NO791247L - Fremgangsmaate til selektiv sidekjedeavbygning av steroidforbindelser og til fremstilling herav egnede mikroorganisme-defektblokkmutanter samt nye mikroorganismestammer - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for selektiv sidekjedeavbygning

av steroidforbindelser og fremgangsmåte for fremstilling av"hertil egnete mikroorganisme-defektblokkeringsmutanter og nye mikroorganismestammer.

Den forste beretning vedrorende mikrobiologisk omvandling av steroidforbindelser henleder seg tilbake til 1937 da Mamoli og Vercellone (Ber. 7O.47O og Ber. 70.2079) beskrev den stereospesifikke reduksjon av 17-ketosteroider til 17-|3-hydroksysteroider. I år 1952 beskrev Peterson og Murray

(US-PS 2.602.769) en teknisk betydningsfull fremgangsmåte for ll-a^-hydroksylering av progesteron ved hjelp av rhizopus nigricans.

Etter denne .tid er det blitt beskrevet tallrike omvandlinger av steroidforbindelser ved hjelp av mikroorganismer (se eksempelvis W.-Charney og H.L. Herzog, Miorobial Transformation of Steroids, Academic Press, New York, 1967).

På tross av disse tallrike forslag for mikrobiologisk omvandling av steroidforbindelser er bare et fåtall av disse reaksjoner egnet for fremstilling av viktige steroidhormoner av utgangsmaterialer som er lett tilgjengelig og som forefinnes i store mengder. Her kan i forste linje nevnes

•17-C-alkylsidekjede inneholdende sterinforbindelser av plante-

og dyrisk opprinnelse, eksempelvis steriner av cholestan-, cam-pestan- og stigmastan-serien.

Det er kjent at tallrike mikroorganismestammer, eksempelvis slike av akromobakter, artrobakter, bacillus, brevibakterium, korynebakterium, flavobakterium, mikrobakterium, mykobakterium, nokardia, protaminobakter, serratia og streptomyces, er egnet til å vokse på sterinforbindelser av nevnte art, f.eks. på cholesterin som karbonkilde (se f.eks. Arima et al., 1969, Agr.Biol. Chem. 33: I636-I643). Derved blir som regel på

en ikke spesifikk måte såvel ringsystemet som også eventuell forekommende sidekjeder til ringsystemet angrepet av mikroorganismene, henholdsvis avbygget ved deres vekst. Overveiende er derved angrep og avbygging i ringsystemet den foretrukne

og/eller den hurtigste reaksjon. I et nylig publisert arbeide fra Arima et al., Agric. Biol. Chem. 42(2), 4II-416, blir det beskrevet arbeider for transformering av cholesterin ved hjelp av mikrobiologisk sidekjedeavbygning i nærvær av inhibitorer for redusering av ringavbygnihg i steroidskjelettet. Ifolge disse angivelser var et betydningsfult antall av de testede ca. 200 vildstammer i stand til, under innvirkning av inhibitorene å gi en vidtgående selektiv sidekjedeavbygning i C-17 av utgangsmaterialet. Noen stammer leder derved til 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre (^-1,4 BNC) med vekslende utbytte.

På grunn av den potensielle betydning av store mengder av forekommende naturlige sterinforbindelser med 17-C-sidekjeder av planteopprinnelse (fytosteriner) eller'

dyrisk opprinnelse (cholesterin) som utgangsmaterial for hoyverdige farmasoytika med steroidgrunnstruktur er det utfort tallrike forsok for oppnåelse av en selektiv sidekjedeavbygning på mikrobiologisk måte. En sammenfattende oversikt over disse arbeider finnes i Adv. Appl. Microbiol. 22, 29 (1977), 29-58, Christoph K.A. Martin "Microbial Cleavage of Sterol Side ChainsV Det vises spesielt til kapitelet IV i denne publikasjonen som under A til C.angir de til nå funne måter for selektiv sidekjedeavbygning. Forslagene til teknikkens stilling faller deretter, i tre grupper: Omvandling av ringsstrukturen av sterinforbindelsene på en slik måte at mekanismen for ring-spaltningen blir undertrykt, hvorved en selektiv sidekjedeavbygning muliggjores. Medanvendelse av inhibitorer'for hemming av steroidringavbygning og/eller av mikroorganismevkst såvel som soken etter mikroorganismemutanter forer til vidtgående selektiv sidekjedeavbygning.

Etter denne, fremgangsmåten ifolge teknikkens stilling oppnås som sluttprodukt ved den mikrobiologiske avbygning for storste del 17-ketosteroidforbindelser som riktignok er verdifulle som mellomprodukter'ved teknisk fremstilling av hormoner fra estran-androstan- og spirostan-serien, men dog ér mindre egnet til fremstilling av steroidhormoner fra pregnanserien, eksempelvis progesteron, hydrocortison,

cortison, prednison, prednisolon, triamcinolon og lignende.

Ved de sistnevnte tilfelle må igjen kjemisk innbygges stereospesifikke sidekjeder i 17-stilling.

Det er kun ved enkelte tilfelle til nå lykkes

å oppnå som stoffvekslingsprodukt fra mikrobiologisk avbygning av steroidforbindelser som inneholder i 17-C-stilling en alkylsidekjederest og. derved spesielt en rest av oc-propionsyre. Steroidforbindelser av denne art er spesielt egnet for teknisk fremstilling av steroidhormoner av pregnanserien fra steriner av naturlig opprinnelse. Det er derved innlysende at utvinnelse av partielle sterinavbygningsprodukter av denne art derfor er spesielt vanskelig, da det her er nodvendig med en selektiv sidekjedeavbygning - under samtidig forhindring av spaltning og avbygning av ringstrukturen, men dertil kommer også at veksten av mikroorganismene ved sidekjedeavbygning må komme

til en avbrytelse som etter nåtidens kjennskap er et mellomstadium for oppnåelse av 17-ketosteroidstruktur..

J.M. Whitmarsh beskriver i. "The Biochemical Journal",. 90, 19^4, 23 p til 24 p, mikrobiologisk avbygning av cholesterin med en norcardiakultur i nærvær av inhibitorer som 8-hydroksychinolin under dannelse av små mengder av 3_okso-pregna-4-en-20-karbonsyre ( ^ -4 BNC) og 3-^okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre (a-1,4 BNC). Det nylig publiserte US-PS 4.029.549 (Antosz et al.) beskrev mikroorganismemutant NRRL B-8ll9,.med hvilken det skal være mulig å avbygge selektivt 17-C-steroidforbindelser med 8 til 10 karbonatomer i 17-C-alkylresten til 9a~0H AD og 9«-0H BN-syre. Som det imidlertid fremgår fra kapitel IV C fra publikasjonen av C.K.A. Martin a.a.O, side 50 til-52, finnes det idag ingen pålitelig fremgangsmåte for fremstilling av 17-C-steroid-oc-propionsyreforbindelser av 17-C-sidekjede-steroidsubstrater, henholdsvis reproduserbar utvinnelse av mikroorganisme-defektmutaner, som på en pålitelig måte og med hoyt utbytte kan gi 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser som sluttprodukt ved ensymatisk avbygning, når det skal arbeides i fravær av inhibitorer av den nevnte art. Arbeidet i fravær eller i nærvær av mindre mengder av inhibitorer må av tekniske grunner - f.eks. på grunn av det uonsket hoye rom-tid-utbytte - synes onskelig.

Oppfinnelsen har derfor stilt seg oppgaven å muliggjore fremstillingen'av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser med teknisk brukbart og forbedret utbytte ved selektiv mikrobiologisk avbygning av 17-C-sidekjede-steroid-substrater.

Derved skal på en målrettet måte anvendes fremstilte og

utvalgte mikroorganisme-defekt-blokkeringsmutanter som. på .i. forhånd er utvunnet av egnede vildstammer. Det skal derved spesielt være mulig - om enn ikke nodvendig - å arbeide med utvalgte defektblokkeringsmutanter også i fravær av inhibitorer som hindrer steroidavbygning og/eller vekst av mikroorganismer.

En videre oppgave ved oppfinnelsen er en sikrere og reproduserbar fremstilling av mikroorganisme-defektorblokkeringsmutanter som er egnet for forbedret, spesielt inhibitorfri teknisk utvinnelse av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser av steriner;av naturlig opprinnelse.

Spesielt har oppfinnelsen stilt seg det mål å fremstille mikrobiologisk 3-okso-pregna-4-en-20-karbonsyre (^-4 BNC) og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre (a~1>4BNC) etter den beskrevne måten. Utgangsmateria.l for den mikrobiologiske fremstillingen av disse forbindelsene- skal spesielt være naturlige og/eller plante steriner som til nå er avfallsprodukter med liten praktisk betydning. Også enkle etterkommere av disse naturlige utgangsmaterialer skal være egnet for oppfinnelsen.

Ved en spesiell utforelsesform skal oppfinnelsen særlig fremskaffe en måte å fremskaffe hoyvirksomme mirko-organisme-defektblokkeringsmutanter for de ved aktuelle tekniske fremgangsmåter anvendte bestemte sterinutgangsmaterialer og dermed muliggjore en tilpasning av sterinutgangsmaterialene til mikroorganisme-def ektblokkerings-mutantene. Produktene /\-4 BNC og A-I,4 BNC fremstilt i henhold til oppfinnelsen, er verdifulle mellomprodukter, eksempelvis for fremstilling av forbindelser av progesteron-serien.

