JPS62275685A - グルタチオン合成に関与する新規な組換えプラスミドと、その組換えプラスミドを導入させた酵母によるグルタチオンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａＣｏｌｉ）起源のグルタチオン合成に関与する酵素の
遺伝子を、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｏ＋ｙｃ
ｅｓ）属酵母において複製可能なベクターに組み込み、
かつ、前記酵素の遺伝子のプロモーター部位を酵母起源
のプロモーターに差し替えたプラスミドに関するもので
あり、また、このプラスミドを酵母に移入してグルタチ
オンを製造する方法に関する。

グルタチオンはグルタミン酸、システィンおよびグリシ
ンから成るトリペプチドで、広範な肝疾患の治療薬とし
て、また試薬として汎用される重要な化合物である。グ
ルタチオンは、従来、有機合成法によフて、あるいは微
生物（特に酵母）から抽出する方法によって製造されて
いるが、前者は反応工程の長さとその複雑さにおいて、
また後者は繁雑な操作を必要とするにも拘らず、菌体内
で合成されるグルタチオン量が少ない点で、必ずしも有
利な方法とはいえず、より効率的な製造方法の開発が望
まれている。

かかる現状に鑑み、本発明者らは遺伝子組み換え技術を
応用することにより、エシェリキア・コリが保有してい
るグルタチオン合成に関与する酵素の遺伝子と、酵母プ
ロモーターとから新規なプラスミドを造成させ、このプ
ラスミドを酵母に移入することによって、酵母内のグル
タチオン含量を高めることに成功した。

グルタチオンは、アデノシン−５′−三リン酸（ＡＴＰ
）が反応のエネルギーとして関与する２種の酵素、すな
わち、γ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素（以下
、ＧＳ）ｌ−１と略称する）とグルタチオン合成酵素（
以下、ＧＳＨ−ＩＩと略称する）の作用によって、グル
タミン酸、システィンおよびグリシンから酵母内で生合
成されるが、この生合成反応を最も律速しでいるのは、
酵素ＧＳ）！−Ｉの活性であることを、我々は突き止め
た。このことから、酵母を利用する従来のグルタチオン
製造法で、少量のグルタチオンしか製造できないのは、
酵母が元々保有している酵素ＧＳＨ−１の活性が貧弱で
あることに、原因があるものと推定できる。

本発明者らは酵母内でのグルタチオンの増産を目指して
、酵素活性が高いと思われるエシェリキア・コリの酵素
ＧＳＨ−１の遺伝子（以下ｇｓｈ−Ｉと記す）を酵母で
発現させることを試みた。しかし。

エシェリキア・コリの遺伝子ｇｓｈ−■（Ｋ、Ｗａｔａ
ｎａｂｅ＋ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ
ｅｓ、、１１．４３９３（１９８６））は、そのプロモ
ーターを含んだままでは、酵母中で形質を発現しない、
そこで我々は、鋭意研究の結果、強力な酵母プロモータ
ーをサツカロミセス属酵母から新たに検索し、エシェリ
キア・コリ起源の遺伝子ｇｓｈ−１のプロモーター部分
を、前記の酵母プロモーターに差し替えることにより、
エシェリキア・コリ起源の遺伝子ｇｓｈ−１を、酵母中
で発現させることに成功した。そして、エシェリキア・
コリ起源の遺伝子ｇｓｈ−１のプロモーター部分を、前
記の酵母プロモーターに差し替えた遺伝子ｇｓｈ−１で
発現する酵素ＧＳＨ−１は、酵母起源の酵素ＧＳＨ−Ｉ
よりも酵母中での活性が著しく高く、従って、当該組換
え遺伝子ｇｓｈ−Ｉを酵母に移入することにより、その
酵素が関与するグルタチオン量を大幅に増大させること
ができた。

実施例１において（１）酵母プロモーターの検索。

（２）クローニングした強情性酵母プロモーター、Ｐ−
８の制限酵素地図、（３）プロモーター部分を差し替え
た遺伝子ｇｓｈ−Ｉを含むプラスミドの造成、さらに（
４）該プラスミドの移入による酵母の形質転換を順次説
明する。後記実施例２において。

