ES2351573B1 - Dispositivo y método para cultivo tridimensional de células adherentes. - Google Patents

Dispositivo y método para cultivo tridimensional de células adherentes. Download PDF

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ES2351573B1 ES200901531A ES200901531A ES2351573B1 ES 2351573 B1 ES2351573 B1 ES 2351573B1 ES 200901531 A ES200901531 A ES 200901531A ES 200901531 A ES200901531 A ES 200901531A ES 2351573 B1 ES2351573 B1 ES 2351573B1
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Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo y método para cultivo tridimensional de células adherentes basado en el uso de soportes filamentosos inmersos en un medio de cultivo.

Description

Dispositivoymétodo para cultivo tridimensionalde células adherentes.
Campo técnico de la invención
La presenteinvenciónse refiereaun dispositivoymétodopara cultivo tridimensionalde células adherentes basado en el uso de soportes filamentosos inmersos en un medio de cultivo.
Estado de la técnica
El cultivo celular es ampliamente empleado en la industria biotecnológica como un método para obtener diferentes productos biológicos producidosporlas célulasytambién comoun métodopara producir célulaspara diferentesaplicaciones, como puede ser la terapia celular. El cultivo celular también es empleado en investigación como un método muy conveniente para estudiar interacciones celulares o el efecto de diferentes sustancias en el metabolismo celular.
En los métodos de cultivo celular, las células pueden ser cultivadas en suspensión o adheridas a una superficie, como es el caso de las células dependientes de anclaje.
Las células dependientes de anclaje se cultivan tradicionalmente como una única capa de células en la superficie interna de recipientes con diferentes formas. Estas superficies se sumergen en un medio de cultivo apropiado, como puedeserelcasodelas botellas rodantesolos frascosdecultivotipo“T”,dondeelmediodecultivose introduceenel interior del recipiente, de manera que baña las paredes donde se realiza el cultivo celular. Este tipo de cultivos son empleados, entre otras cosas, para realizar estudios de eficacia de diversas sustancias sobre el desarrollo de determinados fenómenos celulares como pueden ser la angiogénesis o la metástasis. Sin embargo, el hecho de que el crecimiento en monocapa no reproduzca las condiciones en las que las células se encuentran en la naturaleza, limita la aplicación e interpretación de los resultados obtenidos en dichos estudios.
Otras alternativas emplean soportes particulados con estructura macroporosa para el cultivo celular. Las células crecen en la superficie externa de las partículas y dentro de las cavidades internas, o poros, de las partículas del soporte, las cuales se mantienen en suspensión mediante diferentes modos de agitación.
También es conocido la preparación de los llamados esferoides, preparados de manera artesanal y en los que muchas células crecen juntasensuspensión, adheridas unasaotras, hastael límite impuestoporla fuerzagravitacional que actúa sobre el esferoide en crecimiento que se mantiene en suspensión. Los esferoides son de particular interés en el estudio de cultivos celulares tridimensionales, ya que los esferoides simulan con mayor precisión que los cultivos superficiales las condiciones naturales en las que las células se encuentran en los organismos vivos, donde másque estructurarse en formademonocapas, las células forman estructuras tridimensionalesytejidos.
En la solicitud de patente PCT/EP2006/064483, se describe el cultivo de células en la superficie de microhilos en forma de monocapas. En la descripción de la invención, se describen distintas distribuciones de microhilos adecuadas para llevara caboel objetivode cultivar las células en monocapas enla superficiede los hilos.
De especial interés es el desarrollo de cultivos tridimensionales de células adherentes en el caso de la producción de células terapéuticas, tanto somáticas como troncales,ya que unfactor clave parael éxitode las terapias desarrolladas a partirdela implantaciónde células,es disponerdemétodosde producción con suficiente productividadyqueno afecten al grado de diferenciación de las células cultivadas. En estas aplicaciones, es necesario disponer de métodos de producción de células donde se consiga una elevada productividad, superior a cientos de miles de células por lote, ycon elevada homogeneidad.
