JPS62265982A - 一次細胞の不滅化法 - Google Patents
一次細胞の不滅化法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は腫瘍誘発性ＤＮＡを一次細胞（ｐ ｒ ｉｍａ
ｒｙｃｅｌｌ） に与える技術としＣエレクトロポレー
ション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ）を用いで
かかる細胞を腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でトラ
ンスフェクトすることによる不滅化一次細胞の産生法に
関する。
ｒｙｃｅｌｌ） に与える技術としＣエレクトロポレー
ション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ）を用いで
かかる細胞を腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でトラ
ンスフェクトすることによる不滅化一次細胞の産生法に
関する。
発明の背景
ＤＮＡを暉乳動物細胞に入れるトランスフェクションは
遺伝子の発現および調節の研究に重要な寄与をしできた
。この技術はそれに対し分子プローブが利用できない新
しい遺伝子の発見に貢献しできた。遺伝子を細胞に導入
するのに用いる種々の方法は天然のものおよび人工的な
ものの２つの系統に分けることができる。
遺伝子の発現および調節の研究に重要な寄与をしできた
。この技術はそれに対し分子プローブが利用できない新
しい遺伝子の発見に貢献しできた。遺伝子を細胞に導入
するのに用いる種々の方法は天然のものおよび人工的な
ものの２つの系統に分けることができる。
「天然の」トランスフェクションは無傷の（または遺伝
子操作をした）ウィルスで細胞を感染させることによっ
て達成される。ウィルスからの遺伝情報（ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ ）は宿主細胞ＤＮＡに一体化でき、その結果、宿主
細胞の形質転換が起こＤＮＡの「人工的／、ｌ’ Ｊ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 操作および異なる起源の無傷細胞へ
のその導入は、通常、化学的方法または乎で行う方法の
いずれか（こよって達成される。いくつかの技術がＤＮ
Ａを体細胞中に導入するために開発されできた。これら
の技術は高分子を受容体細胞へ与える仕方に応じて５つ
のタイプに分けられる： １、マイクロインジェクション〔ブレスマンら（Ｇｒａ
ｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ 、 ）、ホペーセイレルズ
ーツアイトシュリフト・フィール・フイジオロギイッシ
エ・ヘミ−（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ ＺＰｈ
ｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、 ３５２ 、５２７〜
５３２、（１９７１）：カペッキイ（ｃａｐｅｃｃｈｉ
）、セル（ｃｅｌｌ ）、２２．４７０〜４８８ （
１９８０） ）２、ビヒクル介在転移 一赤血球ゴースト〔フルサワら（Ｆｕｒｕｓａｗａｅｔ
ａｌ、）、メンツズ・イン・セル・バイオロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）、 １４゜
１７〜８０ 、（１９７６） Ｊ −リポソーム〔ポステら（Ｐｏｓｉｅ ｅｔ ａｌ、）
。
子操作をした）ウィルスで細胞を感染させることによっ
て達成される。ウィルスからの遺伝情報（ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ ）は宿主細胞ＤＮＡに一体化でき、その結果、宿主
細胞の形質転換が起こＤＮＡの「人工的／、ｌ’ Ｊ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 操作および異なる起源の無傷細胞へ
のその導入は、通常、化学的方法または乎で行う方法の
いずれか（こよって達成される。いくつかの技術がＤＮ
Ａを体細胞中に導入するために開発されできた。これら
の技術は高分子を受容体細胞へ与える仕方に応じて５つ
のタイプに分けられる： １、マイクロインジェクション〔ブレスマンら（Ｇｒａ
ｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ 、 ）、ホペーセイレルズ
ーツアイトシュリフト・フィール・フイジオロギイッシ
エ・ヘミ−（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ ＺＰｈ
ｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、 ３５２ 、５２７〜
５３２、（１９７１）：カペッキイ（ｃａｐｅｃｃｈｉ
）、セル（ｃｅｌｌ ）、２２．４７０〜４８８ （
１９８０） ）２、ビヒクル介在転移 一赤血球ゴースト〔フルサワら（Ｆｕｒｕｓａｗａｅｔ
ａｌ、）、メンツズ・イン・セル・バイオロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）、 １４゜
１７〜８０ 、（１９７６） Ｊ −リポソーム〔ポステら（Ｐｏｓｉｅ ｅｔ ａｌ、）
。
メンツズ・イン・セル・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 ）、 １４．３３〜７
１、 （１９７６） ： グレゴリアゾイスら（Ｇｒ
ｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ、 ）、 ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ ）、２４４．１７０〜１７２、（１
９７３）Ｊ −復元仙台ウイルスエンベロープ 〔ロイターら（Ｌｏｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）、
エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ。
ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 ）、 １４．３３〜７
１、 （１９７６） ： グレゴリアゾイスら（Ｇｒ
ｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ、 ）、 ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ ）、２４４．１７０〜１７２、（１
