JPS61219863A - 多項目同時イムノアツセイおよびその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、多項目の物質を同時に免疫学的測定法により
測定する多項目同時イムノアッセイおよびそれに使用す
る試薬に関するものである。

〔゛従来技術〕

近年、病気の診断などを目的とする臨床検査において、
生体試料中の物質を免疫学的測定法（イムノアッセイ）
に定量する方法が広く普及しつつある。日常的な臨床検
査１こおいては、集団検診の場合や、病気の診断要素と
して複数の項目物質の定量値が求められる場合に、同一
生体試料について多項目の物質についてそれぞれ定量す
る必要がある。このような多項目の物質の免疫学的測定
において、アッセイの操作を簡略化し、また被検者ヘの
試料採取の負担を少なくするために、同一試料について
多項目の物質の測定を同時に行う種々の方法が開発され
ている。

たとえば、特開昭５２−１５８１５号公報に代免疫学的
測定法において測定する成分化対応する抗原または抗体
をそれぞれ区別可能な異なる粒子径を有する粒子群に固
定させ、これらの固定化粒子を同時に試料と免疫学的反
応させ、次いで標識化試薬を反応させた後、粒子径と標
識量をマルチパラメーター粒子分離装置薯ζより測定し
てその相関を求めるか、粒子分離装置により粒子を粒子
径群檻従って分離して個別の標識量を測定する方法が用
示されている。

特開昭５６−７８５９８号公報１ζは、２種類の成分を
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により同時に震域 量する方法に詔いて、第一成分の抗体を試原管内壁に固
相化し、第二成分の抗体をビーズ表面に固相化し、該試
験管内ζζ該ビーズを入れて試料との免疫学的反応を行
わせ、その後それぞれについて免疫学的測定する方法が
開示されている。

特開昭５７−１２８６８号公報には、複数の測定物質に
対するそれぞれの抗体を互いに分離測定可能な固相に結
合させ、試料と免疫学的反応を同時にさせた後、それぞ
れの固相について必要な慣用の後処理をして標識量を測
定する方法が開示されている。

特開昭５８−１７４８５１号公報には、分別可能な２以
上の担体として反応管担体とエレメント担体を用いて、
それらの担体のそれぞれに測定すべき成分に対して特異
的結合能を有する物質を固定し、免疫学的測定に供する
方法が開示されている。

特開昭５９−１９７８６２号公報には、多項目同時測定
イムノアッセイ用試薬として、複数の固体担体のそれぞ
れを測定項目に応じて色分けし、各色の担体それぞれに
測定項目に対応する別々の抗原または抗体を結合させた
ものを使用する方法が開示されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来法番ζおける多項目同時免疫学的測定法においては
、■必要とされる試料量が多い、■担体に各特異的結合
物質を均一に十分量固定化することが困難である、■各
担体が重なりあって、各担体上の特異的結合物質と測定
物質との反応が均一に行えず、測定値の変動が大きいな
どのいずれかの問題点を有していた。

本発明の目的は、このような多項目同時イムノアッセイ
における問題点を解消できる新規なイムノアッセイおよ
びそれに使用する試薬を提供するところにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、前記の目的のもとに完成されたものである。

すなわち、本発明は第一には、試料中の多項目の測定物
質に対応する特異的結合物質の固定化試薬を用いて、同
時に免疫学的測定法により定量する方法書ζおいて、各
特異的結合物質の固相化試薬としてその固相化担体がシ
ート状片からなるものを用いることを特徴とする多項目
同時イムノアッセイを提供するものである。

さらに、本発明は、上記方法を好適に実施するために使
用する試薬であって、各特異的結合物質を固相化させた
それぞれのシート状片担体を帯状に相互に分離測定可能
に連結して構成させてなる多項目同時イムノアッセイを
提供するものである。

本発明方法において使用される各特異的結合物質の固相
化試薬は、その固相化担体がシート状片からなるもので
ある。また、その好ましい態様として、それらのシート
片をそれぞれの項目について分別測定が可能な状態で帯
状に連結させたものである。

