JPS63102671A - 欠陥性ブロック突然変異種の製造法および新規微生物菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ステロイド化合物の選択的側鎖減成方法に用
いられる微生物の好ましい欠陥性ブロック突然変異種の
生産に関する。

［従来技術］ ステロイド化合物の微生物を利用した変換は、１９３７
年にマモリ（Ｍａｍｏｌｉ）およびベルセローネ（Ｖ　
ｅｒｃｅｌ　１ｏｎｅ）により１７−ケトステロイド類
の１７−β−ヒドロキシステロイド類への立体特異的還
元が報告されたのが最初である（ベリヒテ・デル・ドイ
ツチェン・ケミッシエン・ゲゼルシャフト（Ｂｅｒ、）
第７０巻４７０頁および２０７９頁）。

１９５２年には、ペターソン（Ｐ　ｅｔ　ｅｒｓｏｎ）
およびマレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ｌこより、す゛ゾプス・
ニクリプノン・ス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　　ｎｉｇｒｉｃ
ａｎｓ）を用いたプロゲステロンの１１−αヒドロキシ
化の工業的に重要な方法が開示されている（米国特許第
２．６０２．７６９号）。

その時以来、微生物を利用したステロイド化合物の変換
について非常に多数の報告かなされている（たとえば、
ダブリュ・チャーニー（Ｗ、Ｃｈａｒｎｅｙ）およびエ
ソチーＬル１１ハーゾーグ（１（、Ｌ　、　Ｈｅｒｚｏ
ｇ）軽ミクロピアル・トランスホーメイション・オブ０
ステロイズ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ｔｒａｎｓｆａｒ
ｍａｔｉｏｎ　ｏｆＳ　ｔｅｒｏｉｄｓ）、ニュー・ヨ
ーク（Ｎ　ｅｗ　　Ｙ　ｏｒｋ）化アカデミツク・プレ
ス（Ａ　ｃａｄｍｉｃ　　Ｐ、ｒｅｓｓ）刊、１９６７
年参照）。

しかし、ステロイド化合物の微生物的変換についてこれ
ほど多数の研究がなされたにもかかわらず、容易にしか
も大量に入手しうる出発物質から重要なステロイドホル
モン類を生成するのに適した方法はほんの少ししかなか
った。これに関連して、１７−Ｃ−アルキル側鎖を有す
る植物性または動物性のステロール化合物、たとえばコ
レスタン、カムペスタンおよびスチグマスタン系列のス
テロールが特に注目される。

非常に多種の微生物の菌株、たとえばアクロモバクタ−
（Ａ　ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクタ−
（Ａ　ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂ　ａｃ
ｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂ　ｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆ　ｌａ
ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉ
ｃｒ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎ　ｏｃａｒｄｉａ
）、プロタミノバクタ−（Ｐ　ｒｏｔａｍｉｎｂａｃｔ
ｅｒ）、セラチア（Ｓ　ｅｒｒａｔ　ｉａ）およびスト
レプトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）は、前述
のステロール化合物、たとえばコレステロールを炭素源
として生育できることが知られている（たとえば、アリ
マ（Ａｒｉｍａ）ら、アグリカルチュラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒ。

Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第３３巻１６３６〜１６
４３頁１９６９年参照）。

この様な生育に際し、微生物による攻撃または減或は、
一般に環構造および環に存在しうる側鎖の双方に対し非
特異的に起るのであるが、主として環攻撃および減成が
好ましくおよび／またはより速い反応なのである。

最と、ステロイド構造の環の減成を抑制する禁止剤の存
在下に微生物により側鎖を減成してコレステロールの変
換を行うことが報告されている（アリマ（Ａｒｉｍａ）
ら、アグリカルチュラル・アント・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ａｇｒ、　ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　）４２（
２）巻４１１〜４１６頁）。

この報告によれば、試験に供された野生菌株約２００種
の大部分が、禁止剤の影響下に出発物質のＣ−１７にお
いて側鎖を非常に選択的に減成することができる。数種
の菌株は、収量に変化があるものの３−オキソ−プレグ
ナ−１，４−ツエン−２０−カルボン酸（Δ−１，４８
ＮＧ）を与える。

ステロイド括構造を有する高品質の薬理組成物の出発物
質として１７−Ｃ側鎖を有する天然のステロール化合物
または植物起源（フイトステロール）もしくは動物起源
（コレステロール）のものが非常に重要であるので、微
生物的経路により側鎖の選択的減成を達成するための試
みが数多くなされた。

これらの業績をまとめた総説は、アドブ・アブル・ミク
ロバイオ口（Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、　）第２２巻２９〜５８頁（１９７７年）のクリス
トフ・ケイ−エイ−７−チン（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ　　
Ｋ、　Ａ。

Ｍａｒｔｉｎ）、“ミクロビアル・クリビジュ・オブ・
ステロール・サイド・チェインズ（Ｍ　１ｃｒｏｂｉａ
ｌＣｌｅａｖａｇｅ　　ｏｆ　　Ｓ　ｔｅｒｏｌ　　Ｓ
　ｉｄｅ　　Ｃｈａｉｎｓ）”になされている。この中
で、第４章を特に参照する。

この章には、側鎖の選択的減成についてこれまでの３方
法をＡ−Ｃとして分類している。これに従えぼ、従来技
術は次の３クループに分けられる。

すなわち、出発物質のステロールの環構造を環の分裂が
妨げられる機構で変換することにより側鎖の選択的減成
が可能になる：禁止剤を共存させてステロイド環の減成
および／または微生物の生育を妨げる、最後は、可能な
限り広範囲に所望の側鎖の選択的減成を行う微生物の突
然変異種を捜すことである。

上述の先行技術に従えば、微生物的減成により主として
得られる最終生成物は、１７−ケドステロイド化合物で
ある。該ステロイド化合物は、ニストラン、アントロス
タンおよびスピロスタン系ホルモン類の工業的生産にお
ける中間体としては好適であるが、プレグナ系ステロイ
ドホルモン類、たとえばプロゲステロン、ヒドロコルチ
ゾン、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニソロン、ト
リアムシノロンなどの製造にはあまり適していない。

後者の場合、１７−位に立体特異的な側鎖を再び化学的
に導入する必要がある。

アルキル側鎖および特にα−プロピオン酸残基を１７−
Ｃ位に有するステロイド化合物は、微生物を用いた減成
の物質代謝生成物としては偶然に得られるだけであった
。この型のステロイド化合物は、特に天然のステロール
類からプレグナ系ステロイドホルモン類を工業的規模で
生産する場合に有用である。しかし、この種のステロー
ルの部分減成生成物の回収が非常に困難であることは明
らかである。これは、側鎖の選択的減成を、同時に環構
造の切断および減成を防ぎながら行わなければならない
だけでなく、さらに、側鎖の減成を行う微生物の生長を
、これまでに得られた知見によれば、１７−ケドステロ
イド構造が得られるまで移行状態で停止しておかなけれ
ばならないことによる。

ノカルジアを８−ヒドロキシキノリンの様な禁止剤の存
在下に培養してコレステロールを微生物的に減成するこ
とにより少量の３−オキソ−プレグナ−４−エン−２０
−カルボン酸（Δ−４８ＮＣ）および３−オキソ−プレ
グナ−１，４−ジエン−２０−カルボン酸（Δ−１，４
ＢＮＧ）が得られろことが報告されている（ジェイ・エ
ム・ホイットマーシュ（Ｊ　、　Ｍ、　Ｗｈｉｔｍａｒ
ｓｈ）、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａＬ　　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ）第９０巻２３〜２４
真上１９６４年））。また、最近の米国特許第４．０２
９，５４９号（アントラ（Ａ　ｎｔｏｓｚ）ら）には、
１７−Ｃに炭素数８〜ｌＯのアルキル基を有するステロ
イド化合物を選択的に減成して９α−０ＨＡＤおよび９
α−ＯＨＢＮ酸を形成できるとされる微生物突然変異種
（ＮＲＲＬＢ−８１１９）が記載されている。しかしな
がら、前述のシー・ケイ・ニー・マーチン（Ｃ，に、Ａ
Ｍａｒｔｉｎ）の総説の第４章Ｃ（５０〜５２頁）に特
に示されている様に、今日に至るまで、１７−Ｃに側鎖
を存するステロイド基質から１７−Ｃステロイド−α−
プロピオン酸化合物を微生物的に製造できろ信頼性のあ
る方法はなく、また、前述の様な禁止剤が存在しなくて
も、触媒を用いた方法の様に信頼性があり、高収率で１
７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸を製造すること
ができる微生物の欠陥性ブロック突然変異種を再現的に
回収できる信頼性のある方法もない。けれども、禁止剤
の不使用または極少量の使用下に操作を行うことが、技
術的な理由により、１ことえば望ましい高時空収率を達
成するために必要である。

［発明の目的］ 本発明の目的は、天然ステロール類から禁止剤不存在下
においても１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸化
合物を工業的に生産するのに適した欠陥性ブロック突然
変異種を安全でしかも再現性のある方法で生産すること
にある。

前記化合物の本発明による微生物的生産に用いる出発物
質としては、これまで何ら実際的な重要性が見い出され
なかったので不用な物質とされていた天然および／また
は植物性ステロール類を使用することができる。これら
の天然の出発物質の簡弔な誘導体も適当な出発物質とし
て用いろことができる。

