JPS6228425B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗体又は抗原を写真化学的且つ定性
又は定量的に検出する免疫検査法に関する。 抗原又は抗体を定性又は定量的に検出するため
に、抗原又は抗体を放射性同位元素を以つて標識
する方法や、酵素を以つて標識する方法は既に用
いられている。 また、特開昭55−116259号では、本出願人によ
つて、放射性同位元素や酵素の代りに分光増感色
素により、抗原又は抗体を標識して免疫反応さ
せ、標識された抗原又は抗体と標識された抗原―
抗体反応物とを分離し、標識された抗原又は抗体
或いは標識された抗原―抗体反応物のどちらか一
方をハロゲン化銀と接触させ、分光増感色素の吸
収する波長の光で露光し、次いで、露光されたハ
ロゲン化銀を現像し、得られる濃度を測定するこ
とを特徴とする微量成分の写真化学的な検査方法
が提案されており、その方法では標識物質として
写真用分光増感色素が使用されている。 本発明も同様にして標識物質としての分光増感
剤を用いるものであるが、その際、シアニン色素
の末端複素環内のシアニン発色団中の窒素原子以
外の原子にカルボキシル基を結合し、含有するシ
アニン色素を分光増感剤として使用することを特
徴とするものである。 本発明は更にそうして、標識せられた抗原又は
抗体を免疫反応に附し、その反応生成物と未反応
物とを分離したのち、又は分離すると同時にそれ
らの何れか一方をハロゲン化銀と接触させ、対応
するシアニン色素を吸収する波長の光で露光し、
次いで露光されたハロゲン化銀を現像し、得られ
た濃度を測定することを特徴とする。 抗原又は抗体の写真化学的免疫検査法に関す
る。 本発明で使用されるシアニン色素は次記一般式
（） で示される。そうして、式中ｍとｎは各々１又は
２を表わし、同一でも異つていてもよく、ｐは２
又は３、ｑは１又は２を表わす。Ｌ，L₁，L₂は
同一でも異つていてもよく場合により低級アルキ
ル基、アリール基又はハロゲンで置換されていて
もよいメチン基を表わし、Ｚ及びZ₁は各々５員又
は６員の含窒素ヘテロ環核を完成するに必要な非
金属原子群を表わし、同一でも異つていてもよ
く、Ｘは無機又は有機のアニオンであり、Ｒと
R₁とは場合により芳香族基、OH基、スルホ基等
により置換せられた炭素原子１〜18、好ましくは
１〜７のアルキル基であつて、同一でも異つてい
てもよく、ｑが１のときはベタイン型構造を形成
し、R₂はＺの置換基でカルボキシ含有基 ―Ｐ_i―Ｑ_j―COOHを表わす。式中Ｐは

