JPS62269694A - 増殖性動物細胞を培養して有用な高分子物質を生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （ｍｌ　　産業上の利用分野 本発明は増殖性動物１ＩａＪ胞を培養して有用な高養系
九関するものである。

（ｂｌ　　従来技術 細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン。

インターフェロンの如き抗ウィルス削成いはホルモンの
如き生物薬品の製造くとって宜要である。更忙近年特定
タンパク質などを標的とするモノクローナル抗体の生産
は抗体産生細胞とミエローマによるハイプリドーマの培
養によるものであり、その技術の解決は工業的にｘ賛な
テーマである。

従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんなど
を用いて実験室的規模で行なわれている。

一方近年前記した如き有用物質の産生な目的として工業
的な細胞の培養法及びそのための装置とし工、いくつか
の提案がなされ℃いる。これらの提葺は、太き（分けて
何着培養 （ａｎｃｈｏｒａｇ＠ｄｅｐｅｎｄａｎｔ　ｃｕｌｔｕ
ｒｅ　）と浮遊培養、つまりサスペンジョン培ＩＩ　（
５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒ＠）との２つの方式
に分類されるが、これらの方式は培養される細胞の特性
によっていずれかに決められる。

このうちサスペンジョン培養に関して下記の提案がなさ
れている。例えばマグネテイックスターラーもしくは機
械的（駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピナ
ーフラスコの中ＩＣ＠整された攪拌機能を設けた培養方
法が提案されている（米国４？奸第２．９５８．５１７
号および同第３．６４９．４６５号明細書参照）。

特開昭５７−６５１８０号公報には、回転可能なシャフ
ト上に支持される少くとも１枚の比較的大表面積の屈撓
性シートを攪拌機とし、該攪拌機を回転させて該シート
を波立たせ、それによってヒトの２倍体１１１１７６１
のような成る種の虚弱細胞に対し所望の穏かた攪拌を作
り出すサスペンジョン培養装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、細胞が一
定量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比
較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジョン培！！＃において、細胞の生長増
殖が比較的低い密度で停止するのを防ぎ、Ｉａ脂を大量
に且つ重密度で培養するために、一般に′ＩＩｒシい培
養液を培養槽中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い
培養液を培養槽外へ排出しながら培養する方式、すなわ
ち通称バーヒユージョン方式゛と言われる方式が提案さ
れ１いる。

この方式を用いて培養するに当って′Ｎ景なことの１つ
はサスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養液とを効
率よく分離し、古い培養液を培ＩＩ橿外へ取り出し、培
養槽内のｍ胞の生育環境を最適条件下に維持することで
ある。

特開昭５９−１７５８７７号公報及び特開昭５９−１７
５８７８号公報には、半透膜の片面側に細自を含む培養
液を供給して通過させ、そし″′Ｃ該半透膜の他方の面
側に廃業生産物を除去するかあるいは該他方のｃ［ｉｉ
＠から細胞を含む培誉欣中に栄養分を補給する方法が提
案されている。

第３回次世代産業基盤技術シンポジウムーバイオナクノ
ロジーー子福果（Ｐ２Ｓ５．１９８５年）には、二重の
瓶構造をなす透析培養糸が提案されている。すなわち、
内底は透析薄峨から成っており、該内底内でナマルバ細
胞の培養を行い、外底内に該内底が浸漬する程度の透析
液を充填し、該透析液中にナマルバ細胞の生育阻害物質
を除去して内底中のナマルバ細胞の！ｌ！１Ｅｆｔ域め
る方法が記載され℃いる。

上記特開昭５９−１７５８７７号、特開昭５９−１７５
８７８号および上記予稿集に記載された方法では、実際
に培養を行う場所に広い透析面積を確保しなければなら
ないことになる。

特開昭６１−２５４８３号公報には、付看増殖性細胞の
培養法及び装置か開示され曵いる。すなわち、付着細胞
を担体に担持し工充填しているｍ！ＩＡｔ＠参部に培養
環境調節部で調節した培地を供給し、該培養部を通過し
た培養液から代謝生産物を分離、除去し、それをｕｉ培
培養環境部節部戻す方法及び客１が開示されている。同
公報には、上記分離、・除去を、限外ｆ過あるいは透析
によって行うことが記載され℃いる。

特開昭６１−２８３８５号公報に開示された上記方法は
、付着細胞の培養法として特記される。

また、［ジャーナルオプインターフェロンリサーチＪ　
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　）主、　／Ｉ６４，５３３−５４１（１
９８２）には、２１の丸底フラスコ中に含有された誘導
浮遊を１００＋０００　　ＭＷＣ（ｎｏｍｉｎａｌ　ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔｃｕｔｏｆｆ　）　　
濾過上ジュール中を再循環し、白皿球とウィルスを含有
している液を再循環し、そし℃インターフェロン含有ｆ
ｓ辰を貯水槽に供給し同時に１０９０００　　ＭＷＣ濾
過七ジュール中を再循環し、そし℃インターフェロン非
含有＃液を上記丸底フラスコに戻す方法が開示されてい
る。