特別な態様では、本発明の目的は、前記の工業的規模の
各方法において、特定のステロールを出発物質として使
用するための高活性の欠陥性ブロック突然変異種を生産
する方法を提供することにあり、これによりステロール
類を出発物質とすることおよび選択すべき欠陥性ブロッ
ク突然変異種を利用することが可能になる。前記方法に
よる生産物であるΔ−４ＢＮＣおよびΔ−１，４８ＮＣ
は、たとえばプロゲステロン系化合物の製造中間体とし
て重要である。

［発明の構成］ 本発明の要旨は、１７−Ｃに側鎖を有するステロイド基
質、たとえば動物性または植物性ステロール化合物から
、少くとら高選択に側鎖を減成し、好気的条件下でステ
ロイド環の減成または微生物の生長を抑制する禁止剤の
不存在下においてら１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピ
オン酸化合物、特に３−オキソ−プレグナ−４−エン−
２０−カルボン酸（△−４８ＮＧ）および／または３−
オキソ−プレグナ−１，４−ジエン−２０−カルボン酸
（△−１，４８ＮＣ）を工業的規模で生産することがで
きる欠陥性ブロック突然変異種を製造ずろ方法に存し、
該方法は、 （１）ステロール化合物を単一炭素源として好気的に生
育でき、環減成に比べ１７−Ｃ−側鎖減成を好ましく行
う微生物の野生菌種を単離、培養し、（２）野生菌種を
自体既知の突然変異処理に付し、（３）突然変異種群を
、１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸化合物を生
産する突然変異種は生長せずまたは実質的に生長しない
が、共存している望ましくない突然変異種は生長して、
生長中またはその後に死滅させる分離培地（所望の突然
変異種の蓄積培地）中で培養し、次いで（４）残った突
然変異種の菌株を１７−Ｃに側鎖を有するステロール化
合物により培養しながら１７−Ｃ−ステロイド−α−プ
ロピオン酸化合物の生産性が高い菌株を分離することを
特徴としている。

前恥の△−４ＢＮＣおよび△−１，４８ＮＯの構造式は
次の通りである： ３−オキソ−プレグナ−４−エン−２０−カルボン酸、 ３−オキソ−プレグナ−１，４−ジエン−２０−カルボ
ン酸。

本発明はさらにこの方法により製造される欠陥性ブロッ
ク突然変異種、特にΔ−４Ｂ　Ｎ　Ｃおよび／またはΔ
−１，４ＢＮＣを製造する変異種を包含する。この点に
ついて述べれば、本発明は、特に新規ブロック突然変異
種コール（Ｃｈｏｌ）７３−Ｍｌｌに関するものである
。このコール７３−Ｍｌｌは、オランダ国バール（Ｂ　
ａａｒ）在、セントラールビューロー・フォール・シメ
ルクルトウールス（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　　
ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）にＮｏ
、ＣＢ５４３７．７７として、米国メリーランド、ロッ
クビル（Ｍａｒｙｌａｎｄ　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）在
、ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＮｏ、ＡＴＣ０３１３８
５として、また工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第４４９２号として寄託されている。この新規ブ
ロック突然変異種は、天然および／または植物性ステロ
ールから、たとえ禁止剤の不存在下においても、３−オ
キソ−プレグナ−４−エン−２０−カルボン酸または３
−才キツープレグナ−１，４−ジエン−２０−カルボン
酸を製造するのに好ましく用いられる。

このコール７３−Ｍｌｌは、本発明の方法に従い、新規
野生菌株コール（Ｃｈｏｌ）７３　（本発明者らにより
始めて分離されたものであり、これも本発明の目的の１
っである）から得られる。コール７３は、オランダ国バ
ール（Ｂａａｒ）在、セントラールビューロー・フォー
ル・シメルクルトウールス（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅ
ａｕ　　ｖｏｏｒ　　Ｓｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ
）にＮｏ、ＣＢＳ　６６０．７７として、米国メリーラ
ンド、Ｇ−／クビル（Ｍａｒｙｌａｎｄ　　Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ）在、ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃｉｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＮｏ、ＡＴ
ＣＣ３１３８４として、また工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第４４９１号として寄託されている
。この野生菌株はコリネ型閉（ｃｏｒｙｎｅ４ｏｒｍ　
　ｂｏｃｔｅｒｉａ）に分類される。

本発明による微生物の欠陥性ブロック突然変異種の抽出
： ・　本発明の明らかな目的は、開示された型の突然変異
種、すなわち、野生菌株の選択および突然変異処理とそ
れに続（他の選択の非常に特別な組合せにより得ること
ができる微生物であって、示された種類のステロイド化
合物により生育する微生物の欠陥性ブロック突然変異種
を製造する安全かつ再現性ある方法に存する。

本発明の方法に従い得られた欠陥性ブロック突然変異種
は次のような特徴を有している。すなわち、この突然変
異種は、炭素源としてステロイド環を消費したとしても
、ステロイド環による生育に対して相当な程度ブロック
されており、一方、この突然変異種は、ｌ　７−Ｃ位に
存在しまたは形成されたα−プロピオン酸残基の減成に
対して充分ブロックされているので１７−Ｃ位に長い側
鎖を有する対応するステロイド基質からの１７−Ｃ−ス
テロイド−α−プロピオン酸化合物の確実な製造および
発酵液からの該化合物の単離を技術的に良好な収率で行
うことができる。要すれば、この方法は、前述の禁止剤
の不存在下でも有利に行うことができろ［たとえば、ク
リストフ・ケイ・エイ・マーチン（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ
　　Ｋ、　Ａ、　Ｍａｒｔｉｎ）の前掲書第４章Ｂ参照
コ。この方法は、本発明による野生菌株の特別な選択、
それに続く突然変異処理および選択段階の組合せにより
行われる。

本発明の方法においては、所望のブロック突然変異種は
次の４段階の操作を連続して実行して得られる。

第１段階：微生物の野生菌株の選択 第２段階：突然変異処理 第３段階：第２段階で得られた突然変異種の分離または
全突然変異種群から得られ た所望の突然変異種の濃縮 第４段階：第３段階で分離または濃縮した突然変異種の
培養および所望の１７−Ｃ −ステロイド−α−プロピオン酸化 合物を最適に生産するブロック突然 変異種の選択。

上記４段階の手順は、所望の欠陥性ブロック突然変異種
を得る為に連続して１度に行うことができる。しかし、
この手順において、第３段階で分離または濃縮された突
然変異種を再び第２段階の突然変異処理に付し、更に第
３段階にかけるという様に、第２段階または第３段階を
１回ないし数回繰り返して行うのが有効である。

第１〜４段階の各操作を次により詳しく説明する。

第１段階：望ましい野生菌株の選択 選択される微生物の野生菌株は、ステロイド化合物、特
に１７−Ｃに側鎖を有するステロイド化合物により好気
的条件下に生育できるものでなければならない。本発明
に適した菌株は、ステロイド環の減成速度に少くともほ
ぼ等しい側鎖減成速度を有しているものである。けれど
も、好゛ましい野生菌株は環減成に比べ側鎖減成におい
てより大きい速度を示すものである。

野生菌株は、土壌試料から既知の方法により分離するこ
とができろ。植物性および動物性ステロール化合物が広
く分布していることから、上述の種類の好ましい野生菌
株は、一般にいずれの土壌試料からも見い出される。野
生菌株は、水性培地中、好気的条件下で、好ましくは単
一炭素源としての１７−Ｃに側鎖を有するステロイド化
合物の存在下に培養する。

必ずしも必要ではないが、本発明におけるこの選択手順
において、最終的に所望の欠陥性ブロック突然変異種に
より減成されるステロイド化合物を炭素源として供給す
ることもてきる。

たとえば、コレステロールまたはフィトステロールを最
終的に減成して１７−Ｇ−ステロイド−α−プロピオン
酸化合物を得ようとする場合、これらの天然ステロール
類の１つ、要すれば工業的規模で使用される特定のステ
ロール化合物を、好ましい単一炭素源として野生菌株の
選択および培養に用いる通常の培地に存在させることが
できる。

しかしながら、野生菌株の１択および培養におけろ炭素
源としてのステロールと最終のステロイド減成過程に用
いられるステロール化合物の間に対応がある必要がない
ことが見い出されている。

全過程の中では、適当な野生菌株を選択することが特に
重要である。通常、野生菌株は側鎖減成上り環誠成を主
として行うことが見い出されている。本発明により選択
されるべき野生菌株は、ステロイド化合物の環減成速度
に比べ少くともほぼ等しい側鎖減成速度を示す乙のでな
ければならない。次の様な野生菌株を選択し、培養する
のが好ましい。すなわち、その様な菌株は、１７−Ｃ位
に飽和または不飽和の、好ましくは炭素数８〜１０のア
ルキル基を有するステロール化合物により生育する場合
、後述の標準状態で測定した選択減成性能か一般式： ％式％ （ここで、ａは生育因子、ｂは選択因子を表わす。）で
示される選択係数Ｉに従うような菌株である。

適当かつ好ましい野生菌株の選択を特徴づける選択係数
１は、上に示された様に、生育因子ａと選択因子すの関
数として得られる。

好ましい微生物の野生菌株に対するＩは少くともｌＯで
ある。■が大きい程望ましく、少くとも１００以上であ
ることが望ましい。

多くの分離された野生菌株群から野生菌株を選択した場
合、最高の■値を有する菌株を本発明の次の段階の手順
に付すことが好ましい。この様にして、■が少くとも＋
０５である野生菌株を選択することが特に有利である。