Oppfinnelsen vedrorer således i en forste utforelsesform en fremgangsmåte for fremstilling av. 17-C- . steroid-a-propionforbindelser ved enzymatisk sidekjedeavbygning av 17-C-sidekjede-steroidsubstrater,karakterisert vedat man

a) dyrker mikroorganisme-defektblokkeringsmutanter, som også gir steroidforbindelser med 17-a-propipnsyrerest også

i fravær-av inhibitorer som hemmer steroidavbygning og/eller vekst, i et vandig næringsmedium ved aerobe betingelser i nærvær av steroidsubstratet ved anrikning av 17-C-steroid-a-propionsyref orbindelsene i fermentasjonsopplosningen og

b) isolerer de dannede 17-C-steroid-oc-propionsyreforbindelsene. Spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte'for fremstilling av 3-okso-pregna-4-en-20-karbonsyre (&-4 BNC) og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre(/rl,4,BNC) ved mikrobiologisk sidekjedeavbygning av 17-C-sidekjedesteroid-. substrater,karakterisert vedat man a) dyrker mikroorganismer som gir A-4 BNC og/eller A~l,4 ^NC°Sså i fravær av inhibitorer som hemmer steroidringavbygning og/eller mikroorganismevekst, i et vandig næringsmedium ved aerobe betingelser og i nærvær av et 17-C-sidekjede-steroid substrat ved anrikning av 3_°kso-pregna-4-en-20-karbonsyre og/ eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre og b) deretter isolerer dannet 3-okso-pregna-4-en-20-karbonsyre og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre.

Utbyttet av £-4 BNC og/eller 4 1,4 BNC skal derved;fortrinnsvis være minst 15 vekt-% beregnet av anvendt steroidsubstrat.

Strukturformelen av de her angitte forbindelsene A-4 BNC og /y 1,4 BNC er sonffolger: 3-okso-pregna-4-en-20-karbonsyre.

3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre.

I en videre utforelsesform vedrorer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av aerob arbeidende mikroorganisme-def ektblokkeringsmutanter som er egnet til teknisk utvinning av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser, spesielt for fremstilling av 3-°kso-pregna-4-en-karbonsyre og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbo'nsyre av 17-C-sidekjede-steroid-substrater, f.eks. av sterinforbindelser av dyrisk eller planteopprinnelse, i det minste ved omfattende selektiv sidekjedeavbygning, hvorved onskelig også i fravær av inhibitorer som hemmer steroidringavbygning og/eller mikroorganismevekst, hvorved denne fremgangsmåten erkarakterisert vedat man l) isolerer og dyrker en mikroorganisme-vildstamme som er egnet til aerob vekst på sterinforbindelser som eneste karbonkilde og som foretrekker 17-C-sidekjedeavbygning fremfor ringavbygning,

.2) underkaster vildstammen i og for seg kjente mutasjonsbehandlinger, 3) dyrker mutasjonspopulationen på et skillemedium på hvilket mutanter som gir 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelsene, ikke eller praktisk ikke vokser, mens de uonskede ledsakende mutantstammer vokser og derved, henholdsvis under deres vekst,

blir drept og

4) dyrker den gjenværende rest av mutantstammene på 17-C-sidekjedesterin-forbindelsene og herved isolerer

stammene med optimal produksjon av 17-C-steroid-a-propion-syref orbindelsene.

Oppfinnelsen vedrorer videre de etter denne fremgangsmåte fremstilte og derved spesielt£-4 BNC og/eller A-I,4 BNC givende blokkeringsmutanter. Spesielt vedrorer oppfinnelsen i denne sammenheng en ny blokkeringsmutant Chol.

spes. 73-M11 som er blitt deponert ved Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland, under nummeret CBS 437•77>og ved American Type Culture Collection,.Rockville, Maryland,

USA, under nummeret ATCC 31385- Disse blokkeriirgmutanter er

egnet for inhibitorfri fremstilling av 3-°kso-pregna-4-en-

20 karbonsyre eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre også

i fravær av de nevnte inhibitorer av steriner av naturlig eller planteopprinnelse. Disse blir utvunnet ved frem-

gangsmåten i henhold til oppfinnelsen fra den likeledes av sokerne isolerte, henhorende til oppfinnelsen og ved Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland

under nummeret CBS 660.77 og ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, under nummeret ATCC

31384 deponerte nye vildstamme Chol.spee.73»Som tilhorer

gruppen av coryneforme bakterier.

Utvinnelse av mikroorganisme-defektblokkeringsmutanter i

henhold til oppfinnelsen

En avgjorende gjenstand ved foreliggende oppfinnelse er at det muligens for forste gang er muliggjort en sikker, reproduserbar fremgangsmåte for utvinning av defektblokkeringsmutanter av den'nevnte art,dvs. av mikroorganismer som kan bli utvunnet ved en helt bestemt .kombinasjon av seleksjon og mutasjon med etterfølgende ny seleksjon fra vildstammer og som er i stand til å vokse på steroidforbindelser av den beskrevne art. De etter fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen utvunnede mikroorganismedefektblokkeringsmutanter utmerker seg ved at de på den ene side overfor en vekst på steroidringstruktur ved fortæring av disse ringer som karbonkilde, er betydelig blokkert, men på ,den andre side i henhold til oppfinnelsen er de utvunnede mikroorganismemutanter også tilstrekkelig blokkert overfor en avbygning av en 'i 17-C-stilling i steroidet foreliggende, henholdsvis dannet a-propionsyrerest, slik at det er teknisk mulig med en målrettet frem-' stilling av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser med lengere 17-C-sidekjeder og deres isolering fra fermentasjonsopplosningen med godt utbytte. Det er derved spesielt fordelaktig at det om onskelig er mulig også å kunne arbeide i fravær av inhibitorer av nevnte art- se f.eks. Christoph K.A. Martin, a.a.O., kapittel IV B. Ved den oppfunnede kombinasjon av bestemte utvalg av vildstammer og etterfølgende mutasjons-.og

seleksjonstrinn er dette blitt mulig.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for utvinnelse av onskede blokkeringsmutanter kan det oppstilles folgende fire fremgangsmåtetrinh: Trinn 1: Målrettet utvelgelse av mikroorganismevildstammer . Trinn 2: Mutasjonsbehandling,•

Trinn 3: Separering av den utvunnede mutasjonspopulasjon fra trinn 2, henholdsvis anrikning av onskede mutanter... fra den totale utvunnede mutasjonspopulasjon,

Trinn 4- Dyrkning av de.i trinn 3 separerte, henholdsvis anrikede mutantstammer, med optimal produksjon av de onskede produkter av 17-C-steroid-a-propionsyre.

Disse fire fremgangsmåtetrinn kan gjennomlopes i en eneste operasjon for utvinning av de onskede defektblokkeringsmutanter. Det kan også være hensiktsmessig å gjenta frémgangs-måtetrinn 2 og 3 ^n eller flere ganger slik at de i trinn 3 separerte - henholdsvis anrikede - onskede mutasjonspopulasjoner fornyet blir underkastet en mutasjonsbehandling ifolge trinn 2 og.deretter på ny blir separert i trinn 3-

I det folgende blir enkeltheter ved de anforte trinn 1 til 4 forklart.

Trinn- 1: Isolering av egnede vildstammer.

De utvalgte mikroorganisme-vildstammer

skal være i stand til, ved aerobe betingelser å vokse på steroidforbindelser og spesielt på steroidforbindelser med 17-C-sidekjeder. De for oppfinnelsen egnede stammer har derved

fortrinnsvis i det minste omtrent samme avbygningshastighet for sidekjedene som for ringdelen av steroidforbindelsene. Foretrukne er dog vildstammer som viser en hoyere sidekjedeavbygnings- . hastighet i forhold til ringavbygning.

Isoleringen av vildstammene kan skje på kjent

måte fra jordprover.. På grunn av den omfattende utbredelse av sterinforbindelser av plante og dyrisk opprinnelse, forefinnes egnede vildstammer av nevnte art praktisk regelmessig i alle jordprover uavhengig av opprinnelse. Dyrkning av disse utfores under aerobe betingelser i nærvær av næringsme.dium og. fortrinnsvis i nærvær av en sterinforbindelse med en 17-C-sidek jede som eneste karbonkilde. Det er derved mulig - skjont på ingen måte nodvendig - allerede på dette trinn av selektivfremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen å fremlegge arten av karbonkilde som slutligen skal avbygges med den sokte defektblokkeringsmutanten. Dersom eksempelvis cholesterin eller en fytosterin skal avbygges til 17-C-steroid-a-propion-syref orbindelse som sluttprodukt, så kan en av de naturlige sterinforbindelser, om onskelig de bestemte sterinforbindelser som skal anvendes ved teknisk fremstilling, fortrinnsvis anvendes som eneste karbonkilde i det ellers konvensjonelle næringsmedium for utvelgelse og dyrkning av vildstammene.

Det har riktignok også vist seg at det ikke er nodvendig

allerede på dette trinn å foreta en utvelgelse mellom s.terin-karbohkilder ved utvelgelseDg dyrkning av vildstammer som skal anvendes ved fremgangsmåten ved steroidavbygning.