Los métodos o dispositivos existentes aplicados al cultivo tridimensional de células adherentes adolecen de los siguientes problemas:
-
En el caso de los recipientes sobre cuya superficie interior crecen las células, estas se ven forzadas a crecer en dos dimensiones hasta que toda la superficie disponible para cultivo ha sido saturada por células, momento en el cual podrían iniciar el crecimiento tridimensional. Sin embargo, las células que están en contacto con la superficie, una vez que son cubiertas por sucesivas capas celulares, ven limitado su acceso a los nutrientes provistos por el medio de cultivo, por lo que crecen en un entorno drásticamente diferente al de las células de las capas superiores del cultivo.
-
En el caso de los soportes particulados macroporosos que se mantienen en suspensión mediante agitación, las células que crecen en la superficie de las partículas están sometidas a un choque continuo contra el resto de partículasen suspensión,porloqueson dañadasporlasfuerzasde fricción. Mientrasquelas célulasque crecen en el interior de los poros, se encuentran sometidas a diferentes micro-ambientes creados en el interior de dichos poros, lo cual implica unas condiciones heterogéneas de cultivo. Además, una vez concluido el cultivo, la recuperación de las células está dificultada por el impedimento estérico, ya que incluso si las células son despegadasdela superficie internadelosporos,lamayoríadeellasquedaatrapadaenelinteriordelaspartículas yno puede ser recuperada.
-
En el caso de los esferoides, aunque tanto el entorno de cultivo como su similitud con un cultivo tridimensional perfecto son adecuadas,elmétodode preparaciónesextremadamente improductivo,ylos tamañosdelos cultivos obtenidos están limitados a pocos cientos o miles de células. Este tamaño máximo tan reducido de los cultivos tridimensionales que se pueden alcanzar con los esferoides es debido a los límites impuestos por la fuerza gravitacional que hace caer a los esferoides que crecen en suspensión.
Para solucionar estos problemas, es necesario encontrarel modode mantener indefinidamente en suspensiónyen un ambientehomogéneo, un cultivo tridimensional, sin someterloa fuerzasde fricción provocadas por choques entre las partículas o turbulencias provocadas por la agitación del medio de cultivo.
Descripción de la invención
La presente invención describe un dispositivoy un método para cultivo tridimensional de células adherentes mediante la aplicación de un medio de cultivo al dispositivo, previamente inoculado el medio de cultivo con células adherentes.
El dispositivocomprendeunoomás soportes filamentosos estáticos dispuestosdemodoquesefavoreceel desarrollo de cultivos tridimensionales. Los soportes filamentosos se encuentran dispuestos de forma paralela en el interior del dispositivopara cultivo celular tridimensionalyfijadosaélpor susextremos.Los soportes filamentosos también pueden estar dispuestos en estructuras de soporte que pueden ser apilablesy que se fijan al dispositivo de cultivo celular tridimensional formando una o más capas de soportes filamentosos.
Los soportes filamentosospueden haber sido sometidosa un tratamientode modificación superficialque afecteal modo en que las células se adhieren a los mismos o al modo en que las células se comportan una vez adheridas.
El dispositivo para cultivo celular tridimensional puede adoptar diferentes geometrías, pudiendo ser de forma cilíndrica o en forma de prisma entre otras.
El método para cultivo celular tridimesional de la presente invención es de aplicación tanto a la producción de célulaso derivadosde estas células, comoala generaciónde cultivos tridimensionalesparael estudiode diferentes aspectos estructurales, metabólicos o de interacción entre diferentes tipos celulares.
El método se inicia con el llenado del dispositivode la presente invención con una suspensión de células adherentes en mediode cultivo.Tras mantener inmóvilel dispositivoypasadoeltiempoenelquelas célulasse adhierenala superficiede los soportes filamentosos, se retirael mediode cultivoyes reemplazado por medio fresco.El reemplazo del medio de cultivo puede ser realizado de forma continua mediante un sistema de filtrado.
La observación de la evolución del cultivo puede ser realizada de forma visual cuando el dispositivo dispone de paredes transparentes o mediante la extracción de los soportes filamentosos cuando su disposición así lo permita.