さらに、■の絶対値は、炭素源として使用されるステロ
イド基質の種類に影響されることが見い出された。すな
わち、たとえば最初の選択ステップにおいて動物性ステ
ロール化合物で培養すれば植物性ステロールで培養する
よりも著しく成長し、それに対応してより大きいＩ値を
得ることができるのである。この記述にとられれること
なく、野生菌株の選択におけるこれまでに示された好ま
しい条件を採用することができる。

成育因子ａおよび選択因子すの決定は、次に示す標準状
態（好気性過程）において行う。

成育因子ａ。

特定の微生物菌株を、５００ｍＣエルレンマイエルフラ
スコ（以下に示す組成の栄養液１００　ｍＱＭ入れられ
ている）中において、３０℃、＋５Ｏｒ、ｐ、ｍで振盪
しながら培養する。

育成培地は、次の組成から成る： ＩＱ、当り １．０９　　リン酸二水素カリウム ０．５９　５＆酸マグネシウム・七水和物０．１９　　
塩化ナトリウム ０．１９　　塩化カルシウム・二水和物５ｇ　　　　硫
酸アンモニウム １．０９　　　トウイーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　８０　（
ポリオキンエチレンソルビタンモノオレエ ート） ２．０９　　１７−Ｃに側鎖を有するステロール化合物
（たとえば、コレステロー ルまたはシトステロール） ０５ｇ　　酵母エキス ０．０１９１−ヒスチジン ０゜０２９　ｄ（２−メチオニン ０．０２９　　ｄＱ”−）ジットファン２μ９　　　ビ
オチン ４００μ９　パントテン酸カルシウム ２μ９　　　葉酸 ２０００μ９　イノジット ４００μ９　ナイアシン ２００μｇ　Ｐ−アミノ安息香酸 ４００μ９　ピリドキシン塩酸塩 ２００μ９　リボフラビン ４００μ９　チアミン塩酸塩 微量元素溶液 この生育培地のｐＨは６．８である。

生長（細胞密度）を測定するために、一定時間毎に撹拌
した培養物から、定量の細胞懸濁液を採取する。蒸留水
に対する吸光度（Ｅ゛）を、光度計（ツアイス（Ｚｅｉ
ｓｓ）−ホトメータ、タイプＰＬ４）により、波長６２
０　ｎｍ（液厚ｄ＝　１　ｃｍ）で測定する。

生長の始まる前の、初期吸光度ＥＯ（すなわち、ｔ”ｔ
ｏでの吸光度）は約０．７７５である。＠副液は吸光度
が０．７程度において測定できる様に希釈して用いる。

生育因子ａは、上記の培養条件では遅くとも５日で到達
する対数生長期の柊時点（時間ｔ１、吸光度Ｅｌ）にお
けろ細胞懸濁液の最大吸光度として与えられる。すなわ
ち、ａ−ΔＥ＝ＥＩ−Ｅｏ　である。

選択因子ｂ＝ 試験すべき菌株を、トウイーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　８０
　（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）Ｏ
。

１％およびステロール化合物（たとえば、コレステロー
ル）０．１％を含有する栄養ブイヨン■メルク（Ｍｅｒ
ｃｋ）製）において、３０℃で４８時間培養する。次い
で、細胞を緩衝液で洗浄し、リン酸緩衝液（ｐＨ７，５
）に再懸濁する。

ステロール化合物の減成は、ワールブルグ（Ｗａｒｂｕ
ｒｇ）容器において、放射性同位体により標識されたス
テロール化合物、たとえば４−”Ｃ−および２６−１４
Ｃ−コレステロールまたは対応する標識されたシトステ
ロール化合物を並行して測定する。

主容器内の細胞懸濁液２．４３１１２に、ステロール溶
液０．２ｍｆ７（たとえばコレステロール溶液）（約０
゜１μＣｉで標識された基質５マイクロモルのトウィー
ン８０　０．１％溶液）を加える。試料を３０℃で６日
間培養し、反応は４Ｎ硫酸０　、２　ｍＱを加えて停止
させる。

基質の分裂により発生した二酸化炭素をエタノールアミ
ン（０，２ｆｆＣ）に補集し、シンチレーション計数管
により測定する（試料０　、１　ｙ、（ｌを各々シンチ
レーション溶液チンサー・ユニソルブ（Ｚｉｎｓｓｅｒ
Ｕ　ｎｌｓｏｌｖ月　１５ｘｆｆに溶解）。

選択因子すは、この様にして測定した放射能の無次元比
として次式で表わされる： この式におけるステロール化合物は使用された放射性同
位体で標識されたステロール化合物、たとえば対応する
コレステロールまたはβ−シトステロール化合物である
。

環の炭素原子および側鎖の炭素原子を放射性標識するこ
とによりステロール化合物の微生物による減成を測定す
る技術は一般にすでに知られている［たとえば、ステロ
イズ（Ｓ　ｔｅｒｏｉｄｓ）　６７７〜Ｇ８８頁１９６
４年、ジー・イー・ピーターソン（Ｇ　、　Ｅ　、　Ｐ
　ｅｔｅｒｓｏｎ）およびジエイ・アール・ディビス（
Ｊ、　Ｒ，Ｄａｖｉｓ）″コレステロール・ユーテイリ
ゼーション・パイ・ストレプトマイセス・エスピーピー
（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
　　ｂｙＳ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　５ｌ）ｐ）”
およびザ・ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、Ｂ、Ｃ）第２０６巻５１１〜５２３頁１９
５４年、スレッサ・シー・スタットマン（Ｔｈｒｅｓｓ
ａ　　Ｃ，Ｓｔａｄｔｍａｎ）ら“スタデイズ・オン・
マイクロバイオロジカル・デグラディション・オン・コ
レステロール（Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆ　Ｃｈ
ｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）”参照コ。

本発明の方法のこの第１段階における野生菌株の選択に
とって、野生菌株の選択因子すが少くともｌ、好ましく
は少くとも２であることが望ましい。野生菌株の生育因
子ａは少くとも０．！、好ましくは少くとも０．２、最
も好ましくは少くとも１である。

本発明の方法の後続段階に最も適した野生菌株を選択す
る場合、因子ａとｂを互いに調整することか望ましい。

本発明の範囲においては、特に大きい選択因子すを有す
る野生菌株が有利であり、また、異なる分離野生菌株の
間で選択を行う場合、まず選択因子すができるだけ大き
いものを選択するのが有利である。

一方、当然、特に良好に成長すること（生育因子が非常
に大きいこと）も、突然変異させ、その後、突然変異種
群から選択を行うための野生菌種の選択における指標で
ある。

アクロモバクタ−、アルスロバクタ−、バチルス、ブレ
ビバクテリウム、コリネバクテリウム、フラボバクテリ
ウム、ミクロバクテリウム、ミコバクテリウム、ノカル
ジア、プロタミノバクタ−、セラチアまたはストレプト
ミセスのような菌株を第１段階における野生菌株として
用いることができる。特定の菌株が属する属の特性は、
本発明の方法にとってそれ程決定的なものではない。重
要なのは、むしろ前述した様なステロール化合物を自存
した培地における培養中の菌株の特性、特に、生育因子
ａおよび選択因子すで決定される選択係数Ｉである。

第２段階； 選択された野生菌種を自体既知の方法で突然変異させる
。突然変異は、たとえば紫外線またはＸ線の高エネルギ
ー照射によって行うことがてきる。

また、突然変異誘導剤が特に好ましい。適当な突然変異
誘導剤を例示すれば、■−メチルー３−ニトロー１−二
トロソグアニジンの様なニトロソグアニジン化合物また
はエチルメタンスルホネートなどが挙げられる［詳細に
ついては、たとえば米国特許第４，０２９，５４９号明
細書第２欄５７行以下およびそれに引用された文献参照
コ。

基本的には、得られる欠陥性突然変異種の特性が詳細に
は予知できないという限りにおいては、野生菌株の突然
変異処理の結果は不確実なものであるということも事実
である。けれども、微生物の群に対して統計学の法則を
応用することができるので、突然変異の最適な開始原則
を確立することが可能である。突然変異を誘導する最適
条件を決定する方法は、既知の文献に見い出される［イ
ー・ニー・アデルバーグ（Ｅ　、　Ａ　、　Ａ　ｄｅｌ
ｂｅｒｇ）、エム・マンデル（！ｖ１．Ｍａｎｄｅｌ）
、ジー・シー・シー・チェノ（Ｇ、Ｃ，Ｃ，Ｃｈｅｎ）
“オプテイマル・コンディションズ・フォー・ミュータ
ジエニシス・パイ・Ｍ−メチル−Ｎｏ−二トローＮ−ニ
トロソグアニジン・イン・ニジエリチア・コリ（Ｑｐｊ
　ｉｍａｌＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｍｕｔａｇ
ｅｎｉｓｉｓ　ｂｙ　Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ”−ｎｉｔ
ｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｉｎ　
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）”バイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョン（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）第１８
巻７８８〜７９５頁１９６５年参照］。

一般に、微生物群における突然変異頻度を増すには、突
然変異誘導剤の濃度および作用時間を、微生物群の一部
が致死的損害を受ける程度に選ぶ。

この様にして、微生物群の生存部分における種々の突然
変異の頻度を多少とも増加させる。

本発明の方法においては、突然変異誘導剤の濃度および
作用時間は、初期群の１０〜９９．９９９％が処理によ
り不活性化される様に選ぶ。好ましくは、致死率９０〜
９９．９９％が選ばれろ。

