JPS625922A - 百日咳毒素の非毒素免疫原性調製剤の調製法と百日咳菌ワクチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はワクチンの調製に関するものであり、特に百日
咳の起因となるボルデテラ・ベルツッシス（以下百日咳
菌という）に対するワクチンの製造法に関する。

［従来の技術１ 従来の百日咳ワクチンは、不活化ポルデフう・ベルツッ
シス細胞を用いていた。

［発明が解決しようとする問題点］ 上記不活化細胞は、活竹青索と保護抗体の刺激に寄与し
ない物質とを比較的多量に含んでいるので、効力に限界
があるほか、不測の反応を起】危険をもっ（いた。極（
最近になって、ボルムアルデヒドまたはゲルタールアル
デヒドでトキソイド処理をフォローして百日咳菌細胞か
ら仮糸赤面球状凝集素（Ｆ　ＨＡ　）抗原と、リンパ球
増多症促進因子（１１］　Ｆ　）抗原とを抽出した百日
咳ワクチンの製法が提案されている。しかし、上記方法
によって無毒化または抗原の１〜キソイド化は完全（１
ものでなく、非可逆なものでもない。更にサッカ■−ズ
・デンシティ・グラジエン１ル遠心分離を含む抗原の抽
出法は比較内角ＩＦＩが大きく、費用もかさむものであ
る。

本発明は上記欠員の１つまＩこはそれ以上を除去し、或
いは減少させることを目的としている。

本発明者は百日咳菌抗原をカルボジイミドで処理するこ
とによって免疫原性を害うことなしに良好にトキソイド
化できることを見出した。それどころか、免疫原４ｔ１
１はカルボジイミド処置により実質的に向上するという
ことをも見出して本発明を達成したものである。

［問題点を解決するための手段］ 上記目的を達成するため、本発明はカルボジイミドで百
Ｅ１咳毒素を処理することによって百日咳毒素の非毒素
化免疫調製剤を調製する方法を提供するものである。

百日咳毒素は、イの毒素（ＰＴ）と仮糸赤血球凝集索（
Ｆ　ｌ−Ｉ　Ａ　＞との親和性混入物の形で処理するこ
とが好ましい。

′本発明の好ましい特長は、百日咳毒素を免疫原性トキ
ソイド化ソイド、次いでその調製物を生卵学的受容担体
に処方する（　ｆｏｒｎ＋ｕｌａｔｉｎｇ）ことからな
る百日咳菌ワクチンをｌｉＪ造する方法を提供する。

更に本発明の好ましい特徴は、次の］［稈よりなる百日
咳菌ワクチンの製造法を提供するものである。すなわち
、百日咳菌細胞を培養し、前配線胞中の赤血球凝集毒素
（Ｆ　ＨＡ　）抗原と百日咳毒素（ＰＴ）抗原とを培地
内にレリーズさせ、前記細胞と内毒素とを実質的に＠離
させた培地からＦ　１１Ａおよび１）■抗原を回収し、
Ｆ　）−Ｉ　ＡおよびＰ　Ｔ抗原の脱毒素を行なうべく
両抗原を水溶性カルボジイミドで処理し、次いで生理学
的受容担体に処方することからなる。

疑いを回避するため、百日咳毒素（Ｐ　−ｒ　）が、ヒ
スタミン感作因子（ト１ｓＦ）、百日咳毒素生成物、百
日咳ＡＩ）　ｌ）−リボシルトランスフＪラースおよび
アイスーツ１〜活竹化蛋白と同様に、リンパ球増多症促
進因子（Ｌ　Ｉ）　Ｆ　）またはリンパ球増多症促進因
子−赤面球凝集索（１−１３Ｆ　−’　）Ｉ　Ａ　）と
しての分野で知られていることに注目される。ＰＴに関
する参照文献は、抗原として知られているＬＰＦおよび
伯の名称の何れに対しても対応するものとなる。