上記方法は、インターフェロンな培養により製造する方
法として特記される。

ところで、細胞培養により有用物質を得るために工莱的
にｘｉなことは、目的とする有用物質を高い濃度で得る
ことである。一般ＶＣ細胞培養におい℃培養液中の細胞
が産生する有用物質の濃度は極めて低く、培養液から有
用物質を分離、ｆＩ製するために煩雑な手段を要し、そ
れが回収率の低下、コストアップの原因の１つになつ℃
いる。「ジャーナルオグインターフェロン　リサー＋　
ｊ　　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ン主、Ａ４．５３３−５４１（１
９８２）の上記方法は、インターフェロン濃度の高い溶
液を与えるから、そのような意味で工業的に有利な方法
と云えよう。

しかしながら、培養な高い細胞！［で行なうことにより
、成る程度有用物質の濃度を高くすることは可能である
が、細胞を萬密度で培養するためには前述した如く新し
い培ＩＩ！液を供給しながら、古い培養液を培養系外へ
排出しなければならず、扁！！によるＪａｌ胞培養技術
においては、有用物質の一度を扁くするためには自ら限
界があった。

ｆａｔ　　発明の目的 本発明の目的は、増殖性動物細胞のサスペンジョン培養
に関し、該動物ａ胞を培養し″Ｃ有用な一分子麓物買を
生産するｆ規な方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、増殖性動物細胞の培養によってそ
れが産生ずる有用な高分子量物質をより高められた一度
で得ることができる方法な提供することである。

本発明のさらに他の目的は、有用な高分子量物質Ｙｍい
濃度で含む培養液を得ると共にそれを実施するための工
業的に有利な培養システムを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、特に有用な高分子量物質と
しての抗体を高濃匿で得るための簡単で工業的価値のあ
る細胞培養方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、増殖性動物細胞、の生育阻
害物質を除去し、そして成長促巡物質を含む培養敵な得
、該培養液を循環使用すること（よって、経済的に且つ
工業的ｖｃ有利に有用な高分子量物質を生産する方法を
提供することにある。

本発明のさらに他の目的は以下の説明から明らかとなる
であろう。

（ｄ）　　発明の構成および効果 本発明のかかる目的および利点は、本発明によれば、 囚　増殖性動物細胞をサスペンジョン状態で培養して該
増殖性動物細胞が産生ずる有用な高分子を物質と該増殖
性動物Ｉａ胞を含有するナスペンション培養混合液を形
成する培養工程； （Ｂｌ　　該サスペン：）ヨンＪ＠４＃混合液から該動
物細胞と分離してｉ４Ｎ液を取り出丁分離工程；（Ｃ）
　該動物細胞と分離された該培養液から、上記有用な鍋
分子物質と異なる該動ｖＩＪａ胞の代謝産物である該動
物細胞の生肯阻害低分子黛物ｖＬ’を除去する除去工程
； ０　生青阻害低分子敏物質を除去された培養液の一部又
は全ｇｔ上記培堡工程（Ａ）に循環する循環工程；　お
よび ■　本培養系に蓄積された上記有用な高分子量物質な回
収する回収工程、 からなろ増殖他動′＃！ＪＭＡ胞を培養し１有用な高分
子量物質を生産する方法によって達成される。

かかる本発明によれば、生青阻害低分子被物質？除去し
て培養液を循環する工程を含むから培養を高い１ｌＡｌ
＆密度（培養中に細胞が増殖して高い細胞密度を達成す
る場合と培養の当初から高い細胞密度を有する場合とを
包含する）で行うことが可能となり、またそのため有用
な高分子量物質を高い濃度で含む培養液を得ることがで
きる。また、有用な高分子量物ｆｆ　Ｙ　尚い濃度で含
む培ＩＩ液中に８いて高い細胞密度ｔｔ達成することが
でき、このことも不発明者により初めて得られた知見で
ある。この昶見によって、有用な高分子量物質をますま
す高い濃度で含む培４＃液を！１ＩｃＬ５ることが可能
となったのである。

本発明の方法は、上記囚〜叩の５工程な有している。本
発明方法は、上記（４）工程から明らかなとおり、サス
ペンジョン状態で培養する方法に適用される。サスペン
ジョン状繍での培養とは、水性媒体中で細胞それ自体が
浮遊しながら、或〜Ｓは細胞を微小担体（マイクロキ〒
リアーンに担持して浮遊しながら、またマイクロカプセ
ル中で＋１１１ＩＩａが浮遊しながら生育されるような
種々の浮遊培養をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊
させながら培養する方式に有利に用いられる。

本発明の培養工程において、培養する動物細胞は、サス
ペンジョン状感にて増殖可能なものであり且つ有用な高
分子量物質を産生ずるものであればよ（、天然の増殖性
動物細胞のみならず、人為的或いは遺伝子操作により変
性された細胞例えばハイプリドーマであってもよい。