【式】

【式】―CO―，―Ｏ―又は―Ｓ―を表わ し、R₄は水素、炭素数１〜８のアルキル基、置
換アルキル基を表わす。またＱは、炭素数１〜10
のアルキレン、置換アルキレン、アリーレン、置
換アリーレン、アラルキレン、アルカリーレンあ
るいは、ジペプチド、トリペプチド残基を表わ
し、ｉおよびｊはそれぞれ０または１を表わし同
一でも異つていてもよい。 Ｚ及びZ₁で示される含窒素ヘテロ環核として
は、例えば、チアゾール、４―メチルチアゾー
ル、４―フエニルチアゾール、４，５―ジメチル
チアゾール、４，５―ジフエニルチアゾール、ベ
ンゾチアゾール、４―クロルベンゾチアゾール、
５―クロルベンゾチアゾール、６―クロルベンゾ
チアゾール、７―クロルベンゾチアゾール、５―
ニトロベンゾチアゾール、６―ニトロベンゾチア
ゾール、４―メチルベンゾチアゾール、５―メチ
ルベンゾチアゾール、６―メチルベンゾチアゾー
ル、５―ブロモベンゾチアゾール、６―ブロモベ
ンゾチアゾール、５―ヨードベンゾチアゾール、
５―フエニルベンゾチアゾール、５―メトキシベ
ンゾチアゾール、６―メトキシベンゾチアゾー
ル、５―エトキシベンゾチアゾール、５―エトキ
シカルボニルベンゾチアゾール、５―フエネチル
ベンゾチアゾール、５―フルオロベンゾチアゾー
ル、５―クロル―６―ニトロベンゾチアゾール、
５―トリフルオロメチルベンゾチアゾール、５，
６―ジメチルベンゾチアゾール、５―ヒドロキシ
―６―メチルベンゾチアゾール、テトラヒドロベ
ンゾチアゾール、４―フエニルベンゾチアゾー
ル、５―フエニルベンゾチアゾール、ナフト
（２，１―ｄ）チアゾール、ナフト（１，２―
ｄ）チアゾール、ナフト（２，３―ｄ）チアゾー
ル、５―メトキシナフト（１，２―ｄ）チアゾー
ル、７―エトキシナフト（２，１―ｄ）チアゾー
ル、８―メトキシナフト（２，１―ｄ）チアゾー
ル、５―メトキシナフト（２，３―ｄ）チアゾー
ル、オキサゾール、４―メチルオキサゾール、４
―ニトロオキサゾール、５―メチルオキサゾー
ル、４―フエニルオキサゾール、４，５―ジフエ
ニルオキサゾール、４―エチルオキサゾール、ベ
ンズオキサゾール、５―クロルベンズオキサゾー
ル、５―メチルベンズオキサゾール、５―ブロム
ベンズオキサゾール、５―フルオロベンズオキサ
ゾール、５―フエニルベンズオキサゾール、５―
メトキシベンズオキサゾール、５―ニトロベンズ
オキサゾール、５―トリフルオロベンズオキサゾ
ール、５―ヒドロキシベンズオキサゾール、６―
メチルベンズオキサゾール、６―クロルベンズオ
キサゾール、６―ニトロベンズオキサゾール、６
―メトキシベンズオキサゾール、６―ヒドロキシ
ベンズオキサゾール、５，６―ジメチルベンズオ
キサゾール、４，６―ジメチルベンズオキサゾー
ル、５―エトキシベンズオキサゾール、ナフト
（２，１―ｄ）オキサゾール、ナフト（１，２―
ｄ）オキサゾール、ナフト（２，３―ｄ）オキサ
ゾール、５―ニトロナフト（２，１―ｄ）オキサ
ゾール、４―メチルセレナゾール、４―ニトロセ
レナゾール、４―フエニルセレナゾール、ベンゾ
セレナゾール、５―クロルベンゾセレナゾール、
５―ニトロベンゾセレナゾール、５―メトキシベ
