JPS63118654A

JPS63118654A - 多項目イムノアツセイ装置

Info

Publication number: JPS63118654A
Application number: JP26405786A
Authority: JP
Inventors: Kazunari Imai; 一成今井; Daizo Tokinaga; 時永　大三; Teruaki Kobayashi; 映章小林; Kenji Yasuda; 健二保田; Satoshi Takahashi; 智高橋
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1986-11-07
Filing date: 1986-11-07
Publication date: 1988-05-23
Also published as: JPH0588786B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は圧力差を利用して試料を移動させる方式のイム
ノアッセイ装置に係り、特に多項目測定に好適なイムノ
アッセイ装置に関する。

〔従来の技術〕

腫瘍マーカの測定は癌の確定診断検査ではないが、組繊
細胞学的検査や、形態学的検査に比べ患者の肉体的負担
も少なく、検体が血液などの体液であるので簡単に入手
することができ、癌スクリーニング検査として適してい
る。

腫瘍マーカによる癌スクリーニングが有用であるために
は、その検査の有病正診率がより高率であり、なおかつ
非癌良性疾患での無病止環率がより高率である必要があ
る６言いかたを変えれば、癌での陽性率がより高率であ
り、なおかつ偽陽性率がより低率である必要がある。と
ころが現在知られている各種のマーカはどれも単独でこ
れらの条件を十分満足させるものではない。そこで、診
断能をさらに向上させる目的で複数のマーカを組み合わ
せて測定するコンビネーションアッセイ（ｃｏｍｂｉｎ
ａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）の有用性が注目されている。

一方、各種腫瘍マーカを測定する目的で、各種のイムノ
アッセイが提案されている。しかしながら、どのイムノ
アッセイにおいても１種類の腫瘍マーカごとにしか測定
することができず、上記のコンビネーションアッセイを
行おうとすれば、個別に複数種の腫瘍マーカを測定しな
ければならない、つまり、測定しようとする数種に比例
した被検液と、手数を要する。

測定時間の短縮、装置化が容易という特徴を有する方法
の一例としてつぎの方法が提案されている（アナリティ
カルケミストリ、５７．２７５４頁から２７５６頁（１
９８５年）、　（Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、。

５７．２７５４−２７５６　（１９８５））。この方法
では、ビーズに抗体を固定化させた後ステンレス製のチ
ューブにつめてマイクロリアクターとし、これに測定す
べき試料溶液、及び標識物質を結合した抗体の順に通過
させ、通過する間に反応させ。

最終的にマイクロリアクター中に結合した標識物質量を
測定することにより試料中の測定対象物質量を算出する
。

しかし、この方法においても複数種の腫瘍マーカを同時
に測定することはできず１個々の腫瘍マーカを別々に測
定せねがならない。その結果、必要な被検液量は多量と
ならなざるを得ない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記従来技術は、コンビネーションアッセイのために同
時に複数種の腫瘍マーカを測定する際に一種類ごとに別
々に測定せざるを得す、測定に手間と時間を要するとと
もに、多量の被検液を必要とする問題があった。

本発明の目的は、複数種の腫瘍マーカの測定を一度に行
うことにより、測定操作時間を短くするとともに、被検
液量を少量にしたイムノアッセイ装置を提供することに
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、液流を用いて試料゛を移動させ、その流路
中に設けた抗体を固定化した反応部分で抗原を反応させ
る方式のイムノアッセイ装置において、測定対象とする
複数種の抗原に対応する抗体をそれぞれ異なる同相部分
に固定化した固相部分を流路中に直列に配置して構成す
ることにより達成される。

〔作用〕

抗体は、結合する抗原を特異的に認識するので、複数の
抗原に対応する抗体をそれぞれ固定化した同相部分を直
列に接続し、この中に試料を流せば、干渉することなく
、試料中に含まれる各種抗原が。

それぞれに対応した担体中に固定化されることになる。

つまり、−度の試料注入により、複数種の抗原を同時に
捕捉できるようになる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を示す。

実施例１゜市販のガラスピーズ（平均粒径約１０μｍ）を硝酸、続
いて純水で良く洗浄する。このビーズを０．１％Ｎ−β
（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラ
ン水溶液に３０分間浸漬、続いて純水で良く洗浄した後
１１０℃で乾燥させる。これを２．５％グルタルアルデ
ヒド水溶液に１５分間浸漬し、純水で良く洗浄した後、
直ちに測定対象を抗原とする抗体溶液（約４ｍｇ／ｍＱ
溶液、ｐ　Ｈ７）に浸漬し、４℃で一晩放置する。

