JPS6230720A - 新規活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、上皮細胞の成長促進作用及び胃酸分泌抑制作
用を示す活性ペプチドに関する。

（従来の技術） エイチ・グレゴリ−（Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ　　）は、ヒ
ト尿に含まれる胃酸分泌抑制物質の抽出精製を行い。

２ｆｉの物質、すなわちβ−ウロガストロン（β−ＵＧ
）及びγ−ウロガストロン（γ−ＵＧ）′（ｃ−得た〔
゛ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　２５７巻−３２５−
３２７頁、１９７５年〕。β−ＵＧ及びｒ　−ＵＧは、
いずれも１６種のアミノ酸からなる１本領ポリペプリド
があって、それぞれ、アミノ酸総数５３及び５２１等電
点４．５及び４．３である。

一方、コーエン（Ｃｏｈｅｎ　）らは、ヒト尿から上皮
細胞の成長促進作用を有する物質、すなわち。

ヒト上皮細胞成長因子（ｈ−ＥＧＦ）ｔ”発見した（　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７２巻１３１７頁、１９７５年）。このｈ−ＥＧ
Ｆはアミノ酸総数が４９ケである。

（発明が解決しようとする問題点） 種々の生理活性の類似性及び免疫学的交互性からウロガ
ストロン（ＵＧ）とｈ−ＥＧＦとは同一の物質であろう
と言われている反面、アミノ酸総数が前記したとおり一
致しないことは、永らく疑問とされていた。そこで９本
発明者らは、コーエンらの方法に改良を加えて、ラジオ
レセプターアッセイ（ＲＲＡ）を指標にヒト尿からのｈ
−ＥＧＦ’の抽出を検討した。

この結果、β−ＵＧ、　　γ−ＵＧ及びコーエンらが発
見したｈ−ＥＧＦとは異なる新規なｈ−ＥＧＦを単離す
ることに成功し１本発明に至った。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、ヒト尿から抽出され、下記神）〜（ｇ）の理
化学的性質にニジ特定され、上皮細胞の成長促進作用及
び胃酸分泌抑制作用を有する活性ペプチドに関する。

（ａ）紫外線吸収　　第１図に示す（活性ペグチスベク
トル　　ド濃度８０μｇ／ｍｅ、　　リン酸２ナトリウ
ム水溶液） （ｂ１分子量　　　　約６，０００ （ＳＤＳ−尿素−ポリアク プルアミドゲルディスク電 気泳動法） ｔｃ＞等電点　　　　４．４０ （ポリアクリルアミドゲル 等電点電気泳動法） （ｄ）呈色反応　　　フォリン・ローリー法　十り−マ
シー・プリシャ ント・プル法　　　　　＋ ７エノール硫酸法　　　− フクシン法　　　　　　− （ｅ）溶解性　　　　水に可溶（ただし、　　ｐＨ４，
４０付近では等電点沈殿 をする）。

酸性メタノール、酸性アセ トリトリル、塩基性メタノ ール及び塩基性アセトニト プルに可溶。

（ｆ）性状　　　゛　白色粉末、水に溶かすと無色透明
。

（ｇｌ構成アミノ　　Ａ／ａ、　Ａｓｎ、　Ａｓｐ、　
Ｃｙｓｔ酸　　　　　　　Ｇｌｕ、　　Ｇｌｕ、　　Ｇ
ｌｙ、　　Ｈｉｓ　＊Ｉｉｅ、　　Ｌｅｕ、　Ｌｙｓ、
　Ｍｅｔ。

Ｆ’ｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ 及びＶａｌ 本発明に係る活性ペプチドは次の条件に工夛。