９７３）Ｊ −復元仙台ウイルスエンベロープ 〔ロイターら（Ｌｏｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）、
エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ。
Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、 ）、１３９，２２３〜２３４
（１９８３）］ ３、促進剤の助けによる転移 一リン酸カルシウム〔グラハムら（Ｇｒａｈａｍｅｔ
ａｌ、）、ピロロジー（ＶｉｒｏｌＯｇｙ） 。
（１９８３）］ ３、促進剤の助けによる転移 一リン酸カルシウム〔グラハムら（Ｇｒａｈａｍｅｔ
ａｌ、）、ピロロジー（ＶｉｒｏｌＯｇｙ） 。
５２．４５６〜４６７、（１９７３） 〕−リン酸カル
シウム／ポリエチレングリコール−ＤＭＳＯショック〔
ヨナークら（ Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｌ、）、 「モノクローナル・ア
ンテイボデイス・アンド・ファンクショナル・セル・ラ
イング（ＭｏｎｏｃｌｏｍａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅ１ｌＬｉｎｅｓ
） （プログレス・アンド・アプリケーションズ（Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ）
） Ｊ、プレラム、プレス（Ｐｌｅｒｕｍ Ｐｒｅｓｓ
） 、 ４１８〜４２２ 。
シウム／ポリエチレングリコール−ＤＭＳＯショック〔
ヨナークら（ Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｌ、）、 「モノクローナル・ア
ンテイボデイス・アンド・ファンクショナル・セル・ラ
イング（ＭｏｎｏｃｌｏｍａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅ１ｌＬｉｎｅｓ
） （プログレス・アンド・アプリケーションズ（Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ）
） Ｊ、プレラム、プレス（Ｐｌｅｒｕｍ Ｐｒｅｓｓ
） 、 ４１８〜４２２ 。
（１９８４’）Ｅ
−ＤＥＡＥ−デキストラン〔グラハム（Ｇｒａｈａｍ
） 、 アドバーンシズ・イン・キャンサー・リサーチ
（Ａｄｖ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、） 。
） 、 アドバーンシズ・イン・キャンサー・リサーチ
（Ａｄｖ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、） 。
２５．１〜５１、（１９７７）Ｊ
−、ｆ？ソリエチレングリコールスクロースショック〔
チューら（ｃｈｕ ｅｔ ａｌ、 ）、ジーン（Ｇｅｎ
ｅ ） 、 １３，１９７〜２０２．（ｔｃ＋５ＤＪ４
、レーザーマイクロビーム〔ツカコシラ（Ｔｓｕｋａｋ
ｏｓｈｉ ｅｔ ａｔ、 ）、アプライド・フイジイツ
クス・ビイ（Ａｐｐｌｉｅｃｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｂ。
チューら（ｃｈｕ ｅｔ ａｌ、 ）、ジーン（Ｇｅｎ
ｅ ） 、 １３，１９７〜２０２．（ｔｃ＋５ＤＪ４
、レーザーマイクロビーム〔ツカコシラ（Ｔｓｕｋａｋ
ｏｓｈｉ ｅｔ ａｔ、 ）、アプライド・フイジイツ
クス・ビイ（Ａｐｐｌｉｅｃｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｂ。
）、３５．２２８４〜２２８９、（１９８４）Ｊ５、エ
レクトロポレーション〔ノイマンラ（Ｎｅｕｍａｎｎ
ｅｔ ａｌ、 ）、 ｊ−アローピーアン。
レクトロポレーション〔ノイマンラ（Ｎｅｕｍａｎｎ
ｅｔ ａｌ、 ）、 ｊ−アローピーアン。
モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション・
ジャーナル（Ｅｍｂｏ Ｊ、）、 １ ．８４１〜８４
５．（１９８２）：ボッターら（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ
ａｔ、 ）、 プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）。
ジャーナル（Ｅｍｂｏ Ｊ、）、 １ ．８４１〜８４
５．（１９８２）：ボッターら（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ
ａｔ、 ）、 プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）。
ＵＳＡ、８１．７１６１〜７１６５． （１９８４）〕
これらの技術はＤＮＡ、ＲＮＡ、 蛋白質、脂質。
薬剤、小さな分子ならびに小器官およびウィルス粒子を
体細胞に導入するのに用いられてきた。これらの技術の
１つ１つには各々、限界があり、ある種の生物学的問題
はある１つの方法を用いて最善ｊこアプローチされる。
体細胞に導入するのに用いられてきた。これらの技術の
１つ１つには各々、限界があり、ある種の生物学的問題
はある１つの方法を用いて最善ｊこアプローチされる。
ＤＮＡ−介在遺伝子転移は、通常、リン酸カルシウム−
ＤＮＡ沈降法の種々の修正法によつＣ達成される。この
方法はＤＮＡリン酸カルシウム共沈降体の形成（４５分
）および受容体細胞と該共沈扉体とを一緒に行う時間の
かかるインキュベーション（２時間）を必要とする。次
いで、エンドシト−シス様の方法を介して該沈降体を取
り込む〔ロイターら（Ｌｏｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）
、シバ・ファウンド・シンプ（ｃ１ｂａ Ｆｏｕｎｄ
、 Ｓｙｍｐ、） 、１（１１）．１６３〜１７５ （
１９８２）］。この技術は細胞内取込能力を有する線維
芽細胞由来の特異的細胞の使用を必要とし、かくしてそ
の適用には限界がある。
ＤＮＡ沈降法の種々の修正法によつＣ達成される。この
方法はＤＮＡリン酸カルシウム共沈降体の形成（４５分
）および受容体細胞と該共沈扉体とを一緒に行う時間の
かかるインキュベーション（２時間）を必要とする。次
いで、エンドシト−シス様の方法を介して該沈降体を取
り込む〔ロイターら（Ｌｏｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）
、シバ・ファウンド・シンプ（ｃ１ｂａ Ｆｏｕｎｄ
、 Ｓｙｍｐ、） 、１（１１）．１６３〜１７５ （
１９８２）］。この技術は細胞内取込能力を有する線維
芽細胞由来の特異的細胞の使用を必要とし、かくしてそ