第２段階の突然変異に続いて、第３および第４段階にお
いて、所望の欠陥性ブロック突然変異種の分離および濃
縮のために選択を繰り返す。

第３段階： 引き続いて、突然変異処理で得ｆコ微生物の大きい群か
ら本発明に望ましい特定の突然変異種を選択する為に、
培養条件は、変性された特定の特性を有する突然変異菌
株の選択が有利になる様に選ぶ。

所望の欠陥性突然変異種の濃縮は、通常、特定の突然変
異種は生育しないか、または実質上生育しないけれども
、一方、望ましくない共存する微生物は生育して生育中
または生育後に死滅させることができる様な条件下に行
う。この様にすれば、環減成酵素はブロックされている
が、ステロール化合物の１７＝Ｃ側鎖を以前と同様に減
成することができるブロック突然変異種を効果的に分離
することができる。さらに測定を行うことにより、この
第３段階においては、側鎖の減成中に選択的にα−プロ
ピオン酸残基を１７−Ｃ位に形成する様なブロック突然
変異種を分離できることが立証された。

この目的のため、突然変異種群を、最終的には所望の突
然変異種のａ縮培地として用いられる分離培地により培
養する。この様な分離培地としては、水性栄養培地を使
用することができ、該培地は、炭素源として１７−Ｃ位
に限定された数の炭素を膏する側鎖を有するステロイド
化合物または全＜１７−Ｃ位に側鎖を有しないステロイ
ド化合物を含有する。

１７−Ｃ位に置換基を有しないステロイド化合物を除い
ては、炭素数が５を越えない側鎖を有する化合物がこの
突然変異種の分離培地に加える炭素源として適している
。

とりわけ、突然変異種の分離または濃縮培地の炭素源と
してｌ　７−Ｃ位に炭素数３の側鎖を有するステロイド
化合物を用いるのが望ましく、１７−Ｃ−ステロイド−
α−プロピオン酸化合物の１種または２種以上を単一炭
素源として用いるのが好ましい。

さらに、分離培地の炭素源として、本発明に従い培養さ
れるブロック突然変異種により最終目的物として生産さ
れる１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸化合物を
用いるのが特に好ましい。

従って、植物性または動物性ステロールからΔ−４８Ｎ
　ＧまたはΔ−１，４ＢＮＣを最終的に得ようとする場
合、第３段階の分離または濃縮培地の単一炭素源として
Δ−４ＢＮＣおよび／またはΔ−１，４８ＮＣを好まし
く用いることができる。

他方、この方法は、通常の栄養溶液を用いて好気的条件
下に行うこともできる。

突然変異処理により突然変異した微生物は、与えられた
炭素源での生育能力を失っており、分離培地で培養され
ても自己増殖できない、すなわち生育しない。第２段階
の突然変異処理においてそれ程損傷も受けず、また他の
害も受けていない突然変異種群の他の部分のものは分離
培地の炭素源により生育することができ、培養中に増殖
する。

本発明では、突然変異種分離培地における条件選択の習
性の相異を利用して、非生育突然変異種に損傷を与える
ことなく生育菌株を生育中または生育後に死滅させる。

この様な分離は、たとえば、ペニシリン化合物のような
抗菌剤を加えることにより可能となる。

ペニシリン化合物を加えれば、非生育菌株を傷つけずに
残したまま生育した微生物菌株を死滅させることができ
る。

突然変異種の他の可能な分離方法は、細胞破壊物質、特
に放射性物質の分離培地中で生育している突然変異種群
に加える方法である。たとえば、３２ｐが好ましく用い
られる。

この方法は、たとえば適当な放射性同位体で標識された
塩を栄養溶液に併存させて行うことができる。３２ｐを
用いて分離する場合、栄養溶液にＮａＨ，”Ｐｏｔを併
存させるのが有用である。

本発明の目的であるブロック突然変異種は他の損傷を受
けていない突然変異種から既知のレダーバーブのスタン
プ法を用いて分離することができる。

ここで使用されたペニシリン濃縮方法およびレグ−バー
ブのスタンプ法は、たとえばザ・ジャーナル・オン・ジ
・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ　、　Ａ　ｍ
ｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ　ｏｃ、）第７０巻４２６７頁
１９４８年ビー・ディ・デービス（Ｂ　、　Ｄ　、　Ｄ
　ａｖｉｓ）（ペニシリン濃縮方法）、ジャーナル・才
ブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔ、）第６３０３９
９頁１９５２年ジエイ・レダーバーブ（Ｊ　、　Ｌ　ｅ
ｄｅｒｂｅｒｇ）およびイー・エム・レダーバーブ（Ｅ
、Ｍ、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ）（レダーバーブのスタンプ
法）に記載されている。

第４段階： この様にして分離、選択された欠陥性ブロック突然変異
種は、ここで通常の培地により培養され次いで、要すれ
ばさらに選択を行う。この選択は、たとえば用いられる
出発物質（天然まｆこは植物性ステロール化合物など）
に依存し乙微生物菌株に所望される結果に従って行うこ
とができ、この場合、微生物の生育における物質代謝生
産物の化学的性質および菌株の生育能力が決定的な要因
になる。最終の目的物の生産能力が最大のブロック突然
変異種が好ましいことはもちろんである。

この様にして得られた菌株は、工業的規模の工程で使用
することかできる。

この段階での培養および選択は１回または複数回行うこ
とができろ。

本発明の方法の範囲内において、突然変異誘導剤のより
強い効果が、目的物の生産を最大にする上で欠陥性突然
変異種に望ましく現われるようにするために、各段階、
すなわち第２段階の突然変異およびそれに続く第３段階
の突然変異種の分離を１回または複数回反復することが
できる。そして通例最後に第４段階の操作を行う。

所望される特７こ活性の高い欠陥性ブロック突然変異種
を決定する為に、収率を決定する標準試験を用いろこと
ができる。この試験は、禁止剤の不存在下に次の条件で
行う。すなわち、試験すべき欠陥性ブロック突然変異種
を、ペプトン０．８％、酵母エキス０．９％、グルコー
ス０．３％、トウイーン８０（ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレエート）０．０６％およびコレステロー
ルまたはシトステロール０．０６％の組成を有する栄養
溶液（ｐＨ７，２）１００ｍＱの入った５００ｉＱエル
レンマイエルフラスコで培養する。菌株は、振盪器を用
い、振盪速度１５０　ｃｐｍＳ温度３０℃で６２時間予
備培養する。次に、ＢＲＩＪ３５（ポリオキシエチレン
モノラウリルエーテル）０．１％およびステロール化合
物０．１％を加えて１２０時間培養を続ける。培養を終
了させた後、試料を採取し、抽出して薄層クロマトグラ
フィーにより分析する。

本発明において好ましい欠陥性ブロック突然変異種は、
コレステロールまたはシトステロールを基準にして、ｌ
　７−Ｃ−α−プロピオン酸化合物特にΔ−４ＢＮＣお
よび／またはΔ−１，４８ＮＣの収率が少くとも１５重
量％、好ましくは少くとも３０ｆｆｉ竜％を示すもので
ある。コレステロールを用いた場合、使用コレステロー
ル環を基準にした収率は少くとも５０重量％、たとえば
７０〜８０重１％にすることができる。シトステロール
を用いた場合、収率は一般にやや低く、たとえば４０〜
５０重量％である。

けれども、この様な収率は、禁止剤を用いない方法では
これまで達成することはできなかった。

１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸化合物、特に
３−オキソ−プレグナ−４−エン−２〇−カルボン酸お
よび／または３−オキソ−プレグナ−１，４−ジエン−
２０−カルボン酸の製造方法： 出発物質として選ばれたステロール基質、たとえば天然
のステロール化合物の選択的変換は、以上に述べた方法
により欠陥性ブロック突然変異種を選択した後、自体既
知の手順で行うことができる。たとえば、出発物質であ
るステロイド化合物は、培養期間中に培地に加えること
ができ、あろいはブロック突然変異種の培養開始前に培
地に加えておくこともできる。ステロイド化合物は１種
でまたは２種以上の混合物として使用することができる
。選択的に減成されるべきステロイド化合物は、培地Ｉ
Ｑ当り約０．１−１００９の割合て用いるのが好ましい
。培養段階で変換されるステロイド化合物の最適濃度は
、一般に菌株に依存し、いずれの場合も簡単な予備試験
で決定できろ。通常、培地中のステロール化合物濃度は
、２０９／ｆｆを越えないことが望ましく、多くの場合
、１５９／Ｑを越えず１９／（２以上にするのが好まし
い。

側鎖を減成すべきステロイド化合物は、反応系に一度に
加えるのではなく、少量ずつ加えるのが好ましい。出発
物質であるステロイドを、減成反応の行われる系へ実質
上連続的に加えるのが特に好ましい。この様にすれば、
所望の減成生成物の収虫を増すことができる。

微生物は、炭素源として変換されるべきステロール類ま
たは物質代謝できる追加の炭素源゛のいずれかを、通常
その微生物に必要な栄養分および育酸物質と共に含有し
ている生育培地で培養する。

微生物の生育にとって特に好ましいのは、パラフィン、
グリセロール、カルボン酸、でん粉、デキストリン、蔗
糖、グルコース、フルクトースおよび砂糖含有廃物など
である。好ましい窒素源は、アンモニウム塩、硝酸塩、
ペプトン、とうもろこし浸漬液、大豆粉、醸造糟、魚粉
などである。