形質転換によりＧＳＨ−１活性を増強したサツカロミセ
ス属酵母ＹＮＮ２７／　ｐＧｓＲ１５１８−４を液体培
養し、集菌後菌体内グルタチオン〜含量を測定した結果
を示す。この場合、培養に用いる培地は何ら実施例２に
限定されるものではなく、炭素源、窒素源、無機物を含
有する合成培地、または天然培地のいずれをも使用する
ことができる。炭素源としては、例えばグルコース、シ
ュークロース、フラクトース、でん粉加水分解物、糖蜜
などの種々の炭水化物が使用でき、また窒素源としては
、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸
アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機およ
び有機アンモニウム類、あるいはペプトン、酵母エキス
、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物などの窒
素性有機物などが使用できる。これらに加え、生産量増
強のため、構成アミノ酸であるグルタミン酸、システィ
ン、グリシンあるいは、それらの生合成過程の中間体、
あるいはＡＴＰなどを添加することもある。無機物とし
ては、例えばリン酸第−水素カリウム、リン酸第二カリ
ウム、ａ酸マグネシウム、硫酸マンガンなどが使用でき
る。また、培養は振どう培養あるいは通気攪はん培養な
どの好気条件下に行なうのが好ましく、培養温度は通常
２０℃から３０℃、培養期間は通常１６時間から４８時
間で十分である。

なお、本発明で使用されるベクターは、通常。

遺伝子増強という点からコピー数の多いプラスミドが使
われるが、宿主の性質によってはコピー数の少ないプラ
スミドであっても差し支えない、さらに、プロモーター
ＤＮＡ供与酵母菌及び宿主酵母菌も例示のサツカロミセ
ス属酵母ＹＮＮ２７にのみ限定されるものでない。

実施例１ （１）　　　　プロモーターの 酵母プロモータを一検索するための染色体ＤＮＡには、
サツカロミセス属酵母ＹＮＮ２７の染色体ＤＮＡを通常
の方法、例えばクライヤーらの方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１２，３４．Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７５））で抽出して使用した。

また、プロモーターを検索するベクターには、酵母及び
大腸菌で活性を示すプロモーターを検索するのに通常使
用されるプロモータープローブベクターｐＭＣ１５８５
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、　、　１４３，９７１　（
１９８０））を用いた。

まずプロモータープローブベクターｐＭｃ１５８５１０
μｇと、酵母から抽出した染色体ＤＮＡｌ０μｇをそれ
ぞれ制限酵素Ｂａｎ　ＨＩで切断した後、１００ユニツ
トのＴ４リガーゼを用いて染色体ＤＮＡのＢａｍＨ１断
片を、　ｐＭｃ１５８５のＢａｍＨＩ切断部位に挿入し
て複数個のプラスミドｐＭＹ−Ｘを得た。尚、制限酵素
を作用させる等組み換えＤＮＡの基本操作は、当該技術
分野における常法１例えばモレキュラークローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８２））に
記載された方法に準拠して行なった。

こうして得たプラスミドｐＭＹ−Ｘによる酵母ＹＮＮ２
７の形質転換は、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７５
，１０４（１９７８）に記載された方法に従って行った
。

すなわち、　ＹＮＮ２７を培養後集菌し、細胞壁溶解酵
素であるザイモリエースー１００７（生化学工業株式会
社製）を作用させてプロトプラストとし、これにプラス
ミドｐＭＹ−Ｘを混合し、３日乃至４日間培養して形質
転換を行わせた。形質転換株の選択は、宿主ＹＮＮ２７
が持つウラシル要求性を利用して、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトサイドを含有
するＳＤ培地（Ｍ、ローズ及びり、ホトスティン、Ｊ、
Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．．１７０，８８３（１９８３）参照
）に於いて行った。また、ＰＭＣ１５８５に挿入された
染色体ＤＮＡ断片上のプロモーター活性の有無及び強弱
は、ｐＭｃ１５８５上のβ−ガラクトシターゼ活性の発
現に基づく、コロニーの発色度（青色）によって識別し
た。