また内毒素は、しばしばこの物質の性質に対応するリポ
多糖体（Ｌ　Ｐ　Ｓ　）として引用される。

ＰＴおよびＦＨＡ抗原は百日咳菌の適当な株の細胞の形
で得てもよい。この菌はワクチン化される主体の環境に
より株として用いられる。

前述の事柄に関連して次のことを注意すべきである。本
発明によれば、天然に生ずる微生物ｌ１１１もしくは遺
伝子による変種および／または人工的遺伝子イクイバレ
ント百日咳菌ｍｍの何れかが用いられ、かつ微生物細胞
と解釈されるものが参照される９、かかる細胞を得るた
めの種々なｆ順は周知で゛ある［例えばディ・ママーｊ
イスほか（１９８２）１七レキコラ−・り［１−＝−ン
グ、ア・ラボシトリーマユニ１アル　ｍｌ　−）レド番
ス１リング・ハーバ−１−コー」−り・・・参照１゜こ
の細胞は、当該細胞の成長と分裂、１〕■お上σＦ　Ｌ
Ｉ　Ａの生成を導く条件の下で、百１］咳閑の培養のた
めの適当イ１培地で培養する。これらの培地および培養
条ｆｌはよく知られでいる。一般に水溶性培地を３０℃
から４０℃の濃度、１））１７．０〜８．０で用いる。

Ｐ］およびｆ’ｌｌＡの各抗Ｉｔ７ｔの好適なＨｓが、
２〜５［］の後増殖した百１］咳菌細胞から培地中に１
１１１れるど、培１１！ｌは合Ｆ１＋的イす時間（すな
わち、３０分間１００００（＋）内の遠心分離によつ（
−細胞から離れる。

Ｐ　ＴおよびＦ　ｌ−Ｉ　Ａ抗原番よ免疫原性を害ねな
い適当な方法で培地から回収される。本発明によればレ
レクティブ・アフイニｊイ・り１１７１〜グシフイまた
はり刀ンドとして固定したトリアジンを用いるダイリガ
ンドク１１７１〜グラノイに基づく単一抽出手法によっ
てＰ　１、ｌ−Ｈ△両抗原並びに１１）Ｓのごとき毒素
化合物を他のＩ飽生成物から遁餡状態で回収することが
できることを見出１ノ１５二ものである。これに関連し
て、毒素化合物からのｕｋ　ｌ１ｉｌ＋は、該化合物が
ほぼ完全に除去されることを意味することが理解される
。ある秤の化合物はカルボジイミド９１１３理によって
実質的に服毒素化される。１上記抽出媒作中に通常はポ
リサッカライドが１〜リアジンのキャリアどじで用いら
れる。Ｊイ１わ６、市販されているブルートリアジンダ
イリガンドを含むプルーセファ［１−ス［例えば）／７
−マシノー）ネ１（スウェーデン）ｖＪタイプＣＩ−−
６１３］を用いる。

ダイリガンドクロマ］−グラフィは、免疫原性を阻害せ
ずにＰＴ　ａ３よびＦＨＡ抗原の保持を導く条件の下で
達成される。１？レクチイブ・アノイニーティ物質であ
るブルーセファロースの場合に、実質的なヒルフリー培
地はＩ）Ｌｌ　５．５−８．５（例λば、ｐＨ約６．０
）でよく混和される。

未結合細胞生成物と化合物を含む液を浮遊させた培地は
結合Ｐ　ＴとＦ　Ｈ△とを強力なイオンをもつ溶出液を
用いてダイリガンド物質から抽出したのら捨てる。ブル
ーセフｊ７［１−スの場合には、通常１ＭＪλＡ化す１
〜リウム水溶液または類似の溶出液が用いられる。所望
の］〕−１およびＦ　ｆＩＡ　ＩＡ原を含むカラムフラ
クションはウマ赤面法凝集毒素の手段によって固定され
る。

本発明によれば１）丁含有物質をカルボジイミドで処理
する。カルボジイミドは一般式Ｒ−Ｎ　＝　Ｃ＝Ｎ−Ｒ
’で表わされる化合物である。式中１（−１Ｒ′は同一
または異イｉるアルキルまたはアリル基で、好ましくは
低級アルキル（例えばＯ１’〜４をもつアルキル）と任
意に置換１ノたフェニル基から選ばれたものであ・る。

特に前述のジイミドは１−Ｔチル−５−（３−ジメヂル
アミノプロビール）−カルボジイミド（以下Ｆｒ）ＡＣ
）である。一般に、カルボジイミドは酸添加塩；例えば
イれらのハイドロクロライドの形で用いられる。カルボ
ジイミド処理は毒素の青竹が実質的にのぞかれるまで続
ｔＪられる。処理物の組成（ま公知の種々のテス］へに
よって容易に七ニターすることができる。例えばマウス
中のヒスタミン感作活性白血球増感促進アビリティを確
かめることができ、これらの方法は後記実施例および文
献に記載される。