さらに、発酵を促進する為に、酵母エキスやビタミン類
を添加することができる。栄養培地にはカルシウム塩、
マグネシウム塩、マンガン塩または鉄塩と同様、ナトリ
ウム塩、カリウム塩、リン酸アンモニウムなどの無機塩
を含有させることも有益である。

ステロール類の培地への乳化は、既知の乳化剤、たとえ
ば脂肪酸ソルビタンエステル類またはそれらのエチレン
オキシド付加物、ポリオキシエチレンモノラウリルエー
テルまたは脂肪酸アミノ−アルキルベタインを用いて行
うことができる。

使用培地は、微生物培養前に加熱して殺菌するのが好ま
しい。培地を冷却し、微生物菌株の適当な種菌を接種し
た後、２５〜５５℃、好ましくは２７〜３０℃で培養す
る。培地のｌ）　Ｉ−１は４〜８５、好ましくは７．０
〜８．０にする。培地には、振盪、撹拌または吹込みに
より酸素を供給し、ステロールが所望程度織成されるま
で培養を続ける。

減成に要する時間は、ステロイド濃度および発゛酵条件
に依存するが、一般に２・１〜１６０時間を要する。

この様にして得られた生成物は、通常、発酵液中に蓄情
され、次いで反応混合物から既知の方法で回収される。

たとえば、ＢＮＣ化合物は、細胞の分離を行う前または
行った後に、有機溶媒を用いて培地から抽出される。有
機溶媒としては、メチルイソブチルケトン、酢酸エステ
ル、ｎ−ヘキサノール、ｎ−オクタツール、クロロホル
ムまたはｎ−ヘキサンなどが用いられる。

具体的には、ＢＮＣ化合物の分離は、ＢＮＣ１９を含有
する発酵液ｔＣに対し、はぼ同量の前述のような有機溶
媒を用い、パーコレータ、ホモジナイザー、分液漏斗で
行う。後二者による場合、乳濁液からＢＮＣ含有有機相
を分離する為に遠心操作を加えなければならない。

溶媒を蒸発させた後、ＢＮＣ含有残渣を、たとえばベン
ゼンから再結晶化して純品とする。融点は２３３〜２３
６℃である。

溶媒抽出は、とりわけ酸性領域で可能である。

たとえば、試料を５０％硫酸でｌ）Ｈ約２に調節し、メ
チルイソブチルケトン、酢酸エステル、ｎ−ヘキサノー
ル、ｎ−オクタツール、クロロホルムまたは、ｎ−ヘキ
サンで上述の様に抽出する。抽出は、中性領域において
も行うことができる。

精製は、陰イオン交換によっても行うことができる。こ
の場合、発酵液は、まず望ましい濃度に濃縮し、アルカ
リ性、たとえばりＨ１２に調節する。規定量のメタノー
ルを加え、ホモジナイザーで撹拌した後、細胞塊をバス
ケット遠心分離機で分離する。上澄のアルコール−水を
ポンプで取り出し、イオン交換カラムに通す。イオン交
換樹脂としては、たとえばアセテート型の陰イオン交換
樹脂を用いろ。ＢＮＣ化合物は、完全にイオン交換樹脂
に結合する。酢酸のメタノール１０％溶液で溶出すれば
、主としてｌ３ＮＣを含有した生成物が得られる。再結
晶すれば、融点２３３〜２３６℃の純ＢＮＣが得られる
。

好ましい具体例によれば、ＢＮＣ化合物は、発酵液から
酸性領域におけろ沈殿および濾過により簡単に単離でき
る。この場合、発酵液をアルカリ性にし、濾過して細胞
質および他の固形成分を除去する。その後、酸性化して
ＢＮＣを固体状で沈殿させ、例えば吸引濾過して容易に
回収することができる。

酸性化には、いずれの鉱酸も使用でき、また、酢酸のよ
うな有機酸、さらに気体状二酸化炭素も使用できる。ｐ
＋−１５において、完全な沈殿が行われる。懸濁液を少
しの間加熱すれば濾過を有利に行える。

単離された固体物は、最高９０％のＢＮＣ化合物を含有
している。純品は、再結晶により得ることができる。

本発明の開示したところは、コレステロール、シトステ
ロールなどのような天然のステロイド基質を用いてのみ
実施されるのではない。たとえばΔ−４ＢＮＣおよび／
またはΔ−１，４８ＮＣに変換される出発物質には、こ
れらの誘導体、たとえばコレステノン、シトステノン、
スチグマステノンなどが包含される。

本発明の研究段階において、コリネ型細菌に属する野生
菌株が、所望の欠陥性ブロック突然変異種を得る為に特
に適していることが見い出された。

この菌株コール７３（微工研菌寄第４４９１号）の形態
的性質および生理的性質の詳細な研究を行った結果を次
に示す。

１、細胞形　不規則、主として短環体、一部球形または
長環体、部分的に分岐、 一部角；未成熟微生物：主として長 い、弱く分枝した環体。

２、胞子形成　陰性。

３、ダラム染色性　陽性。

４、肉汁寒天平板培養　小円形淡黄色コロニー、周縁円
滑、凸形、円滑、 光沢。

５　グルコース−寒天 生育　　　　　　　やや良好、他は４と同じ。

６　グルコース−硝酸 塩−寒天生育　　　やや良好、他は４と同じ。

７、ポテト−寒天生育　コロニー結合、やや赤味、他は
４と同じ。

８、グルコース−アス パラギン寒天生育　非常に小さい円形コロニー、淡黄色
、周縁用 滑、光沢。

９°、でん粉−寒天生育　中程度の円形コロニー、一部
浅裂、淡黄色、光沢、 肉汁寒天上より湿潤。

１０、カゼインカルンウ ム寒天生育　　　　生育速度小、カゼイン性圏形成せず
。

１１、脱脂乳生育　　　　陰性、凝固せず。

１２、トリプトフマンか らのインドール生成　陰性 １３、酸生成／メチルレ ラド試験　　　　　陰性。

１４ボガスープロスカ ウア（Ｖｏｇａｓ　−Ｐ　ｒｏ− ｓｋａｕｅｒ）反応（アセ トン形成）　　　　陰性。

１５、クエン酸塩生育　　極微量〜陰性。

１６、ＮＯ３のＮＯｌへの 還元　　　　　　　陰性。

１７、ＮＯｘの還元　　　弱陽性。

１８、炭化水素の利用　　グルコース、フラクトース、
蔗糖、麦芽糖、 マンノース、乳糖、ガ ラクトース、マンニラ ト、ラムノース、アラ ビノースおよびでん粉 を利用；いずれもガスま たは酸の生成なし。

１９、塩化ナトリウム 一肉汁　　　　　　ＮａＣ１３％で良好に生育、５％で
普通に生育、 ７％で生育せず。

２０、尿素の分解　　　　陽性。

２１、酸素要求　　　　　厳密に好気性。

２２、生育温度　　　　　１９〜３７℃で生育、３０℃
付近で良好。

２３．０．５９ＮａＨ＊ＰＯ４ １，８９に、ＨＰｏ。

０．５９Ｍｇ５Ｏ，−７８２０ ０，２９ＭｎＳ　Ｏ４・４　Ｈｔｏ ｏ、２９０ａＣ１ｔ・２ＨｔＯ Ｏ，０２９ＦｅＳＯａ＊７ＨｔＯ ０、５９Ｎ　８４Ｎ　Ｏ３ ｔ、ｏ９）ウィーン８０ ２．０９コレステロール １０００ｘｃ蒸留水（ｐＨ６，８） における生育　　　　６日後、白色小コロニー。

この野生菌株を、後に述べる実施例で示す様にｌ−メチ
ル−３−二トロー１−二トロソグアニジンで処理して突
然変異させる。突然変異種群を本発明の方法に従って処
理して、新規ブロック突然変異種コール７３−Ｍｌｌ（
微工研菌寄第４４９２号）を得る。このコール７３−Ｍ
ｌｌは、ステロイド環減成および／または生育を抑制す
る禁止剤の不存在下においても３−オキソ−プレグナ−
４−エン−２０−カルボン酸および／または３−オ千ツ
ープレグナー１，４−ジエン−２０−カルボン酸を生産
できろ。

この様にして、コレステロールを出発物質として、たと
えばΔ−４８ＮＧおよび／またはΔ−１゜４８ＮＣを良
好な収率で得ることができ、一方、ＡＤおよび／または
ＡＤＤは極少量しか生産されない。

次に実施例を挙げて本発明方法を更に具体的に詳述する
。

［実施例］ 実施例Ｉ Ａ、適当な野生菌株の回収ニー 常套の濃縮方法に従ってステロール減成微生物を土壌試
料から単離し、寒天平板試験法でコレステロールでの生
育能力に関して試験する。単一炭素源としてコレステロ
ールを用いて明確なコロニー発育を示す菌株を更に選択
操作に付する。