の適用には限界がある。
種々の細胞タイプはそれらがトランスフェクトされるこ
とに関する特異的効率を有する。これらの差異にかかわ
らず、多種類の細胞タイプがトランスフェクションに成
功しで用いられできたつこれらはリン酸カルシウムＤＮ
Ａ−共沈外／ポリエチレングリコール−Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ
技術によっで懸局液中でトランスフェクトされたリンパ
球様の正常細胞を包含する（ヨナークら（Ｊｏｎａｋ
ｅｔ ａ！、）。
とに関する特異的効率を有する。これらの差異にかかわ
らず、多種類の細胞タイプがトランスフェクションに成
功しで用いられできたつこれらはリン酸カルシウムＤＮ
Ａ−共沈外／ポリエチレングリコール−Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ
技術によっで懸局液中でトランスフェクトされたリンパ
球様の正常細胞を包含する（ヨナークら（Ｊｏｎａｋ
ｅｔ ａ！、）。
バイブリド−７（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ）、 ３．１
０７〜１１８ （１９８４））。
０７〜１１８ （１９８４））。
従前の実験（ヨナークら（Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｔ、）
。
。
バイブリド−７（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ）、前掲）によ
り。
り。
リン酸カルシウムＤＮＡ−共沈外／ポリエチレングリコ
ール−ＤＭＳＯ介在転移によるヒト白血病細胞から単離
したＤＮＡの、刺激された一次マウスリンパ球への導入
Ｃζよって培地中で継続的ｌこ増殖する能力を有する細
胞系を産生できることが証明されている。従つζ、かか
る付与技術による腫瘍誘発性ＤＮＡでの正常な、刺激さ
れたリンパ球ノトランスフエクションはマウスリンパ［
−、？４化し、次いて培地中でこれらの細胞を継続的に
維持する新しい方法であることが示された。かかる新し
い細胞系（不滅化マウスリンパ球）は単クローン形態の
それらの産生物を産生ずるであろう。
ール−ＤＭＳＯ介在転移によるヒト白血病細胞から単離
したＤＮＡの、刺激された一次マウスリンパ球への導入
Ｃζよって培地中で継続的ｌこ増殖する能力を有する細
胞系を産生できることが証明されている。従つζ、かか
る付与技術による腫瘍誘発性ＤＮＡでの正常な、刺激さ
れたリンパ球ノトランスフエクションはマウスリンパ［
−、？４化し、次いて培地中でこれらの細胞を継続的に
維持する新しい方法であることが示された。かかる新し
い細胞系（不滅化マウスリンパ球）は単クローン形態の
それらの産生物を産生ずるであろう。
ボッターら（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ、 ） 、前掲
、およびセリス、（ｃｅｌｉｓ）、バイオケミカル・ジ
ャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ） 、 ２２３
、２８１〜２９１、（１９８４）はエレクトロポレーシ
ョンによってマウスのプレＢ細胞および線維芽細胞に導
入されたクローン化ヒトおよびマウスＩｇｋ 遺伝子
の発現（ごついて研究し、かかる方法は伝統的な方法で
は扱いにくいものも包含する多くの細胞に適用できるこ
とを開示した。
、およびセリス、（ｃｅｌｉｓ）、バイオケミカル・ジ
ャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ） 、 ２２３
、２８１〜２９１、（１９８４）はエレクトロポレーシ
ョンによってマウスのプレＢ細胞および線維芽細胞に導
入されたクローン化ヒトおよびマウスＩｇｋ 遺伝子
の発現（ごついて研究し、かかる方法は伝統的な方法で
は扱いにくいものも包含する多くの細胞に適用できるこ
とを開示した。
パン・プラント（Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ ） 、バイオテ
クノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｔｏｇｙ ） 、
３ ％１８７〜１９１（１９８５）は電場中で細胞を融
合する新しい方法を総括し、テクニクローン（Ｔｅｃｈ
ｎｉｃｌｏｎｅにおいてルングツク（Ｌｕｎｄａｋ ）
および彼の同僚がヒト悪性腫瘍細胞からｍｙｃ遺伝子を
単離し。
クノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｔｏｇｙ ） 、
３ ％１８７〜１９１（１９８５）は電場中で細胞を融
合する新しい方法を総括し、テクニクローン（Ｔｅｃｈ
ｎｉｃｌｏｎｅにおいてルングツク（Ｌｕｎｄａｋ ）
および彼の同僚がヒト悪性腫瘍細胞からｍｙｃ遺伝子を
単離し。
それをクローンし、それをプラスミド中に挿入し、高電
圧電気パルスを用いて抗体を産生ずるヒトリンパ球を該
プラスミドでトランスフェクトしで少くとも８力月間安
定であったヒト細胞系を産生じたことを述べＣいる。該
パン・プラント（ＶａｎＢｒｕｎｔ ） の文献によ
っては当業者はルンダツク（Ｌｕｎｄａｋ ）の実験を
追試できない。何故ならば。
圧電気パルスを用いて抗体を産生ずるヒトリンパ球を該
プラスミドでトランスフェクトしで少くとも８力月間安
定であったヒト細胞系を産生じたことを述べＣいる。該
パン・プラント（ＶａｎＢｒｕｎｔ ） の文献によ
っては当業者はルンダツク（Ｌｕｎｄａｋ ）の実験を
追試できない。何故ならば。
（ａ）何ボルトのパルスを用いなければならないか、（
ｂ） トランスフェクションに先立つでかかる細胞は「
活性化／刺激されＣいなければならないか否か、（ｃ）
パルス処理直前に細胞およびプラスミドをどのような・
状態にしでおくのか、（ｄ）何回パルスを与えるべきな
のか、（ｅ）各パルスの適当な長さおよび振幅、（ｆ）
細胞および陣Ｅｈ誘発性ＤＮＡの適当なａ度、（ｇ）用
いたｒｍｙｃＪ 遺伝子の性質および由来、および（
ｈ）かかる細胞を培地中で増殖し、その増殖を無間隔に
維持する組織培養条件が開示されていζいからである。
ｂ） トランスフェクションに先立つでかかる細胞は「
活性化／刺激されＣいなければならないか否か、（ｃ）
パルス処理直前に細胞およびプラスミドをどのような・
状態にしでおくのか、（ｄ）何回パルスを与えるべきな
のか、（ｅ）各パルスの適当な長さおよび振幅、（ｆ）
細胞および陣Ｅｈ誘発性ＤＮＡの適当なａ度、（ｇ）用
いたｒｍｙｃＪ 遺伝子の性質および由来、および（
ｈ）かかる細胞を培地中で増殖し、その増殖を無間隔に
維持する組織培養条件が開示されていζいからである。
発明の開示
本発明は。