高速液体クロマトグラフィーを行うとき、第２図に示す
ように保持時間５５分の位置に溶出する。

ただし、２８０１１ｍの波長の吸光度を指標とする。

カラム　　　８ｍｍφＸ２５０　ｍｍ カラム剤　　平均粒径５μｍオクタデシル化シリカゲル
〔例えば、デペロジル ＯＤＳ　（野村化学■商品名）〕 溶出液　　　５０　ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセト
ニトリル水溶液（アセトニ トリル／水が２８０７１０００゜ 容量比） 流速　　　　１ｍｌ！／分 本発明に係る活性ペプチドは１次のようにして製造する
ことができる。

まず、ヒト尿をｐＨ３〜４にし、ポリアクリル酸屋イオ
／交換樹脂、ポリメタクリル酸をイオン交換樹脂等の弱
酸性イオン交換樹脂と接触させ、つする。ついで、溶出
液を好ましくは濃縮及び脱塩した後、ゲルろ過及びイオ
ン交換を適宜の順序で行う。ここで、濃縮は１例えば、
スチレン−ジビニルベンゼン系共重合体、アクリル酸エ
ステル系重合体、メタクリル酸エステル系重合体等の巨
大網状ポリマーからなる中性吸着樹脂と上記溶出液全接
触させ９次いで、該樹脂への吸着物をメタノ−乞アセト
ニトリル、ｎ−プロパツール等の水溶性有機溶剤と水と
の混合液で溶出する方法又は限外ろ過法によって行うこ
とができ、比活性を上げるような他の濃縮方法を採用し
てもよい。上記脱塩は、架橋デキストランゲル、架橋ポ
リアクリルアミドゲル等の親水性ゲルを用いたゲルろ過
法により行うことができる。上記したゲルろ過は。

脱塩に採用することができるゲルろ過法と同様の方法で
行うことができるが、展開液としては、酢酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液等の緩衝液であって。

０、０２　Ｍ以上かつｐＨ５〜９のものを使用するのが
好ましい。上記したイオン交換は、ジエチルアミノエチ
ルセルロース、ジエチルアミノエチルアガロース等の弱
塩基性イオン交換樹脂を酢酸緩衝液。

リン酸緩衝液等の緩衝液であって０．０５Ｍ以下でｐＨ
５〜８．５のもので平衡化した後、前工程で得られた溶
出液を添加又は負荷し、ついで、該樹脂への吸着物を酢
酸アンモニウム水溶液で溶出することにより行うことが
できる。

このようにして得られた溶出液は、ついで、逆相分配温
液体クロマトグラフィーによって精製される。

逆相分配型液体クロマトグラフィーにおいて用いられる
逆相分配型カラムに充填するカラム剤としては、多孔性
シリカゲルに疎水性官能基を化学結合したものが使用さ
れる。特に、疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルが
１分離能及び回収率の点ですぐれている。シリカゲルに
導入される疎水性官能基としてはメチル基、エチル基、
プロピル基、オクチル基、オクタデシル基等のアルキル
基、シアノプロピル基、フェニル基などが例示され、こ
れらはシリカゲルに対して炭素含量で８〜２０重量％含
まれているのが好ましい。細孔の孔径としては６０Ｘ〜
３ｏｏＸ、に孔径を有するものが好ましい。又粒径とし
ては小さいものが望ましいが実用上５〜７μｍ程度が良
い。