シート片の材質には特に限定されず、測定成分に対する
特異的結合物質が十分量結合できる性質を有するもので
あればよい。そのような担体としては、たとえば、多糖
類（たとえばセルロース、デキストラン、デンプン、デ
キストリン、ヒドロキシエチルセルロース、ｐ−アミノ
フェノキシヒドロキシプロピルデキストラン、アガロー
ス、セファデックスなど）のハロゲン化シアン活性化物
（特公昭４５−８８５４８号公報参照）、多糖類のメタ
過ヨウ素酸ナトリウム活性化物（特開昭５８−７５６号
公報参照）、セルロースまたはその誘導体のアミノエチ
ルもしくはアミノプロピル化物（特開昭５９−４２４５
２号公報参照）、セルロースまたはその誘導体のメルカ
プト化物（特開昭５８−８０５５８号公報参照）、多糖
類のシアネート化物（特公昭４９−２８０８１号公報参
照）、多糖類のエピクロルヒドリン−ｐ−アミノフエ２
処理物（特開昭５４−１５８９９４号公報参照）、芳香
族アミン基を含む多糖類誘導体のジアゾ化物（希塩酸、
亜硝酸ナトリウム処理）、セルロースカルボナート誘導
体、酢酸セルロース、天然繊維（綿、麻、ウールなど）
などの天然高分子誘導体担体、エチレン、プロピレン、
スチレン、ビニルアルコール、アクリルアミド、アクリ
ロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エ
ステル、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、無水マレ
イン酸などの重合体もしくは共重合体担体、またはこれ
らに公知の手段によりアミノ基、ヒドロキシル基、カル
ボキシル基、スルホン基、チオール基、アジド基、イン
シアノ基などの反応性官能基を導入したものが挙げられ
る。材質の種したもの、表面に粗面加工したもの、織布
状としたものなどとして使用することができる。各シー
ト状片には、測定物質の項目が判別ができるようなマー
キングを施すことが好ましい。

本発明において、好ましい態様では、このような材質の
担体に測定物質に対する特異的結合物質をそれぞれ固定
化した各シート片を、必要に応じて各片間に分離ゾーン
を設けて、連結ないし接着させることにより、帯状シー
トを構成する（第１図参照）。

ここで、「測定物質に対する特異的結合物質」とは、測
定物質と免疫学的反応などの特異的親和性に基づく反応
により特異的に結合する物質をいい、具体的には抗原、
ハプテン、抗体、抗体フラグメント、し々ブターなどを
意味する。これらの特異的結合物質の担体への固定化法
は、物理的吸着法、共有結合法、架橋法、包括法などの
常法によればよい。このような固定化法の詳細について
は、固定化酵素における方法を応用すればよく、たとえ
ば、千畑一部編、「固定化酵素」　（昭和５０年８月２
０日、株式会社講談社発行）第９〜７５頁などの成書や
総説を参照すればよい。

各シート片の面積は、その担体にそれぞれの測定対象物
質の免疫学的測定に必要な量の各特異的結合物質を固定
化できる面積として決定されうる。

これらのシート片を連結ないし接着する手段は任意であ
り、適宜な基体、連結具ないし接着材を使用すればよい
。また、各シート片間の分離ゾーンとしては、空間を介
在せしめてもよいし、特異的結合物質を結合させない空
白部分を介在せしめてもよい。また、帯状シートを測定
物質の項目数に対応する数の区画に分割し、各区画に直
接、各特異的結合物質をそれぞれの分離測定が可能なよ
うに固定化できる手法により調製されたものも本発明の
態様として含まれる。

本発明試薬の帯状シートの大きさについては、短辺の長
さは免疫学的反応を行う反応管内番とおいて反応に必要
とされる反応液内に完全に浸漬するサイズであり、長辺
の長さは両短辺を接した場合に形成されるリングの径が
反応管内径より小さく、反応管内壁との間に十分に免疫
学的反応を行させる番こ必要な空隙を与えるサイズとし
て決定される。