（ａ）正常な、活性化／刺激された一次細胞を供し；
（ｂ）エレクトロポレーションによって腫瘍誘発性ＤＮ
Ａ／腫瘍誘発遺伝子でかかる一次細胞をトランスフェク
トしてトランスフェクトされた一次細胞を産生し：次い
で （ｃ）かかるトランスフェクトされた一次細胞から不滅
化一次細胞系を回収することを特徴とする不滅化一次細
胞系の産生法を提供するものである。
Ａ／腫瘍誘発遺伝子でかかる一次細胞をトランスフェク
トしてトランスフェクトされた一次細胞を産生し：次い
で （ｃ）かかるトランスフェクトされた一次細胞から不滅
化一次細胞系を回収することを特徴とする不滅化一次細
胞系の産生法を提供するものである。
前記工程（ｂ）で一次細胞をトランスフェクトするのに
用いる腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子は、所望によ
り、エレクトロポレーションによるトランスフェクショ
ンに先立ってリポソームに含ませＣもよい。
用いる腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子は、所望によ
り、エレクトロポレーションによるトランスフェクショ
ンに先立ってリポソームに含ませＣもよい。
また１本発明はこの方法によって産生される不滅化一次
細胞系を提供するものである。
細胞系を提供するものである。
また、本発明は生物学的産生物の産生を可能とする条件
下で細胞系を培養することを特徴とするそのコーディン
グ配列が本発明の不滅化一次細胞系内に含有されるＤＮ
Ａからなる生物学的産生物の産生法を提供するものであ
る。「コーディング配列」なる語は本発明の不滅化一次
細胞系を調製するのに用いる正常な、活性化／刺激され
た一次細胞のＤＮＡ内で天然に見い出されるコーディン
グ配列ならびに本発明の方法で用いるＮＣｒ誘発性ＤＮ
Ａ／腫瘍誘発遺伝子に含まれるコーディング配列を包含
する。
下で細胞系を培養することを特徴とするそのコーディン
グ配列が本発明の不滅化一次細胞系内に含有されるＤＮ
Ａからなる生物学的産生物の産生法を提供するものであ
る。「コーディング配列」なる語は本発明の不滅化一次
細胞系を調製するのに用いる正常な、活性化／刺激され
た一次細胞のＤＮＡ内で天然に見い出されるコーディン
グ配列ならびに本発明の方法で用いるＮＣｒ誘発性ＤＮ
Ａ／腫瘍誘発遺伝子に含まれるコーディング配列を包含
する。
また１本発明は、
（ａ）正常な、活性化／刺激された一次細胞を供し；
（ｂ）エレクトロポレーションによっでｍａ誘発性ＤＮ
Ａ／１ｉｌｉ誘発遺伝子および外来の機能性ＤＮＡ配列
でかかる一次細胞を共トランスフェクトして共トランス
フェクトされた一次細胞を産生し：次いで （ｃ）かかる共トランスフェクトされた一次細胞から外
来の機能性ＤＮＡ配列を含有する共トランスフェクトさ
れた不滅化一次細胞系を回収することを特徴とする外来
の機能性ＤＮＡ配列を含有すル共トランスフェクトされ
た不滅化一次細胞系の産生法を提供するものであろう また１本発明はこの方法によって産生される共トランス
フェクトされた不滅化一次細胞系を提供するものである
。
Ａ／１ｉｌｉ誘発遺伝子および外来の機能性ＤＮＡ配列
でかかる一次細胞を共トランスフェクトして共トランス
フェクトされた一次細胞を産生し：次いで （ｃ）かかる共トランスフェクトされた一次細胞から外
来の機能性ＤＮＡ配列を含有する共トランスフェクトさ
れた不滅化一次細胞系を回収することを特徴とする外来
の機能性ＤＮＡ配列を含有すル共トランスフェクトされ
た不滅化一次細胞系の産生法を提供するものであろう また１本発明はこの方法によって産生される共トランス
フェクトされた不滅化一次細胞系を提供するものである
。
また、本発明は生物学的産生物の産生を可能とする条件
下で細胞系を培養することを特徴とするその「コーディ
ング配列」が本発明の共トランスフェクトされた不滅化
一次細胞系内（こ含有されるＤＮＡからなる生物学的産
生物の産生法を提供するものである。
下で細胞系を培養することを特徴とするその「コーディ
ング配列」が本発明の共トランスフェクトされた不滅化
一次細胞系内（こ含有されるＤＮＡからなる生物学的産
生物の産生法を提供するものである。
「コーディング配列」ζる語は本発明の方法でトランス
フェクションに用いる腫瘍誘発性ＤＮＡ／＠瘍誘発遺伝
子に含まれる外来の酸痛性ＤＮＡ配列のコーディング配
列、ならびに本発明の共トランスフェクトされた不滅化
一次細胞系を調製するのにＤＮＡ受容体としで用いる正
常な、活性化７／′刺激された一次細胞のＤＮＡ内で［
天然に見い出されるＪ ＤＮＡコーデイノグ配列を包含
する。
フェクションに用いる腫瘍誘発性ＤＮＡ／＠瘍誘発遺伝
子に含まれる外来の酸痛性ＤＮＡ配列のコーディング配
列、ならびに本発明の共トランスフェクトされた不滅化
一次細胞系を調製するのにＤＮＡ受容体としで用いる正
常な、活性化７／′刺激された一次細胞のＤＮＡ内で［
天然に見い出されるＪ ＤＮＡコーデイノグ配列を包含
する。
また、本発明はかかる不滅化が実質的に、腫瘍誘発遺伝
子よりなるＤＮＡでの正常な一次細胞のトランスフェク
ションの結果である場合の不滅化一次細胞系を提供する
ものである。
子よりなるＤＮＡでの正常な一次細胞のトランスフェク
ションの結果である場合の不滅化一次細胞系を提供する
ものである。
前記工程（ｂ）で一次細胞をトランスフェクトするのに
用いる腫瘍誘発性ＤＮＡおよび外来の機能性ＤＮＡは、
所望により、エレクトロポレーションによるトランスフ
ェクションに先立ってリポソームに含ませてもよい。
用いる腫瘍誘発性ＤＮＡおよび外来の機能性ＤＮＡは、
所望により、エレクトロポレーションによるトランスフ
ェクションに先立ってリポソームに含ませてもよい。
発明の詳説
ヨナークら（Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｌ、 ） 、バイブ
リド−？ （Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ）、３．１０７〜１
１８ （１９８４）はリン酸カルシウムＤＮＡ−共沈外
／ポリエチレングリコールーＤＭＳＯ介在送達によるヒ
ト白血病細胞からのＤＮＡの、刺激されたマウスリンパ
球への導入によって、培地中で継続的に増殖する能力を
持つ細胞系を産生できることを報告している。今や、か
かる細胞の不滅化を実行するためのリンパ球を包含する
免疫細胞の如き一次細胞の。
リド−？ （Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ）、３．１０７〜１
１８ （１９８４）はリン酸カルシウムＤＮＡ−共沈外
／ポリエチレングリコールーＤＭＳＯ介在送達によるヒ
ト白血病細胞からのＤＮＡの、刺激されたマウスリンパ
球への導入によって、培地中で継続的に増殖する能力を