ンゾセレナゾール、５―ヒドロキシベンゾセレナ
ゾール、６―ニトロベンゾセレナゾール、５―ク
ロル―６―ニトロベンゾセレナゾール、ナフト
（２，１―ｄ）セレナゾール、ナフト（１，２―
ｄ）セレナゾール、１―アルキルイミダゾール、
１―アルキル―４―フエニルイミダゾール、１―
アルキルベンズイミダゾール、１―アルキル―５
―クロルベンズイミダゾール、１―アルキル―
５，６―ジクロル―ベンズイミダゾール、１―ア
ルキル―５―メトキシベンズイミダゾール、１―
アルキル―５―シアノベンズイミダゾール、１―
アルキル―５―フルオロベンズイミダゾール、１
―アルキル―５―トリフルオロメチルベンズイミ
ダゾール、１―アルキルナフト（１，２―ｄ）イ
ミダゾール、１―アリール―５，６―ジクロルベ
ンズイミダゾール、１―アリール―５―クロルベ
ンズイミダゾール、１―アリールイミダゾール、
１―アリールベンズイミダゾール、１―アリール
―５―クロルベンズイミダゾール、１―アリール
―５，６―ジクロルベンズイミダゾール、１―ア
リール―５―メトキシベンズイミダゾール、１―
アリール―５―シアノベンズイミダゾール、１―
アリールナフト（１，２―ｄ）イミダゾール；上
記化合物中アルキルはメチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ブチル基や２―ヒドロキシア
ルキル、３―ヒドロキシプロピル；アリールは、
フエニル、例えばクロル置換フエニル、メチル置
換フエニル、メトキシ置換フエニルを表わす。Ｚ
及びZ₁で示される含窒素ヘテロ環核は更に、列え
ば、２―ピリジン、４―ピリジン、５―メチル―
２―ピリジン、３―メチル―４―ピリジン、２―
キノリン、３―メチル―２―キノリン、５―エチ
ル―２―キノリン、６―メチル―２―キノリン、
６―ニトロ―２―キノリン、８―フルオロ―２―
キノリン、６―メトキシ―２―キノリン、６―ヒ
ドロキシ―２―キノリン、８―クロロ―２―キノ
リン、４―キノリン、６―エトキシ―４―キノリ
ン、６―ニトロ―４―キノリン、８―クロロ―４
―キノリン、８―フルオロ―４―キノリン、８―
メチル―４―キノリン、８―メトキシ―４―キノ
リンを表わす。 Ｒ又はR₁としては、好ましくは例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、ベン
ジル、β―フエニルエチル、２―ヒドロキシエチ
ル、２―メトキシエチル、２―（２―メトキシエ
トキシ）エチル、２―スルホエチル、３―スルホ
プロピル、３―スルホブチル、４―スルホブチ
ル、２―（ピロリジン―２―オン―１―イル）エ
チル、テトラヒドロフルフリルの外さらに２―ア
セトキシエチル、カルボメトキシエチル、２―メ
タンスルホニルアミノエチルなどがあり、無機又
は有機酸アニオンＸの例は、クロライド、ブロマ
イド、アイオダイド、ｐ―トルエンスルホネー
ト、ｐ―ニトロベンゼンスルホネート、メタンス
ルホネート、メチルサルフエート、エチルサルフ
エート、パークロレートなどである。 Ｚの置換基R₂で示されるカルボキシ含有機―
Ｐ_i―Ｑ_j―COOH中Ｑの例としては、