Ved utforelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen har utvelgelse av den riktige vildstamme en spesiell betydning. Det har vist seg at vanlige vildstammer fortrinnsvis avbygger ringer fremfor•sidekjeder. De utvalgte vildstammer ved utforelse av oppfinnelsen skal i det minste ha samme avbygningshastighet overfor sidekjeder som for ring-

delen av steroidforbindelsene. Spesielt foretrukket blir dog utvalgt og dyrket slike vildstammer som.ved vekst på sterinforbindelser med mettede eller umettede alkylrester i 17-stilling, og riktignok fortrinnsvis rester med 8 til 10 C-atomer, viser en selektiv avbygningseffekt - målt ved de nedenfor beskrevne standarbetingelser - ifolge den generelle formel

. r . ■ Her er a vekstfaktor og b selektivfaktor for vildstammevekst som defineres som folger. Selektivitetsindeksen I som er karakteristisk for egnede og foretrukne vildstammer, utgjor

dermed et produkt i henhold til den angitte formel av vekstfaktor a og selektivitetsfaktor b..Tallverdien for I for den foretrukne mikroorganisme-vildstamme er i det minste 10. Hoyere tallverdier for I er onsket og kan eksempelvis være 100. ;

Ved seleksjon av vildstammer fra en storre isolert- vildstamme-populasjon kan det være onskelig å underkaste stammene med den hoyeste tallverdi for I flere trinn ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Så kan det være spesielt hensiktsmessig å

utvelge slike vildstammer som har en tallverdi I på i det minste

•5 10 . Det har forovrig vist seg at absoluttverdien for -I kan

være avhengig av det utvalgte steroidsubstrat som karbonkilde. Så er det eksempelvis mulig at av den utvalgte vildstamme ved dens dyrkning på sterinforbindelser av dyrisk opprinnelse i det her omtalte forste seleksjonstrinn vokser vesentlig bedre -

og folgelig gir hoyere verdi for I - enn på sterin fra plante-.opprinnelse som karbonkilde. Uavhengig herfra gjelder de tidligere angitte foretrukne betingelser for utvelgelse av vildstammer.

Bestemmelse av vekstfaktor a og selektivitetsfaktor b for vildstammevekst utfores ved folgende standarbetingelser (aerobe betingelser).

Vekstfaktor a:

Den aktuelle mikroorganismestamme blir inkubert i en ^ >00 ml Erlenmeyerkolbe (100 ml næringsopplosning med den nedenfor beskrevne sammensetning) ved 30°C på en rystemaskin (Rystefrekvens: 150 omdreininger/minutt). Næringsmediet hadde folgende sammensetning (per liter):

For måling av veksten (celletetthet) blir det etter bestemte

tider uttatt aliquote mengder av cellekultur fra ristekulturen og .rv' målt den aktuelle ekstinksjon (E') i et Zeiss-fotometer (type PL 4) ved en bolgelengde'på.620 nm (sjikt-tykkelse d - 1. cm) mot destillert vann. Utgangsekstinksjonen EQ var for veksten startet - c.v.s. ved tidspunktet t - ca. 0,775* Suspensjonen ble fortynnet så mye at det kunne måles i området

E = 0,7-

Vekstfaktoren a fremkommer som den maksimale

optiske tetthet av cellesuspensjonen ved slutten av den logaritmiske vekstfase (tidspunkt t-^, ekstinksjon E-^) som •

under de gitte kulturbetingelser blir oppnådd etter senest 5 dager, d.v.s. a =&E = - E .

Selektivitetsfaktor b:

De stammer som skal proves, blir dyrket 48

timer ved J0°C i næringsbouillon I (Merck) pluss 0,1$ "Tween 80"

(pplyoksyetylensorbitanmonooleat) pluss 0,1 % sterinforbindelser,

f.eks. cholesterin, hvoretter cellene blir vasket med en puffer og ' resuspendert i en f osf at-puf f er (pH-7,5)« Avbygningen av sterinforbindelser blir målt ved parallellforsok med radioaktiv markerte sterinforbindelser, f.eks. 4-14 C og 26-14 C-cholesterin eller tilsvarende markerte sitpsterinforbind-elser i Warburg-kar.

Til 2,4 ml cellesuspensjon i hovedkaret ble tilsatt 0,2 ml sterinopplosning (f.eks. cholesterinopplosning)

(5 yj. mol med ca. 0,1 yu Ci markert substrat i 0,1%-ig "Tween 80" - opplosning), opplosningen ble inkubert 6 timer ved 30°C og reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av 0,2 ml 4 n H2S0^.

Det ved substratspaltningen oppståtte aktive

COg blir absorbert i etanolamin (0,2 ml) og målt"i en scintilla-tionscounter (0,1 ml prove i 15 ml scintiallatarvæske "Unisolv" firma Zinsser).

Selektivitetsfaktoren b er det dimensjonslose forhold av den således målte radioaktivitet.

I■denne ligningen betyr benevnelsen "sterinforbindelse" den aktuelle radioaktive markerte sterinforbindelse, altså eksempelvis tilsvarende cholesterin- eller (3-sitosterinforbindelser.

Teknikken for bestemmelse av mikrobiologisk avbygning av sterinforbindelser ved radioaktive markeringer av enten et ringkarbonatom eller et sidekjedekarbonatom er forovrig en kjent metode ifolge teknikkens stilling hvorved denne angir flere detaljer. Det- vises eksempelvis til..

folgende publikasjoner: Steroids, 677-688 (1964), G.E. Peterson og J.R. Davis "Cholesterol Utilization by Streptomyces spp."

og J.B.C. 206, 5II-523 (1954) Theressa C. Stadtman et al., "Studies on the Microbiological Degradation of Cholesterol".

For utvelgelse av vildstammene i trinn 1 ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er det videre foretrukket at'selektivitetsfaktoren b av vildstammen i.det minste utgjor 1, fortrinnsvis i det minste 2, Vekstfaktoren a av vildstammene skal i det minste utgjore 0,1, fortrinnsvis i detminste 0,2 og

utgjor spesielt i det minste 1.

Ved utvelgelse av de best egnede vildstammer for de videre trinn ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen . er det hensiktsmessig å avveie faktorene a og b mot hverandre. Så.kan det ved utforelse av oppfinnelsen være hensiktsmessig

å gi vildstammer med en spesielt hoy selektivitetsfaktor fortrinn og ved valg mellom forskjellige isolerte vildstammer å utvelge forst og fremst vildstammer med høyest mulig tallverdier for b. Omvendt kan naturligvis en spesiell god vekst - uttrykt ved en spesielt hoy tallverdi for vekstfaktoren a - være grunn for å gi en slik vildstamme. fortrinn ved etterfølgende mutasjon og derpå folgende seleksjon av mutantpopulasjon.

Som vildstamme i trinn 1 er eksempelvis slike

som achromobacter, arthrobacter, bacillus, .brevibacterium, corynebacterium, flavobacterium, microbacterium, mycobacterium, nocardia, protaminobacterium, serratia, eller streptomyces aktuelle. Avgjørende ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er ikke'.tilhørigheten av bestemte vildstammer til en bestemt gruppe. Mer viktig er de foran diskuterte egenskaper ved dyrkning på næringsmedia med sterinforbindelse og spesielt dens selektivitetsindeks I, som blir bestemt av vekstfaktoren a og selektivitetsfaktoren b.

Til trinn 2:

Mutasjon av den utvalgte vildstamme utfores på

en i og for seg kjent måte. Dette kan eksempelvis utfores ved energirik bestråling med UV eller røntgenstråling. Egnet er spesielt behandling av cellene med midler som forårsakter mutasjon. Egnede mutasjonsfremmende midler er eksempelvis nitrosoguanidinforbindelser som l-metyl-3-nitro-l-nitrosogu-anidin eller etylmetansulfonat. Mer detaljert vises til generelle angivelser i den kjente teknikkens stilling, se eksempelvis US-PS 4.O29.549, spalte 2, linje 57 og fl., med de der angitte henvisninger.

Hovedsakelig gjelder også for oppfinnelsen at resultatet av vildstamme-mutasjonen for så vidt er ubestembar da.egenskapene for de oppnådde defektmutanter for de enkelte ikke på forhånd kan forutsies. På tross av dette er det mulig å fastlegge prinsippene for en optimal mutasjonslosning da

statistikkens lover er anvendbar for en mikroorganisme-populas jon. Fra litteraturen er det kjent fremgangsmåter

for å bestemme optimale betingelser for induksjon av mutasjoner (se også E.A. Adelberg, W. Mandel, GCC Chen (1965) "Optimal Conditions for Mutagenisis by N-metyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine in Escherichia coli", Biochem. Biophys. Res.

Commun. l8, 788-795).

I alminnelighet blir for økning av hyppigheten av mutasjoner i mikroorganismepopulasjoner valgt slik konsentrasjon og innvirkningstid for mutasjonsfremmende midler at en del av mikroorganismepopulasjonen blir letalt skadet. Derved stiger mer eller mindre hyppigheten av forskjellige mutasjoner blant den overlevende del av populasjonen.

Ved utfolrelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen blir konsentrasjonen og innvirkningstiden for de mutasjonsfremmende midler valgt slik at utgangspopulasjonen ved behandlingen til 10-99>999$ blir inaktivert. Fortrinnsvis blir det valgt en dodsrate fra 90 - 99>99$'Til fremgangsmåtetrinn 2 for mutasjonene etterfølger fremgangsmåtetrinn 3

og 4>som nar"til gjenstand fornyede 'seleksjonstrinn for oppdagelse av anrikning av onskede defektblokkeringsmutanter.