Ｂ、生育因子ａの決定ニー 生育因子ａを決定するため、下記組成の培地中、単離し
た純粋の培養菌を振盪培養法により好気的に培養する。

培地組成（ｌρ当）ニ リン酸二水素カリウ、ム１．０９：硫酸マグネシウム・
七水和物ｏ、５９；塩化ナトリウム０．１ｇ；塩化カル
シウム・二水和物０．１’Ｃ硫酸アンモニウム５．０ｇ
ニドウィーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　８０　（ポリオキシエ
チレンソルビタンモノオレエート）１．０９；１７−Ｃ
−側鎖スチロール化合物（たとえばコレステロール）２
．０９；酵母エキス０．５９：Ｒ−ヒスチジン０゜０１
９；ｄｆ２−メチオニン０．０２９：ｄｆ２−　）リブ
トラアン０．０２９．ビオチン２μ９；パントテン酸カ
ルシウム４００μｇ：葉酸２μ９：イノシット２’ＯＯ
Ｏμ９；ナイアシン４００μ９；ｐ−アミノ安息香酸２
００μ９：ピリドキシン塩酸塩４００μ９；リボフラビ
ン２００μｇ：チアミン塩酸塩４００μ９；微量元素溶
ｔＬ：栄養培地のりＨ６，８゜ 細胞懸濁液の吸光度を測定するため、２４時間間隔でそ
れぞれの試料を採取し、ツァイスーホトメータ（タイプ
ＰＬ４）で蒸留水に対して波長６２０　ｎｍ（ｄ＝　Ｉ
　Ｃｍ）における吸光度（Ｅ゛）を測定する。

発育因子ａは対数発育期の終時点における最大吸光度か
ら初期吸光度（Ｅ　ｏ）を差引いた値として得られる。

Ｃ４還択囚子すの測定ニー 引続き、２６−”Ｃおよび４−”Ｃで標識したコレステ
ロールを用い、コレステロールの側鎖減成能に関するワ
ールブルグ（Ｗａｒｂｕｒｇ）試験法により振分フラス
コ中、コレステロールで最良の発育を示す上記野生菌株
を試験する。

この菌株を５００ｍＱエルレンマイエンマイエルフラス
コ中ン１．５６％、酵母エキスｏ、２８％、塩化ナトリ
ウム０．５６％、グルコースｏ、ｉｏ％、トウイー：／
（８０）０．１０％、コ’ｖ；Ｚテａ−）’ｖＯ。

０５％から成る栄養溶液（ｐＨ７，２）１５０′ＲＱを
用いて培養する。この菌株を機械的振ｄ器上、３０℃て
４８時間培養し、次いで細胞を遠心分離して０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）中で２回洗浄し、同−容の
緩衝液に再懸澗する。

ワールブルグ試験のため、細胞懸ω液２．４ｚｔ２をコ
レステロール溶液（コレステロール５マイクロモルおよ
び４−”Ｃまたは２６−”Ｃ２００００ｃｐｍ）　０　
、２　ｚＱ中で培養する。放射能を有する遊離二酸化炭
素を中心容器内のエタノールアミン０゜２πρ中に捕集
する。３０℃で６時間後、６Ｎ硫酸０．２１を加えてこ
の反応を停止させ、同時に懸濁液に残存する二酸化炭素
を追出す。吸収した１４ＣＯ２を測定するため、ワール
ブルグ容器からエタノールアミン０　、１　ｚＱを取出
し、シンデレージョン計数管（バーソルド（Ｂ　ｅｒｔ
ｈｏｌｄ）−フリーセフ（Ｆ　ｒ　１ｅｓｅｋｅ）社タ
イプｂＦ５０００）で放射能を測定する。選択因子すは
商（２６−１４ＣＯ２）／（４−”ｃｏｔ）として計算
されろ。

上記試験結果から、野生菌株のコール（ｃｈｏｌ）　７
３を選択した。結局、この菌株の生育因子ａの値は３．
７１、選択因子すの値は５０であった。この菌を使用し
て所望のブロック突然変異種を得た。

一連の野生菌株のワールブルグ試験における好ましい選
択因子ｂ：（２６−目ＣＯ２）／（４”ＣＯ２）を下表
に示す。

内部の名称　　寄託受理番号　　選択因子ｂＳＣ−１８
ＤＳＭ　　１４１９　　　１．ｌ５Ｃ−８９ＤＳＭ　　
１４２１　　　１．２ＳＣ−１０４ＡＴＣＣ３１４５５
１，９ＳＣ−３３８ＤＳＭ　　１４２５　　　１．７Ｓ
Ｃ−３５８ＤＳＭ　　１４２７　　　１゜２ＳＣ−３７
２ＤＳＭ　　１４２８　　　２．３実施例２ Ａ、突然変異ニー 突然変異および選択方法を完全に実施することにより、
コール７３菌株から突然変異種コール７３−Ｍｌｌを単
離する。

Ｂ、良好なりＮＣ収率を示す突然変異種の回収ニー １、紫外線照射による突然変異処理。

ＢＮＣ収率を増大させろため、上記突然変異種コール７
３−〜ｉ１１を別の突然変異処理に付する。

この処理において、機械的振盪器上、ペプトン０８％、
酵母エキス０．９％、グルコース０．３％、トウィーン
（ｓｏ）ｏ、ｏｓ％、コレステロール００６％から成る
栄養溶液（ｐＨ７、２、栄養溶液Ａと呼称する。）中で
上記菌株を３０°Ｃで繁殖さ什る。

対数発育期に達したとき、細胞を遠心分離し、滅菌０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６、５）で２回洗浄し、同様の
緩衝液に再懸濁し、顕微鏡て細胞密度を１０８（細胞数
）／ｘｆ２に調節し、この細胞懸濁液８ｔｔｒＱをペト
リ皿に入れ、紫外線ランプ（ゲッチンゲン市在、ニー・
ジュツト・ユン（Ｅ　、　Ｓ　ｃｈｕｃｔＪ　ｕｎ）社
製の紫外線照射ランプ）を用いて距離３０□で９０秒照
射する。

Ｃ１所望の突然変異種の選択および単離、−１、最終生
成物の生成抑制能が弱められた菌株の濃縮ニ リン酸二水素ナトリウム０．０５％、リン酸水素二カリ
ウム０．２０％、硫酸マグネシウム・七水和物０．０５
％、塩化カルシウム・二水和物０゜０２％、硫酸マンガ
ン・四水和物０．００５％、硫酸鉄・七水和物０．００
５％、硫酸アンモニウム０．１０％、ビオチン０．００
１％、ＢＲＩＪ３５（ポリオキンエチレンモノラウリル
エーテル）０゜１０％、コレステロール０．５０％、Ｂ
ＮＣｏ、５０％から成る栄養溶液（ｐ）１７．２）中で
、上記紫外線照射した細胞懸濁液を培養する。３０℃で
７２時間培養した後、この培養液１ｍＱを新鮮な栄養溶
液Ａに入れて再び好気的に３０℃で４８時間培養する。

２、ペニシリン法 発現することもある復帰突然変異を除くため、生育培養
溶液をペニシリン処理に付する。上記細胞懸濁液０．１
スＱを、リン酸二水素ナトリウム０゜０５％、リン酸水
素二カリウム０．２０％、硫酸マグネシウム・七水和物
０．０５％、塩化カルシウム・二水和物００２％、硫酸
マンガン・四水和物０．００５％、硫酸鉄・七水和物０
．００５％、硫酸アンモニウム０．１０％、ビオチン０
．００１％、ＢＲＩ　Ｊ　３５（ポリオキシエチレンモ
ノラウリルエーテル）ｏ、ｉ　ｏ％、ｌ３ＮＣＯ，１０
％から成る栄養溶ｔＬ（ｐｔｌ　７　、２　）　ｌ　Ｏ
ｍＱに入れろ。３０℃で１８時間振盪した後、上記と同
一の組成を何する新鮮な栄養溶液をあらかじめ加温し、
この溶液で約１０６（細胞数）／Ｗｆ２に希釈し、１０
０ＯＩＵペニシリンＧを加え、更に３０℃で５時間培養
する。細胞を遠心分離して抗生物質を除き、滅菌した生
理食塩溶液で細胞を洗い、ＢＮＣの代りにコレステロー
ルｌ、０％を含有する上記同様の培地中で細胞を更に４
８時間培養する。得られた細胞！！澗液を溶液に寒天１
．６％を加えｔこ上記同様の栄養培地の平面上に塗抹し
て、基質濃度を大にしたその培地上で最も良好な発育を
示すコロニーを培養菌株として使用する。

上記の方法により、菌株を単離し、コレステロールと共
に培養して良好なりＮＣ収率を示才菌味を得た。これら
の菌株を西ドイツ国ゲッチンゲン在、ドイッチェン・ザ
ンムルング・フユア・ミクロオルガニスメン（Ｄ　ｅｕ
ｔｓｃｈｅｎ　　Ｓ　ａｍＩＩＩｌｕｎｇ　　ｆｕｒＭ
　ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ＝　Ｄ　Ｓ　Ｍ）に寄
託した。これらの菌株を次に示す。

内部の名称　　、寄託受理番号　　ＢＮＣ収率Ｔ　＋　
３７　　　　Ｄ　Ｓ　Ｍ　１４２５　　３１５ｉ９／１
００ｉ（２Ｔ　ｌ　３９　　　ＤＳＭ　１４３７　　３
０５所／１００峠Ｔ　１６２　　　Ｄ　Ｓ　Ｍ　１４３
９　　３２１１９／　１００ｉｆ２Ｔ１６６　　　ＤＳ
Ｍ　１４４２　　３０８巧／１００７１ＱＴ　ｌ　９０
　　　ＤＳＭ　１４４３　　３１８屑９／１００肩ＱＴ
１９１　　　　ＤＳ〜１１４４４　　３９２所／１００
ｚ１２Ｔ　２４４　　　　Ｄ　Ｓ　Ｍ　１４４５　　３
０２ｚ９／　１００ｉ＋ｆｆ実施例３ Ａ、最も活性大なる突然変異菌株のＢＮＣ収率ニー ５００Ｊ！Ｑエルレンマイエルフラスコ中、上記実施例
２に記載の菌株を、ペプトン０．５％、酵母エキス０．
８％、コーングルテン０．４％、グルコース０．３％、
トウイーン８０．０．０５％、コレステロール０．０５
％から成る栄養溶液（＋）Ｈ７，２）１００１中で好気
的に培養する。菌株を機械的振盪器（振盪回転数１５　
Ｏｒｐｍ）上、３０℃で４８時間予備培養する。栄養溶
液に乳化剤０．２％とコレステロール０．５％を加えて
更に１２０時間培養し、培養を完成する。熟成経時点で
試料を取出し、ｐｉ（２，０に調節し、培養液と同量の
酢酸エチルで抽出し、薄層クロマトグラフィで分析する
。

