JPS63137695A

JPS63137695A - 抗コンドロイチン硫酸ｄモノクロ−ン抗体及びこれを用いるコンドロイチン硫酸ｄの検出方法

Info

Publication number: JPS63137695A
Application number: JP28216186A
Authority: JP
Inventors: Hiroharu Kimata; 弘治木全; Yasuteru Oike; 大池　康照; Masahito Yamagata; 山形　方人; Akira Suzuki; 鈴木　旺
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1986-11-28
Filing date: 1986-11-28
Publication date: 1988-06-09
Anticipated expiration: 2010-05-17
Also published as: JPH0745518B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の属する技術分野］本発明は、コンドロイチン硫酸りに対して特異性の高い
モノクローン抗体及びそれを用いるコンドロイチン硫酸
りの検出方法に関するものである。

［従来の技術とその問題点］コンドロイチン硫酸は、他の酸性ムコ多糖と共に、種々
の結合組織の基質成分として広く存在することはよく知
られている。このコンドロイチン硫酸には、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン（以下ｒＧａｕＮＡｃＪ　という。）
とＤ−グルクロン酸　（以下ｒ　ＧｕｃＵＡ　Ｊ　とい
う、）がグリコシド結合した三糖を構成単位とし、Ｇａ
見ＮＡｃのＣ−４位に硫酸基の結合したコンドロイチン
硫酸Ａ（以下ｒｃｓ−ＡＪ　という、　）　、　ＧａＪ
ＩＮＡｃのＣ−６位に硫酸基が結合したコンドロイチン
硫酸Ｃ（以下ｒＣ９−Ｃｌ　という、）、ＧａｕＮＡｃ
のｃ−ｅ位及びＧｊＬｃＵＡのＣ−２位にそれぞれ硫酸
基の結合したコンドロイチン硫酸Ｄ（以下ｒＣ９−０」
　という。）　、　ＧａｆＬＮＡｃのＣ−４位及びＣ−
８位にそれぞれ硫酸基の結合したコンドロイチン硫酷Ｅ
（以下ｒ　Ｃ５−ＥＪという、）、その他し−イジュロ
ン酸　（以下ｒｌｄｏＵＡ　Ｊという。）とＧａ１ＮＡ
ｃがグリコシド結合した三糖を構成単位とし、Ｇａ　ｆ
ＬＮＡｃのＣ−４位にｉ酸基の結合したコンドロイチン
硫酸Ｂ（デルマタン硫酸ともいう、以下ｒＣＳ−ＢＪ　
という、）、更にＩｄｏＵＡのＣ−２位にも硫酸基が結
合したデルマタン硫酸硫酸などの構造単位の種類のある
ことが知られている。

これらの中、０Ｓ−Ａ及びＣ５−Ｃはを椎動物に広く見
出され、また含量が多いこともあって入手し易いことか
ら１種々検討がなされている。また、　Ｃ５−８は血管
はじめ各種結合組織に存在するが、その含量は少なく、
皮組織に多く存在し、つａン酸が他のコンドロイチン硫
酸（以下「Ｃ５」という、）がＧＪｌｃＵＡであるのに
対して、Ｉｄｏ（ｊＡである点で異っている。これに対
して、Ｃ５−Ｄは広＜　ａＳ−Ａ。

ｃｓ−ｃ、　Ｃ９−Ｅの中に混成類として含まれている
にもかかわらず、高等動物では含量が少ないため、今日
まで殆ど無視されてきた。

また、同じムコ多糖の一種であるヘパラン硫酸のエンド
サイト−シス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）にはＧｉｃＵ
ＡのＣ−２位に硫酸基が結合していることが必須条件で
あるとの最近の報告（Ｎ、Ｓ、　Ｆｅｄａｒｋｏ、　ａ
ｎｄ　Ｈ。