たとえば、約８〜ｌ０ＩＩＩＩＸ約１５〜４０鱈の範囲
のものが使用されえ、約５　ｍ　Ｘ　８０１１１１のサ
イズが一つの目やすとなる。

本発明試薬を応用しつる免疫学的測定法としては種々の
公知のシステムがあり、基本的に各単項目に対する測定
法において免疫学的反応を同時に行うべく、各項目化必
要な試薬をそれぞれ混合してまたは同時もしくは相前後
して用いるように修飾すればよい。応用しうる免疫学的
測定法のシステムとしては、■測定対象物質とその標識
化物質を固相化された特異的結合物質に対して拮抗的Ｓ
ζ反応させ、結合もしくは遊離の標識化物質の標識量を
測定する方法、■固相化された特異的結合物質に対して
測定対象物質を反応結合させた後もしくはそれと同時に
、第二の特異的結合物質を標識化したものを結合測定対
象物質と反応させ、その結合標識量を測定する方法、■
■の方法における第二の特異的結合物質として標識物質
が結合可能な分子団もしくは官能基を導入したものを用
い、免疫学的反応に供した後、標識物質を加えて結合さ
せ、その結合標識量を測定する方法などが挙げられる。

標識物質としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、
化学発光物質、金属などの一般の免疫学的測定法に使用
されるものを用いればよく、またその標識化物の調製も
常法による。

アッセイにおける免疫反応の反応条件は常法によるが、
侍に測定項目が多い場合ζζは、ダイレクトミキサーな
どの使用により、反応エネルギーを与え、十分均−薯と
反応が進行するように配慮する必要がある。

各測定項目についての各標識量の測定は、免疫看 一望一 学的反応終了後、反応液を除去し、シート片毎にパ別個
に分離して行う。分離測定にあたっては本発明試薬の各
シート片をマーキングに基づいて分離すればよい。また
帯状シートの場合は、各測定項目に対応する区画を区画
境界もしくは分離ゾーンで切断して、各区画毎の標識量
の測定を行えばよい。また、本発明試薬の帯状シートの
形態のままで、各区画毎の標識量を限局的に検出測定す
るシステム、シートの各区画上を標識量検出器を走査さ
せて標識量を測定するシステムを採用することもできる
。たとえば、１２５１を標識として用いたＲＩＡにおい
て、各区画毎の放射能量を光フアイバースコープにより
集束し、それをγ−カウンターで測定する方法などが適
用できる。

標識量の測定値からの各測定対象物質の定量値の算出は
常法による。

なお、測定対象項目の組み合わせは任意であり、検査も
しくは診断目的に応じて必要なものを選択決定すればよ
い。たとえば、ホルモン（成長ホルモン、プロラクチン
、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ニストロジエ
ン類、プロジエストロン、テストステロン、副扉皮質刺
激ホルモン、Ｔ′５Ｈ１Ｔ３、Ｔ４、カテコールアミン
、アルドステロン、コルチゾール ストリン、セクレチン、ソマトスタチンなど）、免疫グ
ロブリン（ＩｇＡ　、ＩｇＭ　、ＩｇＧ　、ＩｇＥ。

ＩｇＤ　）　、腫瘍マーカー（たとえばＡＦＰ，ＣＥＡ
。

ＢＦＰ．フェリチン、β２−マイクログロブリン、ＣＡ
Ｉ　９−９、ＣＡ１２５、シアル化ルイスＸ。

？’″ ｒ−ＧＴＰアイソエンｌイムなど）、ウィルス（′単純
庖疹ウィルス、水痘・帯状庖疹ウィルス、サイトメガロ
ウィルス、インフルエンザウィルス、肝炎ウィルス、ア
デノウィルスなど）、各種アレルゲン、薬物詔よびその
中間代謝物などを対象検査項目に応じて適宜に組み合わ
せればよい。