【式】 R₅はメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、イソブチル、ターシヤリーブチル、ヒドロキ
シメチル、１―ヒドロキシエチル、メルカプトメ
チル、２―メチルチオエチル、ベンジル、Ｐ―ヒ
ドロキシベンジル、３―インドリルメチル等の置
換アルキレンやフエニレンがあり、その代表例
は、―COOH、―NH―OH₂―COOH、―NH―
CH₂CH₂COOH、

【式】

【式】― NHCOCH₂CH₂COOH、―
NHCOCH₂CH₂CH₂COOH、

【式】

【式】

【式】

【式】― CONHCH₂COOH、

【式】

【式】― CONHCH₂CH₂COOH、

【式】

【式】―CO （NHCH₂CO）₂OH、―CO（NHCH₂CO）₃OH等を
挙げることができる。本発明において標識に使用
される分光増感色素の一般式で示されるシアニ
ン色素化合物の具体例としては、次記のものがあ
げられる。 これら化合物の性質や合成法については、
「Cyanine Dyes and Related Compounds」（F.
M.H amer 著 1964年Interscience Publishers
刊）に詳述されている。 また、本発明でそれらシアニン色素で標識され
る抗原あるいは抗体としては、ペプチドホルモ
ン、例えば、インシユリン、Ｃ―ペプチド、グル
カゴン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、エリ
トロポエチン、セクレチン、コレシストキニン、
ガストリン、アンジオテンジン、バゾプレツシ
ン、オキシトシン、メラニン細胞刺激ホルモン、
副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、成
長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、
卵胞刺激ホルモン、非ペプチドホルモン、例え
ば、ステロイドホルモン類のグルココルチコイ
ド、アルドステロン、副腎性アンドロジエン、エ
ストロジエン、プロジエステロン、テストステロ
ンあるいは、その他のホルモン、例えば、甲状腺
ホルモン（サイロキシン、トリヨードサイロニ
ン）、コーチゾール、エステリオール、アドレナ
リン、ノルアドレナリン、メラトニン、アセチル
コリン、酵素例えば、リゾチーム、C₁エステラ
ーゼ、アルカリホスフアターゼ、ペプシノーゲ
ン、トリプシン、カイネース、ビールス、特異抗
原、腫瘍抗原、例えばα―フエトプロテイン、血
清蛋白成分、例えば、チロキシン結合グロブリ
ン、IgG、IgE、薬品（例えば、LSDなど）、その
他（例えば、リウマチ因子、ミオシンなど）、お
よびそれらと同様の抗原抗体反応性を有するも
の、好ましくは、インシユリン、Ｃ―ペプチド、
α―フエトプロテイン、サイロキシン、トリヨー
ドサイロニン、甲状腺刺激ホルモン、カルシトニ
ン、CEA、グルココルチコイド、アンドロステ
ロン、テストステロン、副腎性アンドロジエン、
エストロジエン、プロジエステロン、アンギオテ
ンシン，、リゾチーム、トリプシンさらに好
ましくはインシユリン、Ｃ―ペプチド、サイロキ
シン、トリヨードサイロニン、アンドロステロ
ン、リゾチームがある。 本発明で使用する標識剤はシアニン色素の末端
複素環内のシアニン発色団中の窒素原子以外の原
子にカルボキシル基を含む置換基を結合しており
有利に抗原又は抗体にペプチツド化学や蛋白化学
で用いられているペプチツド結合形成反応を適用
して、容易に標識できる。 それらペプチツド結合形成反応としては、 １ 炭素末端活性化法 酸塩化物法（―COCl）、酸アジド法（―
CON₃）、混合酸無水物法（MA法）（クロロギ
酸エチルエステル、クロロギ酸イソブチルエス
テル、ビバリン酸クロリド、イソ吉草酸クロリ
ド、ジフエニルリン酸クロリド、オキシ塩化リ
ン、無水硫酸を用いて合成したMAなど）、活
性エステル法（ｐ―ニトロフエニルエステル、
トリクロロフエニルエステル、ペンタクロロフ
エニルエステル、シアノメチルエステル、チオ
グリコール酸エステル、Ｎ―ヒドロキシフタル