トキソイド処理の必修時間は一般（こｐ　ｔｌ　（＋口
４．０から８．０の幅、濃度４℃から３０°Ｃの幅、使
用１６カルポジイミドの種類とｍｌによって変化しつる
。

ＥＤＡＣ処理の場合は一般にＩ’）　ｔｌ　１ｆｆｉ　
４．０から６．０、気温１５℃から２５℃の領域にお【
ノる弱酸性ｐ　ｔ−＋で施される。５．０から３０．　
Ｏｎ＋Ｈのト１）ＡＣ濃度を用いて処理は通常６時間か
ら２４時間施される。

毒性が充分に減少されると、残留カルボジイミドは透析
又は当該分野で周知の他の適切な方法で便宜に取り除か
れる。

本発明のワクチンは特に筋肉内又は皮下注目を経て一般
に静脈もしくは経口にて施される。静脈注射では、ワク
チンは水性、油竹補形薬Ｃの無菌溶液もしくは懸濁状態
ぐ施され、等張、懸濁液の精製用に任意容器の白液に例
えば０．１５８水ｆ［プトリウムｍ素のごとき、防腐剤
やイの＋Ａ　Ｉｔをも含んでいる。このような処方ｔま
甲イひ投り又は多数投！ｊ密閉容器で便宜的に提供され
る。

経［］投与では、ワクチンは水もしくはシ［１ツブ、カ
プセル、服用カプセル、丸薬、錠剤状のひと口状で、あ
るいは水性、油性の等張、懸濁液かシ［１ツブ状の懸濁
液で提供され、前記懸濁液は懸濁材もしくは０／Ｗ又は
ｗ１０エマルジョンを（（意に含／υでいる。好ましく
は又は必要であれば香りづ１］、甘味づけ、ジャム状、
厚さ変更又はエマルジ」ン各材が処方中に含まれる。

錠剤は結合剤、潤滑剤、不活性稀釈剤又は表面活性もし
くは分散剤を任意に混合した例えば冷凍パウダー又は顆
粒などのパウダーや顆粒のような抗原調製を含み、圧縮
又は型流して不活性液状稀釈剤状に処方される。このよ
うな錠剤は任意に刻み［１７Ｊ１１　丁又は塗被される
。カプセル並びに丸薬は活性化合物を単独に、又は１つ
もしくはそれ以−ヒの補助成分添加物を含む。カブヒル
又は任意に補助成分を会合して、水性又は油性の等張懸
濁液又はエマルジョン中に活性化合物を含む。

一般に、本発明のワクチンは抗原がプロティン＝　１１
− １０〜１００１１ｇ／ｍｌｌ１１度での等張懸濁液に提
供されるよう処方されている。各投与が便宜１−１０．
１・〜・１、Ｏｍρ含有の単−一定投与状で施される場
合、各投与は一般に１０〜２０μ０の抗原を含むことが
望ましい。ＰＴとＦ　１１　Ａ抗原の相関比例はワクチ
ン中で変化することが望ましい。しかしながら、一般に
Ｐｌ−とＦ　ｌ−Ｉ　Ａの相関比は各々１０：１〜１：
１０の範囲が望まれる。

本発明のワクチンは好ましくは例えばジフテリアもしく
は強縮１−キソイドのごとき１つの又はそれ以上の疾病
に対し、刺激的保護用の抗原を含む複合共役ワクチンと
しても処方される。望よ（〕くは本発明のワクチンはア
ルバイト［１ゲル、ムラミルジペプタイド（Ｍｒ）Ｐ）
又はその誘導体のひとつ、精製ザボニン（Ｏｕｉｌ−＾
）などの１つ又（Ｊそれ以上のアジュバント又は免疫相
乗剤を効果的一定投与に処方する。

本発明はワクチンと調剤受容担体とを結合させることに
より、ワクチンの調剤上の処方を提供Ｊるものである。

　１２一 本発明のワクチンは予防接種スケジュールに従いヒｌ−
に投ちすることで白「１咳罹病を回避Ｊることができる
。投与の酊とスケジュールは抗原の抗原性と免疫原性に
よって定まり、更に患者の年齢体重のごとき調剤」−の
勘案によって定まる。しかし、多くの場合には、このワ
クチンは４〜６週間の間をあ・）て当該年齢の２〜６ケ
月に少なくとも２回投与し、更に好ましくは１８ケ月児
５オ児には促進剤投与を続けることが推奨される。本発
明の毒性過程による免疫強度の度合やアジュバントおに
び／または他の免疫強化剤の含有によってその開をある
程度加減することが可能である。