Til trinn 3-

Til etterfølgende utvelgelse av bestemte onskede defektblokkeringsmutanter for anvendelse ved oppfinnelsen fra den store mikroorganismepopulasjon etter mutasjonsbehandlingen blir det i henhold til oppfinnelsen valgt slike kulturbetingelser ved hvilke forandrede spesifikke egenskaper av dannede mutantstammer blir til fordel ved seleksjonen. Anrikningen av onskede defektblokkeringsmutanter skjer i henholdt til oppfinnelsen ofte ved slike betingelser ved hvilke de spesielle mutantene ikke eller praktisk ikke vokser mens uonskede tilstedeværende organismer ved deres vekst blir drept. På denne måten lykkes det å isolere slike defektblokkeringsmutanter som har mistet evnen for ringavbygning, men endog har evnen for avbygning av 17-C-sidekjeder på sterinforbindelser, hvorved det ved flere forholdsregler spesielt i trinn 3 sikkerstilles at spesielt slike defektblokkeringsmutanter blir isolert som ved side-avbygning fortrinnsvis danner a-propionsyrerest i 17-C-stilling,

Hertil blir det i fremgangsmåtetrinn 3 mutasjons-populas jonen dyrket på et "skillemedium'" som tjener som anrikningsmedium for de Snskede mutasjonsstammer. Som mutasjons-skillemedium kan anvendes, et vandig næringsmedium som inneholder som karbonkilde en steroidforbindelse med en 17-C-sidekjede med begrenset C-tall eller som ikke inneholder sidekjede i 17-C-stilling. Som karbonkilde egner det seg i dette mutant-skillemediumet foruten i 17-C-stillihg ikke substituerte steroidforbindelser spesielt slike som inneholder inntil . 5 C-atomer i sidekjedene. Foretrukket anvendt er riktignok i slike mutant-skille-h.v. anrikningsmedium som karbonkilde, en steroidforbindelse med 3 C-atomer i 17-C-sidekjeden, hvorved her hensiktsmessig anvendes en 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelse eller et flertall slike onskede 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser som eneste karbonkilde.

Det kan herved videre være foretrukket i dette mutantskillemidlet å anvende som karbonkilde slike 17-C-steroid-propionsyreforbindelser hvis fremstilling er etterstrevet av blokkeringsmutantene i henhold til oppfinnelsen. Skal altaå i henhold til oppfinnelsen eksempelvis utvinnes /^-4 BNC eller A-1,4 B^C som sluttprodukt fra steriner av plante eller dyrisk opprinnelse, så kan det være hénsiktsmessig i mutantskille,-

h.v. anrikningsmediet, i dette trinn 3 å anvende som eneste karbonkilde&-4 BNC og/eller A-!>4BNC-

For ovrig blir det her arbeidet med konvensjonelle næringsopplosninger ved aerobe betingelser.

Slike mikroorganismer som har undergått en mutasjonsbehandling, har på grunn av denne, mutasjonsbehandlingen mistet evnen til å vokse på den nu foreliggende karbonkilde, og kan ikke formere seg ved dyrkning av mutasjonsskillemidlet. De vokser altså ikke. En annen del av mutasjonspopulasjonen som enten ved mutasjonsbehandlingen i trinn 2 ikke er blitt tilstrekkelig skadet eller som har andre defekter, erskikket til å vokse på karbonkilden av mutasjonsmediet. Ved dyrkning inntrer altså her en formering.

Oppfinnelsen nyttigjor seg disse forskjellige forhold på.en slik måte at betingelsene i mutasjonsskille-mldlet blir valgt slik at de voksende stammer på grunn av deres vekst, eller under deres vekst blir drept uten at de ikke-voksende mutantstammer blir beskadet..

Mulig er en slik adskillelse eksempelvis, ved tilsetning av antibiotika, éksempelvis ved tilsetning av penicillinforbindelser. Tilsetning av penicillinforbindelser forer til dreping av andelen av voksende mikroorganismestammer, mens ikke voksende stammer blir ubeskadet.

En annen mulighet for mutantskillelse i dette stadium.er innbygging av celleskadende, spesielt radioaktive, komponenter i de på skillemediet voksende andel av mutasjonspopulasjonen. Egnet er eksempelvis innbygging av YJ 32 i de voksende mutasjonsstammer. Mulig er også eksempelvis medanvendelse av tilsvarende radioaktive markerte salter i næringsopplosningen ved dette seleksjonstrinn. For åd-

op op skillelse ved hjelp av P J har en. medanvendelse av NagH^ PO^

.blitt benyttet. • ..

Av den resterende ubeskadigede defektblokkering-mutant kan da f.eks. de i henhold til oppfinnelsen etterstrevede defektblokkeringsmutantstammer isoleres ved hjelp av den kjente Lederbergske Stempelmetode. Vedrorende den her- anvendte fremgangsmåte og penicillinanrikningsmetoden samt Lederbergske Stempelmetode blir eksempelvis vist til J.Amer.Chem.Soc. JO, 4267, (1948) Davis, B.D. (Penicillin-anrikningsmetode), J.Bact. 63, 399 (1952) Lederberg, J., Lederberg, E.M. (Lederbergske Stempelmetode)..

Til trinn 4:

De således isolerte og selekterte defektblokkeringsmutanter kan hå dyrkes på et vanlig næringsmedium og kan om-onskelig, utsettes for videre seleksjoner. Seleksjonen kan her eksempelvis utfores etter det etterstrevede resultat av mikroorganismestammene på det utgangsmaterial som skal anvendes, eksempelvis altså på naturlig eller plante sterinforbindelser, hvorved her spesielt den kjemiske natur av stoffutvekslings-produktene fra mikroorganisme-veksten og vekstvillighet av stammene kan være bestemmende. Naturligvis foretrekkes blokkeringsmutanter med optimal produktivitet av det onskede sluttprodukt, Disse stammer kan.da innsettes ved tekniske fremgangsmåter. Dyrkning og seleksjon kan her skje i ett eller flere trinn.

I rammen i henhold til oppfinnelsen er det også * mulig' å gjenta fremgangstrinnene ved mutasjon ifolge trinn 2 og den etterfølgende mutasjonsskillelse ifolge trinn 3 ^n eller

flere ganger dersom det synes onskelig med en ennu sterkere

. innvirkning av. mutas jonsf remmende midler på de defekte mutas jons-stammer for oppnåelse av optimale produksjonsresultater. Til slutt blir det som regel opparbeidet ifolge trinn 4-

For bestemmelse av onskede, spesielt aktive, defektblokkeringsmutanter kan anvendes en standardtest, som i fravær av inhibitorer og under folgende forsøksbetingelser kan gjennomføres: Den defektblokkeringsstamme -som skal undersøkes, blir dyrket i en Erlenmeyerkolbe med 100 ml næringsopplosning med folgende sammensetning: 0,8$ pepton, 0,9$ gjærekstrakt,

0,3$ glukose, 0,06$ "Tween 80" (polyoksyetylénsorbitan-monooleat) , 0,06$ cholesterin eller sitosterin, p^ 1, 2..

Kulturen blir satt på en rystemaskin (rystefrekvens 150 omdr./min.) og fordyrket ved 30°C i 62 timer, deretter blir den tilsatt 0,1$ BRU (polyoksyetylenmonolauryleter) og 0,1$ sterinforbindelse

og dyrket videre i 120 timer. Etter avbrytelse av kulturen blir det uttatt prover og disse blir ekstrahert og tynnskiktkromato-grafisk analys.ert.

De i henhold til oppfinnelsen foretrukne defekt-blokkeringsmutanter gir et utbytte av 17-C-oc-propionsyrederivat og derved spesielt/y-4 BNC og-eller A.-1,4 BNC på i det minste 15 vekts-$, fortrinnsvis mindt 30 vekts-$ på cholesterin eller

sitosterin. På cholesterin ligger utbyttet spesielt ved minst

50 vekts-$, det kan f.eks. ligge i området fra 70 til 80 vekts-$ - beregnet av anvendt sterinforbindelser. På sitosterin ligger utbyttet som regel lavere, men det kan også her f.eks. oppnås 40 til 50 vektsprosent. Forarbeidsmetoder uten anvendelse av

inhibitorer blir det således gjort tilgjengelige resultater som til nu ikke er kjent.

Fremgangsmåte for fremstilling av 17-C-steroid- . a-propionsyre-forbindelser og spesielt for fremstilling av 3-°kso-pregna-4-en-20 karbonsyre og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre.

Den selektive omdannelse av det som utgangsmateriål valgte steroidsubstrat, f.eks. altså av en naturlig sterinforbindelse, kan etter.fremskaffelse og utvelgelse av defektmutant utfores ved den foran beskrevne fremgangsmåte på i og for seg kjent måte. Så kan eksempelvis den som utgangsmateriål valgte steroidforbindelse tilsettes kulturen under inkubasjonsperioden eller den kan bli tilfort næringsmediet for inokuleringen av blokkeringsmutantene. Det kan anvendes en steroidforbindelse. Fortrinnsvis blir steroidforbindelsene som skal avbygges, selektivt, anvendt i en mengde av fra omtrent 0,1 til 100 g/l. Den optimale konsentrasjon av sterinforbindelser som skal omdannes i dyrkningstrinnet er i alminnelighet avhengig av ■

stamme og kan bestemmes ved enkle forforsok. I alminnelighet ligger konsentrasjonen av sterinforbindelser i mediet fortrinnsvis ikke over 20 g/l og ofte ikke over 15 g/l, imidlertid foretrekkse mengder over 1 g/l.

Det kan derved være foretrukket å ikke tilsette substratet som skal undergå en sidekjedeavbygning, til reaksjns-mediet på én gang, men tilføre dette litt etter litt i forlopet av reaksjonen-. Fortrinnsvis blir utgangsmaterialet ved denne utforelsesform i det vesentlige tilsatt kontinuerlig til reaksjonsblandingen i forlopet av .avbygningsreaksjonen.

På denne måte kan ofte utbyttet av de onskede avbygningsprodukter bli forhoyet.