〔作用〕

本発明方法は、上述したようｉζ免疫学的測定法を実施
するに際して、多項目の測定物質に対する特異的結合物
質をそれぞれ固相化したシート状片を同時に免疫学的反
応に供することにより、多項目の測定物質の免疫学的測
定を一回の反応操作で行うことができる。そして、免疫
学的反応終了後、これらの各シート片を分別して各標識
量を測定することにより、各測定物質の定量を行うこと
ができる。さらにこのようなシート片としてこれらシー
ト片を連結させて帯状に構成させたものは、免疫学的反
応操作においては一つの固相化試薬として取り扱われ、
測定時において分離ないし分別して標識量の測定に供さ
れる。また帯状シートの各区画の標識量を同時に測定で
きる測定機器の開発により、多項目の標識量が同時に測
定される。

〔実施例〕

実施例　１ １、材料 ＡＦＰ，ＣＥＡおよびフェリチンに対する抗体を結合さ
せたベーパーディスク、および各１２５１標識抗体は、
それぞれ市販の放射免疫測定用キット（商品名ｒファデ
パスＡＦＰプリスト」、「ファテハスＣＥＡ７’リスト
」、［ファデバスフエリチンプリスト」、以上ファルマ
シア、ダイアグノステイクス社製）のものを使用しに０
各ペーパーデイスクには各測定項目毎にマーキングをし
た。

２．　測定 ■　ＡＦＰ、ＣＥＡおよびフェリチンに対する抗体をそ
れぞれ固定化した各ペーパーディスクを１枚づつ計８枚
各試験管に入れた。

■　標準曲線作製用試験管には、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび
フェリチンの標準液を各５０μβづつ、試料用試験管１
こは患者血清５０μｅと生理食塩水１００μｌを加え、
それぞれ室温で２０〜２４時間インキュベーションした
。

■　反応液を吸引除去し、生理食塩水約２　ｗｅで各デ
ィスクを４回洗浄した。

■　１２５■標識ＡＦＰ抗体、１２５　■標識ＣＥＡ抗
体および１２５Ｉ標識フ工リチン抗体を各５０μβづつ
各試験管に加え、室温で２０〜２４時間インキュベーシ
ョンした。

■　反応液を吸引除去し、生理食塩水２　ｄにて各ディ
スクを４回洗浄した後、各ディスクをマーキング毎に別
々の試験管に移し、ｒ−カウンターにより各ディスクの
放射能を測定した。

■　各標準液の測定値より、ＡＦＰ、ＣＥＡおよびフェ
リチンについてのそれぞれの標準曲線を作成し、患者血
清中の各含量を定量した。

３、結果 得られたＡＦＰ、ＣＥＡおよびフェリチンの標準曲線は
それぞれ第２〜４図のとおりであった。

対照として、従来法どおりそれぞれ単独でアッセイした
場合番こ得られた標準曲線を図示した。

患者血清の各物質の定量値は次のとおりであった。なお
、従来法は、各項目をそれぞれ単独でアッセイしたもの
である。

実施例　２ 固相化試薬として、実施例１で用いた８種のＡＦＰ％Ｃ
ＥＡおよびフェリチン抗体のペーパーディスクをＡＦＰ
２枚、ＣＥＡＩ枚、フェリチン２枚計５枚木綿糸で゛縫
い止めて帯状シートとなし、実施例１と同様にイムノア
ッセイに供した。放射能の測定にあたっては、連結糸を
裁断して各ディスクを分離してそれぞれ測定した。

試料としては、それぞれのスタンダード血清を用いた。

結果は次のとおりであった。

実施例　８ １、材料 ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｌ！Ｓ　ｐ’ｔｅ
ｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ、　ＤＩ　）、ハウｘ　タス）　
（Ｇｒｅｅｒ　Ｌａｂｓ、　Ｈｌ）、スギ花粉（Ｔ１７
）、アルテルナリア真菌（Ａ　Ｉ　ｊｅ　ｒ　ｎ　ａ　
ｒ　１　ａ　ｔ　ｅ　ｎｕ　Ｉ　Ｓ　１Ｍ６　）　、猫
表皮屑（Ｃａｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ、’　Ｅｌ　）
　　（Ｄ各アレルゲンペーパーディスクは市販品（ファ
ルマシア社製）を用いた。その他の試薬は、市販のＩｋ
Ｅ抗体測定用ＲＡＳＴキット（商品名［ファデバスＲＡ
ＳＴＪ、ファルマシア社製）のものを使用した。