個々の菌株を用いて得られたＢＮＣの収率は実施例２Ｃ
−２の項中の表に示した通りである。

実施例４ ＡＴＣＣ３１８５菌株を作用させて基質コレステロール
から代謝産物として生成する好ましくないコレスト−４
−エン−３−オンおよびコレスタ−１，４−ジエン−３
−オンの集積は、交換すべき基質を連続的に反応混合物
に加えれば、実質的にその集積を抑制することができる
。この操作は他のステロール基質に対しても同様に応用
することができる。

ペプトン０．９％、酵母エキス０．９％、グリセロール
０．５％から成る栄養培地（ｐＨ６、５）にＡＴＣＣ３
１８５菌株を接種し、３０℃で４８時間、あらかじめ培
養してよく発育させる。ｉｆｆ発酵容器（２個）中、ペ
プトン０．９％、水浸コーン０．９％、酵母エキス０．
９％、リン酸水素二カリウム０．５％、グリセロール０
．５％、ポリプロピレングリコールＯ１１％から成る滅
菌栄養溶液（ｐＨ６。

５）４００ｘ（に、よく発育した上記菌株培養物５０ｍ
（ｌを接種して発酵さける。この発酵液を３０℃で撹拌
し、空気を５００ｘ（７分の速度で通気する。

２４時間発酵後、発酵容器にコレステロール５９、ソル
ビタンモノステアレート１９、ポリプロピレングリコー
ル４ｄ、ＩＮ水酸化ナトリウム４吋および水１００ｘ（
を含む乳化液を投入ポンプで供給する。この乳化液を５
ｘＱ／時間で投入するようポンプを作動させ、発酵開始
２４時間目から４４時間目に渡って基質を添加する。４
４時間および７８時間発酵後、それぞれ発酵容器から発
酵液１００ｍＱを採取し、硫酸で酸性にしてメチルイソ
ブチルケトンで抽出し、処理生成物を薄層クロマトグラ
フィーで定量分析する。

対照熟成液において、２４時間発酵後、基質の全量を発
酵容器に投入した。

基質を連続的に添加したものについて、４４時間熟成後
の熟成液を分析した結果、１ｏａｄ当りコレステロール
１２０ｘｙ、コレステノンおよびコレスタジェノン計４
０ｘｇ、ビスノルコレノン酸１００幻；７８時間熟成後
の熟成液を分析した結果、１００ｘｆ２当りコレステロ
ール２０１９、コレステノンおよびコレスタジェノン計
５ｍ９、ビスノルコレノン酸２６０１Ｒｇであった。

基質全量を１度に添加したものについて、４４時間熟成
後の熟成液を分析した結果、１００祿当りコレステロー
ル１００Ｒ９、コレステノンおよびコレスタジェノン計
２４０１Ｒ９、ビスノルコレノン酸８０ｘ９ニア８時間
熟成後の熟成液を分析した結果、１００ｘＱ当りコレス
テロール４０Ｒ９、コレステノン１Ｏ０１ｔ９、ビスノ
ルコレノン酸１８０，１１９であった。

実施例５ メタンスルホン酸エチルエステルによる突然変異処理ニ
ー ペプトン０．９％および酵母エキス０．８％を含有する
栄養溶液中で５Ｃ１０４菌株を培養し、対数発育期に達
した後、遠心分離し、滅菌０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）で２回洗浄し、細胞密度が１０’（細胞数）Ｉ
ＲＱとなるように同様の緩衝液に再懸濁する。メタンス
ルホン酸エチルエステルの濃度が０．１Ｍとなるように
この突然変異誘導物質を細胞懸濁液に添加する。このバ
ッチを室温で２時間振盪した後、細胞を遠心分離して除
去し、リン酸緩衝液で２回洗浄し、最後に新鮮な栄養溶
液に再懸濁して培養する。

実施例６ 野生菌株コール７３（ＣＢＳ　６６０．７７、ＡＴＣＣ
３１３８４または微工研菌寄第４４９１号）から突然変
異種コール７３−ＭＩ　Ｉ（ＣＢＳ４３７．７７、ＡＴ
ＣＣ３１３８５または微工研菌寄第４４９２号）の回収
ニー Ａ１通常の濃縮方法に従って各種土壌から多数のステロ
ール減成微生物を単離した。その後、これらの菌株を、
４−”Ｃおよび２６−”Ｃで標識したコレステロールと
共に培養することにより、菌株の中からステロール類の
側鎖を選択的に減成する微生物を探索した。コール７３
菌昧は２６−１４ｃｍコレステロールに対して最も高い
減成速度を示すので、選択減成のための欠陥性突然変異
種を作るのに特に適当であると考えられる。

以下に説明する突然変異種の分離法はコリネ型細菌に属
する本発明のコール７３菌株ばかりでなく、他の菌種に
対しても応用することができる。

コール７３菌株は１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロ
ソグアニジンで処理することにより効果的に突然変異を
起させろことができる。細胞を下記培地Ａにより３０℃
で４８時間培養する。

培地Ａの組成・酵母エキス１．０％、ペプトン１゜０％
、グルコース０．５％（ｐＨ７，５）。

２Ｘ１０８（細胞数）／２Ｑの細胞濃度を宵する細胞培
養物を、突然変異誘導化合物（１ｍｇ／Ｉ（りと共に３
０℃で１時間処理し、下記培地Ｂ中で更に３日間培養し
て細胞濃度１０９（細胞数）／収に増大させる。

培地Ｂの組成ニリン酸二水素ナトリウム０．０５％、リ
ン酸水素二カリウム０．２０％、硫酸マグネシウム・七
水和物０．０５％、塩化カルシウム・二水和物０．０２
％、硫酸マンガン・四水和物０．００５％、硫酸鉄（Ｉ
Ｉ）・七水和物０．００５％、硫酸アンモニウム０．１
０％、Ｄ−ビオチンｏ。

００１％。

Ｂ、ポリオキシメチレンモノラウリルエーテル０．１％
および３−オキソ−プレグナ−１，４−ジエン−２０−
カルボン酸０．１％を添加した上記培地ＢｌｏｗＱに、
Ａで得られた培養溶液０　、　ｌ　ｚＱを導入し、３０
℃で３６時間培養する。環減成系に欠陥を有する突然変
異種を助長するために、同一組成の新鮮な生育培地をあ
らかじめ加温してこの培地で混合物を１０６（細胞数）
／、ｖｆ２に希釈し、１０００１Ｕ（１次Ｑ当り）ペニ
シリンＧを添加し、この混合物を更に３０’Ｃで２４時
間培養した後、細胞を洗い、寒天２％とグリセロール０
．５％を加えた生育用の培地Ｂから成る寒天平板上に散
布する。細胞を再生産して可視的大きさのコロニーを形
成させた後、これをレプリカ平板法により、ポリオキシ
エチレンモノラウリルエーテル０．１％と３−オキソ−
プレグナ−１，４−ジエン−２０−カルボン酸０．１％
含有栄養寒天培地Ｂに移し、再び培養する。このような
選択操作により、レプリカ平板法による処理後はステロ
イド含有栄養平板上でもはや生育しない５０種以上の突
然変異種のコロニーが単離された。

これらのうち、最も有用な突然変異種を選定するため、
各菌株を栄養溶液Ａ２＋１１１２に接種し、３０℃で２
４時間培養し、ポリオキシエチレンモノラウリルエーテ
ル０．２％およびコレステロール０゜２％と混合して更
に７２時間後、培養溶液を分析する。各試験管の内容物
をメチルイソブチルケトン０　、５　ｘ（ｌと共に振盪
して遠心分離し、有機層の一定量をメルク（Ｍｅｒｋ）
シリカゲルプレートに適用し、ベンゼン−酢酸エチル（
７０：３０）展開液で展開する。クロマトグラフィプレ
ート上に濃硫酸とエタノール（１：１）混合物をスプレ
ーし、Ｉ２０℃に加熱することにより、該ステロイドを
検出する。この操作により、ＣＢ５４３７．７７、ＡＴ
ＣＣ３１３８５まｆこは微工研菌寄第４４９２号菌株は
、ステロール環の減成を阻止し得る突然変異種として認
められた。

実竜例７ コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）に属するＣＢ５４３７，７７、ＡＴＣＣ３１３８５ま
たは微工研菌寄第４４９２号によるステロール変換を正
確に試験するため、この菌株を栄養溶液Ａ１００！１（
含有振盪フラスコ中、１５０ｃｐｍで振盪しながら３０
°Ｃで２４時間培養する。次いでポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレエート０．１％とコレステロール溶液
０．１％を加え、種々の経過時間における試料を採取、
分析する。