持つ細胞系を産生できることを報告している。今や、か
かる細胞の不滅化を実行するためのリンパ球を包含する
免疫細胞の如き一次細胞の。
腫瘍誘発性ＤＮＡでのトランスフェクションはかかるＤ
ＮＡを細胞中に与えるのに用いる方法、受容体細胞の機
能状態および不滅化を行うのＣご用いる腫瘍誘発性ＤＮ
Ａ源に依存することが見い出された。例えば １３１Ｊ
ンパ球が共沈外体と共にインキュベートされ、ＤＮＡの
侵入がポリエチレングリコール−ＤＭＳＯショック処理
によって促進されるリン酸カルシウムＤＮＡ共沈降法（
ヨナークら（Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｌ、 ）、 ハイブ
リドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ） 、前掲）はかかる
細胞を不滅化しようとする腫瘍誘発性ＤＮＡの１種々の
一次免疫細胞（すζわち、造血起源の細胞）中へのトラ
ンスフェクションに用いられた。この試みは不滅化細胞
系を産生ずる実施においで、ランダムに成功したに過ぎ
なかった。さらに、該リン酸カルシウムーＤＮＡ共沈降
法は受容体細胞の性質に関する限界をさらに持っている
。例えば、（エンドシト−シス能力を有するマクロファ
ージおよび線維芽細胞起源のある種の細胞以外の）一次
細胞は食作用がす＜、従ってリン酸カルシウム−ＤＮＡ
共沈降体の取込はこれらの細胞中へのＤＮＡ導入の非常
に効果的な方法ではない。また、リン酸カルシウム−Ｄ
Ｎ Ａ共沈降法のもう１つの限界は、それが情度を要
し、かつこれらの細胞の活性に直接の影響を持ち、かか
る方法のトランスフェクション効果に干渉する高濃度塩
に一次免疫細胞を暴露することを含むこと（こある。
ＮＡを細胞中に与えるのに用いる方法、受容体細胞の機
能状態および不滅化を行うのＣご用いる腫瘍誘発性ＤＮ
Ａ源に依存することが見い出された。例えば １３１Ｊ
ンパ球が共沈外体と共にインキュベートされ、ＤＮＡの
侵入がポリエチレングリコール−ＤＭＳＯショック処理
によって促進されるリン酸カルシウムＤＮＡ共沈降法（
ヨナークら（Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｌ、 ）、 ハイブ
リドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ） 、前掲）はかかる
細胞を不滅化しようとする腫瘍誘発性ＤＮＡの１種々の
一次免疫細胞（すζわち、造血起源の細胞）中へのトラ
ンスフェクションに用いられた。この試みは不滅化細胞
系を産生ずる実施においで、ランダムに成功したに過ぎ
なかった。さらに、該リン酸カルシウムーＤＮＡ共沈降
法は受容体細胞の性質に関する限界をさらに持っている
。例えば、（エンドシト−シス能力を有するマクロファ
ージおよび線維芽細胞起源のある種の細胞以外の）一次
細胞は食作用がす＜、従ってリン酸カルシウム−ＤＮＡ
共沈降体の取込はこれらの細胞中へのＤＮＡ導入の非常
に効果的な方法ではない。また、リン酸カルシウム−Ｄ
Ｎ Ａ共沈降法のもう１つの限界は、それが情度を要
し、かつこれらの細胞の活性に直接の影響を持ち、かか
る方法のトランスフェクション効果に干渉する高濃度塩
に一次免疫細胞を暴露することを含むこと（こある。
エレクトロポレーションが、造血および非造血両起源の
正常な、活性化／刺激された一次細胞を腫瘍誘発性ＤＮ
Ａ／腫瘍誘発遺伝子で効果的にトランスフェクトして不
滅化一次細胞系を効果的に得るのに信頼しで用いること
ができるこ吉を見い出した。また、エレクトロポレーシ
ョンが、造血シトして不滅化一次細胞系を効率的に得る
のに信頼して用いることができることを見い出した。
正常な、活性化／刺激された一次細胞を腫瘍誘発性ＤＮ
Ａ／腫瘍誘発遺伝子で効果的にトランスフェクトして不
滅化一次細胞系を効果的に得るのに信頼しで用いること
ができるこ吉を見い出した。また、エレクトロポレーシ
ョンが、造血シトして不滅化一次細胞系を効率的に得る
のに信頼して用いることができることを見い出した。
「一次細胞」なる語は以前に組織培養を経ていない、あ
るいは以前に組織培養を経Ｃいるが無期限に組織培養を
経ることができない生きた生物体を意味する。好ましい
一次細胞は造血起源のもの、特に多潜能幹細胞 ３１Ｊ
ンパ球、Ｂ系統前駆体。
るいは以前に組織培養を経Ｃいるが無期限に組織培養を
経ることができない生きた生物体を意味する。好ましい
一次細胞は造血起源のもの、特に多潜能幹細胞 ３１Ｊ
ンパ球、Ｂ系統前駆体。
’ｌ’ リンパ球、Ｔ系統前駆体、骨髄幹細胞、単球、
マクロファージ、好中球、好エオシン球、巨大核細胞、
および肥絆細胞である。かかる細胞は常法によっで単離
できる。
マクロファージ、好中球、好エオシン球、巨大核細胞、
および肥絆細胞である。かかる細胞は常法によっで単離
できる。
「不滅化一次細胞」なる語は本発明の方法によるトラン
スフェクションの結果、継続的に増殖スるが、かかるト
ランスフェクションナくシではそのように増殖しない一
次細胞を意味する。
スフェクションの結果、継続的に増殖スるが、かかるト
ランスフェクションナくシではそのように増殖しない一
次細胞を意味する。
「正常一次細胞」なる語は、もしかかる正常一次細胞が
まず活性化／刺激されたならば不滅化できるようにする
こ乏がてきる未不滅化一次細胞を意味する。「活性化／
刺激された一次細胞」なる語は本発明の方法により不滅
化をすることができるよう番こされた正常一次細胞を意
味する。かかる活性化／刺激された一次細胞はかかる細
胞を刺激／活性化剤に暴露することによつＣ調製できる
。
まず活性化／刺激されたならば不滅化できるようにする
こ乏がてきる未不滅化一次細胞を意味する。「活性化／
刺激された一次細胞」なる語は本発明の方法により不滅
化をすることができるよう番こされた正常一次細胞を意
味する。かかる活性化／刺激された一次細胞はかかる細
胞を刺激／活性化剤に暴露することによつＣ調製できる
。
「刺激／活性化剤」ζる語は該正常一次細胞を（制限さ
れた寿命で）増殖するように刺激する剤を意味する。か
かる剤は当該分野においてよく知られている。活性化／
刺激された一次細胞の調製は当１咳分野；こおいてよく
知られている。好ましくは、該刺激／活性化剤は、また
、正常一次細胞を刺激して分化させる。正常Ｂ細胞を活
性化／刺激するのに用いるべき適当な刺激／活性化剤は
抗原、マイトジェンおよび発育因子を包含する。本発明
の不滅化一次細胞系による特異釣車クローン抗体の産生
が所望される場合、公知の抗原を刺激／活性化剤として
用いるべきである。例えば、活性化／刺激された１３１
Ｊンパ球は抗原によつＣ攻撃されかつ抗体を産生ずる細
胞に分化したリンパ球であり、該抗体とは攻撃する抗原
の１の抗原決定基（こついて特異的なものである。かか