本発明の他の特長は、ワクチンの有効免疫原性崩の投与
もしくは調剤上の処方により百日咳を防ぐ方法を提供す
るにある。更に本発明の特長と利益は以下の実施例から
明らかであろう。

［実施例１ 実施例Ｉ 百日咳菌ワクチン調製 Ａ　毒素の調製 グラスゴー地方における子供の百日咳から検出された百
日咳菌＾３８１は下記を含有する変更スタイ培地（ファ
ーンバック７ラス］１リットル中５００　ｌ１ｌ）は、
ポルデー・ジャング培養プレート１の成長から接柱され
、５１１間３７°Ｃで゛インギコベー１〜される。有機
物は４℃、３０分間に１０．００Ｏｒｐｍ（Ｘ　４４，
３００ｇ　）での２度の遠心によ−）で廃除される。残
留物、無細胞培養体液のＤ　Ｉ−１は２．５Ｎ塩酸で６
．０にアジヤス１へされ、ヂメｎ　＋Ｊ−ル０６０１％
（Ｗ／Ｖ最終１１１１１＆）（ジグマフＩＦ　’／　’
７１−１７　）！　’−Ｊ　７Ｊ合衆国）が防腐剤どじ
てイ」加される。

ブルーＩＹファ［１−ズ　ＣＬ−６Ｂ（ファーマシアリ
ミテツド、スウ丁−ｆン）が付加され（培養体液１リッ
トルにつき１０　ｍｌの密封ゲル）、１８時＋１！　／
ｌ°０て゛ゆっくりかき況ぜられる。培養体液は次にゲ
ルから分離されて廃棄され、ゲルはガラスカラムにぞぞ
がれた後、室温にてｐｉ−１８，０で数カラム吊の０．
０５Ｍ−１〜リス塩Ｍ緩衝液で洗滌される。

百日咳菌抗１１ｊは、ｐ＋−＋ａ、ｏで１Ｍ−すｌヘリ
ウム塩イオン強度に接近して０．０！１Ｍ−１ヘリスー
塩酸緩衝液と共にカラムから溶離され、５ｍρ分画のカ
ラム溶１！１１が収集され、ウマの赤血球との正赤面球
凝集索を引起（〕、これらはマイナス２０℃で貯蔵、凝
集、保管される。こうして得られた百［」咳菌抗１京調
製は１〜キソイド処理を容易にするために２リツトルの
２０．０ｍＨすｌ−リウムリン酸塩緩衝液に対（〕、ｓ
、０ｐｌ−１以下で０５Ｍ　　ＮａＣｆになるまで１晩
透析される。

理 ８１〜キソイド処膠 １〜キソイド混合液の最終容量中の総プ１］ナイン５０
μｇごとにに「デル−５−（３−ジメブルアミノブ目ピ
ル）−カルボジイミドｌ−１Ｏｆｆ（Ｅｌ）ＡＣ）４．
０　ｍｇがイζＪ加される。カルボジイミドは５．０ｐ
１−１で０．５Ｍ　　Ｎ　ａ　（：、　１２まで、２０
．０ｍＭナトリウ１８リン酸塩緩衝液に溶解される。ト
キソイド混合最終容量は、５０μｇ百日咳菌抗原プ［］
ナインと、混合液４．Ｏｎ＋ｇＥ　Ｄ　Ａ　Ｃｍ（ｉ−
’を含有するまでアジドストされる。混合処理物は３７
℃で２４時間静置される。

Ｃ注吐四ワクチンの碑１ トキソイド抗原はカルボジイミド廃除用に２０．Ｏｎ＋
Ｈす］〜リウムリン酸塩緩衝液に対して０．旧％（ｗ／
ｖ　）チメロ４ノーール中０．５Ｎ　ａ　ＣＩＩまで完
全に透析される。帰着懸濁はこれにより無菌リン酸緩衝
塩化ナトリウム水溶液（ＮａＣｆ　　８１−１にＣｆ　
　Ｏ，２（Ｊ（１、Ｋｔｌ？ＰＯ４０，２（Ｊ（１−’
並ヒニＮ　ａ　２　ｔ−Ｉ　Ｐ　０４　１．１５（Ｉｆ
ｆ　−’）　トなる。