グリシン溶液に浸漬し、未反応のアルデヒド基を処理し
た後、リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で洗浄する。これを
直径０．２ｍｍ、長さ４ｃｍのステンレスチューブに充
填し、抗体固定化カラムとした。

各種の抗体をそれぞれ上記の手順に従い、固定化し、各
種の抗体固定化カラムを準備した。

このようにして得られた固定化抗体カラムを第１図のよ
うに接続する。直列に接続した異なる種類の抗体を固定
化したカラム１，２．３に、送液ポンプ４を用いて緩衝
液５を連続的に流しておく。

流速は０．５ｍｕ／ｍｉｎである。測定する試料液を５
０μａだけ、カットバルブ６を用いて導入する。試料は
カラム１．カラム２．カラム３を通過した後、三方コッ
ク７を介して流路８より、排出され徘液溜９に注ぐ。次
いで、グルコースオキシダーゼを標識した抗体を、それ
ぞれ各種の抗体について準備し、はぼ同一濃度（約１　
ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ　）となるように混合した。この標
識抗体混合液を、試料注入より２分間経過後に、７５μ
Ｑを注入し、試料と同様にカラム１．カラム２．カラム
３．を通過させた後、三方コック７を介して排液溜９に
注ぐ。

標識抗体混合液注入後２分間カラムの洗浄をしてから標
識抗体の結合量を電気化学的に検出する。

検出はカラム１．カラム２．カラム３を別々に行う。ま
すカラム１の測定を行うために、コック１０．１１，１
２．１３を操作し、液をバイパス１４及びバイパス１５
を通過させ、カラム２．カラム３を通過しないようにす
る。１％グルコース溶液をカットバルブ５を用い注入し
、カラム１で反応し生じたＨ、Ｏ，を、三方コック７を
介して導かれた検出器１６で測定する。

続いて、カラム２の測定を行う。この場合、コック１７
，１８，１２，１３を操作し、バイパス１９及びバイパ
ス１５を通過するようにした後、同様の測定を行う。同
様に順次、カラム３の測定を行う。

測定する抗体として、ＡＦＰ　（α−フェトプロティン
）、β２−ミクログロブリン、ＣＥＡ　（癌胎児性抗ｙ
Ｋ）を用いて、各種濃度の試料を作製し、上記測定手順
に従い測定を行い検量線を得た。その結果を第２図に示
す。

結果はそれぞれを個別に従来法に従って測定した結果と
よく一致した。相関係数は、それぞれ、ＡＦＰに対し、
１．０２．β２−ミクログロブリンに対し、０．９５．
ＣＥＡに対し、０８９７であった。

従って本方法は同時に多項目の測定が可能であることが
わかる。

実施例２゜市販のガラスウールを、実施例１記載の方法と同様にシ
ランカップリング処理した後、グルタルアルデヒドを用
いて各種の抗体を固定化させた。

直径５ｍｍ、長さ１ｃｍのガラス管にそれぞれ各種の抗
体を固定化したガラスウールをつめ反応カラムとする。

このようにして得られた反応カラム３種を第３図に示す
ように直列に接続した。異な名種類の抗体を固定化した
反応カラム２１，２２，２３に送液ポンプ２４を用いて
流量０．３ｍＱ／ｍｉｎで緩衝液２５を連続的に流して
おく。

測定したい試料を注入部２６より注入する。試料は、カ
ラム２１，２２，２３を通過して後、徘液溜２７に導か
れる。さらに緩衝液を流しカラムを洗浄する。

次いで、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを標識した各種抗体
を等量ずつ混合し、その７５μ念を注入部より注入する
。洗浄のため、一定時間緩衝液を流す。続いてカラムに
結合した標識抗体量を測定する。注入部よりＯ−ニトロ
フェノール−β−Ｄ−ガラクトシド溶液を注入する。カ
ラム２１を通過した反応液を、コック２８を介して吸光
検出器２９に導き、４２０ｎｍでの吸光度を測定した。

次にカラム２２の測定を行う。コック４５．２８を操作
し、バイパス３０を経て、０−ニトロフェノール−β−
Ｄ−ガラクトシド溶液をカラム２２に導く。コック３１
を介して反応液を吸光検出器３２に導き、吸光度を測定
する。