Por últimoy unavezqueel cultivo tridimensionalha alcanzadoel tamaño deseado,se inducen comportamientos en las células mediante la adición de agentes químicos. En caso necesario, las célulaspueden recuperarse para otros fines mediante tratamiento químico, aplicando enzimas u otros agentes químicos, o mediante tratamientos físicos, que alteren las propiedades de las células adheridasy las desprendan de los soportes filamentosos.A continuación, las células se recuperan como una suspensión celular a través del puerto de recolección.
El desarrollo de cultivos tridimensionales de células adherentes sobre soportes filamentosos estáticos permite imitarconmásprecisiónque con otros sistemas existentesel entornode crecimientodelas célulasylostejidosenla naturaleza, por lo que es una herramienta más útil que los cultivos bidimensionales para i) analizar la interacción entre células del mismoo diferente tipo;ii) estudiarlaevoluciónde enfermedades; iii) producir célulaso;iv) producir modelosexperimentalesdeórganosy organismos.
En el contexto de esta memoria serán de aplicación las siguientes definiciones:
Esferoide:agregadode célulasque formanun cultivohomogéneo con forma esferoidalydiámetro inferiora500 micrómetros. Típicamente un esferoide puede contener un máximo de 25.000 células.
Cultivo tridimensional: agregado de células que se multiplican en varias dimensiones formando capas de células. Adiferencia de la estructura bidimensional de los cultivos de células en monocapa, en los que las células únicamente interaccionan con otras células a través de sus paredes laterales, los cultivos tridimensionales forman estructuras en las que la mayor parte de las células está en contacto con otras células en toda su superficie.
Célula adherente: célula cuyo crecimiento se produce adherida a un sustrato o soporte.
Microhilo: elemento con forma filamentosaycuya sección transversal presenta una distancia máxima entre dos puntos cualesquiera contenidos en dicha sección inferior a 1000 micrómetros.
Soporte: superficie a la que se adhieren las células adherentes.
Estructura de soporte: armazón al que se fijan los extremos de los soportes filamentosos.
Descripción detallada de la invención
El dispositivo para cultivocelular tridimensionaldela presenteinvención consiste en unoo más soportes filamentosos estáticos, preferiblemente microhilos, que se encuentran sujetos al dispositivo que los contiene. Preferiblemente los microhilos se encuentran inmovilizados por ambos extremos a las paredes del dispositivo, conteniendo el dispositivo el medio de cultivo que alimenta a las células durante su crecimiento.
La disposición de los microhilos en el interior del dispositivo para cultivo tridimensional, es tal que microhilos contiguos se encuentran dispuestos de forma paralela, permitiendo el desarrollo de varias capas de células creciendo unas sobre otras sin tocar las células que crecen sobre microhilos contiguos. De forma preferible la distancia entre microhilos contiguos es igual o mayor a 100 micrómetros, o incluso mayor a 300 micrómetros.
Enun modode realizaciónpreferente,losextremosdeunoomás microhilosse encuentran fijadosauna estructura de soporte preferiblemente apilable que se introduce enel dispositivode cultivo tridimensionalyque se fijade forma desmontable al dispositivo de cultivo tridimensional formando al menos una capa de microhilos. De forma preferente, la estructura de soporte es un marco apilable.
En otro modo de realización preferente, el dispositivo puede contener una o más estructuras de soporte apiladas, con uno o más microhilos fijados a cada estructura de soporte formando una o más capas de microhilos. Los microhilos contenidos en las estructurasde soporte pueden disponero node células en su superficie. Las estructurasde soportealasquese fijan unoomás microhilos,se separan entresí mediante unoomás elementos espaciadoresque mantienenla distancia deseada entre las sucesivas estructurasde soporte con unoo más microhilos.De formapreferentelas estructurasde soporte contiguasse disponende formaparalela.De forma opcional,unmismo dispositivo de cultivo celular tridimensionalpuede disponerdevarias estructurasde soporte con unoomás microhilosalosque se adhieren células siendo las células de una estrucutura de soporte de un tipo distinto a las de otra estrucutura de soporte.