多くの形質転換株の中から発色度の強い１３株を選び、
それら１３株中のプラスミドｐＭｃ１５８５に挿入され
た染色体ＤＮＡ断片の長さをアガロースゲル電気泳動に
より調べた。また１３株をＳＤ培地で３０℃１日間培養
後、遠心分離して集菌し、ガラスピーズで菌体を破砕し
てその抽出液中のβ−ガラクトシターゼ活性を定量した
ＣＭ、ローズ及びり、ホトスティン、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏ１．．１７０，８８３（１９８３）参照）。結果を表
１に示す。

表１＝形質転換体のβ−ガラクトシターゼ活性傘菌株　
　β−ガラクトシターゼ　　断片のサイズ活　　　性 ２　１．９００　６．２ ３　３．０００　２．４ ４１．６００９．９ ５　７．１００　３．８ ６　　　　　　　　　　　　　　　　８７０　　　　　
　　　　　　　　　　Ｎ、Ｄ、傘傘拳７　６１０　２．
１ ８１３．０００　３．８ ９　５００　１２．０ １０　８６０　２．６ １１　　ｇ５０　２．６ １２　２．１００　　Ｎ、Ｄ。

一＊ユニット：　ｎｍｏｌ　０ＮＰＧ／ｍｇプロティン
／＠ｉｎ申−＊Ｎ、Ｄ、　　　：検出せず 表１に示した１３株の中で、最もβ−ガラクトシターゼ
活性が強い菌株（Ｎｏ、８参照）の持つプラスミド上に
クローニングされた強活性酵母プロモーターをＰ−８と
名付けた。

（２）強゛性プロモーターＰ−８の制限酵素地図菌株Ｎ
ｏ、８よりこれに含まれるプラスミドｐＭＹ−８を常法
通り抽出し、これに各種の制限酵素を作用させて強活性
酵母プロモーターＰ−８の制限酵素地図を作成した。こ
れを第１図に示す、切断部位が認められた制限酵素はＨ
ｐａｌ　＋　ＫｐｎＩ　、　Ｎｒｕｌ　、　５ａｃＩ　
、　Ｓａｌ　Ｉ及びＳｔｕ　Ｉの６種類であった。それ
らの各ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分析した
。

本発明において、プロモーター部分が差し替えられる遺
伝子ｇｓｈ−Ｉには、微生物、動植物起源を問わず、グ
ルタミン酸とシスティンとから、γ−グルタミル−Ｌ−
システインを合成する酵素ＧＳ）ｌ−１の遺伝子ｇｓｈ
−１がいずれも使用可能である。しかし、好ましくはエ
シェリキア・コリＲＣ９１２（微工研条寄第４７号）の
ごとく、グルタチオンによる活性阻害が解除された酵素
ＧＳＨ−Ｉの遺伝子ｇｓｈ−Ｉが素材として用いられる
。なかでも、Ｋ、ワタナベ等。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、１１．４３９３
（１９３６）に記載されたプラスミドｐＢＲ３２２に、
ＲＣ９１２起源の遺伝子ｇｓｈ−Ｉを組み込んだプラス
ミド（以下、これをプラスミドＰＧＳ１００と称する）
を使用するのが最も好ましい。

本実施例においては、このプラスミドｐに５１００を使
用して本発明の組換えプラスミドを造成した過程を例示
する。この際、造成に使用した菌株はエシェリキア・コ
リＨＢＩＱＩである。

まず、　ｐＧｓｌｏｏを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで切断し、
遺伝子ｇｓｈ−Ｉを含むＤＮＡ断片をｐＢＲ−３２７（
Ｘ、ソベロン等、に６ｎｅ、旦、　２８７　（１９８０
））のＰｓｔ　ｒ切断部位に挿入してプラスミドｐＧｓ
Ｒ１００を作製した。次に、プラスミドｐＧｓＲ１００
を制限酵素Ｓｅａ　Ｉで切断し、さらにプラスミド１μ
ｇ当り０．１ユニツトの１（ｐａ　Ｉで２０分間部分切
断を行い、遺伝子ｇｓｈ−１を完全に含むＤＮＡ断片を
得た後、その断片の両端にＢａｎ）Ｉ　Ｉリンカ−を付
与した。一方、プラスミドｐＭｃ１５８５を制限酵素Ｐ
ｖｕ　ＩＩで切断後、自己閉環させることにより大部分
のラクトースオペロンを除いたプラスミドＰＧＳＲ１を
調製した。このＰＧＳＲ１をＢａｍＨＩで切断し。