また細胞として、ＩＬ−２の如きリンホカインを産生ず
るリンパ球由来の増殖性細胞であってもよく、インター
フェロン（ＩＦＮ）の如き有用な生理活性物質を産生ず
る２倍体細砲であってもよい。さらに種々のモノクロー
ナル抗体を産生゛する増殖性細胞であってもよ（、本発
明はかかる七ツク″ローナル抗体を産生ずる細胞の培養
に対してモノクローナル抗体を高い濃度で得る目的のた
めに特に適している。

本発明におけるサスペンジョン状感の細胞培養工程図に
おいて培養槽中においては、培養しようとする細胞が培
ＩＩ液中に浮遊した状態で培養される。培養は、上記し
たとおり培養中に細胞が増殖する場合を包含することは
もちろん、培養中に細胞が実質的に増殖しない場合をも
包含する。培養液は実質的に水よりなる水性媒体に、種
々の無機塩、ビタミン類、補酵素、グドワ糖、アミノ酸
、抗生物質などの通常細胞培養に使用される添加成分が
加えられている。また培養液には血清を加えることもで
きるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液として
使用することも出来る。

本発明方法は１．培養工程囚からのサスペンジョン培養
混合液からその中の動物細胞と分離して培養液を取り出
す分離工程（１３）を包含する。この動物細胞と培養液
との分離は、後述する第１図に示されたよ５に培養槽内
（例えばサスペンジョン培養液中）で行うことができる
。また培養槽からサスペンジョン培重畝を一旦槽外に取
り出し、培養槽外で動物細胞と培養液とを分離し、動ａ
ＩＩＪｌｌＡｊｌｉ！は培養槽へもどす方式であっても
よい。これらいずれの場合であっ工も動物細胞と培養液
との分離は細胞が生育した状態で、分離された培養液中
に細胞が実質的に混入しない方法で分離できればよ（、
種々の分離手段が採用できる。分離工程（Ｂｌは、例え
ば重力沈降、遠心沈降あるいは一過によって実施される
。重力沈降は、例えば第１図に図示されているように培
養槽内にセトリングゾーンを設けそのゾーン内で動物細
胞と培＊ｇとを１カにより分離して動物細胞なセ）　Ｉ
Ｊングさせ、その上澄Ｊ？！＊ｇを培養槽外へ取出すこ
とによって実施できる。遠心沈降は遠心分離によりまた
、一過は例えば回転フィルター、固定フィルター、ホロ
ーファイバモジュールなどを用いて実施できる。フィル
ターによって分離する場合には、例えばハイプリドーマ
はほぼｌＯμ電以上の大きさを有するから、ハイプリド
ーマと培養液との分離にはフィルターの細胞径が５μｍ
以下のものが好適に用いられる。

工程ｔＢ）における上記の如き動物細胞と培養液との分
離は無菌状態で実施される。

上記分離工、Ｉ　（Ｂｌからの培養液は、動物細胞の代
謝産物である該動物細胞の生青阻害低分子量物質を含有
する。この低分子を物質は該Ｉｇｌｌ物細胞の生育を阻
害するため、すなわち該低分子量物質が培番系中にある
程度の童まで蓄積すると該動物細胞は最早増殖しなくな
るかあるいは減少するようＫなるため、久いで工ｍ　ｔ
ｅｌにおいて除去される。該低分子量物質の除去は、例
えば限外ｆ過、透析あるいは吸着によって実施できる。

生長を阻害する低分子量物質は通常高々１万である。培
養工程（４）で形成されたサスペンジミン層嬰混合液中
には通常分子量１万ｔＭｉえる有用な高分子量物質が産
生されるため、この除去工程（０では該有用な高分子量
物質を残存させそして生青阻害低分子量物質のみを除去
することができる。

有用な高分子量物質は、例えば免疫グープリンのような
タンパク負である。免疫グロブリンは例えば１．ｌ／Ｇ
　、　　Ｉ！１Ｍである。

また、免疫グロブリンはヒト又はヒト以外の動物の免疫
グロブリンであることができる。

除云工８（０を例えば限外ｒ過により実施する場合に、
有用な高分子ｔ＠賞がＩｙＧであるときには、分子量約
１５万の物質を実質的に透過しない限外ｆ過膜、例えば
分子菫分画１万〜５万程度の限外ｒ過膜が好適に使用さ
れる。また、有用な高分子量物質がＩｙＭであるときに
は、分子量約１００万の物質を実質的に透過しない限外
１通膜例えば分子量分画１〜５０万程直の限外ｒ過膜が
好適に使用される。すなわち、上記の如き限外ＰｉＡ膜
を使用することによって、ＩｙＧ　、　　Ｉ、ｙＭの如
き有用な高分子量物質を透過させず（、細胞の生育を阻
害する物質を除去せしめた培養液を得ることができる。

工８（Ｃ１における限外濾過は、ｆ通函を容易に洗滌、
再生できる方式、つまりホールド・アップが少ない方式
が好ましい。その形式としてはホロー・ファイバー、ス
パイラル、チュブラ−。