Los microhilos contenidos en el dispositivo para el cultivo celular pueden haber sido sometidos a un tratamiento de modificación superficialque afectealmodoenquelas célulasse adhierenalos microhilosoalmodoenquelas células se comportan una vez adheridas.
El dispositivo puede adoptar diferentes geometrías, siendo preferible un dispositivo de forma cilíndrica dispuesto conelfondo circularparaleloalsuelo.Enundispositivoparacultivocelular tridimensionalcongeometría circular,los microhilos se disponen unidos por sus extremos a las paredes del recipiente en el que se realiza el cultivo. En el caso de que uno o más microhilos se dispongan en una o más capas mediante el apilamiento de estructuras de soporte, se dispone cada estructuradesoportede manera perpendicularalejedelcilindro huecoque contieneal mediode cultivo. En otro modo de realización, el dispositivo para cultivo celular tridimensional posee forma de prisma rectangular en el que unoo más microhilos se fijanpor susextremosa las paredes del recipiente enel que se realizael cultivo.Enel caso de que uno o más microhilos se dispongan en una o más capas mediante el apilamiento de estructuras de soporte, se dispone cada estructurade soportede forma horizontalyparalelaal suelo.
El tamaño preferido de los dispositivos para cultivo celular en cualquiera de sus geometrías es de 100 cm en su mayor dimensión, aunque preferiblementeel tamaño máximo esde50 cmo incluso mejor,de2 o incluso1 cm ensu mayor dimensión.
El dispositivo para cultivo celular tridimensional disponede tapas tantoenla parte inferior como enla superior de manera que, junto conlas paredes, formaun recipiente cerrado,impermeable tantoa líquidos comoagases.El dispositivopara cultivo celulartridimensionalpuede disponerde membranasdeun filtroquecomunicael interiory elexterior del recipiente para permitirel intercambiogaseosode manera estéril. Adicionalmente,el dispositivo puede contener filtros para la entradaysalida de medio de cultivoy un puerto de inoculación en la parte superioryotro de recolección en la parte inferior.
El método para cultivo celular tridimensional de la presente invención se inicia tras retirar la tapa del dispositivo, conelllenadocon una suspensióndecélulas adherentesen mediode cultivoylarestitucióndelatapapara cerrarel dispositivo.
Alternativamente, las células pueden ser introducidas en el dispositivo para cultivo celular tridimensional a través de un puerto de inoculación dispuesto en la parte superior del mismo.
Posteriormenteel dispositivoparacultivocelular tridimensionalse mantiene inmóvilparagarantizarquelas células sedimenten sobrela superficiede los soportes filamentososy se adhieran comenzandoa multiplicarse.
Transcurrido el tiempo necesario para que las células ubicadas sobre la superficie de los microhilos se adhieran a estos, se retira el medio de cultivo usadoy es reemplazado por medio fresco. De forma opcional el medio de cultivo puedeserreemplazado continuamentealritmo deseadoatravésdeun sistemade filtradoquepermite introducirmedio de cultivo al interior del sistema mientras se retira el medio de cultivo usado de manera continua. La introducción del medio de cultivo a través del sistema de filtración permite reducir las turbulencias generadas por el recambio del medio.
La evolución del cultivo tridimensional puede ser analizada visualmente mediante observación directa de las célulasen crecimiento sobrelos soportes filamentosenel casodequeel dispositivopara cultivo tridimensional disponga de paredes transparentes. En caso de que los soportes filamentosos estén dispuestos en estructuras de soporte, éstos pueden ser extraídos para proceder a analizar el cultivo tridimensional en otro entorno.
Cuando el cultivo tridimensional ha alcanzado el tamañodeseado, se inducen comportamientos en las células en cultivo mediantela adiciónde agentes químicos. Estos agentes químicos pueden ser introducidosa travésdel puerto de inoculación o bien por la parte superior del dispositivo tras retirar la tapa. Estos comportamientos pueden ser, de manera orientativa aunqueno limitativa,la induccióndela diferenciación celularpara formar tejidosuórganosapartir de las células en cultivo,lainduccióno inhibiciónde tumores,la induccióno inhibiciónde angiogénesis.