逆相分配型液体クロマトグラフィーは、先ず。

溶出させる。溶出用液としてはアセトニトリル。

メタノール、エタノール、ｎ−プロパツール等の水溶性
有機溶媒と、酢酸、ギ酸、塩酸、リン酸。

トリフルオロ酢酸、メチル硫酸等の酸またはこれらの酸
とアンモニア、苛性ソーダ等のアルカリの塩を混合して
得られるｐＨ１，５〜７の範囲の緩衝液が用いられる。

この溶出にあたって、上記溶出用液の水溶性有機溶媒濃
度は、溶出に適するように適当な濃度に調整される。例
えば、アセトニトリル水溶液では。

アセトニトリルの濃度が１８〜２８容量チ、好ましくは
２０〜２５容量チの濃度で溶出するのが好ましい。アセ
トニ）　ＩＪル濃度が１８容量チ未満では、全く溶出さ
れないか溶出時間が長くなり、２８容量チを越えると浴
出先端付近に溶出されるため精製効果が低下する傾向が
ある。また、アセトニトリル濃度に勾配をつけて溶出す
る場合、ｆ６出後のアセトニ）　ＩＪルの初期濃度は０
〜１６容量チ及び最終濃度は２０〜３０容ｉｉｔチとす
るのが好ましい。なお、最終濃度は３０容ｉｔ％を越え
てもさしつかえない。このようにアセトニトリル濃度に
勾配をつけて溶出を行う場合、アセトニトリル濃度が２
０〜２５容量チの時にペプチドを溶出させる。

溶出に際し、用いる有機溶媒は、その極性が小さくなる
に従い溶出力が増すため、極性の大きなもの程、有機溶
媒濃度を大きくする必要がある。例えばメタノール、エ
タノール、アセトニトリル。

ｎ−プロパツールの順に極性が小さくなり、この順によ
り低濃度で溶出することができる。以上の溶出は、常圧
下で行っても高圧下で行ってもよい。

液としては中性（たとえば、酢酸アンモニウム。

ｐＨ７）でアセトニトリル濃度２０〜２５容ｉ％のもの
を使用するとｈ−ＥＧＦ量は、まず３種類に分類される
。これらをそれぞれ溶出順にｈ　−ＥＧＦ−１，ｈ−Ｅ
ＧＦ−２，ｈ−ＥＧＦ−３とする。

このうち、さらにｈ−ＥＧＦ−２について逆相り順Ｋｈ
−ＥＧＦ−２−１とｈ−ＥＧＦ量−２−２の２種類に分
離する。

このうち、　　ｈ　−ＥＧＦ−２−１を含む分画を減圧
濃縮又は凍結乾燥すると白色粉末状で本発明に係る活性
ペプチドが得られる。

コレを５ＤＳ−尿素−ポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動（モノマー濃度１３．８％）で分析するとき、
それぞれ単一バンドとして認められ。

その推定分子量ハミオグロビン部分加水分解物（分子量
１６９４９，１４４０４，８１５９，６２１４゜２５１
２．１３６０）の混合物を標準とした分子量マーカーを
用いたとき約６０００に位置する。又。

ｐＨ勾配（ｐＨ４からｐＨ６，５）を有するポリアクリ
ルアミドゲルプレートを用いた等重点電気泳動を行うと
きそれぞれ異なる位置に単一バンドとして認められた。

表面電極を用いて測定した等′重点は４．４０である。

その他、前記した理化学的性質を示す。

上記電気泳動法による結果及び前記した高速クロマトグ
ラフィーの結果が第２図に示すとおりであることから１
本発明に係る活性ペプチドが単一化合物であることがわ
かる。

本発明に係る活性ペプチドが、前記したアミノ酸から構
成されることは、アミノ酸分析装置を使用して確認した
。

また１本発明に係る活性ペプチドは、上皮細胞の成長を
促進する作用を示し、ｈ−ＥＧＦであることがわかシ、
胃酸分泌抑制作用を併せて示す。

以上において、ｈ−ＥＧＦ分画の確認は、マウスの願下
線から得たマウスＥＧＦがマウス肝細胞膜上のＥＧＦレ
セプターに対してｈ−ＥＧＦと競争的に結合する性質を
利用して測定される。すなわち、ｈ−ＥＧＦ又はｈ−Ｅ
ＧＦを含む試料。

ＥＧＦレセ〆ター及び放射性ヨウ素で標識したマウスＥ
　Ｇ　Ｆを水溶液中で混合して反応させ、ＥＧＦレセプ
ターとマウスＥＧＦ又はｈ−ＥＧＦとの結合物を生成さ
せ、これを分離して、その放射活性を測定し、検量線に
照らし、ｈ−ＥＧＦｆｉ度を決定する〔以下、この方法
を、ラジオレセプターアッセイ（Ｒ，Ｒ，人と略す）と
いう〕。