プレートアンドフレームなどが挙げられるが就中ホｐ−
・ファイバー、プレートアンドフレームの形式が望まし
い。

除去工程（Ｃ）は、上記限外ｒ過の他に、透析あるいは
吸着によって行うことができる。これらはそれ自体公知
の方法によって実施することができる。

本発明方法は、久いで上記工程（Ｃ）から得られた培養
液の１部又は全部を、上記培養工程（４）に循環する。

例えは、本発明方法に従って、工程図でモノクローナル
抗体を産生させ、工程（０でこれを含む成分を分画して
培養工程図に循環させることによってサスペンジョン培
養液中のモノクローナル抗体浪度が高くなっても（例え
ば１１１Ｐ／ｄ以上）、そのこと自体細胞の生育、増殖
には特に悪い影醤は与えない。

上記循環玉揚Ｑ）ｌ　において、前工程（Ｃ）から分画
された有用物質を含む高分子量物質は、培養液中のその
濃度や細胞の生育状態を監視しながら、培養工程図中へ
循環するその割合を決定される。

すなわち一般に工ＩＭ（Ａｔにおけるサスペンジョン培
養混合液中の細胞密度が低く且つ有用物質の濃度も低い
場合には、工程（Ｃ）からの培養液の金貨乃至はとんど
を培養槽中へ循環することが望ましく、一方サスベンジ
ョン培養混合液中の有用物質の濃度が比較的高くなるに
従って、その循環割合を少な（し、他は系外へ取り出す
ことが望ましい。

本発明方法において、上記工程図〜０の実施により、本
培養系中に蓄積された上記有用な高分子量物質は、上記
工程図〜０の１回の実施後（、あるいは複数回の実施後
に、本培髪系から取り出され回収される。該取り出しは
、例えば上記工程（Ｃ）かもの培養液の１部から取り出
すことができ、あるいは工程図の培養液から動物細胞を
含む状態で取り出すこともできる。この取り出しは連続
的に行ってもよく、また間歇的に行ってもよいが連続的
に行うのが好ましい。

本発明方法は、工程図におい℃血清添加培地をサスペン
ジョン培−＃混合液として用いて実施することができ、
また血清を実質的（含有しない培地を用いて実施するこ
ともできる。血清は動物細胞の成長を促進する物質を含
有し、工程（Ｃ）で生青阻害低分子量物質を除去したの
ちにおいても該成長を促進する物質を残留し、それ数工
程０の循環１徨によって培養工程図に循環することによ
って、高価な血清中の該成長を促進する物質を利用しう
ろことは本発明方法の利点である。

例えば血清昧加培地を用いて培養する場合、除去工８（
Ｃ１において、分子量分画１万の限外ｆ過膜を用いて生
育阻害物質を除去し、他を培養工程図へ循環すれば血清
の使用割合を大巾におさえることが可能となる。

また、血清を実質的に含有しない培地を用いて工程図の
培養を実施する場合には、培養液中に例えばトランスフ
ェリン、インシュリン、フルフミン、エタノールアミン
あるいはセレン化合物の如き成長促進物質を通常添加す
る。これらの成長促進物質のうち、例えばトランスフェ
リン、インシュリンあるいはフルフミンの如き比較的高
分子量の化合物は、上記工程（０で生青阻害低分子量物
質を除去したのちくおいても培養液中に残存せしめるこ
とができる利点がある。

例えば、無血清培地（例えばＩＴｇＳ　）を用いて培養
する場合、分子量分画１万の分離膜を用いると成長促進
物質としてのトランスフェリンを高回収率で回収し再使
用可能でありまたインシュリンは部分的に回収される。

分子量分画ｌ千の分離膜を用いるとトランスフェリンの
みならずインシュリンを一層高い回収軍で回収して、工
程（Ａ）に循環することが可能となる。

また本発明の方法を実施するに当って、新しい培養液の
供給と、古い培養液の排出とは、培養槽中の液面の水準
がほぼ一定となるように維持することが望ましいが、必
ずしもその必要はない。新しい培養液の供給と古い培養
液の排出とは、それぞれ独立して、連続的く行なうこと
もできまた間歇的に行なうこともできる。

本発明方法（おいて、サスペンジョン培養混合液中の酸
素濃度を一定に維持するために、酸素を供給する方法と
しては、前述の如く、サスペンジョン培養混合液中へ酸
素または酸素含有ガスを直接供給してもよ（、また他の
供給手段によってもよい。他の供給手段としては、例え
ば酸素キャリアーを用いる方法である。酸素キャリアー
としては、水と実質的に混合しないで酸素を溶解し得る
液状の化合物が使用される。

°その例としては、人工血痕の素材として使用されるよ
うな種々のフルオロカーボンが挙げられる。かようなフ
ルオロカーボンを酸素供給手段として使用する場合には
、酸素を溶解させたフルオロカーボンをサスペンジョン
培養混合液中の上部から液滴状または薄膜状で添加てれ
はよ一層１゜ 培養を効率的に行なうために、新しい培養液および酸素
などをサスペンジョン液中へ均一に供給し、一方古い培
養液を槽外へ排出する必要があり、そのためサスペンジ
ョン液は効率良く攪拌されていることが望ましい。攪拌
方法としては、攪拌真の回転による如！！機械的攪拌方
法、また案内・筒を用いたドラフト効果による方法、こ
の他前記した如き酸素を溶解した酸素キャリアーを用い
ることによる酸素供給と攪拌を同時に行なう方法などが
挙げられる。もちろんこれら攪拌手段を２つ以上併用す
ることもできる。