Ｅ、　Ｃｏｎｒａｄ　：　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｔ、
、　１０２．５８７（１８８Ｇ））もあり、類似構造を
有する０Ｓ−Ｄ又はそれを含む混成類は生体内における
ムコ多糖の移動、分布１代謝に深く関与し、重要な生理
機能を果たしていることが容易に想定される。他方１組
織の状態を把握するマーカーとして重要な役割を果たす
ことが期待される。即ち、種々の疾患において、その病
態に応じて患部のムコ多糖に変化のあることが認められ
ている０例えば、悪性腫瘍において、Ｃ５−Ｃを多量に
含有することが知られている。この場合、Ｃ５−Ｃ中に
含まれる微量成分である０Ｓ−Ｄを検出、測定すること
は、Ｃ９−Ｄが微量な特異な成分である故に、微妙な変
化をより早期に把握することも可能であり、診断上重要
な意義を有すると考えられる。

しかしながら、ａｓ−ｎを測定する方法としては、組織
からプロテオコンドロイチン硫酸を取り出し、コンドロ
イチナーゼで処理し、生じた分解物を同定することによ
ってＩＪ−Ｄを測定するという酵素化学的方法はあるが
、この方法は煩雑であり、かつ時間を要し、微量成分の
検出は困難であるという難点があって１診断の方法とし
ては適切とは言い難いという欠点がある。そこで、本発
明者らはＣ５−Ｄを簡便に、かつ短時間で測定する方法
として免疫的手法に着目した。

Ｃ８に対するモノクローン抗体についてはいくつかの報
告［Ｒ，Ｂ、　Ｊｅｎｋｉｎｓ、ａｔ　ａｌ、：　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　　２５８．　８２７９（１９８１）；　
　Ｚ、　　Ａｖｎｕｒ、　　ｅｔ　　ａｔ、：Ｃｅｌ＋
、　３８．８１１（１９８４）］があるが、これらのう
ち。

Ｊｅｎｋｉｎｓ　らのモノクローン抗体は、Ｃ５−Ｃ（
７）　４糖、６糖を認識するものであり、Ａｖｎｕｒら
のモノクローン抗体は、　Ｃ５−Ｃの他、Ｃ９−Ａ及び
ヘパラン硫酸をも認識してしまい、共に高分子の０Ｓ−
Ｄのみを特異的に認識するものではない。

そこで、本発明者らは、　Ｃ５−Ｄに対し、優れた特異
性を示すモノクローン抗体を得ることを目的として鋭意
研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

［発明の構成］本発明は、　０９−Ｄを含有する組織由来のプロテオコ
ンドロイチン硫酸を抗原として予め免疫したマウスのリ
ンパ球とマウスのミエローマとの細胞融合により形成さ
れたハイブリドーマから産生される抗Ｃ５−Ｄモノクロ
ーン抗体、及び該モノクローン抗体を用いることを特徴
とするＣ９−Ｄの検出方法に関するものである。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明の目的を達成するための第一段階は、抗体を産生
ずる新規な単クローンハイブリドーマを確立することで
ある。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細
は実施例で示すが、簡単には次の３工程から成る。

１、免疫２、細胞融合３、　ハイブリドーマの選択と単りローン化急羞本発明において、抗原として用いるプロテオコンドロイ
チン硫酸としては、Ｃ５−Ｄを含有する組織、例えば鶏
胚軟骨、サメ軟骨、クジラ軟骨、ウシ鼻軟骨等由来のも
のであれば、如何なるものでもよいが、特にＣ５−Ｄに
富んだ組織由来のもの、入手容易なもの、及び強い抗原
性があるケラタン硫酸を含まないもの、例えば鶏胚肢芽
未分化組織由来のプロテオコンドロイチン硫酸（以下ｒ
　ＰＧ−Ｍｌという、）を用いることが好ましい。

従来は、これら組織から得たプロテオコンドロイチン硫
酸をヒフルロニダーゼ処理して、成可く余分な糖を除去
し、蛋白含量を高めたものを抗原として用いていたが（
Ｊｅｎｋｉｎｓらの方法）、本発明においては、組織か
ら得たプロテオコンドロイチン硫酸を酵素処理すること
なく、そのままを抗原として用いる。