（実施例） 以下において、ｈ−ＥＧＦ量は、上記Ｒ，ＲＡ法により
求めたものであシ、比活性は、２８ｏｎｍの吸光度と試
料の液量（ｍｌ　）の積めたりのｈ　−ＥＧＦ量である
。

実施例 （１）男子床３　ｋｌ（ｈ−ＥＧＦｉｌ　６０ｍｇ、比
活性１．６Ｘ１０　　）Ｋ４Ｎ塩酸を加、ｔてｐＨ３，
０に調整した。これを予め４Ｎ塩酸でカルボン酸型にし
たアクリル酸型カチオン交換樹脂（ＷＫ　−２０、三菱
化成工業■商品名）を充てんしたカラム（４（Ｒ）に流
速２００　ｌ／時間で流した。次いで、カラムを水１０
０Ｉ！で洗浄し、１００Ｊの酢酸アンモニウム緩衝液（
塩化ナトリウム５０ｋｇ、酢酸アンモニウム７、７　ｋ
ｇおよびアンモニア水１５．５１！に水’！ｚ加えて１
００Ｉ！とじたもの）９次いで４８Ｊの４Ｎ苛性ソーダ
溶液、更に９０／の水で溶出した。

溶出後のｐＨけ溶出時間と共に増大する。このうち。

溶出後のｐＨが１１以下の分画を集めた。この溶出液中
のヒ）ＵＧは６０，４■（回収率３８条、比活性０．０
５）であった。

（２）溶出液２０／（ｐＨ４，５に調整）ＩＣメタクリ
レート系中性吸着樹脂（ＨＰ２ＭＧ：三菱化成工業■商
品名）　８００　ｍｌを加えて２時間攪拌してｈ−ＥＧ
Ｆを吸着１次いで塩酸−メタノール混合液（６Ｎ塩酸：
メタノール＝１：１λ５．容量比）８１で溶出した。こ
れを中和後、減圧濃縮して５００ｍＪとし架橋デキスト
ランゲル（セファデックスＧ−２５，フアルマシア・フ
ァインケミカル・ＡＢ商品名）に負荷し、０．０１Ｍ酢
酸アンモニウムで展開して塩を含まない部分を採取した
。次いでｐＨ５，３の０．０１Ｍ酢酸アンモニウム液で
平衡化したジエチル了ミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロー
ス（ＤＥ−３２，ワットマン・ケミカル十）ζレーン３
７社篩品名）カラムに吸尤・させた。０．０１Ｍ酢酸ア
ンモニウム液で洗浄後、０．３Ｍ酢酸アンモニウム液で
溶出した。この溶出液中のｈ−ＥＣ）Ｉ”量は１４．４
　ｍｇ　（回収率３８％、比活性１．２）であった。

（３）この得ため出液を限外ろ過（分画分子量１０００
）に工り脱塩し、６０ｍｊ？寸で凝縮した後。

架橋デキストランゲル（セファデフクス０−５０゜７ア
ルマシア・ファイン・ケミカル・ＡＢ商品名）でゲルろ
過した。展開液は０．０１Ｍ酢酸アンモニウム液で展開
し、ＲＲ，Ａ活性分画を採取した。この溶出液中のｈ−
■シＧ　Ｉ”危は１０　ｍｇ　（回収率７０チ、比活性
５．６）であったっ （４）この溶出液をオクタデシルシリル化シリカゲル（
デベロジルＯＤＳ、野村化学■閤品名）を充填したカラ
ム（３６，７ｍｍφｘ５００ｍｍ、　このカラ第１ｆＬ
と第２ｇＩＬの混合比を変化させて、グラジエを含むア
セトニ）　ｌ）ル水溶液（水ニアセトニｌ−１）ルー５
：１．容量比）、第２液には、酢酸アンモニウムＱ、０
５Ｍを含むアセトニトリル水溶液（水ニアセトニトリル
ー５：１．６．容量比）ｆｉ−用いた。