また培養は、培養槽の有効培誉容槓（Ｖ）Ｋ対して新し
い培養ｇ、′ｌｋ：供給する割合（′Ｉｉｒシい培養液
の供給ｔ／Ｖ）は−日当つ０．２〜１０．好ましくは０
．５〜５の範囲とするのが適当である。

上記本発明方法は、 （１）　　有用な縄分子＊ｖＡ質を産生しうる増殖性動
物細胞をサスペンジョン培養するための培養槽、 （２）　　増殖性動物細胞を含むサスペンジョン培ＩＩ
版から該動物細胞と分離して培４ｊ：液を取り出すため
の分離手段、 （３）増殖性動物細胞と分離された培養液を、該培養液
から該培養液に含まれる該動物細胞の代謝産物である該
動物細胞の生青阻害低分子量物質を除去するための除去
手段に送るための輸送手段、 （４）　　上記除去手段、 （５）　　生青阻害低分子量物質を除去された培養液を
培養槽へ循環輸送するための手段、および （６）　　有用な高分子量物質を回収するために、この
システムから培養液を抜き取るための手段 から成る増殖性動物細胞を培養槽中にエサスペンジヨシ
状態で培養するための本発明の培養システムによって有
利に実施することができる。

かくして本発明によれば有用物質殊にモノクローナル抗
体を高い濃度で含有する培養液を比較的簡単な手段で得
ることかでさ、また好ましい態様においては血清、成長
因子な、どの高価な物質を大巾に節約することが可能と
なる。

以下実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例１ ｉｌ）培養装置 添付第１図に示す培養システムを使用した。

培１１ｍ（ＡＰ−１）は第１図のよう（外壁の円１１１
に隔壁によって仕切られたセトリングゾーンがも５げら
れ、その上部には培養液の排出口を有しており、正味培
養容積は約２０ＯＮである。第１図のＡＰ−２はプレー
トアンドフレーム型限外〆過装置である。限外Ｐ：ＡＩ
Ｍはぼりポア社製ペリコンラボカセット用限外ｆ過膜を
使用した。使用した膜の分画分子量は実験データの項に
記する。

（２）培ＪＩ液 ４ｔｌＲ培地として、ＲＰＭＩ　１６４０培地、ハム−
１２培地及びダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１
で混合したもの（以下ＲＤＦと称する）ｉｋ用い、増殖
因子としてインスリン。

トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸を加
えた。エタノールアミンの添加量は、１０　ｔｔ＆／Ｉ
Ｌｔ、　＊セレン酸は２×ｌＯ″″″ｍｏｌｅ／ｌであ
り、インスリン及びトランスフェリンについては培地α
−１においてはインスリン２μｉ／ａｔ、　　）ランス
７エリン１０μＩ／Ｍｌであり培地β−１においてはイ
／スリン０．２μＪｌ／ｄ！、　　）ランス７エリン１
μ９／−であった。

（３）培養方法及び結果 あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積がｉ１３２００　ｍｌになるように培ｊｊＩ液α
を送入し、これをマウスミエローマ細胞Ｐ３０１株を虜
株とするマウスＸマウスバイブ＋３　）’−ｆｆ　４０
１０Ｂ６株を４　Ｘ　１０’　１ｖＡ／ＪＩｊとなるよ
うに播穫した。この細胞はＩｙＧ産性株である。培養槽
では炭酸ガス５％を含む酸素ガスが（溶存酸素が３解と
なるように）吹込みノズルＢを通して自動的にコントロ
ールされて送入され℃いる。培養槽中の培養液は３７℃
に保持されている。培養槽中にはマリン型攪拌翼が取付
けられており攪拌速度は６０ｆであった。

播種後４日間は回分培養を行った。第１表に示すように
培養開始後４日目に細胞密度は１、Ｉ　Ｘ　１０’個／
ｍｕ　Ｋ遅し、回分培養では最高密度（到這したと判断
しパー艦ユージ目ンを開始した。パーヒユージョンの尺
度として正味培養容積の１日当つの置換軍として表わし
実験結果を併記する。すなわちポンプＰ−Ｉ。

Ｐ−Ｉｌ、　Ｐ−１１１を駆動しパルプＸを開、パルプ
Ｙを閉として、培養槽内で細胞と分離された培ＩＩ液を
ラインＤから抜きとり、その賞と同じ麓の新培地αをラ
インＡから連続的に送入した。限外ｆ過装置ＡＰ−２に
は分子量分画１０００の限外１過膜がセットされており
、ラインＦからは膜な通過した液を、またラインＥから
は膜を通過しなかった液を系外に取出した。時間の経過
とともｖｃｍ胞″Ｍ度が上昇し、１０日には１２ＸＩＯ
・１１１／ｄＫ遜した。この時点で図においてパルプＸ
を閉じパルプＹを開き限外ｆ過膜を通過しなかった液は
ラインＧを通して培養槽に儂環した。同時にラインＡか
ら送入する培地なαからβに変更した。