En caso necesario, las células pueden recuperarse para otros finesmediante tratamiento químico, aplicando enzimas uotros agentes químicos,o mediante tratamientos físicos,que alterenlas propiedadesdelas células adheridasylas desprendandelossoportes filamentosos.Acontinuación,lascélulasserecuperancomounasuspensióncelularatravés del puertode recoleccióno mediantela succióndela suspensión celularporla parte superiordel dispositivo unavez retirada la tapa.
De formaexplicativay no limitativade describen los siguientes ejemplos:
Ejemplos
1-Preparación de un dispositivo para el desarrollo de cultivos celulares tridimensionales
Microhilo de 30 micrómetros de diámetro formado por un alma metálica rodeada de una cubierta vítrea fue enrollado alrededordeun marco cuadradode acero inoxidablede60mmdeladoy2mmde espesor,dejandoun espaciode600 micrómetros entrecadadosdelas100 vueltasde microhilo.Acontinuación,losextremos libres del microhilo se pegaron al marco metálico empleando un pegamento a base de cianocrilato. Cada marco se colocó sobre cuatro espaciadoresde2mmde alturaenel interiordeun recipientede plástico, con tapa,circular, de 8,5 cm de diámetro con tapa. Sobre el marco así dispuesto se colocó otro marco de iguales características separado del anterior por cuatro espaciadores colocados en las esquinas. Sobre este segundo marco se colocó otro marco separado del anterior del mismo modo. El conjunto de los tres marcos apilados en el interior del recipiente constituye un ejemplo de un dispositivo para la realización de cultivos celulares tridimensionales.
2-Desarrollo de un cultivo celular tridimensional
Una suspensiónde células CHO-K1aunaconcentraciónde 66.000 célulaspor mililitrosevertióenel interiorde un dispositivo para la realización de cultivos celulares tridimensionales que previamente había sido esterilizado mediante inmersiónen etanol.Acontinuación,el dispositivose introdujoenel interiordeun incubadora37ºC, 5% de dióxido de carbonoy95% de humedad. Cada 48 horas, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco. Transcurrida una semana, los cultivos se colocaron en un microscopio y se observó que las células habían crecido en capas sucesivas alrededor de los microhilos hasta generar cultivos tridimensionales de forma cilíndricay un diámetroaproximadode 500 micrómetros.
3-Combinación de distintos tipos celulares
Una suspensiónde células CHO-K1aunaconcentraciónde 66.000 célulaspor mililitrosevertióenel interiorde un dispositivo para la realización de cultivos celulares tridimensionales que previamente había sido esterilizado mediante inmersión en etanol. En otro dispositivo de las mismas características se vertió del mismo modo una suspensión celularde células HEK293 fluorescentes a una concentracióndede 60.000 célulaspor mililitro. A continuación, ambos dispositivos se introdujeron en el interior de un incubador a 37ºC, 5% de dióxido de carbonoy95% de humedad. Cada 48 horas, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco. Al cabo de dos díasy empleando los marcos contenidos en los dispositivos en cultivo, se produjo un nuevo dispositivo alternando capas de marcos con células HEK293 fluorescentesycélulas CHO-K1y se continuó el cultivo del mismo modo.Al cabode una semanade cultivo se observóla interacción ocurrida entre las células CHO-K1y las células HEK293 fluorescentes que interactuaban en el cultivo tridimensional.
4-Transfección de un cultivo tridimensional
Una solución del plásmido pCMV/EGFP, que expresa la proteína verde fluorescente, mezclada con lipofectamina, fue introducida en el interior de un dispositivo parala realización de cultivos celulares tridimensionales que contenía un cultivo tridimensional de células CHO-K1. Al cabo de 24 horas se observo la señal fluorescente emitida por la proteína verde fluorescente expresada en el interior de las células que habían sido transfectadas.