第２液は第１液６００　ｍｌに２５　ｍ１１分で流入す
ると共に、第１液と第２液の混合液はカラムに２５ｍ１
１分で流入するようにした。この結果、得られたクロマ
トグラムを第３図に示す。

ＲＲ，Ａ法で各溶出分画全測定すると三つの活性分画が
現われ、各分画のｈ−ＥＧＦＫは、それぞれ胃酸分泌抑
制作用が認められた。該活性分画はそれぞれ、保持時間
が４８〜５２分、５４〜６２分及び６２〜６８分に溶出
し、これらのＨｈ　−ＥＧＦＪｉは８．５ｍｇ、それぞ
れの分画のｈ−ＥＧＦ量は、溶出順にＬＯｍｇ、　　１
．５＃及び５．０■であり。

各ｈ−ＥＧＦの比活性は溶出順に１３０，２４０及び２
９０であった。各分画を減圧濃縮し、凍結乾燥して乾燥
品を得、上記溶出順にｈ−ＥＧＦ−１、ｈ−ＢＧＩ”−
２及びｈ−ＥＧＦ−３とした。

８ＤＳ−尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（七ツ
マー濃度１３．８％、標準物質：ミオグロビン部分加水
分解物で分子量が１６９４９．１４４０４゜８１５９．
６２１４．２５１２及び１３６０の混合物）による、！
：ｈ−ＥＧＦ−１については９分子量約６０００と約７
４００のニバンド、ｈ−ＥＧＦ−２については９分子量
約６０００と約７０００のニバンド及びｈ−ＥＧＦ−３
については９分子量約６０００の一バンドが検出された
。

第３図に、上記の溶出における各分画毎のＦＬＲＡ活性
値を斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活性は４６〜４８分、
４８〜５０分、５０〜５２分、５４〜５６分、５６〜５
８分、５８〜６０分、６２〜６４分、６４〜６６分及び
６６〜６８分の分画に現われ、他の分画には現われなか
った。

（５）上記（４）で得られたｈ−ＥＧＦ−２を含む分画
をｈ−ＥＧＦ址で５００μｇを、デベロジルＯＤＳを充
填したカラ１ｈ（８１Ｉｒｎφ×２５０画９日立６３５
型に装着）に負荷し、酢酸アンモニウム０．０５　Ｍを
含むアセトニトリル水溶液（アセトニトリル：ｍｌ／分
で溶出した。得られたクロマトグラム（横軸に保持時間
、縦軸に’；ｌ　１３　Ｑ　ｎｍの波長における吸光度
）及びＲＲＡ活性値を示す斜線棒クラ７を第４図に示す
。Ｒ，ＲＡ活性は、保持時間４８〜６０分及び６５〜７
７分に現われる。

４８〜６０分の分画を減圧濃縮し、凍結乾燥して本発明
に係る活性ペプチド（ｈ−ＥＧＦ’　）を得た。

（６）一方、上記（４）で得られたｈ−ＥＧＦ−３を含
む分画について、上記（５）と同様に溶出した。ただし
、展開液として、酢酸アンモニウム０．０５Ｍ１含むア
セトニトリル水溶液（アセトニトリル：水＝　１７０　
：　５００　）　２００　ｍｌに酢酸１ｍＪを添加した
ものを使用した。この結果、ＲＲＡ活性は。

保持時間２２〜２６分、２７〜３０分及び４９〜５５分
の分画に現われた。これらの分画については、Ｒ，ＲＡ
活性分画と２８０　ｎｍの波長における吸光度ピークと
が対応した。これらの分画のうち。