実施例■ ２−クブクを」（性 ワクチン調製は主として糸状赤血球凝集と百日咳毒素（
Ｌ　Ｉ）　Ｆ　−ＨＡ又は［〕Ｔ）と他のいくつかの抗
原どの混合物から成る。

毒性 白血球増加促進活性はマウスへの注射で試験される。４
．０μｑトキソイド抗原プロテイン／マウス投与におい
て、白血球細胞数計測には増加は発見されなかった。ヒ
スタミン感作活性はヒスタミン　ジヒドロク１コライド
３．０１＋１（］／マウスのワクヂン注射５０後のマウ
スを収集ｌノで試験される。

１２．０１１ｇ　ｌ−キライドプロティン／マウスにつ
き、検出活量は発見されなかった。７日以上の４．０μ
ｑトキソイド抗原プロテイン／マウスの投薬後も体重増
加率における意義ある減少は発見されなかった。

試験管内活性 トキソイド百日咳菌抗原は、実験白酒にＪ、るマウスか
らの血清分析にお（する自然１−、非１〜１ソイド抗原
よりもＩｏＧクラスの抗］〕１−抗体の刺激においてよ
り活性することが発見された。

上述並びに以下に］ホベる実施例にお（ｊる毒性並びに
活性の決定は、［薬理学と治療１　　（＋９８３）　１
９号第１頁−第５３頁のエイ・シー・ワードロウ、７−
ル・パー１〜ン外著の評論「白「１咳毒竹」にさらに詳
述されている。

実施例■ 百］］咳ワー２ヂン〜１ ６１−’　Ｔ　／　ＦトＩＡの調製は実施例Ｔ（２バツ
チ）の処置並びに変更培養方法を用いて得られ、これに
おいてメヂルβ・シフロブキシ１〜リン（１ｏ＃　）を
実施例１で用いられたスタイナー・ス］−ル１〜培地に
付加し、培地を３６時間（２バツチ）振とうすると、さ
らに変更した培養方法としくイオナイズミ外著、１９８
３年「感染と免疫性」第４１巻第１．１３８頁−第１．
１４３頁）、これにおいて実施例■のスタイナー・ス」
−ルト培地に代えてメチルβ−シフ１］デ４ニジ］−リ
ン（１０／ｆ　”）を含むシクロデキシ］−リン液（Ｃ
１）培養培地を用い、この再度培地を３６時間（２バツ
チ）振とうする。

ＰＴ並びにＦＨＡ分野は、ＥＬＩＳＡシステム（参考２
）を用いて決定され、表１に見られるように、ＰＴとＦ
　ｌ−Ｉ　Ａの相違する割合が、様々な方法によって得
られる。

全てのバッチはこのあと上記実施例■に記載した方法に
よってトキソイド並びにワクチン組織化１ス前に貯蔵さ
れる。

参考１ 実施例ＴＶ ワクチンの属性 実施例■の方法にＪ：って得られた（貯蔵）ＰＴ／　Ｆ
　ＨＡワクチンの毒性とｆｉｆｉ竹はさらに５６℃で３
０分間全細胞を暖めて調製された標準全細胞百日咳ワク
チン並びに実施例■で説明した方法の最初の部分、例え
ばカルボジイミド処理廃除によって得られる非処理内１
１咳毒性調整の毒性と活性と比較される。

表■は、本発明の調整における貯蔵属性の検出に用いら
れるヒスタミン感作活性結果を詳細にしたもので、通常
ワクチン貯蔵状態（１−４℃）において、免疫投与レベ
ルで、非毒性の復帰も損失もなかった。一方かｒｘり低
い、非免疫投句レベルでさえも毒素は高い毒性を示した
ことをつけ加える。

（以下余白） ＝　２０− 表■ マウス保護ｆ−タ 第１図は、マウスの体重増加デス１−を用いて、得られ
た比較データを示す。図に見られるように本発明の調製
は、リンｍｔａ衝塩化′ｊトリウム（＋）Ｂ　Ｓ　）調
節と比較して、何ら変らず、むしろ標準全細胞ワクチン
は主としＣ体重増加率を減少させた程である。

第２．３図は本発明の調製の抗原ｆ［を２つの異なる投
与レベルで、Ｅｌ、ＩＳＡ測定（例えばイー・エングバ
ル外著、１９８０年［酵素学にお（〕る方法、［第７０
巻第４１９頁−第４３９頁を参照）にてマウスに施した
テスト結果を示している。第３図の場合はフェチュイン
（１’ｅｔｕｉｎ）　塗被（１ウエルにつき４００ナノ
グラム）ミクロ滴定量プレートを用いた変更システムが
用いられる。主として標準全細胞ワクチン（５混濁コニ
ツトｌ１ｊ７／マウス）又は非処理調製（５Ｉ１ｇ／マ
ウス）を用いるより高い抗原性が得られる。