Kulturen blir dyrket i et næringsmedium som inneholder som karbonkilde enten steriner som skal transformeres, eller.også i tillegg metaboliserbare karbonkilder og de nærings- og vekststoffer som vanligvis behoves for disse mikroorganismer. Spesielt gunstig for vekst av mikroorganismene er f.eks. parafin, glycerin, karbonsyrer, stivelse, dekstrin, saccharose, glukose, fruktose og sukkerholdige avfallsstoffer. Egnede nitrogenkilder er ammoniumsalter, nitrater, pepton, maisvann, soyamel, berme og fiskemel.. Videre kan det tilsettes, fermentasjonsakseleratorer som gjærekstrakt og vitaminer. Næringsmediet inneholder dessuten hensiktsmessig uorganiske

salter som natrium-, kalium- eller ammoniumfosfater og kalcium-, magnesium-, mangan- eller jernsalter..

Emulgeringen av sterinene i næringsmediet skjer fortrinnsvis med kjente emulgeringsmidler, f.eks. fettsyre-sorbitanestere eller deres etylenoksidaddukter, polyoksyetylen-monolauryletere eller fettsyreamidoalkylbetain.

Det anvendte kulturmedium blir for bakteriedyrk-ningen sterilisert ved oppvarmning. Etter avkjølingen og podingen av kulturmediet med en egnet forkultur av transformer-ende bakteriestammer blir det inkubert mellom 25° til 55°C,. fortrinnsvis ved 27° til J0°C. p^-verdien av næringsopplosningen ligger mellom<p>^4 til 8,5, fortrinnsvis ved 7,0 til 8,0. Kulturen blir utsatt for fystning, omroring eller gassinlednigen; med surstoff og blir inkubert til fullstendig avbygning av sterin til onsket trinn. Avbygningen av sterin fordrer etter substratkonsentrasjon og andre fermenteringsbetingelser som regel 24 til l60 timer.

Det på denne måten fremstilte produkt som er blitt anriket i férmenteringssuspensjonen, kan deretter på i

og for seg kjent måte utvinnes av reaksjonsblandingen.

Således kan eksempelvis BNC-forbindelser ved ekstraksjon med organiske opplosningsmidler_som metylisobutylenketon, eddiksyreester, n-heksanol, n-oktanol, kloroform eller n-heksan, isoleres fra kulturmediet for eller etter adskillelsen av cellene.

Eksempelvis lykkes en-isolering av BNC-forbind-eiser idet man ekstraherer en liter av en fermentasjons-opplosning som inneholder 1 g BNC, med omtrent samme volum organisk opplosningsmiddel som metylisobutylketon, eddiksyreester, n-heksanol, n-oktanol,'kloroform eller n-heksan i en perforator, turbo-ortirorer eller skilletrakt. Ved de to sistnevnte tilfelle må det for adskillelse av den BNC-innholdende■organiske

■fase fra emulsjonen tilknyttes et sentrifugeringstrinn.

Etter fordampning- av opplosningsmidlet, gjenblir en BNC-holdig rest som etter omkrystallisering f.eks. fra benzen, kan bli opparbeidet i ren form med smeltepunkt på 233° til-236°C.

Opplosningsekstraksjon er spesielt mulit i surt p^-område. Derved blir - opplosningen eksempelvis med ^ 0- fo±g HgSO^innstilt på omtrent p^ 2 og ekstrahert på den tidligere nevnte måte med metylisobutylketon, eddiksyreester, n-heksanol, n-oktanol, kloroform eller n-heksan. Etter inndampning av den organiske fasen, blir også her oppnådd en' BNC-holdig rest, som igjen etter omkrystallisering forer til et rent produkt med smeltepunkt 233 til 236°C. Ekstraksjonen kan også utfores i noytralt område.

Alternativt kan også en rensning utfores ved anioneutbyt-ning. Herved blir fermentasjonsopplosningen hensiktsmessig forst oppkonsentrert og deretter innstilt til en basisk verdi, eksempelvis p^12. Etter tilsetning av en mindre mengde metanol og omroring i turbo-omroreren blir cellemassen adskilt ved hjelp av en gjennomlopsentrifuge. Den vandige-metanolholdige væske blir pumpet gjennom en anionutbytterkolonne som er fylt med en anioneutbytterharpiks, f. eks. i acetat-form.

Den dannede BNC blir derved fullstendig bundet i ioneutbytteren. Ved eluering med 10%-ig eddiksyre i metanol oppnår man et produkt som hovedsakelig inneholder BNC, og etter omkrystallisering blir også her oppnådd rent BNC med et smeltepunkt på 233 - 236°C.

Etter en foretrukken utforelsesform oppnås en isolering av BNC-forbindelsene fra fermentasjonsvæsken helt enkelt ved utfelning i surt^område og avfiltrering. Herved'

blir den alkalisk innstilte fermenteringsvæsken forst filtrert for å fjerne cellematerialet og andre faste bestand- . deler. Deretter blir væsken gjort sur, hvorved BNC utfelles i fast, filtrerbar form og kan f.eks. utvinnes ved enkel filtrering.

For surgjoring kan alle mineralsyrer anvendes,

men det kan også benyttes organiske syrer, f.eks. eddiksyre,

og sogar gassformet COg.- Ved p^5 oppnås praktisk fullstendig utfelling. For å oppnå en bedre filtrerbarhet kan suspensjonen kort opphetes. Det isolerte faststoff kan inneholde opptil 90% BNC-forbindelser. De rene forbindelser lar seg derfra utvinnes ved omkrystallisering.

Spesielle enkeltheter ved oppfinnelsen.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er ikke bare utforbar med naturlige steroidsubstrater som cholesterin, sitosterin osv. Egnede utgangsmaterialer for en transformering til eksempelvisk~4og/eller f\-l,4 BNC er også deres slektninger som cholestenon, sitostenon, stigmastenon og lignende. I rammen av utviklingsarbeidene ble det funnet at en gruppe horende til gruppen av coryneforme vildstamme-bakterier kan være ét spesielt egnet utgangsmateriål for utvinning av de onskede defektblokkerings mutanter. Denne stamme, chol. 73»som er deponert under nummeret V 660,77 i Baarn, Nederland, såvel som under nummeret ATCC

31384. i Rockville, Maryland, USA, ble morfologisk og . vekstfysiologisk undersokt. Derved kunne folgende egenskaper faststilles:

Denne vildstammen blir mutasjonsbehandlet med l-metyl-3-nitro-l-nitrosoguanidin slik som beskrevet nedenfor i eksemplene. Mutasjonspopulasjonen blir ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen opparbeidet. Det ble derved

utvunnet den nye blokkeringsmutant chol.spee 73-M11, som er deponert i Baarn, Nederland, under nummeret 437-77 og.under nummeret ATCC 31385 i Rockville, Maryland, USA. Denne nye blokkeringsmutant er egnet for inhibitorfri fremstilling av 3-okso-pregna-4-en-20 karbonsyre og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre også i fravær av inhibitorer som hindrer steroidavbygning og/eller veksten. Således blir eksempelvis

utvunnet A-4 BNC og-eller /yl>4BNC av cholesterin som utgangsmateriål med stort utbytte - ved siden av mindre mengder av AD og/eller ADD.

♦

Eksempel 1

A. Utvinning av egnede vildstammer

Etter en i og for seg kjent anrikningsmetode blir sterinavbyggende mikroorganismer isolert fra jordprover, som man forst ved en agarplantetest undersoker deres evne til å vokse på cholesterin. Stammer som med cholesterin som eneste karbonkilde, viser klar kolonivekst, blir utsatt for videre seleksjoner.

B. Bestemmelse av vekstfaktor a

For bestemmelse av vekstfaktoren a blir de isolerte ren-kulturer dyrket aerobt i rystekulturer i folgende medium

.(per liter);

For bestemmelse av optisk tetthet av cellesuspensjonen blir uttatt prover med 24-timers avstand og ekstinksjon (E') blir målt i et Zeiss-fotometer (type PL 4). ved en bolgelengde av 620 nm (d = 1 cm) mot destillert vann. Vekstfaktoren a fremstår som maksimal tetthet ved slutten av den logaritmiske vekstfase minus utgangsekstinksjonen Eq.

C Bestemmelse av selektivitetsfaktoren b.

Slike vildstammer som.ved rystekolbetest med cholesterin viser best vekst, blir deretter undersokt i Warburgtest med 26-^C- og 4--markert cholesterin med hensyn ;

til deres egenskaper for sidekjedeavbygning av cholesterin.

Dyrkningen av stammene utfores i 500 ml Erlenmeyer-kolber med 150 ml næringsopplosning med fSigende sammensetning: l,5&tPepton, 0,2E$gjærekstrakt, 0,56$NaCl, 0,10$"glukose, 0,10$ "Tween 80", 0,05$ cholesterin, p^7,2. Stammene blir dyrket

48 timer ved 30 C på rystemaskiner,,cellene blir deretter

avsentrifugert, vasket 2 ganger med 0,05 m PO^-puffer og resuspendért i samme volum puffer.

For Warburg-forsokene blir 2,4 ml cellesuspensjon med 0,2 ml cholesterinopplosning (5 u mol cholesterin og 20000 cpm 4-^C eller 26-^C) dyrket. Avspaltet, radioaktivt COg blir oppfanget i 0,2 ml etanolamin (i sentralkar). Reaksjonen blir etter 6 timer ved 30°C ved tilforsel av 0,2 ml 6 n HgSO^stoppet, hvorved samtidig utdrives tilstedeværende COg. For'måling- av absorbert "^C02blir det uttatt 0,1 ml etanolamin fra Wrburg-karene og aktiviteten blir målt i sczintillation-counter (firma'Berthold u. Frieseke, type bF 5 000). Selektivi-tetsf aktoren b er kvotienten av 26-<1>^C02/4-<1>^C02.