免疫動物としては、マウスを用いるが、このうち、免疫
グロブリンを産生じない腫瘍細胞株の確立されているＢ
ＡＬＢ／ｃを用いることが好ましい。

通常、免疫は数回に分けて行うが、初回免疫はアジュバ
ントと共に投与することが好ましい。

アジュバントとしては、ミョウバン、結核死菌。

核酸、フロインドアジュバント等が使用される。

綴１す１合最終免疫後にリンパ節或は牌臓を摘出し、得られるリン
パ球を細胞融合に供する。一方、細胞融合に使用される
腫瘍細胞株としては、通常、ＰＧ−ＭＳ−１、ＰＧ−Ｘ
ｌｌｔ３−Ａｇ８−０１　及びＳＰ２１０−Ａｇ１４（
ＳＰ２１０）等を用いる。

ハイプリ′−マの゛　　　クローンハイブリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清を種々の分
析法（例えばＲＩＡ　、プラーク法、凝集反応、ＥＬ　
ＩＳＡ等）で目的の抗体産生ハ・イブリドーマを選択す
る。ハイブリドーマを得たならクローニングを行う、ク
ローニングの方法としてはＦＡＣ５（Ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｔ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅｒ
）を用いたり、　５ｏｆｔ　Ａｇａｒを用いてコロニー
を拾い上げる方法の他に、一般によく用いられる限界希
釈法等がある。クローニングはコロニーが一つのハイブ
リドーマから形成されるような細胞濃度で行う。

限界希釈法では９６ウエルプレートの１ウエルあたり細
胞が約１個になるような希釈度を用いる。どの方法を用
いてもクローニングは２回繰返し行い、単一クローンと
する。

）１Ｃ５−Ｄモノクローン４　のクローンを確立したなら抗体は大量にｉｎ　ｖｉｔｒ。

で培養するか、或は１ｎｖｉマ０で培養するかによって
産生される。ｉｎマ１ｔｒｏで産生された抗体は他の抗
体の混入はないが抗体価は低い、　ｉｎ　ｖｉｖａで産
生された抗体は宿主由来の抗体が若干混じるが、抗体価
はｉｎ　ｖｉｔｒｏに比し非常に高い、どちらの方法で
抗体を産生させるかは目的による。

上記方法により、抗ｃｓ−ｎモノクローン抗体が得られ
る。

四ニドΣ喪共抗Ｃ５−０モノクローン抗体を用いて特異的にａＳ−Ｏ
又はそれを含む混成類を検出するためには、通常ＲＩＡ
又はＥＬＩＳＡ等によって行われる。　ＥＬＩＳＡに使
用する時は標識酵素としてβ−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ等を用いるこ
とができる。

［発明の効果］本発明によれば、従来品に比し、０．００４ｕＬｇ／ｄ
以上の０Ｓ−Ｄ構造単位（Ｇｕ　ｃＵＡ２−ＳＯ４−Ｇ
ａ文ＮＡｃ３−５Ｏ４）を含む高分子ＯＳを特異的に認
識する高感度のモノクローン抗体を提供でき、これを用
いることにより組織又は体液中のＣ５−Ｄ構造単位（Ｇ
ｆＬｃＵＡ２−９Ｏ４−Ｇａｌ　ＮＡｃ６−９Ｏ４）を
含む高分子ＣＳを特異的に検出することができる。

ｒ発明の実施例］以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例１（１）匹」立】ｌ鶏有精卵を３７℃で３日間インキュベートした後、肢芽
を分取した。ハンクス液で洗浄後、４にグアニジン塩酸
、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）、５履Ｍ　ＥＤＴＡ、　２＋ｗＭ　Ｎ−エチルマレ
イミド（ＮＥＷ）及び０．３８ｍＭペプスタチンを含む
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を加えて０℃
で２４時間激しく攪拌して抽出した。０℃においてｉｏ
、ｏｏ。

ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みに塩化セシウム
１．３５ｇ／−を加えて１０℃において４０．００Ｏｒ
ｐｍで２日間沈降平衡遠心に付した。密度１．３５以上
の部分をプールした後、外液として４にグアニジン塩酸
、２ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　ＮＥ
Ｍ及び０．０３８ｍＭペプスタチンを含む５０ｄ）リス
塩加緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて透析を行った。それ
ぞれ、４Ｍグアニジン塩醜を含む１０％及び３０％のグ
リセリンを用いて密度勾配遠心（２５，０００ｒｐａ＋
、　１９℃、４３時間）を行った。