イミドエステル、Ｎ―ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステル、Ｎ―ヒドロキシ―５―ノルボルネ
ン―２，３―ジカルボキシイミドエステル、Ｎ
―ヒドロキシピペリジンエステル、８―ヒドロ
キシキノリンエステル、２―ヒドロキシフエニ
ルエステル、２―ヒドロキシ―４，５―ジクロ
ロフエニルエステル、２―ヒドロキシピリジン
エステル、２―ピリジルチオールエステルな
ど）、対称酸無水物法、エトキシアセチレン
法、イナミン法等。 ２ カツプリング法 Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）法、DCC―Ｎ―ヒドロキシサクシンイ
ミド法、DCC―１―ヒドロキシベンゾトリア
ゾール法、カルボニルジイミダゾール法、Ｎ―
エチル―５―イソオキサゾリウム―3′―スルホ
ン酸塩（試薬“Ｋ”）による方法、２―エチル
―７―オキシベンズイソオキサゾリウムトリフ
ルオロホウ素塩法、１―エトキシカルボニル―
２―エトキシ―１，２―ジヒドロキノリン法。 ３ 窒素末端活性化法 イソシアナート法、ホスフアゾ法、亜リン酸
エステル法。 これらの反応基及びその反応方法の詳細につい
ては、「生化学実験講座１タンパク質の化学」（日
本生化学会編、東京化学同人刊、昭和52年）及び
「ペプチド合成法」（泉屋著、丸善刊）等に記され
ている。 結合反応の条件は、抗原又は抗体の種類、分光
増感剤の種類等によつて異なるが、標識される抗
原又は抗体の生物活性をそこなわないような条件
を設定することが重要である。従つて、反応温度
は通常、−40℃から60℃の範囲、好ましくは、−20
から40℃がよく、反応時間は、およそ10分ないし
16時間の範囲から選択される。反応の圧力は、大
気圧が好ましいが、１ないし20気圧の範囲から適
宜選択することができる。溶媒としては、水また
はPH緩衝液などの水系溶媒を使用すると好都合で
ある。DMFやメチレンクロリド等の有機溶媒も
適宜使用することができる。これらの反応条件
は、一般に蛋白質や酵素の修飾に適用される条件
と共通であり、上記文献にその詳細が述べられて
いる。 標識に使用される分光増感剤の使用量は、抗原
または抗体の種類によつて変るが、通常、抗原ま
たは抗体１モルに対し、1/100ないし100倍、好ま
しくは、1/20ないし20倍、特に好ましくは1/2な
いし２倍である。 標識の確認法としては、紫外、可視、赤外、マ
ス、NMRなどのスペクトルを測定する方法と、
標識が導入された末端基の消失を分析により確認
する方法が代表的である。 上記、スペクトル法においては、標識反応終了
後、生成物を分離精製した後、その標識物に固有
のスペクトルを測定確認する。たとえば、可視吸
収スペクトルを測定し、そのスペクトルが標識に
使用された分光増感剤の可視部の固有吸収スペク
トルと、溶媒は会合等を考慮した上で一致すれば
よい。また、ペプチドや蛋白質及びそれらを含む
抗原や抗体の標識においては、標識が行われてい
れば、抗原または抗体の末端アミノ基やカルボキ
シ基が末端基分析において、検出されないので、
これにより標識の遂行を確認することができる。
（なお、特開昭55−116259号参照）。 本発明に於て、標識された抗原抗体反応物と未
反応物との分離法及び標識された反応物又は未反
応物とのハロゲン化銀との接触は、自体公知の方
法によつて行われそれら方法は例えば、特開昭55
−116259号明細書８〜９頁に詳述されている。ま
た、分離と同時に接触を行う方法も特開昭55−
116259号明細書中に、被処理液をして分離層を通
過せしめる方法として説明されている。更に、露
光現像濃度の測定も自体公知の写真化学的な常法
によつて行うことができる。その詳細は、特開昭
55−116259号明細書10〜33頁に説明されている。 本発明において、分光増感色素に標識された、
抗原又は抗体に一般式（Ｓ） D₁―Ａ―D₂ （Ｓ） 〔式中、D₁，D₂は縮合多環芳香族ヘテロ環残
基または芳香族ヘテロ環置換アミノ基を表わし、
これらは―SO₃M基を含んでもよい。Ｍは、水
素、アルカリ金属またはアンモニウムを表わす。
―Ａ―は、２価の芳香族残基を表わし、これらは
―SO₃M基を含んでもよい。ただし、上記D₁，D₂