表■は、生体マウス保護テストの結束を詳細に述べるも
のである。表に表わされるように処理済調製の３つの分
割バッチが実施例■の最初の部分で得られる貯蔵抗原月
の３つの各々処理済バッチごどにデス１−される。非処
理（毒素）調製に引用された有効保護投’；　（Ｐ　Ｄ
　５０＞はこの投与が非処理材用通常致死量であるから
、無論外挿される。

し発明の効果１ 百日咳毒素をカルボジイミドで処理することによって免
疫原付を古うことなしに良好にｔ−キンイド化できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はマウス体重増加テストの比較データを示す線図
、第２図および第３図はＥ　１．、　Ｉ　Ｓ　Ａ測定線
図である。 ザ　ユニバーシティ　］−ト 出　願　人　　Ａブ　ザ　ユニバーシテイオブ　グラス
ボウ 代　　理　　人　　　芦　　１）　直　　衛Ｉ１１　　
　合　　正　　幸 恥Ｇリスホ９ンス ＬＯｇゴｏ／１″月ラヱΣ−に弓ζエカコニ端ホし１ノ
ζ−１９ｃ１　リスボンλ ＩＧ　　３ 手続補正用 （特許庁審査官　　　　　　殿） １、事件の表示 昭和６１年特許願第１１８３７６号 ２、発明の名称 百日咳毒素の非毒素免疫原付調製剤の調製法ど百日咳菌
ワクチンの製造法 ３、補正をする者 事件どの関係　　特許出願人 ザ　ユニバーシティ　］−ト　　オブ　ザユニバーシテ
ィ　オブ　グラスボウ ４、代理人 〒１０５東京都港区西Ｗｉ橋１−１８−１４小４１濃会
館５、補正の対象 （１）願書を別紙のとおり補正します。 η。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　百日咳毒素をカルボジイミドで処理することからな
   る百日咳毒素の非毒素免疫原性調製剤の調製法。 ２　百日咳毒素は仮糸赤血球凝集素を親和的に混入させ
   た形で処理される特許請求の範囲第１項記載の調製法。 ３　カルボジイミドで処理したものを生理学的受容担体
   に処方して百日咳菌ワクチンとする特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の調製法。 ４　百日咳菌細胞を培養し、前記細胞中の赤血球凝集素
   （ＦＨＡ）抗原と百日咳毒素（ＰＴ）抗原とを培地内に
   レリーズさせ、前記細胞と内毒素とを実質的に遊離させ
   た培地からＦＨＡおよびＰＴ抗原を回収し、ＦＨＡおよ
   びＰＴ抗原の脱毒素を行なうべく両抗原を水溶性カルボ
   ジイミドで処理し、次いで生理学的受容担体に処方する
   ことからなる百日咳菌ワクチンの製造法。 ５　百日咳毒素とＦＨＡ抗原とはセレクティブ・アフイ
   ニティ・クロマトグラフィまたはリガンドとして固定し
   たトリアジンを用いるダイリガンドクロマトグラフィに
   よって培地から回収される特許請求の範囲第４項記載の
   製造法。 ６　トリアジンはポリサッカライドキャリア上に固定さ
   れている特許請求の範囲第５項記載の製造法。 ７　カルボジイミド処理はｐＨ４．０〜８．０、湿度４
   〜３０℃の下で行なわれる特許請求の範囲１項ないし第
   ５項の何れかの項に記載の製造法。 ８　カルボジイミドは濃度５．０〜３０．０のものが用
   いられる特許請求の範囲第１項ないし第７項の何れかの
   項に記載の製造法。 ９　カルボジイミド処理は、６〜２４時間行なわれる特
   許請求の範囲第１項ないし第８項の何れかの項に記載の
   製造法。 １０　特許請求の範囲第１項ないし第９項の何れかの項
   に記載された方法によって得られた百日咳ワクチン。 １１　少なくとも１つの助剤と免疫強化剤とを含んでい
   る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２　特許請求の範囲第１０項によるワクチンの免疫原
   性有効調製量を供与することからなる百日咳に対する免
   疫処置方法。