ウロン酸を定量してウロン酸含有画分を集めた。

該両分についてエタノール沈殿を行って得たＰＣ−Ｈに
ついて分析したところ、抗原として用いたＰＣ−にのグ
リコサミノグリカンは下記成分の混成類であった。

Ｇ文ｃＵＡ−Ｇａ　ｌ　ＮＡｃ４−ＳＯ４（ＣＳ−Ａ構
造単位）２Ｇ、４％ＧｆＬ　ｃＵＡ−Ｃａｌ　ＮＡｃ３
−５Ｏ４（ＯＳ−Ｇ構造単位）　３８．１％ＩｄｏＵＡ
−ＧａＪＩ　ＮＡＣ４−８Ｏ４（Ｏ８−Ｂ構造単位）４
．５％その他（コンドロイチン）　　　　’　　　２８
．０％コア蛋白質の分子量約５５０，０００　（ＳＯＳ電気泳動法）コンドロイチ
ン硫酸類の平均分子量約Ｇｏ　、０００［バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｔ）Ａ　１．５ｍを用い
たゲル濾過法］（２）直止二】１（１）で得たＰＣ−Ｍをダルベツコリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）に溶解し、ＰＣ−Ｍ　　５０終ｇ／　２００延
ｆＬ　ｃフロイント完全アジュバント含有）を雌性ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに皮下投与した。２週間後、ブースター
として、ＰＣ−Ｍ　　５０℃ｇ／　２００戸立　（フロ
インド不完全アジュバント含有）を２回皮下投与した。

その１週間後、牌細胞１．３Ｘ　１０’細胞及びミエロ
ーマＭＳ−１細胞２．５　ＸＩＯフ細胞をＲＰＭＩ　１
１３４０培地（日本製薬■製）で洗浄した後、遠心分離
した。ポリエチレングリコールを加えて３７℃で５分間
インキュベートした。　　ＲＰＭｌ　１８４０培地、ウ
シ胎児血清及びＨＡＴ培地の混合液１０−を加えて反応
を停止させた。

ＲＰＭＩ　ＩＥ１４Ｇ培地、ウシ胎児血清及びＩ（ＡＴ
培地の混合液で希釈して、各１００ｐｕを、予めフィー
ダー細胞としてマクロファージをまいたマイクロタイタ
ープレートに入れた。Ｃ０２インキユベーター内におい
て、３７℃で２週間インキュベートした。ハイブリドー
マコロニーの発生したものの上澄みをとり、　ＥＬＩＳ
Ａ法にて分析を行った。

（３）クローニング鶏胚軟骨由来のプロテオコンドロイチン硫酸（以下ｒＰ
Ｇ−）ＩＪ　という、）を抗原とするＭＬ　ＩＳＡ法で
培養液を検定し、陽性のウェルの細胞（ハイブリドーマ
）を希釈し、　００２インキユベーター内において、３
７℃で１週間インキュベートした。コロニーについて、
ＥＬ　ＩＳＡ法にて同様にチェックし、陽性のウェルに
ついて、同様に希釈を繰り返してＭＯ−２２５−Ｋを得
た。

ザイメット社のモノＡｂ−Ｉｎ　ＥＩＡキットＡにより
、ＮＯ−２２５−にはクラスＩｇＭと同定された。

実施例２ＰＣ８−ＤモノクローンＭＯ−２２５−には、ＰＣ−Ｍを抗原として得たモノク
ローン抗体であるが、ＰＣ−Ｍだけでなく、鶏胚軟骨の
主要なプロテオコンドロイチン硫酸であるＰＧ−Ｈとも
反応した。更に、種をこえて、ウシ鼻軟骨のプロテオグ
リカンとも反応した。