に―SO₃M基が含まれないときは、―Ａ―に―
SO₃M基を含む必要がある。〕 で示される化合物を安定化剤として混在せしめる
ときは分光増感色素により、標識せられた抗原又
は抗体は、水溶液中でも安定性が高く、本発明の
実施に際し好都合である。 また、本発明の写真化学的な検査法を実施する
ため、ハロゲン化銀を現像する際一般式(H) 〔式中R¹は、アリール基又は置換アリール
基、R²は水素、アルキル基、置換アルキル基、
アリール基又は置換アリール基〕で示されるヒド
ラジン化合物を共存せしめるときは、現像銀又は
発色色素の光学濃度が増大し、測定に際し好都合
である。その際、濃度増強剤は、現像操作以前の
何れの工程で添加されてもよい。 以下、参考例として本発明で標識に使用するシ
アニン色素の反応性を示し、次いで、実施例を挙
げるが、本発明はそれら実施例に限定されるもの
ではない。 参考例 シアニン色素とクロルギ酸イソブチルとを各々
１当量づつDMF中トリエチルアミンの存在下−
15℃で当量混合した。５分後、TLC（メルク社
製・TLCプレートシリカゲル60F₂₅₄、展開溶媒
CHCl₃／MeOH＝3/1）を行い、TLCスキヤナー
（島津CS―910検出波長600nm、参照波長
370nm）で、反応率（％）を測定したところ、式
―７及び式―９のシアニン色素は反応率が
100％であり、式―８の色素は85％であつた。 実施例 １ 精製ブタインシユリン（シグマ社製）20mg
（3.5μmole）を4M尿素１mlに溶解し、さらに、
Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド（DMF）８mlを
加え、氷冷下（０〜４℃）でよく撹拌しておく
（Ａ液）。次に、色素（―７）1.31mg（2.5μ
mole）をDMF1mlに溶解したものを３組用意し
（計7.5μmole）−15〜−20℃に冷却下に、クロロ
ギ酸イソブチル各１μ及びトリエチルアミン各
0.5μ（予め５μトリエチルアミンを１ml
DMFと混合したものを冷却しておき、これから
100μを添加）を添加し、活性化する。これに
さらに、Ｎ―ヒドロキシサクシンイミド各0.5mg
（Ｎ―ヒドロキシサクシンイミド５mg／１mlDMF
から100μ）を冷却下に添加し、活性エステル
を形成させる（Ｂ液）。 次に、Ａ液を氷冷撹拌下に、Ｂ液を５分間隔で
添加反応させる。氷冷下30分室温30分間反応させ
た後に、0.2Nアンモニア水で平衡化したセフア
デツクスＧ―10カラムで脱塩後、凍結乾燥して色
素標識インシユリンを得た。収量24.6mg（収率
100％）。λ^２％^ＳＤＳ _ｎａｘ＝660nm（SDS：ドデシル
硫酸
ナトリウム）、ε_660on≒3.2×10⁵（約２モル／モ
ルインシユリン）。本標識物のアミノ末端分析に
おいて、ブタインシユリンのアミノ末端であるグ
リシン及びフエニルアラニンは、検出されなかつ
た。また、セフアデツクスＧ―50（１％SDS）カ
ラムでのクロマトグラフイーにおいて、本標識イ
ンシユリンは、単一ピークを示した。また、本標
識インシユリンは、Br70モル％のAgBrCl乳剤
（平均粒子サイズ0.75μ）に対して、約685nmを
極大として分光増感した。 実施例 ２ 実施例１に記載の色素（―７）により標識さ
れたブタインシユリンと、抗ブタインシユリンモ
ルモツト血清及び抗モルモツトIgGウサギ血清を
それぞれ第一抗体、第二抗体として用いた二抗体
法で、種々の濃度の標準インシユリン（0.2〜
12.8ng／ml）に対する検量線を下記の方法で作成
した。 種々の濃度の標準インシユリン溶液0.1mlを小
試験管に分注し、0.1MNaCl、1.0％牛血清アルブ
ミン（BSA）含有の0.1Mトリス塩酸緩衝液PH8.5
（Ｃ液）0.4mlを各試験管に加える。さらに、あら
かじめ力価を定めた抗ブタインシユリンモルモツ
ト血清の稀釈液各0.1mlを加え、次いで、色素
（―７）標識インシユリンをＣ液で溶解し、稀
釈したものを各0.1ml加え、よく撹拌したのち、
４℃で16時間放置する。次に、抗モルモツトIgG
ウサギ血清の稀釈液を0.1ml加え、充分撹拌し、
さらに４℃で24時間反応させる。生じた沈澱物を