る活性化／′刺激された１３１Ｊンパ球は本発明の方法
Ｇこよって不滅化が可能である。Ｂ細胞以外の正常一次
細胞を活性化／刺激するの；こ用いるべき適当なｉ１１
激／活性化剤はマイトジェンおよび発育因子を包含する
。マイトジェンは当該分野においでよく知られている。
れた寿命で）増殖するように刺激する剤を意味する。か
かる剤は当該分野においてよく知られている。活性化／
刺激された一次細胞の調製は当１咳分野；こおいてよく
知られている。好ましくは、該刺激／活性化剤は、また
、正常一次細胞を刺激して分化させる。正常Ｂ細胞を活
性化／刺激するのに用いるべき適当な刺激／活性化剤は
抗原、マイトジェンおよび発育因子を包含する。本発明
の不滅化一次細胞系による特異釣車クローン抗体の産生
が所望される場合、公知の抗原を刺激／活性化剤として
用いるべきである。例えば、活性化／刺激された１３１
Ｊンパ球は抗原によつＣ攻撃されかつ抗体を産生ずる細
胞に分化したリンパ球であり、該抗体とは攻撃する抗原
の１の抗原決定基（こついて特異的なものである。かか
る活性化／′刺激された１３１Ｊンパ球は本発明の方法
Ｇこよって不滅化が可能である。Ｂ細胞以外の正常一次
細胞を活性化／刺激するの；こ用いるべき適当なｉ１１
激／活性化剤はマイトジェンおよび発育因子を包含する
。マイトジェンは当該分野においでよく知られている。
特定のタイプの正常一次細胞に対しでは特定のマイトジ
ェンが好ましいものであることは注意すべきである。例
えは、リボ多糖類（ＬＰＳ）は正常Ｂ細胞を刺激／活性
化する好ましいマイトジェンである。コンカナバリンＡ
は正常Ｔ細胞を刺激／活性化する好ましいマーｒ トジ
エンである（それは分化ならびに増殖を刺激する）。ホ
ークライード（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ）マイトジェンは正
常Ｂ細胞または正常Ｔ細胞を刺激／活性化する好ましい
マイトジェンである（それは分化ζらびに増殖を刺激す
る）。
ェンが好ましいものであることは注意すべきである。例
えは、リボ多糖類（ＬＰＳ）は正常Ｂ細胞を刺激／活性
化する好ましいマイトジェンである。コンカナバリンＡ
は正常Ｔ細胞を刺激／活性化する好ましいマーｒ トジ
エンである（それは分化ならびに増殖を刺激する）。ホ
ークライード（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ）マイトジェンは正
常Ｂ細胞または正常Ｔ細胞を刺激／活性化する好ましい
マイトジェンである（それは分化ζらびに増殖を刺激す
る）。
インシュリンおよびポリミリスチン酸（ＰＭＡ）は正常
ζ線維芽細胞を刺激／活性化する好ましいマイトジェン
である。
ζ線維芽細胞を刺激／活性化する好ましいマイトジェン
である。
用いるべき最適な刺激／活性化剤および正常一次細胞の
刺激／活性化のための最適条件は常法を用いて当業者が
決定でき、それは他のファクターのなかでも、とりわけ
用いる一次細胞タイブおよび個々の刺激／活性化剤に依
存する。
刺激／活性化のための最適条件は常法を用いて当業者が
決定でき、それは他のファクターのなかでも、とりわけ
用いる一次細胞タイブおよび個々の刺激／活性化剤に依
存する。
腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子なる語は本発明の方
法によって正常な、活性化された一次細胞中にトランス
フェクトされた場合、かかる細胞を不滅化するいずれの
ＤＮＡ配列も意味する。本明細書中で用いる「腫瘍誘発
性ＤＮ！」は本発明の方法によって正常な、活性化／刺
激された一次細胞中にトランスフェクトされた場合、か
かる細胞を不滅化する腫瘍細胞または腫瘍細胞系からの
ＤＮＡを包含する。腫瘍誘発遺伝子は正常細胞を廊細胞
に形質転換する役割をするその能力で知られた、単離さ
れたＤＮＡ配列である。本明細書中で用いる「腫瘍誘発
遺伝子」は本発明の方法によって正常な、活性化／刺激
された一次細胞中にトランスフェクトされた場合、かか
る細胞を不滅化するいずれの単離されたＤＮＡ配列も包
含する。
法によって正常な、活性化された一次細胞中にトランス
フェクトされた場合、かかる細胞を不滅化するいずれの
ＤＮＡ配列も意味する。本明細書中で用いる「腫瘍誘発
性ＤＮ！」は本発明の方法によって正常な、活性化／刺
激された一次細胞中にトランスフェクトされた場合、か
かる細胞を不滅化する腫瘍細胞または腫瘍細胞系からの
ＤＮＡを包含する。腫瘍誘発遺伝子は正常細胞を廊細胞
に形質転換する役割をするその能力で知られた、単離さ
れたＤＮＡ配列である。本明細書中で用いる「腫瘍誘発
遺伝子」は本発明の方法によって正常な、活性化／刺激
された一次細胞中にトランスフェクトされた場合、かか
る細胞を不滅化するいずれの単離されたＤＮＡ配列も包
含する。
１つ以上の腫瘍誘発遺伝子タイプが本発明の方法により
個々の正常な、活性化された一次細胞を不滅化するのに
必要となり得ることに注意することが重要である。本発
明の方法により正常な、活性化された。刺激された一次
細胞を不滅化するのに用いるべき好ましい腫瘍誘発遺伝
子は、一次細胞腫瘍または腫瘍−次一細胞系からの腫瘍
誘発遺伝子を包含し、かかる腫瘍または腫瘍細胞系は不
滅化されるべき一次細胞タイブに対応する起源を有する
ものである。本発明の方法により正常な、活性化／刺激
されたＢ細胞を不滅化するのに用いるべき好ましい腫瘍
誘発遺伝子は、寄託番号ＡＴＣＣＨＴＢ４ （ｒ Ｈａ
−ｒａｓ Ｊ ） テアリ、アメリカン・タイプ、カ
ルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ） 、口７
クビル（Ｒｏｃｋｖｉ Ｉ ｌｅ ） 、メリーランド
州、米国（ＡＴＣＣ）から入手可能ｒ、１Ｔ２４ヒト膀
胱癌細胞系から単離したＨａ−ｒａｓ 腫瘍誘発遺伝
子およびｐ５３腫瘍誘発遺伝子（クローンｐ５３−Ｉ（
７、このクローンはドクター・パルダ・ロトン（Ｄｒ、
Ｖａｒｄａ Ｒｏｔｔｏｎ）から入手した。このクロ
ーンの詳細な記載はモレキュラー・アンド・セリュラー
・バイオロジー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１
ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ） 。
個々の正常な、活性化された一次細胞を不滅化するのに
必要となり得ることに注意することが重要である。本発
明の方法により正常な、活性化された。刺激された一次
細胞を不滅化するのに用いるべき好ましい腫瘍誘発遺伝
子は、一次細胞腫瘍または腫瘍−次一細胞系からの腫瘍
誘発遺伝子を包含し、かかる腫瘍または腫瘍細胞系は不
滅化されるべき一次細胞タイブに対応する起源を有する
ものである。本発明の方法により正常な、活性化／刺激