１００日目ら培養槽から細胞を含む培養混合物を正味培
養容積の約１０％に当る２　０　ｍｌ、毎日系外に抜取
った。

以上の培養操作を２６日間継続した。その結果をｔｇ１
表に示す。

第　１　表 細胞　　マウス・マワスへイグリドーマ　　　　４Ｃ１
０Ｂ１１：ｊ唱：１」１オ凰　　α−１：　　ＩＴＥＳ
＋ＲＤＦ’　　　Ｉ　　二２　μｌ／Ｌデ　　　Ｔ：ｌ
ＯμＪレーダ１−４デβ−１：　ＩＴｇＳ＋ｇＤＦ’　
　Ｉ　：　０．２μ＆／ＩＩＡ！Ｔ：１μｌ／１使用限
外ｆ過瞑：ミリポア比製ＰＳＡＣＯＬＣ０５（分子量分
画１．０１３Ｏ）実施例２ 次に記する事項以外は実施例１と同様にして培養実験を
行った。

細胞：マウスミエローマ　Ｐ３Ｕ１とヒトＢセルを融合
して得られたヒ）　ＩｙＡ産生マウス・ヒトハイグリド
ーマ４１（１１株 培胤：午胎児血清（Ｆｅ２）添加培地 限外Ｃ過膜分画分子量：１０．０００ 実験結果をｊｇ２表に示す。

Ｍ２表 ａＩ！＆：マウス・ヒトハイグリドーマ　４Ｈ１１株（
ヒトＩｙＡ産生株）培地　α−２：１０％Ｆ’Ｃ８＋Ｒ
ＤＦ゛β−２＝　１％ＦＣ８＋ＲＤＦ 使用限外ｆ過膜：ミリポγ比製　ＰＴＧＣＯＬＣ０５（
分子量分画１ｏρ００）実施例３ 次に記す事項以外は実施例１と同様にして培ＩＩ案験を
行った。

細胞：マウスミエローマＰ３Ｕ１とヒトＢセルを融合し
て得られたヒトＩ７Ｇ産生マウス・ヒトハイグリドーマ
Ｄ３４・３・１株 培地：基本培地ＲＤＦにインスリン、トランスフェリン
、エタノールアミン、亜セレン酸及びＢＳＡ　（牛皿渭
アルブミン）を添加した無血清培地。

限外Ｃ４編分画分公刊１０．０００ 実験結果をｇｇ３表に示す。

第　３　表 Ｍ！！＆：マ９ス・ヒトハイグリドーマ　Ｄ３４・３・
１株培地：　ａ　−３；　ｆ　Ｔｋ：Ｓ＋ＢＳＡ＋ＲＤ
Ｆ　Ｉ　：　１０ｇ＆ＡＩＴ：　２０ｔＪ／ｄ　Ｂ　Ｓ
Ａ：！Ｗ／ａ／β−３；　ＩＴｇＳ＋ＢＳＡ＋ＲＤＦ　
Ｉ：　２ａｌ／ｍｌ　Ｔ：　２ｔｄｌ／ｌ　ＢＳＡ：０
．５ａｙ／ｄ使用限外Ｃ過膜：ミリボア社製　Ｐ’ｌ’
ＧＣＯＬＣ０５（分子量分画１０，０００）実施例４ ＋１１　　培養装置 添付第１図に示す培養システムを使用した。

培養槽（ＡＰ−１）の内容積は約２００　ｍｌであり、
培養槽の高さくＨ）と直径の比（Ｈ／Ｄ　）は２：１で
あった。この培養槽には第１図に示したように攪拌効果
の実質的に及ばないセトリングゾーンが設けられている
。このゾーンにおけるＶ／３は５．３ｃＲであり、ｈは
８ｃＩＬであった。第１図のＡＰ−２はプレートアンド
フン−ムｍ限外ｆ過装置である。限外ｆ過膜はミリボア
社製ペリコンラボカセット用限外ｒ過膜を使用した。膜
の分画分子量は１万であった。

（２）培養液 基礎培地として、ＲＰＭＩ　１６４０培地、ハム−１２
培地及びダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１で混
合したものにさらにグル；−ス、アミノ酸等を添加した
もの（以下ｅＲＤＦ’　と称する）を用い増殖因子とし
てインスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、
ｆＬセレン酸をＪえた。エタノールアミンの添加ｔは、
１０μＭ、亜セレン酸は２　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’ｍｏ’ｌｅ
／＃であり、インスリ／及びトランスフェリンについて
は培地α−４においてはインスリン９μ７７７ａｔ、　
　）ランス７エリン１０μｊｌ／Ｉｔであり培地β−４
においてはインスリン０．４５μｌ／ａｔ、　　）ラン
スフェリン０．５μ＆／ｄである・ （３）　　培養方法 あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積が約１２０１１７になるように培養液α−１を送
入し、これをマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１株を親株と
するマウス×ヒトハイブリドーマＨ２株を６Ｘ１０’個
／ｄ　となるように播種した。この細胞は■ｙＧ産性株
である。培養槽では炭酸ガス５％を含む酸素ガスが（＃
存酸素がａｐｐｓとなるように）吹込みノズルＢを通し
℃自動的にコントーールされて送入されている。培養槽
中の培ＩＩ液は３７℃に保持されている。培養槽中には
マリン厖攪拌翼が取付１すられており攪拌速度は６θ甲
であった。