遠心分離（3000rpm・10分間）で除去し、各上澄
を、未露光のAgBrCl乳剤（Br70モル％、平均粒
子サイズ0.7μｍ）をTAC支持体上に塗布したフ
イルム上の、55mmφの面積に10μ滴下し、15分
間放置後、富士フイルム製SC―60フイルターを
通して5000lux1秒露光し、下記処方の現像液Ａに
より20℃10分現像した後、常法により定着、水洗
乾燥して得られたフイルム上の黒化濃度を富士フ
イルム製写真濃度計にて測定を行ない、以下の結
果を得た。（各抗血清、標識インシユリンの稀釈
は、標識インシユリン濃度12.8ng／mlの場合の、
現像銀の黒化濃度が3.0〜3.5の間になるように定
めた。） 現像液Ａ メトール 3.1ｇ 亜硫酸ソーダー 45 ｇ ハイドロキノン 12 ｇ 無水炭酸ソーダー 67.5ｇ KBr 1.9ｇ 水を加えて １ 表 １ インシユリン濃度 黒化濃度 （ng／ml） ０ 0.20 0.2 0.51 0.4 0.90 0.8 1.45 1.6 1.96 3.2 2.50 6.4 3.04 12・８ 3.22 実施例 ３ ヒドリゾチーム（白血病患者の尿より精製）50
mgを２mlの2M尿素に溶解し、さらにDMFを６ml
加え、氷冷下（０〜４℃）で撹拌する。色素（
―９）各２mgを３本の小試験管に採取し、各２ml
のDMFを加えて溶解する。これを−15〜−20℃
に冷却下にクロロギ酸イソブチル各２μ及びト
リエチルアミン各１μを添加し、活性化する。
次に、上記ヒトリゾチーム溶液を氷冷、撹拌しな
がら、活性化した色素（―９）を５分間隔で添
加反応させる。氷冷下30分反応させた後、0.2N
アンモニア水で平衡化したセフアデツクスＧ―10
カラムで脱塩後、凍結乾燥して、色素標識ヒトリ
ゾチームを得た。収量約52mg（収率約99％）。 λ^２％^ＳＤＳ _ｎａｘ＝665nm、 ε_660on≒1.64×10⁵ 本標識物のアミノ末端分析において、ヒトリゾ
チームのアミノ末端であるリジンは検出されなか
つた。また、セフアデツクスＧ―50（１％SDSで
平衡化）カラムでのクロマトにより、本標品は、
単一ピークを与えた。また、ミクロコツカス―リ
ゾデイクテイカス（Micrococcus
Lysodeikticus）の菌体を基質にした溶菌活性に
おいて、未修飾の酵素とほぼ同等の活性を示し
た。 上記方法により得た、色素（―９）標識ヒト
リゾチームを0.1MNaCl1％BSA含有する0.05Mト
リス塩酸緩衝液PH8.0に溶解し、1ng／ml、
0.5ng／mlの２種の濃度の溶液を調製し、実施例
２に用いたと同じフイルム上にスポツトし、露光
現像濃度測定を行なつたところ、ブランクとの濃
度差は、それぞれ0.32、0.15であつた。 実施例 ４ 実施例１と同様に色素―７の代りに、色素
―２を用いて、色素標識ブタインシユリンを得
た。収量は25.3mg（収率約100％） λ^２％^ＳＤＳ _ｎａｘ＝668nm ε_660on≒4.03×15⁵ （２モル色素／モルインシユリン） であつた。このものを用いて実施例２同様の２抗
体法により、標準インシユリンに対する満足すべ
き検量線が作成できた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 複素環内のシアニン発色団中の窒素原子以外
   の原子に、カルボキシル基またはカルボキシル基
   を含む置換基を有する置換基を含む置換基を結合
   して含有するシアニン色素を分光増感色素として
   使用することを特徴とする 抗原または抗体に、分光増感色素をペプチツ
   ド結合により結合させて標識した抗原または抗
   体を免疫反応させ、 測定さるべき抗原又は抗体の存在量に応じて
   生成した遊離の標識された抗原又は抗体（Ｆ）
   を標識された抗原―抗体反応（Ｂ）とを分離
   し、 標識された抗原又は抗体、或いは標識された
   抗原―抗体反応物のどちらか一方をハロゲン化
   銀を接触させ、 分光増感色素の吸収する波長の光で露光し、 露光されたハロゲン化銀を現像し、 得られる現像された銀又は発色色素の量、或
   いは現像された銀又は発色色素の光学濃度を測
   定することによる 抗原または抗体の写真化学的免疫検査方法。