２、　方法 ＲＡＳＴ法によるアレルゲン検索に本発明を適用した。

■　リファレンスディスクを各り°ファレンス測定用試
験管に１枚づつ入れ、Ｄｌ、Ｈｌ−Ｔ’ｔｙおよびＭ６
アレルゲンデイスクを１枚づつ計４枚試料測定用試験管
に入れた。

■　リファレンス測定用試験管には各リファレンス血清
Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ５０μｌおよび蒸留水１００μｌづつ、
試料測定用試験管には患者血清５０μｌおよび蒸留水１
５０μｌを加え、それぞれミキシングポルテックスで混
合しながら、１０分間隔で計６回ダイレクトミキサーに
かけて反応エネルギーを与え、室温で２４時間反応させ
た。

■　反応液を吸引除去し、生理食塩水２．５　ｍｌで各
ディスクを８同士分洗浄した。

■　各試験管に１２５１標識ＩｇＥ抗体溶液５０μｌを
加え、−夜室温で静置インキュベート−した。

■　反応液を吸引除去し、生理食塩水２．５　ｙｚｌに
て各ディスクを８回洗浄した後、アレルゲンディスクを
マーキングにより分別して、各ディスクの放射能をγ−
カウンターで測定した。

■　リファレンス血清の測定値により、患者血清の各ア
レルゲンにおける測定値と比較してクラス分けをし、判
定した。

クラス分けは、リファレンス血清Ａの測定値以上をクラ
ス４、ＡとＢの測定値の間をクラス８、ＢとＣの測定値
の間をクラス２、ＣとＤの測定値の間をクラス１、Ｄの
測定値以下をクラス０とした。クラス２以上を陽性者、
クラス１を疑陽性者、クラス０を陰性と判定した。

８、゛結果 各測定値は下表のとおりであり、患者のアレルゲンはＴ
１７と判定された。対照として各アレルゲンディスクを
別々の試験管に入れ、それぞれに患者血清５０μβづつ
を加えて反応させた従来法による結果を示した。

〔発明の効果〕

本発明による多項目同時イムノアッセイによれば、従来
の多項目同時イムノアッセイに比べて、■担体がシート
状片であるため、より多数の項目の同時アッセイが可能
である、■アッセイ１こおける免疫学的反応をより均一
に行うことができる、■ビーズ状やポール状のものに比
べて特異的結合物質の単位体積あたりの固定化量が多く
、必要試料量が少ないなどの利点がある。また、さらに
複数のシート状片を帯状シートに構成させる態様におい
ては、アッセイ操作がより簡略化されるばかりでなく、
各標識量の同時自動測定システムを応用できる利点があ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明試薬の一実施態様の概念図である。第
２〜４図は、本発明の実施例で得られたＡＦＰ、ＣＥＡ
およびフェリチンの標準曲線を示す。 特許出願人　（６７７）ヤマサ醤油株式会社ｗｔ因 寥２図 悸／ｒｄ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）試料中の多項目の測定物質を、それぞれの測定物質
   に対応する特異的結合物質の固相化試薬を用いて、同時
   に免疫学的測定法により定量する方法において、各特異
   的結合物質の固相化試薬としてその固相化担体がシート
   状片からなるものを用いることを特徴とする多項目同時
   イムノアツセイ。 ２）固相化担体がペーパーデイスクであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）固相化試薬が、各特異的結合物質を固相化させたそ
   れぞれのシート状片担体を帯状に連結してなるものであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）試料中の多項目の測定物質を同時に免疫学的測定法
   により定量する方法において使用する各測定物質に対す
   る特異的結合物質の固相化試薬であつて、各特異的結合
   物質を固相化させたそれぞれのシート状片担体を帯状に
   分離測定可能に連結して構成させてなる多項目同時イム
   ノアツセイ用試薬。