次にカラム２３の測定を行う。コック４５及びコック３
１を操作してＯ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクト
シド溶液をバイパス３３を介してカラム２１に導く。コ
ック３４を介して反応液を検出器３５に導き吸光度測定
を行う。

実施例１と同様にＡＦＰ、β２−ミクログロブリン＋　
ＣＥＡの測定を行った。そめ結果を第４図に示す。個別
に従来法で測定した結果とよく一致したのは実施例１と
同様である。

実施例３゜市販のガラス繊維濾紙（厚さ０．２ｍｍ、直径１０　ｍ
　ｍ　）を実施例１記載と同様の方法によりシランカッ
プリング処理した後、グルタルアルデヒドで抗体を固定
化させ、固定化抗体膜とする。各種の抗体をそれぞれ別
に固定化させた固定化抗体膜３６，３７，３８．を重ね
合わせ、反応容器３９に保持たせる。

反応器に測定試料５００μＱを注ぎ、下部に接続してお
いたペリスタポンプ４０により吸引し反応膜中に導入す
る。次いで１０−２Ｍリン酸緩衝液を１０　ｍ　Ｑ流し
、反応膜を洗浄する。

ペルオキシダーゼを標識した抗体３種を、それぞれ５０
μΩずつ、順に反応膜中に導入する。再度１０−”Ｍリ
ン酸緩衝液１０ｍＱで反応膜を洗浄する。

反応膜を取り出し、１枚ずつ測定を行う、検出用反応容
器４１に反応膜３６を保持し、反応容器上部からホモバ
ニリン酸溶液を導き、反応膜で反応させた後、蛍光検出
器４２で測定する。ＡＦＰ。

β２−ミクログロブリン、ＣＥＡを測定した結果を第６
図に示す。

実施例１．実施例２と同様、個別に従来法で測定した結
果と相関よく測定できる。

実施例１，２．３ではガラスを担体として用いる例を示
したが、一般の固定化担体として用いられる素材につい
ては共通に有用であることはいうまでもない。

〔発明の効果〕

本発明によれば、多成分の測定項目を同時に測定するこ
とができるので、操作時間の短縮及び。

試料の少量化の効果がある。すなわち使用する試料量は
、測定項目数に依存しないので、−測定順目当たりの所
要量は、同時に測定する測定項目数に反比例し、多項目
の測定を行うほどその効果は大きくなる。例えば、５成
分の測定を行う場合、従来比で約５分の１の試料量で足
りることになる。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明の実施例１を行う装置の概略図、第２
図は実施例１の測定結果を示す図、第３図は実施例２を
行う装置の概略図、第４図は実施例２の測定結果を示す
図、第５図は実施例３を行う装置の概略図、第６図は実
施例３の測定結果を示す図である。〔符号の説明〕１・・・反応カラム、２・・・反応カラム、３・・・反
応カラム、４・・・送液ポンプ、５・・・緩衝液、６・
・・カットバルブ、７・・・三方コック、８・・・流路
、９・・・排液溜。１０・・・コック、１１・・・コック、１２・・・コッ
ク。１３・・・コック、１４・・・バイパス、１５・・・バ
イパス。１６・・・検出器、１７・・・コック、１８・・・コッ
ク。１９・・・バイパス、２０・・・排液溜、２１・・・反
応カラム、２２・・・反応カラム、２３・・・反応カラ
ム、２４・・・送液ポンプ、２５・・・緩衝液、２６・
・・注入器。２７・・・排液溜、２８・・・コック、２９・・・検出
器。３０・・・バイパス、３１・・・コック、３２・・・検
出器。３３・・・バイパス、３４・・・コック、３５・・・検
出器。３６・・・固定化抗体膜、３７・・・固定化抗体膜、３
８・・・固定化抗体膜、３９・・・反応容器、４０・・
・ポンプ。４１・・・検出用反応容器、４２・・・検出器、４３・
・・排液溜、４４・・ポンプ、４５・・・コック。

Claims

【特許請求の範囲】１、測定対象とする複数の抗原に対応する抗体をそれぞ
れ別に固定化した複数の固相部分を、一連の流路中に連
続的に配置したことを特徴とする多項目イムノアッセイ
装置。２、上記固相部分が、ガラス又は有機高分子から成る繊
維膜から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の多項目イムノアッセイ装置。３、上記固相部分が、固体粒子を充填したカラムから成
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の多項目
イムノアッセイ装置。