播種後１日間は回分培養を行い、１日目かラバーヒユー
ジョンを開始した。パーヒエ−ジョンの尺度として正味
培養容積の１日当りの置換率として表わし実験結果を併
記する。

すなわち永ンブＰ−Ｉ　、　Ｐ−Ｉｌ、　Ｐ−ＩＩＩを
駆動しパルプＸを開、パルプＹを閉として、培養槽内で
細胞と分離された培養液をラインＤかも抜きとり、その
麓と同じ量の新培地α−４をライン人から連続的に送入
した。限外ｆ遇装ｆｌｌＡＰ−２には分子量分＠　１０
００の限外ｆ過膜がセットされており、ラインＦからは
膜を通過した液を、またラインＥからは膜を通過しなか
った辰を系外に取出した。時間の経過とともに細胞密度
が上昇し、６日目には６．６×１０′個／ｄに達した。

この後９日目まで細胞密度は増加しなかったので、この
時点で図においてパルプＸを閉じパルプＹを開き限外１
過腰を通過しなかった液は培養槽に循環した。

同時にラインＡから送入する培地をα−４からβ−４に
変更した。

（４）　　培養結果 以上の培養操作Ｙ４８日間継続した。その結果を第４表
に示す。

第４表 細胞　マウス・ヒトハイプリドーマ　６２株培地　ａ−
４：ＩＴＥＳ＋５ＲＤＦ１：９μ＆／ＩＬ（Ｔ：ｌＯμ
Ｊ＄／ａｇβ−４：　ＩＴＥＳ＋ｅＲＤＦ　Ｉ　：０．
４５　ｐｊｌ／ｍｌ　Ｔ：　０．５ａＪｌ／ａｄ使用限
外ｆ過膜：ミリボッ社製　ＰＳＡＣＯＬＣｔ＋５（分子
型分画ｔｏ、ｏｏｏ）実施例５ 久に記する事項以外は実施例４と同様にして培養実験を
行なった。

細胞：マウスミエローマＰ３Ｕ１とヒトＢセルを融合し
て得られたヒ）　ＩＪ、ＩＧ産生マウス・ヒトハイブリ
ドーマＣ４１−２−１株 培地：　ＩＴｇＳ　＋　ｅＲＤＦ　Ｋ分子麓約４万の人
工ポリマー ＷＡＫＯＰｕｒｅｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＬＴＤ　ＩＩで
あるＮｏ１ｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ　Ｋ３
０（ＣＨｖＣＨＮＣＯＣＨｔＣＨｔＣＨｔ）ｎを添加し
たもの。

実験結果を第５表に示す。

第５表 細胞　マウス・ヒトへイグリドーマ　Ｃ４１−２−１株
培地　ａ−５ＩＴＥＳ＋ｅＲＤＦ　　　　　　Ｉ：９μ
＆／１１７　Ｔ：１０μＪ／／’＋ＰＶＰＫ３００．１
％（ｗ／ｖ） β−５ＩＴＥＳ＋ｅＲＤＦ　　　　　Ｉ：０，４５μ＃
／”　Ｔ：０．５μＪｉ’／１１＋７＋ＰＶＰＫ３００
，００５％（Ｗ／Ｙ）使用限外ｆ過膜：ミリポ７社製　
ＰＳＡＣＯＬＣ０５（分子量分画１０．０００　）実施
例６ 培地以外は実施例４と同様にして培養実験な行った。実
験結果を第６表に示す。

第６表 細胞　　マウス・ヒトハイブリドーマ　８２株培地　ａ
−６：ＩＴＥＳ＋ＢＳＡ（牛血清フルグミｙ）＋ｅＲＤ
ＦＩ　：　９　ｐｉ／ＩＬＩ　′ｒ：１０　ｐｉ／ｄ　
ＢＳＡ：５１４１／ａ／β−６：　ＩＴｇＳ＋ＢＳＡ＋
ｅＲＤＦＩ：２μＪｉ／ＩＩＴ：０．５μｌ／Ｉｔ　Ｂ
ＳＡ：０．２５ダ／ｄ使用限外−過膜：ミリボア社ｍｌ
　　ＰＳＡＣＯＬＣ０５（分子量分画１０．０００）比
較例１ 培地循環を行わず使用培地は常にα−６を用いた以外は
実施例６と同じ条件で培養を行った結果を第７ｖｋに示
す。