ＰＣ−Ｈを抗原としてＥｌ、　ＩＳＡを行った結果を以
下に示す、　ＥＬＩＳＡでの一次抗体は、ハイブリドー
マ上清（ＲＰＭＩ　１８４０培地、　１０％ＦＣ９）を
用い、二次抗体は、マウスＩｇＭ（又はに及びＧ）を認
識するヤギＩｇＧにペルオキシダーゼを結合させたもの
（ＴＡＧＯ社製）を用いた。　ＰＣ−Ｈは、鶏胚置端軟
骨から大池らの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、
　２５７．９７５１（１９８２））に従って調製した。

（１）結合テストＰＧ−ＨをコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレ
ートに、各酵素【コンドロイチナーゼＡＣ−ＩＩ（以下
ｒ　Ｃｈａｓｅ　ＡＣ−ＨＪ　という。）　０．０１１
位／ウェル、コンドロイチナーゼＡＢＣ（以下ｒｃｈａ
ｓｅＡＢＣＪ　という、　）　０．０１単位／ウェル又
はケラタナーゼ０．１単位／ウェル］を入れ、更にハイ
ブリドーマ上清を加え、３７℃で１時間反応後、更に室
温で２時間反応した後、洗浄、二次抗体反応、洗浄、発
色を行った。なお、対照として、ケラタン硫酸を認識す
るマウス七ツクローン抗体であるＨＭ−１２０（ＩｇＧ
　１）を用いた。結果を第１図に示す。

第１図から、　Ｎｏ−２２５−Ｋが、ＰＣ−Ｈのコンド
ロイチナーゼで分解される部分、即ちフンドロイチン硫
醸鎖に結合していることがわかる。

（２）阻害テストＮＯ−２２５−にとＰＧ−）１との反応はＣＳ以外のム
コ多糖、例えば、各種ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、
ケラタン硫酸、ヒアルロン醜、ヘパリンによって全く阻
害されない、換言すれば、これらの高分子とは全く結合
反応を示さない。

また、種々の動物由来のＣ５について同様の試験を行い
、５０％阻害に必要な量を求めた。結果を第１表に示す
、第１表において、記号〉は、少なくとも、この量まで
は５０％阻害には至らないことを示している。この結果
は、ＮＯ−２２５−にとＰＣ−Ｈとの結合反応をＣ９−
Ｄ含量の多いものほど強く阻害すること、換言すれば、
このモノクローン抗体がＣＳｉ内のＤ構造を特異的に認
識していることを示している。

以上の結果より、本発明の抗Ｃ５−０モノクローン抗体
は、高分子Ｃ９−Ｄのみを特異的に認識するので、各種
疾患の診断に有用、かつ簡便な方法を提供するといえる
。

第　　１　　表：ＪｔｖａイＥノ１１位：　　Ｇ！ＬｃＵＡ　−ＧａＪ
ＩＮＡｃＡ　単　位：Ｇ交ｃＵＡ　−Ｇａ１ＮＡｃ　４
−５０４Ｃ単　位：　ＧｆＬｃＵＡ　−１１ａｆＬＮＡ
ｃ　８−９Ｏ４Ｄ　単　位：　ＧｊＬｃＵＡ　２−９０
４−ＧａｊＬＮＡｃ　８−９）４Ｅ　単　位：　ＧＪｌ
ｃＵＡ　−Ｇａ立ＮＡｃ　４，８−ｂｉｓｓＯ４

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｎｏ−２２５−にとＰＣ−Ｈの結合反応が、
予めＰＧ−）１を酵素処理することによってどのような
影響を受けるかを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）コンドロイチン硫酸Ｄを含有する組織由来のプロ
テオコンドロイチン硫酸を抗原として予め免疫したマウ
スのリンパ球とマウスのミエローマとの細胞融合により
形成されたハイブリドーマから産生される抗コンドロイ
チン硫酸Ｄモノクローン抗体。
（２）コンドロイチン硫酸Ｄを含有する組織由来のプロ
テオコンドロイチン硫酸を抗原として予め免疫したマウ
スのリンパ球とマウスのミエローマとの細胞融合により
形成されたハイブリドーマから産生される抗コンドロイ
チン硫酸Ｄモノクローン抗体を用いることを特徴とする
コンドロイチン硫酸Ｄの検出方法。