5-Estructura de soporte circular en pocillos de placa multipocillos
Microhilo de 30 micrómetros de diámetro formado por un alma metálica rodeada de una cubierta vítrea fue enrollado alrededor de marcos cilíndricos de plástico de 35 mm de diámetroy1 mm de espesor, dejando un espaciode600micrómetros entre cadadosdelas100 vueltasde microhilo.Acontinuación,losextremoslibres del microhilo se pegaron a los respectivos marcos circulares empleando un pegamento a base de cianocrilato. Cinco marcos así preparados se colocaron uno sobre otro separados por una arandela de plástico de 35 mm de diámetroy0,1mmde espesorenel interiordeunpocillodeunaplaca multipocilloquedisponíade6pocillos.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Dispositivo para cultivo tridimensional de células adherentes que comprende uno o más soportes filamentosos, caracterizado porque la disposición de dichos soportes filamentosos contiguos es de forma paralela.
  2. 2.
    Dispositivo según la reivindicación 1 caracterizado porque la distancia entre dichos soportes filamentosos contiguos es de al menos 50 micrómetros.
  3. 3.
    Dispositivo según la reivindicación1 caracterizado porque dichos soportes filamentosos tienen undiámetro máximo de 1000 micrómetros.
  4. 4.
    Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque los extremos de dichos soportes filamentosos están inmovilizados por sus extremos a las paredes de dicho dispositivo.
  5. 5.
    Dispositivosegún cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque dichos soportes filamentos se disponen en al menos una estructura de soporte que se fija a dicho dispositivo de cultivo celular.
  6. 6. Dispositivo según reivindicación5 caracterizado porque dichas estructurasde soporte son apilables.
  7. 7.Dispositivo según reivindicación6 caracterizado porque dichas estructuras de soporte se separan por al menos un elemento separador.
  8. 8. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende membranas filtrantes que permitenla entradaysalidade mediode cultivo estérilde manera continua.
  9. 9. Método para cultivo tridimensional de células adherentes caracterizado porque: a) se llena un dispositivo de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones anteriores con una sus
    pensión de células adherentes en medio de cultivo. c) se reemplaza el medio de cultivo agotado por las células por medio fresco. d) se analizan las células en crecimiento sobre los soportes filamentosos. e) se inducen comportamientos en las células en cultivo. f) se recuperan las células delcultivo tridimensional. g) se extrae la suspensión celular para su posterior uso en otras aplicaciones.
  10. 10.
    Método paracultivo tridimensionalde células adherentes según reivindicación9 caracterizado porque dicho análisis de las células en crecimiento sobre dichos soportes filamentosos se realiza de forma visual.
  11. 11.
    Método paracultivo tridimensionalde células adherentes según reivindicación9 caracterizado porque dicho análisis se realiza mediante la extracción de dichas estructuras de soporte que contienen dichos soportes filamentosos.
  12. 12.
    Método para cultivo tridimensional de células adherentes según reivindicación9 caracterizado porque dicha inducción de comportamientos se realiza mediante la adicción de agentes químicos.
  13. 13.
    Método para cultivo tridimensional de células adherentes según reivindicación9 caracterizado porque dicha inducción de comportamientos se realiza mediante la combinación de estructuras de soporte con células de distinto tipo en un mismo dispositivo.
  14. 14.
    Método para cultivo tridimensional de células adherentes según reivindicación9 caracterizado porque dicha recuperación se realiza mediante tratamiento químico, enzimático o físico.
    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS
    N.º solicitud:200901531
    ESPAÑA
    Fecha de presentación de la solicitud: 26.06.2009
    Fecha de prioridad:
    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
    51 Int. Cl. : C12M 3/00 (01.01.2006) C12N 5/00 (01.01.2006)
    DOCUMENTOS RELEVANTES
    Categoría
    Documentos citados Reivindicaciones afectadas
    X
    WO 2007012605 A2 (DRO BIOSYSTEMS SL) 01.02.2007 1-14
    X
    ES 1067871 U (DRO BIOSYSTEMS S L) 01.07.2008 1-14
    X
    EP 1333086 A1 (NISSHO KK et al.) 06.08.2003 1-14
    X
    DRO BIOSYSTEMS SL: -Static Support Bed(Concept, Features &amp; Advantages) 2006 [recuperado el 15.10.2010]. Recuperado de Internet: <URL:http://www.dro.es/ssb/concept.htm> 1-14
    A
    DONALD I W: &quot;Production, Properties and Applications of Microwire and Related Products&quot; J. of Materials Sci., (1987), vol. 22, pp.: 2661-2679, ISSN 0022-2461.