されたＢ細胞を不滅化するのに用いるべき好ましい腫瘍
誘発遺伝子は、寄託番号ＡＴＣＣＨＴＢ４ （ｒ Ｈａ
−ｒａｓ Ｊ ） テアリ、アメリカン・タイプ、カ
ルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ） 、口７
クビル（Ｒｏｃｋｖｉ Ｉ ｌｅ ） 、メリーランド
州、米国（ＡＴＣＣ）から入手可能ｒ、１Ｔ２４ヒト膀
胱癌細胞系から単離したＨａ−ｒａｓ 腫瘍誘発遺伝
子およびｐ５３腫瘍誘発遺伝子（クローンｐ５３−Ｉ（
７、このクローンはドクター・パルダ・ロトン（Ｄｒ、
Ｖａｒｄａ Ｒｏｔｔｏｎ）から入手した。このクロ
ーンの詳細な記載はモレキュラー・アンド・セリュラー
・バイオロジー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１
ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ） 。
５巻、黒８，１８８７〜１８９３頁、１９８５中；こあ
る）である。本発明の方法により正常な、活性化／刺激
されたＢ細胞を不滅化するのに用いるべき好ましい腫瘍
誘発性ＤＮＡは寄託番号ＣＲＬ８２８６でＡＴＣＣから
入手可能なＲＥＨ細胞系とじて公知の急性ヒ） リンパ
芽球白血病からのゲノムＤ Ｎ Ａまたは寄託番号ＡＴ
ＣＣＴｌＢ５９てＡＴＣＣから入手可能ｆ：ＥＬ４ネズ
ミ胸腺腫細胞系（ＥＬ４ ） および腫瘍Ｂ−細胞系
またはＢ細胞腫瘍、特にドクター・ダブリュー・ヘンレ
（Ｄｒ。
る）である。本発明の方法により正常な、活性化／刺激
されたＢ細胞を不滅化するのに用いるべき好ましい腫瘍
誘発性ＤＮＡは寄託番号ＣＲＬ８２８６でＡＴＣＣから
入手可能なＲＥＨ細胞系とじて公知の急性ヒ） リンパ
芽球白血病からのゲノムＤ Ｎ Ａまたは寄託番号ＡＴ
ＣＣＴｌＢ５９てＡＴＣＣから入手可能ｆ：ＥＬ４ネズ
ミ胸腺腫細胞系（ＥＬ４ ） および腫瘍Ｂ−細胞系
またはＢ細胞腫瘍、特にドクター・ダブリュー・ヘンレ
（Ｄｒ。
ｗ、 Ｈｅｎ１ｅ ）、チルドレンズ・ホスピタル（ｃ
ｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ ）、 デ
イパートメントーオブ畢ピロロジー（Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、フィラデルフィア、
ペンシルバニアＪ（Ｌ米１］のヒトバーキットリンパ腫
細胞系（ＢＪＡＢ ）の如きＢ細胞リンパ腫からのゲノ
ムＤＮＡを包含する。
ｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ ）、 デ
イパートメントーオブ畢ピロロジー（Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、フィラデルフィア、
ペンシルバニアＪ（Ｌ米１］のヒトバーキットリンパ腫
細胞系（ＢＪＡＢ ）の如きＢ細胞リンパ腫からのゲノ
ムＤＮＡを包含する。
本発明の方法により正常な、活性化／刺激されたＴ細胞
を不滅化するのに用いるべき好ましい腫瘍誘発性ＤＮＡ
はＴ細胞腫瘍またはＥＬ４の如き腫ロＴ−細胞系からの
ゲノムＤＮＡを包含する。本発明の方法により他の正Ｉ
Ｉｓ １１、活性化／刺激された一次細胞を不滅化する
のＳこ用いるへき好ましい腫瘍誘発性ＤＮＡは一次細胞
＠瘍または腫瘍−次−細胞系からのゲノムＤＮＡを包含
し、かかる腫瘍または腫瘍細胞系は不滅化されるべき正
常一次細胞タイブに対応する起源を有する。例えば、上
皮細胞起源の腫瘍ＤＮＡは本発明の方法により正常な、
活性化されたー刺激された一次上皮細胞を不滅化するの
（こ好ましい。本発明の不滅化細胞系を調製するのに用
いるべき他の適当な腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子
は本発明の方法を用いＣ当業者が決定でき、それは用い
るべき腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子および正常な
、活性化された一次細胞のタイプの如き多くのファクタ
ーに依存する。最近、多くの異なる腫瘍誘発性ＤＮＡ／
腫瘍誘発遺伝子が文献中に報告されこおり、いくつかの
腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子はＡＴＣＣの如き種
々の源から公に入手できる。
を不滅化するのに用いるべき好ましい腫瘍誘発性ＤＮＡ
はＴ細胞腫瘍またはＥＬ４の如き腫ロＴ−細胞系からの
ゲノムＤＮＡを包含する。本発明の方法により他の正Ｉ
Ｉｓ １１、活性化／刺激された一次細胞を不滅化する
のＳこ用いるへき好ましい腫瘍誘発性ＤＮＡは一次細胞
＠瘍または腫瘍−次−細胞系からのゲノムＤＮＡを包含
し、かかる腫瘍または腫瘍細胞系は不滅化されるべき正
常一次細胞タイブに対応する起源を有する。例えば、上
皮細胞起源の腫瘍ＤＮＡは本発明の方法により正常な、
活性化されたー刺激された一次上皮細胞を不滅化するの
（こ好ましい。本発明の不滅化細胞系を調製するのに用
いるべき他の適当な腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子
は本発明の方法を用いＣ当業者が決定でき、それは用い
るべき腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子および正常な
、活性化された一次細胞のタイプの如き多くのファクタ
ーに依存する。最近、多くの異なる腫瘍誘発性ＤＮＡ／
腫瘍誘発遺伝子が文献中に報告されこおり、いくつかの
腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子はＡＴＣＣの如き種
々の源から公に入手できる。
「エレクトロポレーション」なる語は細胞を高電圧電気
パルスに暴露することを意味する。かかる暴露は細胞膜
をＤＮＡの如き高分子量の高分子に対しでより透過性と
する。エレクトロポレーションは細胞およびＤＮＡを含
む容器に高電圧電気パルスを放射できるいずれの装置に
よっても実行できる。例えば、当業者が容易にエレクト
ロポレーション装置に適用できる（ＢＴＸ 、サン・デ
ィエゴ、カリフォルニア州、米国から）入手可能なりＴ
Ｘエレクトロ・セル・マニプユレータ−（Ｅｌｅｃｔｒ
ｏ Ｃｅ１ｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ）、モデル４
０１の如き多くの市販電気−融合システムがある。さら
に、エレクトロポレーションはポッターラ（Ｐｏｔｔｅ
ｒ ｅｔ ａｌ、 ）、 プロシーデイングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）、
ＵＳＡ、 ８１．７１６１〜６１７５ （１９８