I henhold til denne fremgangsmåten ble vildstammen chol 73 utvalgt som har.en vekstfaktor a = 3,71 °g en selektivitetsfaktor b = 5,0. Denne stammen ble anvendt for utvinning av den dnskede blokkeringsmutanten.

I det folgende blir det vist en rekke vildstammer som ved Warburgtest viser en gunstig selektivitetsfaktor b { 26-^^ 002//\.-^~^ C^) og som er blitt isolert av patentsokerene:

Eksempel 2<1>

A Mut as, j on

Utgående fra stammen chol 73 ble etter

den allerede utforlige beskrevne mutasjons- og seleksjons-

metode isolert mutanten chol 73-M H«

B Utvinning av mutanter med forhoyet BNC- utbytte.

1. Mutasjonsbehandling med UV-bestårling:

For okning av BNC-utbyttet ble mutantstamme col 73-M Hutsatt

for en fornyet mutasjonsbehandling. Stammen ble forst formert ved folgende næringsopplosning ved 30°C på en rystemaskin (næringsopplosning A): 0,8$pepton, 0,9$.gjærekstrakt, 0,3 glukose, 0,06$ "Tween 80<»>, 0,06$ cholesterin, pH 7,2.

Etter oppnåelse av den logaritmiske vekstfase ble cellene frasentrifugert, 2 ganger vasket med steril 0. 1 m PO^-puffer (p^6,5)>resuspendert i samme puffer og med mikroskop innstilt på en celle-tetthet på 10^ celler/ml.

8 ml av denne cellesuspensjon ble overfort i en Petri-skål

og bestrålt 90 sekunder under UV-lamper (avstand 30 m>UV-• bestrålingslampe fra.firma .Schutt Jun., Gottingen).

C Seleksjon og isolering av onskede mutantstammer

1. Anrikning av stammer med forminsket sluttprodukt-hemning: Den UV-bestrålte cellesuspensjon blir deretter dyrket i folgende næringsopplosning: .0,05$ NaHgPO^, 0,20$

KpHPO^, 0,05$ MgSO^<*>7H20, 0,02$CaCL2*2H20, 0,05$ MnSO^<*>4H20, 0,005$ [ Fe) 2S0^' 7H20, 0,10$ (NH^JgSO^, 0,0001$ Biotin,

0,10$ BRU 35 (polyoksyetylenmonolauryleter), 0,50$ cholesterin,

0,50$ BNC, PH7,2. Etter 72 timers inkubasjonstid ved 30°C blir 1 ml kulturopplosning overfort i ny næringsopplosning A og fornyet.aerob kultivert 48 timer ved 30°C

2.Penicillin-metode:

For eliminering av mulige revertanter blir. den tilvokste kulturopplosning deretter utsatt for en penicillin-behandling. 0,1 ml av denne cellesuspensjon blir overfort i 10 ml næringsopplosning av folgende sammenstning: 0,05$ NaHgPO^,

0,20$ K2HP0^, 0,05$ MgSO^- 7H20, 0,02$ CaClg• 2H20, 0,05$ MnSO^-4H20, 0,005$ (Fe)2S0^- 7H20, 0,10$ (NH^JgSO^, 0,0001$ bi p-t in, 0,10$ BRU 35 (polyoksyetylenmonolauryleter), 0,10$ BNC, pR 7,2. Etter l8-timers rystning ved 30°C blir fortynnet til ca. 10^ celler pr. ml med frisk, forvarmet næringsopplosning av samme

sammensetning , ble tilsatt 1000 IU penicillin G og videre inkubert 5 timer ved 30°C. Da blir antibiotikumet fjernet ved avsentrifugering av cellene og vaskning. med steril, fysiologisk koksaltopplosning og cellene ble inkubert i det ovenfor angitte medium med 1,0$ cholesterin'istedenfor BNC, ytterligere 48 timer. Deretter ble cellesuspensjonen utplattert på samme næringsmedium pluss 1,6$ agar og koloniene som viser best vekst på dette mediet med forhoyet substratkonsentrasjon, blir uttatt som s.tammek.ultur.

På denne måten ble isolert stammer som etter inkubasjon med cholesterin ga gode utbytter av BNC- Folgende av disse stammer ble ved Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen (DSM i Gottingen deponert.

Eksempel 3

A BNC- utbytter av de mest aktive mutant stammer

Stammen ble aerobdyrket i 500 ml Erlenmeyer-kolber med 100 ml næringsopplosning av folgende sammensetning: 0,5$ pepton, 0,8$gjærekstrakt, 0,4$ maiskli, 0,3$ glukose,.. 0,05$ "Tween 80", 0,05$ cholesterin, pR 7,2. Kulturen ble fordyrket på rystemaskin (rystefrekvens 150 omdr./min.) ved 30°C i 48 timer, deretter tilsatt 0,2$ emulgeringsmiddel.og 0,5$ cholesterin og videre dyrket 120 timer. Etter avbrytelse av kulturen ble uttatt prover, innstilt på p^2,0, ekstrahert 1:1 med eddikester- og tynnskiktkromografisk analysert.'

Utbyttene av de enkelte stammer er angitt i eksempel ' 2 i tabellen under C/2.

Eksempel 4

Akkumulasjonen av uonsket metabolite cholest-4-en-3-on og cholesta-1,4-dien-3-on fra substratet cholesterin ved hjelp av stammen ATCC 3 185 kan vidtgående undertrykkes når substratet som skal transformeres blir tilsatt reaksjonsblandingen kontinuerlig. Tilsvarende gjelder for andre . sterinsubstrater.

To 1 1-fermentere med 400 ml steril næringsopplosning (0,9$ pepton, 0,9$ maisvann, 0,9$ gjærekstrakt,

0,5$ K2HP04, 0,5$<g>lycerin, 0,1$ polypropylenglykol, pR 6,5)

ble impet med 50 ml av en godt tilvokset forkultur av stammen ATCC 3 185, som hadde blitt inkubert i et næringsmedium

(0,9$ pepton, 0,9$ gjærekstrakt, 0,5$ glycerin, PH<6>,5) 48

timer ved 30°C. Fermenterene ble rort ved 30°C og luftet med 500 ml luft/min.

Til en fermenter ble ved hjelp av en doserings-pumpe tilfort etter 24 timers inkubasjonstid en emulsjon av 5 g cholesterin, 1 g sorbitanmonostearat, 4 ml polypropylenglykol og 4 ml 1 n NaOH i 100 ml H20. Doseringspumpen pumpet per time 5 ml suspensjon slik at substrat-tilforselen strekte seg fra den 24- fermenteringstimen til den 44- fermenteringstimen. Etter 44 og 78 timer ble det fra fermenteren uttatt 100 ml kulturopplosning, etter surgjoring med svovelsyre og ekstrahering med metylisobutylketon, ble fermenteringsproduktet kvantitativt bestemt med tynnskiktkromatografi.

Hele substratmengden i kontrollkulturen ble tilfort fermenteren etter 24 timer.

Ved kontinuerlig tilforsel av substratet ble ett♦er 44 timers fermenteringstid folgende mengder bestemt (mg/100 ml) :• cholesterin 120, cholestenohpluss cholestadienon 40, bisnorcholenonsyre 100, etter 78 timers fermentering: cholesterin 20, cholestenon pluss cholestadienon 5»bisnorcholenonsyre 260.

Ved satsvis tilforsel av substratet ble etter

44 timers fermenteringstid bestemt (mg/100 ml): cholesterin 100, cholestenon pluss cholestadienon 240, bisnorcholenonsyre 80; etter 78 timers fermentering: cholesterin 40, cholestenon 100, bisnorcholenonsyre l80.

Eksempel 5

Mutasjonsbehandling med metansulfonsyreetylester: Stammen SC 104 blir dyrket i en næringsopplosning av 0,9% pepton pluss 0,9$ gjærekstrakt og etter oppnåelse av den logaritmiske vekstfase avsentrifugert, vasket 2 ganger med steril fosfatpuffer (0A,5 m, pu 7,5)°S resuspendert slik at celletettheten.ble 10 celler/ml. Til cellesuspensjonen tilsettes metansulfonsyreetylester slik at konsentrasjonen av det mutasjonsvirkende materialet er 0,1 m. Blandingen ble rystet 2 timer ved værelsetemperatur, deretter blir cellene avse'ntrii ugert, vasket 2 ganger med fosfatpuffer og resuspendert i frisk næringsopplosning og dyrket.

Eksempel 6

Utvinnelse av mutant CBS 437-77 henholdsvis ATCC 31 385 fra vildstammen chol 73 (CBS 660.77 henholdsvis ATCC.31 384) A) Tallrike sterinavbyggende mikroorganismer er blitt isolert etter vanlige anrikningsmetoder fra jordprover. Blant disse stammene ble det deretter ved inkubasjon med 4-14C og 26-14 C markert cholesterin, sokt etter mikroorganismer som fortrinnsvis avbygger steriner fra sidekjeden. Derved viste stammen chol 73 med 26-14 C-cholesterin den hoyeste avbygningseffekt og viste seg dermed fortrinnsvis egnet ved seleksjonen av avbygningsdefekte mutanter.

Den etterfølgende beskrevne metode for mutantiso-lering er ikke bare anvendbar på den foreliggende gruppe av coryneforme bakterier henhørende stamme chol 73 > men også for alle andre arter.