その切断部位に１両端にＢａｍＨＩリンカ−を付与した
上記のＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＧＳＲ１５
０を調製した。

このｐＧｓＲ１５０の遺伝子ｇｓｈ−１の下流側に位置
するＢａ＋ｏＨＩ切断部位を、Ｔ４ポリメラーゼでフィ
ルインした後、Ｔ４リガーゼで閉環させてプラスミドｐ
ＧｓＲ１５１を作成し、このＰＧＳＲ１５１をＢａｍＨ
Ｉで切断し。

その切断部位に第１図記載のプロモーターＰ−８断片を
挿入してプラスミドｐＧｓＲ１５１８を調製した。

プロモーターＰ−８断片は、前記したプラスミドＰＭＹ
−８を常法通りＢａｍＨＩで切断して採取した。

次に、このプラスミドｐＧｓＲ１５１８のプロモーター
Ｐ−８断片の上流側に位置するＢａｍ８１部位を消滅さ
せるため、１μｇのｐＧｓＲ１５１８を０．１ユニツト
の制限酵素Ｂａ＠ＨＩで２０分間部分分解して、フィル
インにより平滑末端化した後、　Ｔ４リガーゼで自己閉
環させてプラスミドｐＧｓＲ２５１８を調製した。しか
る後、２μｇのｐＧｓＲ２５１Ｂを’１３ａａＨＴで切
断し、２００　μｌの反応溶液中で２ユニツトのエキソ
ヌクレアーゼＢａ１３１を用いて、３０℃で１０分間部
分分解した６次いで。

切断末端にＸｈｏ　Ｉリンカ−を付与し、最後にＴ４リ
ガーゼで自己閉環させることにより、遺伝子Ｐ−１１と
遺伝子ｇｓｈ−Ｉとの接続部がＸｈｏ　Ｉリンカ−を介
してＧＳＨ−１の構造遺伝子のＮ末端に存在し、Ｐ−８
とｇｓｈ−１の面構造遺伝子のアミノ酸コドン読み取り
フレームが一致しているプラスミドｐＧｓＲ２５１ｇ−
Ｘを作成した。以上説明したプラスミドρＧ５Ｒ２５１
８−Ｘの作成手順の概略は第２図に示されている。

上記のようにして調製したプラスミドｐＧｓＲ２５１ｇ
−Ｘを用いて、酵母ＹＮＮ２７の形質転換を、ネイチャ
ー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２７５，１０４（１９７８）に
記載された方法に従って行った。

すなわち、　ＹＮＮ２７を培養後集菌し、細胞壁溶解酵
素であるザイモリエースー１００７（生化学工業株式会
社製）を作用させてプロトプラストとした後。

これにプラスミドｐＧｓＲ２５１８−Ｘを混合して、Ｓ
Ｄ培地で３０℃−夜振盪培養し、次いで培養液を遠心分
離して集菌後、これをガラスピーズで破砕し、再度遠心
分離に掛けて粗抽出液を回収した。そして、基質（グル
タミン酸＋システィン）とＡＴＰの存在下で生じたγ−
グルタミル−Ｌ−システインをグリオキシル化し、Ｄ　
Ｔ　Ｎ　Ｂ　（５，５’−ジチオビス−（２−二トロ安
息香酸））を用いて比色定量する方法〔ノクイオケミカ
ル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ）ＩＩＩ　、３０９−３１５（１９６９））によっ
て、前記粗抽出液に含まれる形質転換株のＧＳＨ−１活
性を測定した。その測定結果によれば、粗抽出液に含ま
れる形質転換株は、いずれも宿主菌ＹＮＮ２７よりも高
いＧＳ）！−１活性を示していた。この形質転換株の中
で最もＧＳＨ−■活性が高いものから、プラスミドｐＧ
ＳＲ２５１ｇ−４を常法に従って抽出し、そのプラスミ
ドに於ける遺伝子Ｐ−８と遺伝子ｇｓｈ−１との接続部
のＤＮＡ配列及びそれに対応するアミノ酸配列を検定す
ると共に、プラスミドｐＧＳ８２５１８−４を含む形質
転換株のＧＳ）１−Ｉ活性を測定した。結果を下に示す
。

ＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｕＬｙｓＶａｌＩｌｅＡｒｇＰ
ｈａＧｌｎＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＶａｌｌｌｅＰｒ
。

ＧＡＣＧＡＴＴＣＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣ
ＴＧＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＧＴＴＡＡＡ
ＧＡｓｐＶａｌｓｅｒＧｉｎＡｌａＬｅｕＡｌａＴｒｐ
ＬｅｕＧｌｕＬｙｓＨｉｓＰｒｏＧＬｎＡ１ａＬｅｕＬ
ｙｓＧｌｙＩｌｅＧｌｎＡｒｇＧ１ｙＬｅｕＧｌｕＡｒ
ｇＧｌｕＴｈｒＬｅｕＡｒｇＶａＩＡｓｎＡｌａＡｓｐ
対照　　　　ＹＮＮ２７／ｐＧｓＲ１１，７Ｘ　１０−
３形質転換株　ＹＮＮ２７／ｐＧｓＲ２５１ｇ−４５，
８上のデータから明らかな通り、形質転換株ＹＮＮ２７
／ｐＧｓＲ２５１ｇ−４のＧＳＨ−１活性は、対照ＹＮ
Ｎ２７／ｐＧｓＲ１のそれに比べ約３４００倍向上して
いた。

実施例２ ＹＮＮ２７／ｐＧｓＲ２５１８−４の一白金耳量を、１
０ｍ１のＳＤ培地（グルコース２％、イースト・ナイト
ロジェン・ベース０．６７％、アデニン硫酸塩０．００
２％、トリプトファン０．００２％）に接種し、３０℃
で一夜振盪培養後、その全量を同組成のＩＬ培地（５Ｌ
容三角フラスコ使用）に接種して３０℃、１４−２０時
間の振どう培養を行なった。通常の方法で集菌、洗浄後
、菌体をガラスピーズを加えて破砕処理し、その抽出液
中のグルタチオン含量をアナリテイカルバイオケミスト
リー、２７．５０２　（１９６９）の方法に従って分析
した。その結果は次の通りであった。

対照　　　　ＹＮＮ２７／ＰＧＳＲＩ　　　　　　　　
　Ｏ，３形質転換株　ＹＮＮ２７／ＰＧＳＲ２５１ｇ−
４２，４

【図面の簡単な説明】

第１図は酵母よりクローニングしたプロモーターＰ−８
断片の制限酵素切断部位を示す概略図であり、第２図は
本発明に係る新規なプラスミドρＧＳＲ２５１ｇ−Ｘの
作製手順を示す概略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、エシェリキア・コリを起源とするγ−グルタミル−
   Ｌ−システイン合成酵素の遺伝子のプロモーター部分を
   、酵母プロモーターと差し換えてなり、酵母において複
   製可能な組み換えプラスミド。 ２、前記の酵母プロモーターがサッカロミセス属酵母か
   らクローニングされ、第１図に示す制限酵素地図を有す
   る酵母プロモーターである特許請求の範囲１の組み換え
   プラスミド。 ３、エシェリキア・コリを起源とするγ−グルタミル−
   Ｌ−システイン合成酵素の遺伝子のプロモーター部分を
   、酵母プロモーターと差し換えた組み換えプラスミドを
   酵母に移入し、当該酵母を培養し、培養物からグルタチ
   オンを採取することからなるグルタチオンの製造法。