第　７１に 比較例２ 使用培地を培養開始１４日目以降β−６に切換える以外
は比較例１と同じ条件で培養を行ったｔｓ釆を第８表に
示す。

第　８　表 培地なβ−６に切換えた後、生細胞は時間とともに減少
し、２２日目には１０’　ｃｅｌｌｓ　／ｄ以下となっ
たので培養を中止した。

実施例７ 細胞以外は実施例６と同様にして培養実験を行った。実
１ＩＩＩ超米を第９表に示す。本実施例で使用したＶ−
６株はマウス・ミエローマＰ３（Ｊ１株とｋ）Ｂセルを
融合し℃得られたＩ９Ｇ抗体産生株である。

第９表 期細書の浄書（内容に変更なし）

【図面の簡単な説明】

添付第１図は本発明の培養方法を実施する工程の概略図
を示したものである。 ｍｌ　　図 手　続　ネ甫　正　書　（方式） 昭和６１年ん月ゐＥｌ ！時言午庁長宮殿 １、事件の表示 特願昭　６１　　　１１３４６６　　Ｎ２、発明の名称 増殖性動物細胞を培養して有用な高分子物質を生産する
方法および培養システム

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）増殖性動物細胞をサスペンジョン状態で培養
   して該増殖性動物細胞が産生する有用 な高分子量物質と該増殖性動物細胞を含有 するサスペンジョン培養混合液を形成する 培養工程； （Ｂ）該サスペンジョン培養混合液から該動物細胞と分
   離して培養液を取り出す分離工程；（Ｃ）該動物細胞と
   分離された該培養液から、上記有用な高分子物質と異な
   る該動物細胞 の代謝産物である該動物細胞の生青阻害低 分子量物質を除去する除去工程； （Ｄ）生育阻害低分子量物質を除去された培養液の一部
   又は全部を上記培養工程（Ａ）に循環する循環工程；お
   よび （Ｅ）本培養系に蓄積された上記有用な高分子量物質を
   回収する回収工程、 からなる増殖性動物細胞を培養して有用な高分子量物質
   を生産する方法。 ２、上記増殖性動物細胞がハイブリドーマである第１項
   記載の方法。 ３、上記（Ｂ）の分離工程が重力沈降、遠心沈降又はろ
   過によって実施される第１項記載の方法。 ４、上記（Ｃ）の除去工程が限外ろ過、透析又は吸着に
   よって実施される第１項記載の方法。 ５、上記（Ｃ）の除去工程における増殖性動物細胞の生
   育阻害低分子量物質の分子量は高々１万である第１項記
   載の方法。 ６、増殖性動物細胞がサスペンジョン培養混合液中に分
   子量１万を超える有用な高分子量物質を産生し、そして
   上記（Ｃ）の除去工程において得られる培養液として該
   高分子量物質を含有する培養液を生成せしめる第１項記
   載の方法。 ７、上記高分子量物質が蛋白質である第６項記載の方法
   。 ８、上記高分子量物質が免疫グロブリンである第６項記
   載の方法。 ９、上記高分子量物質が免疫グロブリンＧ （ＩｇＧ）である第６項記載の方法。 １０、上記高分子量物質がヒト免疫グロブリンである第
   ６項記載の方法。 １１、増殖性動物細胞を含むサスペンジョン培養混合液
   が血清を実質的に含有しない第１項記載の方法。 １２、増殖性動物細胞を含むサスペンジョン培養混合液
   が該動物細胞の成長を促進する物質を含有する第１項記
   載の方法。 １３、増殖性動物細胞を含むサスペンジョン培養混合液
   が該動物細胞の成長を促進する物質を含有し、そして上
   記（Ｃ）の除去工程において得られる培養液として該成
   長促進物質を含有する培養液を生成せしめる第１項記載
   の方法。 １４、増殖性動物細胞を含むサスペンジョン培養混合液
   が該動物細胞の成長を促進する物質を含有し、該動物細
   胞が培養液中に分子量１万を超える有用な高分子量物質
   を産生し、そして上記（Ｃ）の除去工程において得られ
   る培養液として該成長促進物質と該有用な高分子量物質
   を含む培養液を生成する第１項記載の方法。 １５、上記成長促進物質がトランスフェリン、インシュ
   リン、アルブミン、エタノールアミン又はセレン化合物
   である第１２項記載の方法。 １６、上記成長促進物質がトランスフェリン、アルブミ
   ン又はインシュリンである第１３項記載の方法。 １７、増殖性動物細胞を培養槽中にてサスペンジョン状
   態で培養するための培養システムであって、 （１）有用な高分子量物質を産生しうる増殖性動物細胞
   をサスペンジョン培養するための 培養槽、 （２）増殖性動物細胞を含むサスペンジョン培養液から
   該動物細胞と分離して培養液を取 り出すための分離手段、 （３）増殖性動物細胞と分離された培養液を、該培養液
   から該培養液に含まれる該動物細 胞の代謝産物である該動物細胞の生育阻害 低分子量物質を除去するための除去手段に 送るための輸送手段、 （４）上記除去手段、 （５）生育阻害低分子量物質を除去された培養液を培養
   槽へ循環輸送するための手段、 および （６）有用な高分子量物質を回収するために、このシス
   テムから培養液を抜き取るための 手段 からなる該培養システム。