度、−価ン、ガス混合システムを有
する醗酵装置バイオスタラ）　（ＢＩＯＢＴＡＴ■）Ｍ
Ｙ用いて適当な価（６７℃、ＰＨ７，２、ｐｏ２９９チ
空気飽和）に、できるだけ一定に保った。

双方のモジュール運転の場合、ＩＫＲ媒地ｔそれぞれ６
日、１２日および２０日に完全に新しい培地と交換し、
支持材料を有するモジュールでは強い代謝活性（下記参
照）に応じてさらになお１６日、２３日および２６日に
新しい培地と交換した。

培養期間は４週間であった。

細胞成長を追跡するために、適当な時間間隔で試料’ｌ
ｉｌ　ＩＫＲ循環路およびＥＫＲから取９出し、その中
のグルコース、乳酸塩およびアンモニウム含量を測定し
た。

培ｖＩヲ中断した場合、支持材料モジュールのＩＫＲお
よびＥＫＲ’Ｙからになるまで吸引し、モジュールを両
端で密封個所を鋸引きして開き、キュプロファン中空糸
と炭素繊維からなるマットＹ引出し、顕微鏡で横置する
ことができた。

２、結果 第１表に、培養の間の槓々の時点に対する、それまでに
それぞれ消費された全グルコース量ならひに乳酸塩ない
しはアンモニウムの全産庄菫が記載されている。

２８日培養後に、叉持材料Ｙ七するモジュールの場合、
対照実験と比較した。

−　グルコースの全消費量は十分に９倍高い（２５４■
に灼して２３１５〜）、 −乳酸塩の全産庄童は十分に６倍大きい（２０３■に灼
して１２８０〜）および−アンモニウムの全遊離１１ニ
僅かに高い（７，１ミリモルに対して１０．９ミリモル
）。

２８日の対照実験で得られた最終値には、支持材料モジ
ュールの場合、既に −　約９日（グルコース） −１５日と２０日の関（乳酸塩）ないしに−２０日（ア
ンモニウム）に 到達した。

２６日から２８日までの期間に、支持材料モジュール中
で対照実験と比較したニ ー　グルコース消費ｔに十分に１５倍高い（１４ｑ／ｄ
ａｙに対して２１３ｑ／ａａ７　）、−乳酸塩産庄量は
十分に８倍高い（１６ｍ９／ｄａｙに対して１３７１ｎ
９／ａａｙ　）および−アンモニウム産午ｉ１ｔは十分
に６倍高いＬ　Ｏ，１６ミリモｙｐ　／　ｅＬ”Ｉ　Ｋ
　灼Ｌ　テ０−５４ミリモル／ａａｙ）。

従って全部で、支持材料を有するモジュール中で（対照
実験と比軟して）著しく高い物置交換活性が得られたか
、これは明らかに大きい細胞密度を推測させる。

支持材料モジュールから取り出したマットの光字顕微鏡
による評価の際、細胞の王＊ｓ（見積ｐで９０チより多
い）か炭素繊維に付着しており、キュプロファン中空糸
は完全に細胞を有していないことが確認された。

キュプロファンおよびテナックスに工ｙ力社の登録商椋
である。

モジュール１：支持材料なしの毛！腺モジュール（キュ
プロファン−０１−中 空糸装（１！１） モジュール２：支持材料を有する毛官展モジュール（キ
ュプロファン−ＣＩ− 中空糸および炭素繊維）

【図面の簡単な説明】

飾付図面は、本発明で使用されるモジュールを形成する
平面形成物の実施例を略本するもので、第１図に堆積物
として形成された平面形成物の斜視図であり、第２図は
練物として形成された平面形成物の斜視図であり、第３
図は１！物として形成された平面形成物の斜視図であｐ
５第４図は巻上げられた平面形成物の斜視図であり、第
５図は腺および支持材料の交互配置を有する平面形成物
の斜視図であり、第６図は換逅円形断面を有しない平面
形成物の刷視図である。 １・・・ホース状膜、２・・・細胞の支持材料第１医　
　　　　　第２図 第６図 ２・−細胞の支持肪