    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:
    Fecha de realización del informe 11.01.2011
    Examinador A. Maquedano Herrero Página 1/4
    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
    Nº de solicitud:200901531
    Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12M, C12N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de
    búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS
    Informe del Estado de la Técnica Página 2/4
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud:200901531
    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 11.01.2011
    Declaración
    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
    Reivindicaciones 9-14 SI
    Reivindicaciones
    1-8 NO
    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
    Reivindicaciones SI
    Reivindicaciones
    1-14 NO
    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).
    Base de la Opinión.-
    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.
    Informe del Estado de la Técnica Página 3/4
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud:200901531
    1. Documentos considerados.-
    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.
    Documento
    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
    D01
    WO 2007012605 A2 (DRO BIOSYSTEMS SL) 01.02.2007
    D02
    ES 1067871 U (DRO BIOSYSTEMS S L) 01.07.2008
    D03
    EP 1333086 A1 (NISSHO KK et al.) 06.08.2003
    D04
    DRO BIOSYSTEMS SL: -Static Support Bed-(Concept, Features &amp; Advantages) 2006 [recuperado el 15.10.2010]. Recuperado de Internet: <URL:http://www.dro.es/ssb/concept.htm>
    D05
    DONALD I W: &quot;Production, Properties and Applications of Microwire and Related Products&quot; J. of Materials Sci., (1987), vol. 22, pp.: 2661-2679, ISSN 0022-2461.
  15. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración
    La solicitud reivindica un dispositivo para cultivo tridimensional de células adherentes que comprende uno o más soportes filamentosos contiguos dispuestos de forma paralela. Los extremos de los soportes filamentosos se encuentran inmovilizados mediante unión a las paredes del dispositivo. Las estructuras de soporte son apilables y los dispositivos comprenden membranas filtrantes que permiten la entrada y salida de medio de cultivo de manera continua. La solicitud reivindica, asimismo, un método de cultivo tridimensional de células adherentes basado en la utilización del dispositivo antes mencionado. D01 se refiere a un dispositivo que se utiliza, entre otras cosas, para el cultivo celular. Este dispositivo contiene microfilamentos apilados a los que se adhieren las células del cultivo. Estos dispositivos contienen además membranas filtrantes. D02 describe unas bolsas fabricadas en plástico que disponen en su interior microfilamentos apilados de forma paralela para el cultivo de células. Estas bolsas incluyen dispositivos de entrada y de salida, de modo que se pueda realizar la inoculación del cultivo celular y mantenerlo en óptimas condiciones mediante la circulación continua de medio. D03 reivindica un receptáculo para el cultivo de células que contiene en su interior microfilamentos huecos apilados de forma paralela para que se adhieran las células del cultivo. D04 es la página web del solicitante que describe de forma bastante esquemática el producto que se reivindica. De estos cuatro documentos (D01-D04), tan sólo D03 hace referencia a que el dispositivo se utilice en cultivos tridimensionales. Sin embargo, aunque en el resto de los documentos (D01, D02 y D04) no se haga comentario alguno al respecto, la estructura del dispositivo se halla anticipada por ellos. Por otro lado, aunque ninguno de los documentos (D01-D04) afecta a la novedad de las reivindicaciones de método de cultivo (reiv. 9-14), se considera que las características técnicas que se incluyen en dichas reivindicaciones, salvo el uso de los dispositivos reivindicados, carecen de una actividad inventiva, por ser características comúnmente utilizadas en el estado de la técnica. Por todo ello, se considera que las reivindicaciones 1-8 no cumplen el requisito de novedad, aunque sí las reivindicaciones 9-14. Por otro lado, las reivindicaciones 1-14 no cumplen el requisito de actividad inventiva.
    Informe del Estado de la Técnica Página 4/4
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