Mutasjonen av stammen chol 73 ble utfort ved be-♦ handling med l-metyl-3-nitro-l-nitrosoguanidin. Cellene ble dyrket i 48 timer ved "} 0°G i mediumet A,

Cellekulturen med en celletiter på 2 x 108 celler/ml ble behandlet 1 time ved 30°C med mutasjonsfremmende forbindelser (1 mg/ml), deretter vasket og videre dyrket 3 dager i næringsmedium B til en celletiter på <10° celler/ml.

B) 0,1 ml av den således oppnådde kulturopplosning

ble med tilsetning av o,l$ polyoksymetylenmonolauryleter og 0,1$ 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre i 10 ml næringsmdium B overfort og inkubert 36 timer ved 30°C. For økning av mutanter med defekter i ringavbygningssystemet ble med frisk, forvarmet næringsmedium av samme mammensetning fortynnet til 10^ celler/ml, 1000 IU penicillin G/ml tilsatt og videre inkubert i 24 timer ved 30°C. Da.ble cellene vasket og utplattert på agarplater med næringsmdium B pluss 2$ agar og 0,5$ glycerin. Etter formering av cellene til siktbare store kolonier ble det med Replica-stempelteknikk på næringsagar B' pluss 0,1$ polyoksyetylenmonolauryleter og 0,1$ 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre stemplet, og fornyet inkubert. I rammen av denne utvelgelse ("screenings") ble mer enn 50 mutantkolonier isolert som etter avstempling på steroidholdig næringsmdium ikke mer tilvokste.

For utvelgelse av de mest interessante mutanter ble stammen impet i'2 ml næringsopplosning A, inkubert 24 timer ved 30°C, og tilsatt ytterligere 0,2$ polyoksyetylen- ' monolauryleter og 0,2$ cholesterin og etter ytterligere 72

timer ble kulturopplosningen analysert. Innholdet av rorene ble utrystet med 0,5 ml metylisobutylketon, sentrifugert, aliquote mengder av organiske fase ble overfort på Merck-silikagelplater og utviklet i lopemiddelblandingen benzen-etylacetat (70 + 30). Påvisningen av steroidene på

kromatografiplaten ble utfort ved påsproytning av blandingen kons. H2S0^ + etanol (1 + 1) og påfølgende- oppvarmning til 120°C. Herved ble stammen CBS 437-77, henholdsvis ATCC 31 385) funnet som mutant som har en blokkering ved avbyggelse av sterinringsystemer.

Eksempel 7

For nøyaktigere proving av sterin-transformeringen ved corynebacterium CBS 437.77, henholdsvis ATCC 31 385, ble' stammen fordyrket i: en rystekolbetilsetning med 100 ml næringsopplosning A ved 30°C og en rystefrekvens på 150 omdr./min. i 24 timer. Deretter ble tilsatt 0,1 $ cholesterinopplosning

. og prover ble analysert etter forskjellige tider.

20 ml av kulturopplosningen ble innstilt med 2 n-svovelsyre innstilt på p^2,0 og ekstrahert i en perforator 3 timer med metylisobutylketon,. eddiksyreester, n-heksånol,

n-oktanol, kloroform eller n-heksan. Aliquote mengder av den organiske fasen ble påfort Merck-silikagelplater og

utviklet i lopemiddelblandingen toluol-butanon (80 + 20). Utvurderingen av kromatografiet ble utfort - med en tynnskikt-scanner ved 25O nm. ■ Som hovedkomponent ved cholesterin-. transformeringen ble funnet 50 mg 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre ved siden av.mindre mengder androst-4-en-3,17-dion.og androst-l,4-dien-3,17-dion.

Eksempel 8

For videre provning av. sterin-transformeringen

ved corynebacterium spee. CBS 437 *77} henholdsvis ATCC

31 385»ble stammen dyrket i en rystekolesats med 100 ml

næringsopplosning A ved ^ 0°C og en rystefrekvens på 150 omdr./ min. i 24 timer. Deretter ble tilsatt 0,1$ polyoksyetylensorbitan-

monooleat og 0,1$ sito.sterinopplosning og provene ble uttatt ved forskjellige tider og analysert.

20 ml kulturopplosning ble innstilt méd 2 n- . svovelsyre til p^2,0 og ekstrahert i en perforator 3 timer med eddiksyreetylester. Aliquote mengder av den organiske fasen ble påfort Merck-silisiumdioksydgelplater og utviklet i lopemiddelblandingen toluol-butanon (80 + 20). Utvurderingen av kromatografiet ble utfort med en tynnskikt-scanner ved 25O nm. Derved ble dannelse av 20-karboksypregna-l,4-dien-3-

on og 20-karboksy-pregna-4-en-3-on ved siden av mindre mengder androst-4-en-3,17-dion og androst-1,4-dien-3,17-dien funnet.

Eksempel 9

Kulturopplosningen fra eksempel 7 -ble konsentrert i en rotasjonsfordamper til l/4 av det opprinnelige volum, innstilt med NaOH på p^135tilsatt 3 ganger volumet-av metanol hvoretter cellemassen ble avsentrifugert. Den cellefrie kulturopplosningen ble fort gjennom en anione-utbytterkolonne i acetat-form og ved eluering med metanol ble forst androst-4-en-3,17-dion, androst-1,4-dien-3,17-dion og sporer av cholestenon utskilt. 20-karboksy-pregna-4-en-3-on og 20-karboksy-pregna-l,4-dien-3-on ble etterfølgende adskilt fra ioneutbytteren og anriket. Det anrikede eluatet ble inndampet til torrhet, opptatt med ^%- ±g ammoniakk ved lett oppvarmning, avkjolt til 4°C og utfelte produkter ble avfiltrert. Ved gjentatt solubilisering, ekstrahering i eter og omkrystallisering fra benzen lar okso-pregna-1,4-dlen-20-karbonsyre seg vidtgående rense.

Claims (38)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av 17-C-steroid- '• a-propionsyreforbindelser ved mikrobiologisk sidekjedeavbygning av 17-C-sidekjede-steroidsubstrater, karakterisert ved at man a) dyrker mikroorganisme-defektblokkeringsmutanter, som gir steroidf orbindelser med 17-cx-propionsyrerest også i fravær av inhibitorer som hemmer steroidavbygning og/eller vekst, i et vandig næringsmedium ved aerobe betingelser i nærvær av steroidsubstratet ved anrikning av 17-C-steroid-a- ' propionsyreforbindelsene i fermentasjonsopplosningen og. • b) isolerer de dannede 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelsene. ■ .

2. Fremgangsmåte for fremstilling av. 3-okso-pregna-4-en-20-karbonsyre (^ -4BNC) og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre (^ -1,4 BNC) ved mikrobiologisk sidekjedeavbygning av 17-C-sidekjede-steroidsubstrater, k a r a k t e rii sert ved at, man a) . dyrker en også i fravær av inhibitorer for hemning av steroidavbygningen og/eller vekst^ -4 BNC og/eller A-l>4 BNC med et utbytte på i det minste 15 vekts-% - beregnet av anvendt steroidsubstrat - givende mikroorganismus i et vandig næringsmedium ved aerobe betingelser og i nærvær" av et 17-C-steroidsubstrat ved anrikning av 3-okso-prégna-4-en-20-karbonsyre og/eller 3 •okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre og b) deretter isolerer den dannede 3-° kso-pregn' a-4-en-20 karbonsyre og/eller 3_°kso-l,4-dien-20-karbonsyre.'•

3. Fremgangsmåte i henhold til karvene 1 eller 2, karakterisert ved at det arbeides med defektblokkeringsmutanter som mikroorganismer som etter mutasjon og etterfolgende seleksjon er blitt dyrket av på-forhånd utvalgte vildstammer, som har evnen til å vokse på .steroidforbindelser med 17-C-sidekjeder som foretrukket eneste karbonkilde med i det minste omtrent samme avbygningshastighet for sidekjedene som for ringdelen av steroidforbindelsene, men fortrinnsvis har en forhoyet sidekjedeavbygningshastighet.

4. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 3j karakterisert ved at de anvendte blokkeringsmutanter er blitt dyrket av vildstammer som ved vekst på steroidforbindelser har en selektiv avbygningseffekt ved standardbetingelser i henhold til den generelle formel

hvori a er vekstfaktor og b selektivitetsfaktor for vildstammevekst og selektivitetsindeksen I har minst en tallverdi på 10, fortrinnsvis minst 100.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at selektivitetsindeksen I for vildstammen i det minste er 10 .

6. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 5>karakterisert ved at selektivitetsfaktoren b som for dyrkning av blokkeringsmutanten anvendte vildstamme i det minste er 2, og vekstfaktoren fortrinnsvis er minst 0,2, spesielt minst 1.

7. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 6, karakterisert ved at for dyrkning av vildstammene for etterfølgende seleksjon i henhold til selektivitetsindeksen I gjennomføres på en 17. -C-sidekjedesteroidforbinde]s e og av lignende art som karbonkilde, som ved hovedfremgangsmåten kommer til anvendelse som utgangsmateriål, hvorved fortrinnsvis disse steroidforbindelsene kommer til anvendelse som eneste karbonkilde ved dyrkningen av vildstammene.

8. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 7, karakterisert ved at man arbeider med slike defektblokkeringsmutanter som ved dyrkning av mutantpopulasjonen fra en i og for seg kjent mutant fra den utvalgte vildstammen på et mutantskillemedium ikke eller praktisk ikke vokser, mens de uonskede ledsagende mutantstammer vokser og: derved, henholdsvis under veksten, blir drept.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 8., karakterisert ved at man som mutant-skillemedium anvender et vandig næringsmedium som inneholder som karbonkilde en steroidforbindelse med en 17-C-sidekjede med inntil 5 C-atomer eller også i 17-C-stilling ingen sidekjede, hvorved dog fortrinnsvis anvendes en steroidforbindelse med 3-C-atomer i 17-C-sidekjeden.