第１の分画に含まれるｈ−ＥＧＦが前記したβ−ＵＧに
及び第３の分画に含まれるｈ−ＥＧＦが前記したγ−Ｕ
ＧＫ等しいことを確認した。

（７）　　繊維芽細胞の増殖試験 ウシ胎児血清１０チを含むダルベンコＭＥＭ培地１３．
９ｍ／を加えた３５ｍｍφＸ１０ｍｍシャーレに前記（
５）で得た活性ペプチド及びヒト皮膚繊維芽細胞を含む
細胞液１．１ｍｆ（１，８Ｘ１０６セル）を入れ。

よく混合する。これを３７℃炭酸ガス５％、空気９５％
のインキュベータで単層培養する。培地交換は培養３日
目と６日月に打い、　　０．　３．　５．　７及び１０
０日月血球計算盤を用いて細胞数を測定した。活性ペグ
チドは１００ｇ／ｍｅになるように使用した。また、活
性ペプチドを使用しない場合についても同様に試験した
。この結果を第５図に示す。第５図中グラフ１は活性ペ
プチドｆｔ便用した場合及びグラフ２は活性ペプチドを
使用しない場合を示す。

（８）胃酸分泌抑制試験 体重１３に９のピーグル犬（雄性）の幽門部から約５ｃ
ｍ離れた胃体部に胃屡管金取りつけてインタクトフイス
チューラ大とし、これにヒスタミン４〜６μｇ／に９体
重を１５分間隔で皮下注射し、１５分間隔で胃液を彎屡
管から採取した。胃液量がほぼ一定になった時点で、前
記（５）で得九活性ペプチドを生理食塩水に溶解してｈ
−ＥＧＦｔで０．２５μｇ／に９体重だけ静脈内注射し
た。胃液量はいずれの場合も１５〜３０分後から減少し
、３０〜６０分後に胃液量が最も少なくなつ之。

ヒスタミンの投与と胃酸分泌量の関係を示す棒グラフを
第６図に示す。

（発明の効果） 本発明の活性ペプチドは、上皮細胞の成長促進作用及び
胃酸分泌抑制作用を示す新規化学物質である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る活性ペプチドの紫外線吸収スペク
トル、第２図は本発明に係る活性ペプチドの高速液体ク
ロマトグラム、第３図は実施例の（４）項における逆相
分配型液体クロマトグラム、＠４図は実施例の（５）項
における逆相分配型液体クロマトグラム、第５図は実施
例の（力項における繊維芽細胞の増殖試験結果を示すグ
ラフ及び第６図は実施例の（８）項における胃酸分泌抑
制試験を示す棒グラフである。 符号の説明 １・・・活性ペプチドを使用したときの結果を示すグラ
フ ２・・・活性ペプチドを使用しないときの結果を示すグ
ラフ 代理人　弁理士　若　林　邦　彦　　°°“組長　（確
Ｕ を１図 ぅ籐、ｌｔ峙間（分ジ 茅　２図 比表ｇ摩デー　（日） 第５　因 〔大７ミン９ダ／ド３／１ぢ介

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記（ａ）〜（ｇ）の理化学的性質により特定され
   、上皮細胞の成長促進作用及び胃酸分泌抑制作用を有す
   る活性ペプチド。 （ａ）紫外線吸収スペクトル　第１図に示す（活性ペプ
   チド濃度８０μｇ／ｍｌ、リン酸２ナトリウム水溶液） （ｂ）分子量　約６，０００（ＳＤＳ−尿素−ポリアク
   リルアミドゲルディスク電気泳動法） （ｃ）等電点　４．４０（ポリアクリルアミドゲル等電
   点電気泳動法） （ｄ）呈色反応　フォリン・ローリー法　＋ クーマシー・プリシヤント・プル法　＋ フェノール硫酸法　− フクシン法　− （ｅ）溶解性　水に可溶（ただし、ｐＨ４．４０付近で
   は等電点沈殿をする）。 酸性メタノール、酸性アセトリトリル、塩基性メタノー
   ル及び塩基性アセトニトリルに可溶。 （ｆ）性状　白色粉末、水に溶かすと無色透明。 （ｇ）構成アミノ酸　Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ
   、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、
   Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及び
   Ｖａｌ