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも１つのホース状膜を含有するモジュール
   中で細胞が少なくとも１つのホース状膜外空隙中で水性
   培地中に存在し、少なくとも１つのホース状膜の内部を
   通して細胞への栄養物の供給および代謝物の排出が行な
   われる、動物細胞を増殖および／または細胞からの所望
   有価物の製出のために動物細胞を培養する方法において
   、少なくとも１つのホース状膜外空隙中に細胞の支持材
   料が配置されていて、それに細胞が付着するモジュール
   を使用することを特徴とする動物細胞を培養する方法。 ２、ホース状膜が毛管膜として構成されている、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ６、細胞の支持材料がけん化アセチルセルロースからな
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、細胞の支持材料が繊維形成性飽和ポリエステルおよ
   び／またはコポリエステルからなる、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ５、細胞の支持材料が繊維形成性ポリウレタンからなる
   、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、細胞の支持材料が繊維形成性ポリアクリルニトリル
   からなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、細胞の支持材料が芳香族ポリアミドからなる、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ８、細胞の支持材料がケイ酸からなる、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ９、細胞の支持材料が炭素からなる、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 １０、細胞の支持材料が繊維および／またはフィラメン
   トから構成されている、特許請求の範囲第６項から第９
   項までのいずれか１項記載の方法。 １１、繊維および／またはフィラメントを糸状で使用す
   る、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、細胞の支持材料が被覆された織物糸からなる、特
   許請求の範囲第３項から第１１項までのいずれか１項記
   載の方法。 １３、細胞の支持材料がポリウレタン被覆された織物糸
   からなる、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、細胞の支持材料が生物学的物質で被覆された織物
   糸からなる、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １５、細胞の支持材料が交互配置の異なる型の糸で構成
   されている、特許請求の範囲第３項から第１４項までの
   いずれか１項記載の方法。 １６、ホース状膜が再生セルロースからなる、特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。 １７、ホース状膜が微孔性合成重合体からなる、特許請
   求の範囲第１項または第２項記載の方法。 １８、最大孔径が０．０５〜０．２μｍである、特許請
   求の範囲第１７項記載の方法。 １９、供給および排出のため異なる型の膜を使用する、
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ２０、ホース状膜および細胞の支持材料が一緒に少なく
   とも１つの平面構成物を形成する、特許請求の範囲第１
   項から第１９項のいずれか１項記載の方法。 ２１、平面構成物が堆積物、織物、編物またはサージ製
   品として構成されている、特許請求の範囲第２０項記載
   の方法。 ２２、ホース状膜が細胞のよこ糸を形成し、細胞の支持
   材料がたて糸を形成する、特許請求の範囲第２１項記載
   の方法。 ２３、ホース状膜および細胞の支持材料を形成する糸が
   、大体において互いに平行かつ場合により周期的配置で
   よこ糸として配置されている、特許請求の範囲第２１項
   記載の方法。 ２４、ホース状膜および細胞の支持材料を形成する糸の
   第１部分が、大体において互いに平行かつ場合により周
   期的配置でよこ糸として配置され、ならびに細胞の支持
   材料を形成する糸の第２部分がたて糸として配置されて
   いる、特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２５、細胞の支持材料を形成する糸の直径対ホース状膜
   の直径の比が有利に０．４〜２．０の範囲内にある、特
   許請求の範囲第２２項から第 ２４項までのいずれか１項記載の方法。 ２６、よこ糸の相互間距離が有利に膜外径の０．５〜３
   倍である、特許請求の範囲第２２項から第２５項までの
   いずれか１項記載の方法。 ２７、たて糸の相互間距離が有利にたて糸直径の最低１
   ．０倍で最高１００倍である、特許請求の範囲第２２項
   から第２６項までのいすれか１項記載の方法。 ２８、ホース状膜がスペーサによつて定義された相互間
   距離に定められている、特許請求の範囲第１項から第２
   ７項までのいずれか１項記載の方法。 ２９、スペーサが全部または部分的に細胞の支持材料を
   形成する、特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０、平面形成物層の間にスペーサが配置されている、
   特許請求の範囲第２０項から第２９項のいずれか１項記
   載の方法。 ３１、細胞が細胞の支持材料に付着する、特許請求の範
   囲第１項から第３０項までのいずれか１項記載の方法。 ３２、供給および／または排出を制御・コントロールユ
   ニットにより監視する、特許請求の範囲第１項から第３
   １項までのいずれか１項記載の方法。 ３３、ホース状膜がモジュール構造形式で大体において
   互いに平行かつ大体において直線に延びるように配置さ
   れ、その端部が管端板に保持されていて、ホース状膜の
   間に細胞の支持材料が配置されていることを特徴とする
   動物細胞を培養する装置。 ３４、ホース状膜および細胞の支持材料がマット状に配
   置され、かつホース状膜がマットのよこ糸であり、細胞
   の支持材料がマットのたて糸である、特許請求の範囲第
   ３３項記載の装置。 ３５、マットが膜束に巻上げられている、特許請求の範
   囲第３４項記載の装置。 ３６、膜束がケーシング内に配置され、ケーシングにお
   いてすべての分離継ぎ目が外方へ流体密にポリウレタン
   で密封されている、特許請求の範囲第３５項記載の装置
   。