10. Fremgangsmåte i henhold til kravene 8 til 9»karakterisert ved at man som mutant-skillemedium anvender som karbonkilde minst én 17-C-steroid-oc-propionsyreforbindelse og da fortrinnsvis som eneste karbonkilde for skillemediet.

11. Fremgangsmåte i henhold til kravene 8 til 10, karakterisert ved at man anvender de(t) som sluttprodukt onskede 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelse(r) som eneste karbonkilde i mutant-skillemediet.

12. Fremgangsmåte i henhold til kravene 8 til 11, karakterisert ved at man dreper de på mutant-skillemediet voksende stammer i nærvær av ikke-voksende defektblokkeringsmutanter uten beskadigelse av disse, f.eks. ved tilsetning av antibiotika eller ved anvendelse av P-^.

13. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 12, karakterisert ved at man arbeider i fravær av a, a-^dipyridyl eller 8-hydroksychinolin og . fortrinnsvis også i fravær av andre inhibitorer som hemmer veksten og/eller steroid-ringavbygningen.

14-- Fremgangsmåte i henhold til kravene 1' til 13, karakterisert ved at man arbeider med defekt-blokkeringsmutanter som ved en. inhibitor-fri standardtest gir et utbytte av /y4 BNC og/eller A-1>4 BNC på cholesterin eller sitosterin på minst 30 vekts-% og fortrinnsvis på cholesterin minst 50 vekts-% -' beregnet av anvendt steroidforbindelse.

15- Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 14, karakterisert vedat man arbeider med blokkeringsmutanter fra achromobacter, arthrobacter, bacillus, brevibacterium, corynebacterium, .flavobacterium, microbacterium, mycobacterium, nocardia, protaminobacterium, serratia eller streptomyces.

16. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 5> karakiterisert ved at man arbeider med en defektblokkeringsmutant fra vildstammen chol. spee. (CHS 660.77 henh. ATCC 31384).

17. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 16, karakterisert ved at man arbeider med blokkeringsmutanten chol. spes. 73-M 11 (CBS 437-77 henhv. ATCC 31385).

18. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 17, karakterisert ved at man arbeider med steroidforbindelser med mettede og/eller umettede 17-C-sidekjeder -og fortrinnsvis med opptil 10 C-atomer, spesielt med 8 til 10 C-atomer.

19* Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 18, karakterisert ved at man arbeider med steriner av dyrisk eller planteopprinnelse, spesielt med cholesterin, sitosterin, stigmasterin, campesterin og/eller ergosterin eller deres etterkommere som cholestenon, sitostenon eller stigmastenon.

20. Fremgangsmåte i.henhold til kravene 1 til 19, karakterisert ved at man tilsetter det transfor-merende steroidsubstrat i det minste hovedsakelig kontinuerlig til reaksjonssonen.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av mikroorganisme-def ektblokkeringsmutanter , som er egnet til teknisk fremstilling av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelser, spesielt for fremstilling av 3-okso-pregna-4-en-20-karbonsyre (^-4 BNC) og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre (A^.1,4 BNC) av 17-C-sidekjede-steroid-substrater, f.eks. av sterinforbindelser av dyrisk eller planteopprinnelse,. ved i det minste vidtgående selektiv sidekjedeavbygning også i fravær av inhibitorer som hemmer steroidringavbygning dg/eller vekst, ved aerobe betingelser, karakterisert ved at man 1) isolerer og dyrker en mikroorganisme-vildstamme som er egnet til aerob vekst på sterinforbindelser som eneste karbonkilde og som foretrekker 17-C-sidekjedeavbygning fremfor ringavbygning, 2) underkaster vildstammen en i og for seg kjent mutasjonsbehandling, 3) dyrker mutasjonspopulasjonen på et skillemedium på hvilket mutanter som gir 17-C-steroid-a-propion-syréforbindelene, ikke eller praktisk ikke vokser, mens de uonskede ledsagende mutantstammer vokser og derved, henholdsvis under deres vekst, blir drept og. 4) dyrker den gjenværende rest av mutantstammene på 17-C-sidekjedesterin-forbindelsene og derved isolerer stammene med optimal produksjon av 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelsene.

22. Fremgangsmåte i henhold til krav 21, . karakterisert ved at fremgangsmåtetrinn ved mutasjon 2) og mutasjonsadskillelse 3) blir gjentatt én eller flere ganger på ennu levedyktige mutasjonsstammer fra mutasjonsadskillelsen 3).

23. Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 og 22, karakterisert ved at vildstammer blir utvalgt og dyrket som ved aerob vekst på sterinforbindelser med mettede eller umettede alkylrester i 17-.C- med 8 til 10 C-atomer gir en selektiv-avbygningseffekt ved standardbetingelser i henhold til den generelle formel

hvori a er vekstfaktor og b selektivitetsfaktor for vildstammevekst og selektivitetsindeksen I har minst tallverdien 10, fortrinnsvis 100 og spesielt minst 10 .

24. Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 23, karakterisert ved at dÆ blir utvalgt og anvendt vildstammer som har en selektivitetsfaktor b på minst 1, fortrinnsvis minst 2 hvor deres vekstfaktor a fortrinnsvis er minst 0,2, spesielt minst 1, hvorved det videre kan være foretrukket forst å ta hensyn til deres selektivitetsfaktor b - ved muligst . hoy tallverdi for b - og deretter å ta hensyn til vekstfaktoren a.

25- Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 23,. karakterisert ved at, dyrkningen av vildstammene foregår ved aerobe betingelser i nærvær av et vandig næringsmedium på steriner av plante og dyrisk opprinnelse-, eksempelvis på cholesterin, sitosterin, stigmasterin, og/eller campesterin, hvorved fortrinnsvis anvendes de utvalgte sterinforbindelser som eneste karbonkilde for dyrkning av vildstammene.

26. Fremgangsmåte i henhold til krav 25, karakterisert ved at dyrkningen av vildstammene allerede skjer på sterinforbindelsen som karbonkilde som ved hjelp av den endelig dannede defektblokkeringsmutant skal avbygges til 17-C-steroid-a-propionsyreforbindelse.

27' . Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 26, karakteris e^rt ved åt mutasjonen av den' utvalgte vildstamme blir utsatt for energirik bestråling eller behandling med mutasjonsfremmende midler, f.eks. ved behandling med nitrosoguanidiner og/eller etylmetansulfonat.

28. Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 27, karakterisert ved at det som skillemiddel for . en ved mutasjonen dannet mutantpopulasjon anvendes et vandig næringsmiddel som inneholder som karbonkilde en steroidforbindelse med en 17-C-sidekjede med inntil 5-C-atomer eller også i 17-C-ingen sidekjede, hvorved foretrekkes en steroidforbindelse med 3 C-atomer i sidekjeden.

29. Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 28, karakterisert ved at man som karbonkilde i mutantskillemidlet i det minste anvender en 17-C-steroid-oc-propionsyre-forbindelse som man fortrinnsvis anvender som eneste karbonkilde eller i det minste mengdemessig som hovedkarbonkilde.

30. Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 29, karakterisert ved at man som karbonkilde i mutantskillemidlet anvender slike 17-C-steroid-a-propionsyre-forbindelser, hvilken fremstilling blir tilstebet ved hjelp av de ifolge oppfinnelsen dyrkede defektblokkeringsmutanter.

31. Fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen, karakterisert ved at man dreper de veksende stammer på mutantskillemidlet i nærvær av ikke eller praktisk ikke -voksende defektblokkeringsmutanter uten beskadigelse av disse.

32.. Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 31, karakterisert ved at man utforer drepingen av de i mutantskillemidlet voksende stammer ved hjelp av antibiotikatilsetning, eksempelvis ved tilsetning av en penicillinforbindelse eller ved medanvendelse av P-^-forbindelser.

33' Fremgangsmåte i henhold til kravene 21-32, karakterisert ved at man som hovedsakelig karbon- kilde i mutantskillemidlet anvender 3-okso-pregna-4-en-20-karbonsyre og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre.

34' Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 33, karakterisert ved at man isolerer de på mutantskillemidlet livsdyktige mutantstammer og av disse utvinner mutantstammene med optimal produktivitet av det onskede sluttprodukt.

35' Fremgangsmåte i henhold til kravene 21 til 34»karakterisert ved at mar arbeider med vildstammer fra achromobacter, arthrobacter, bacillus, brevibacterium, vorynebacterium, flavobacterium,. microbacterium, mycobacterium, nocardia, protaminobacterium, serratia eller streptomyces.

36. Fremgangsmåte i henhold til krav.21 til 35»karakterisert ved at man anvender som vildstamme chol. spee. 73 (CBS 660-77 h.v. ATCC 31384.

37. Ny vildstamme chol. spee. 73 (CBS 66O.77 h.v. ATCC 31384.

38. Nye blokkeringsmutantstammer chol. spee. 73-M11 (CBS 437-77 h.v. ATCC 31385) og DSM 1435, H37> 1439, 1442, 1443, 1444» 1445 som er egnet til inhibitorfri fremstilling av 3-okso-pregna-4-en-20-karbonsyre og/eller 3-okso-pregna-l,4-dien-20-karbonsyre. "" 39» Nye mikroorganisme-blokkeringsstammer, fremstilt i henhold til fremgangsmåten i henhold til kravene 21 til 35-