培養溶液２０ｍＱを２Ｎ硫酸でｐＨ２，０に調節し、パ
ーコレータ中、メチルイソブチルケトン、酢酸エステル
、ｎ−ヘキサノール、ｎ−オクタツール、クロロホルム
またはｎ−ヘキサンで３時間抽出する。有機相の一部を
メルクシリカゲルプレート上に適用し、トルエン−ブタ
ノール（８０：２０）展開液で展開する。このクロマト
グラフを薄層走査機（２５０ｎｍ）で評価し、コレステ
ロール変換の主成分として、３−オキソ−プレグナ−１
，４−ジエン−２０−カルボン酸５０ｙＩ９および少量
のアンドロスト−４−エン−３，１７−ジオンとアンド
ロスト−１，４−ジエン−３，１７−ジオンを見出した
。

実施例８ ＣＢ５４３７．７７、ＡＴＣＣ３１３８５または微工研
菌寄第４４９２号（コリネクテリウムｓｐ、）によるス
テロール変換を更に試験するため、この菌株を栄養溶液
Ａ１００１Ｒ（！含有振盪フラスコ中、振盪回数１５０
ｃｐｍの下に３０・℃で２４時間培養した後、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノオレエート０．１％およびシ
トステロール溶液Ｏ１１％を加え、種々の経過時間にお
ける試料を採取、分析する。

培養溶液２０ｘ＆を２Ｎ硫酸テｐＨ２、０ｉ：調節し、
パーコレータ中、酢酸エチルで３時間抽出する。

有機層の一部をメルクシリカゲルプレート上に適用し、
トルエン−ブタノール（８０：２０）展開液で展開する
。クロマトグラフを薄層走査機（２５０ｎｍ）で評価す
る。これにより２０−カルボキシプレグナ−１，４−ジ
エン−３−オン、２０−カルボキシプレグナ−４〜エン
−３−オンに加えるに少量のアンドロスト−４−エン−
３，１フージオンおよびアンドロスト−１，４−ジエン
−３，１７−ジオンの形成を認めた。

実施例９ 実施例７の培養溶液をロータリーエバポレータで初めの
容量の１／４に濃縮し、水酸化ナトリウムでｐＨ１３に
調節し、３倍容のメタノールと混合し、細胞塊を遠心分
離する。細胞を含まない培養溶液を陰イオン交換樹脂（
アセテート型）カラムに通し、メタノールで溶出してア
ンドロスト−４−エン−３，１７−ジオン、アンドロス
ト−１，４−ジエン−３，１７−ジオンおよび痕跡量の
コレステノンを分離する。次いでイオン交換樹脂を１０
％酢酸で溶出して２０−カルボキシプレグナ−４−エン
−３−オンおよび２０−カルボキシプレグナ−１，４−
ジエン−３−オンを分離し、濃縮する。濃縮した溶出液
を蒸発乾固し、わずかに加温しながら５％アンモニアに
加えた後、４℃に冷やし、沈澱生成物を濾取する。エー
テルに溶解、抽出を繰返し、ベンゼンから再結晶し、実
質的純品として３−オキソ−プレグナ−１，４−ジエン
−２０−カルボン酸を得た。

特許出願人　ヘンケル・コマンデイットゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（１）ステロール化合物を単一炭素源として好気的
   に生育でき、環減成に比べ側鎖減成を好ましく行う微生
   物の野生菌株を単離、培養し、（２）野生菌種を突然変
   異処理に付し、 （３）突然変異種群を、１７−Ｃ−ステロイド−α−プ
   ロピオン酸化合物を生産する突然変異種は生育せずまた
   は実質的に生育しないが、共存している望ましくない突
   然変異種は生育して、生育中またはその後に死滅させる
   分離培地で培養し、次いで （４）残った突然変異種の菌株を１７−Ｃ側鎖ステロー
   ル化合物により培養しながら１７−Ｃ−ステロイド−α
   −プロピオン酸化合物の生産性が高い菌株を分離するこ
   とを特徴とする１７−Ｃ側鎖ステロイド基質から、少く
   とも高選択的に側鎖を減成し、好気的条件下でステロイ
   ド環の減成または微生物の生育を抑制する禁止剤の不存
   在下においても１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン
   酸化合物を工業的規模で生産することができる欠陥性ブ
   ロック突然変異種の製造法。 ２、突然変異種選択処理（３）で生存している突然変異
   種菌株について突然変異処理（２）および突然変異種選
   択処理（３）を１回または２回以上繰り返すものである
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３、炭素数８〜１０の飽和および／または不飽和アルキ
   ル基を１７−Ｃ側鎖に有するステロール化合物により好
   気的に生育する際に、標準状態において一般式： １＝ａ・１０ｂ ［式中、ａは生育因子、ｂは選択因子であり、選択係数
   Ｉは少くとも１０、好ましくは少くとも１００、とりわ
   け少くとも１０＾５である。］に従って選択減成効果を
   表わす野生菌株を選択し、培養するものである特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の製造法。 ４、選択因子ｂが少くとも１、好ましくは少くとも２で
   あり、生育因子ａが好ましくは少くとも０．２、特に少
   くとも１である野生菌株、更には、できるだけ選択因子
   ｂの大きい野生菌株を採取し、次いで生育因子ａに従っ
   て採取した野生菌株を選択し、用いるものである特許請
   求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の製造法。 ５、野生菌株を、好気的条件下、水性栄養培地において
   、動物性または植物性ステロール類、たとえばコレステ
   ロール、シトステロール、スチグマステロールおよび／
   またはカンペステロールにより、好ましくは選ばれたス
   テロール化合物を野生菌株培養の単一炭素源として用い
   て培養するものである特許請求の範囲第１〜４項のいず
   れかに記載の製造法。 ６、最終的に得られる欠陥性ブロック突然変異種により
   １７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸化合物に減成
   されるべきステロール化合物を用いて野生菌株を培養す
   るものである特許請求の範囲第５項記載の製造法。 ７、選択された野生菌株の突然変異を、高エネルギー放
   射線の照射またはニトロソグアニジン類および／または
   エチルメタンスルホネートの様な突然変異誘導剤での処
   理により行うものである特許請求の範囲第１〜６項のい
   ずれかに記載の製造法。 ８、突然変異により得られた突然変異種群の分離培地と
   して、炭素数が５を越えない１７−Ｃ側鎖を有するステ
   ロイド化合物または１７−Ｃ位に側鎖を有しないステロ
   イド化合物、好ましくは炭素数が３を越えない１７−Ｃ
   側鎖を有するステロイド化合物を炭素源として含有する
   水性栄養培地を用いるものである特許請求の範囲第１〜
   ７項のいずれかに記載の製造法。 ９、分離培地の炭素源、好ましくは単一炭素源または少
   くとも主な炭素源として少くとも１種の１７−Ｃ−ステ
   ロイド−α−プロピオン酸化合物を用いるものである特
   許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の製造法。 １０、最終的に得られる欠陥性ブロック突然変異種によ
   り製造される１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸
   化合物を分離培地の炭素源として用いるものである特許
   請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の製造法。 １１、分離培地で生育する菌株を、該培地では生育しな
   いかまたは実質的に生育しない欠陥性ブロック突然変異
   種の存在下、該突然変異種に損傷を与えることなく死滅
   させるものである特許請求の範囲第１〜１０項のいずれ
   かに記載の製造法。 １２、分離培地で生育する菌株を、ペニシリン化合物ま
   たは＾３＾２Ｐ化合物を併用した様な抗菌剤を加えて死
   滅させるものである特許請求の範囲第１〜１１項のいず
   れかに記載の製造法。 １３、分離培地の主たる炭素源として３−オキソ−プレ
   グナ−４−エン−２０−カルボン酸および／または３−
   オキソ−プレグナ−１，４−ジエン−２０−カルボン酸
   を用いるものである特許請求の範囲第１〜１２項のいず
   れかに記載の製造法。 １４、分離培地から生存している突然変異種菌株を単離
   し、その中から目的物生産性が高い突然変異種菌株を回
   収するものである特許請求の範囲第１〜１３項のいずれ
   かに記載の製造法。 １５、アクロモバクター、アルスロバクター、バチルス
   、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、フラボバ
   クテリウム、ミクロバクテリウム、ミコバクテリウム、
   ノカルジア、プロタミノバクテリウム、セラチアまたは
   ストレプトミセスの野生菌株を用いるものである特許請
   求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の製造法。 １６、野生菌株としてコール（Ｃｈｏｌ）７３（ＣＢＳ
   ６６０．７７、ＡＴＣＣ３１３８４または微工研菌寄第
   ４４９１号）を用いるものである特許請求の範囲第１〜
   １５項のいずれかに記載の製造法。 １７、新規野生菌株コール（Ｃｈｏｌ）７３（ＣＢＳ６
   ６０．７７、ＡＴＣＣ３１３８４または微工研菌寄第４
   ４９１号）。 １８、禁止剤不存在下において３−オキソ−プレグナ−
   ４−エン−２０−カルボン酸および／または３−オキソ
   −プレグナ−１，４−ジエン−２０−カルボン酸を製造
   するのに適した新規ブロック突然変異種コール（Ｃｈｏ
   ｌ）７３−Ｍ１１（ＣＢＳ４３７．７７、ＡＴＣＣ３１
   ３８５または微工研菌寄第４４９２号）。 １９、特許請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の
   製造法により製造された新規ブロック突然変異種。