４）の方法によっても実行できる。該ボッター（Ｐｏｔ
ｔｅｒ ）法を用いる場合、ＬＫＢ 電源装置＃２１９
７ （ＬＫＢ社、スウェーデン）が電気パルスの好ま
しい電源である。
パルスに暴露することを意味する。かかる暴露は細胞膜
をＤＮＡの如き高分子量の高分子に対しでより透過性と
する。エレクトロポレーションは細胞およびＤＮＡを含
む容器に高電圧電気パルスを放射できるいずれの装置に
よっても実行できる。例えば、当業者が容易にエレクト
ロポレーション装置に適用できる（ＢＴＸ 、サン・デ
ィエゴ、カリフォルニア州、米国から）入手可能なりＴ
Ｘエレクトロ・セル・マニプユレータ−（Ｅｌｅｃｔｒ
ｏ Ｃｅ１ｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ）、モデル４
０１の如き多くの市販電気−融合システムがある。さら
に、エレクトロポレーションはポッターラ（Ｐｏｔｔｅ
ｒ ｅｔ ａｌ、 ）、 プロシーデイングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）、
ＵＳＡ、 ８１．７１６１〜６１７５ （１９８
４）の方法によっても実行できる。該ボッター（Ｐｏｔ
ｔｅｒ ）法を用いる場合、ＬＫＢ 電源装置＃２１９
７ （ＬＫＢ社、スウェーデン）が電気パルスの好ま
しい電源である。
「高電圧」なる語は約１０００ボルト／ ｃｍ ｆ、ｒ
いふ勺 し５５００ポル） ／ Ｃ１１１間の電圧を意味する。
いふ勺 し５５００ポル） ／ Ｃ１１１間の電圧を意味する。
最適へ
電圧は当業者が決定でき、それは正常な、活性化／刺激
された一次細胞の性質、腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫０誘発遺
伝子源の性質、細胞および／またはＤＮＡａ度細胞密度
ならびに用いるエレクトロポレ−ション装置の性質の如
き種々のファクターに依存する。
された一次細胞の性質、腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫０誘発遺
伝子源の性質、細胞および／またはＤＮＡａ度細胞密度
ならびに用いるエレクトロポレ−ション装置の性質の如
き種々のファクターに依存する。
本発明は。
ｆａｌ正常な、活性化／刺激された一次細胞を洪し：（
ｂｌエレクトロポレーションによってかかる一次細胞を
腫瘍誘発性ＤＮＡ／４ｇ誘発遺伝子でトランスフェクト
してトランスフェクトされた一次細胞を産生し：次いで ｆｃｌかかるトランスフェクトされた一次細胞から不滅
化一次細胞系を回収することを特徴とする不滅化一次細
胞系の産生法を提供するものである。
ｂｌエレクトロポレーションによってかかる一次細胞を
腫瘍誘発性ＤＮＡ／４ｇ誘発遺伝子でトランスフェクト
してトランスフェクトされた一次細胞を産生し：次いで ｆｃｌかかるトランスフェクトされた一次細胞から不滅
化一次細胞系を回収することを特徴とする不滅化一次細
胞系の産生法を提供するものである。
また、本発明は本発明の方法によって産生される不滅化
一次細胞系を提供するものである。
一次細胞系を提供するものである。
エレクトロポレーションによって腫瘍誘発性ＤＮＡ／肺
瘍誘発遺伝子を正常な、活性化／刺激された一次細胞に
トランスフェクトするの番ご用いる一般法は以下のとお
りである。正零一次細胞を常法番こより単離する。それ
を前記で概略を述べた如くに単離後、 （ｉｎ ｖｉｖ
ｏ 刺激で）活性化／刺激する、あるいは適当な刺激／
活性化剤に１ｎｖｉｖｏで暴露された供与体（生きた生
物体）からの正常な、活性化／刺激された一次細胞とし
て分離できる。次いで、かかる正常な、活性化／刺激さ
れた細胞を好ましくは約５ｘ１ｏ ｒ：いし約２×１
０ 細胞／献で保護培地中に懸濁する。
瘍誘発遺伝子を正常な、活性化／刺激された一次細胞に
トランスフェクトするの番ご用いる一般法は以下のとお
りである。正零一次細胞を常法番こより単離する。それ
を前記で概略を述べた如くに単離後、 （ｉｎ ｖｉｖ
ｏ 刺激で）活性化／刺激する、あるいは適当な刺激／
活性化剤に１ｎｖｉｖｏで暴露された供与体（生きた生
物体）からの正常な、活性化／刺激された一次細胞とし
て分離できる。次いで、かかる正常な、活性化／刺激さ
れた細胞を好ましくは約５ｘ１ｏ ｒ：いし約２×１
０ 細胞／献で保護培地中に懸濁する。
「保護」培地ζる語はエレクトロポレーションの間、正
常な、活性化／刺激された一次細胞の活性を維持するい
ずれの培地をも意味する。本発明の方法で用いることが
できる保護培地の例はリン酸緩衝食塩水（ｐＢｓ）（ｐ
Ｈ約７）およびグルコース（０，３モル）の如き緩衝溶
液および非イオン性溶液を包含する。ＰＢＳが最も好ま
しい。
常な、活性化／刺激された一次細胞の活性を維持するい
ずれの培地をも意味する。本発明の方法で用いることが
できる保護培地の例はリン酸緩衝食塩水（ｐＢｓ）（ｐ
Ｈ約７）およびグルコース（０，３モル）の如き緩衝溶
液および非イオン性溶液を包含する。ＰＢＳが最も好ま
しい。
ＰＢＳを用いる場合、好ましい電圧は１０００ボルト／
αである。グルコース（０，３モル）ヲ用いる場合、好
ましい電圧は５５００ボルト／Ｃ７＋＋である。
αである。グルコース（０，３モル）ヲ用いる場合、好
ましい電圧は５５００ボルト／Ｃ７＋＋である。
正常な、活性化／刺激された一次細胞を保護培地中に懸
濁した後、（好ましくは約１μｇ ／ｒｎＱないし約１
００μｇ ／ ｍｆｌの）腫瘍誘発性ＤＮＡまたは（１
０”９ ／ ｄｆ、Ｚいし約１０ｔｔｇ／ｍｆｌの）腫
瘍誘発遺伝子を該懸澗液に加える。荷棚液に加えた腫瘍
誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子はゲノムＤＮＡまたは適
当ζ組換体ＤＮＡベクターよりなる遊離ＤＮＡの形態で
よく、あるいはＤＮＡは正常な。
濁した後、（好ましくは約１μｇ ／ｒｎＱないし約１
００μｇ ／ ｍｆｌの）腫瘍誘発性ＤＮＡまたは（１
０”９ ／ ｄｆ、Ｚいし約１０ｔｔｇ／ｍｆｌの）腫
瘍誘発遺伝子を該懸澗液に加える。荷棚液に加えた腫瘍
誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子はゲノムＤＮＡまたは適
当ζ組換体ＤＮＡベクターよりなる遊離ＤＮＡの形態で
よく、あるいはＤＮＡは正常な。
活性化／刺激された一次細胞表面上の少くとも１つの抗
原決定基に対して特異的な抗体で被覆されたリポソーム
内に封入できる。「適当ζ組換体ＤＮＡベクター」はそ
れが含む腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子に作動可能
に連結した発現制御配列を含有する組換体ＤＮＡ技術；
こよって調製されたベクターを意味する。組換体ＤＮＡ
ベクターの調製は当該分野でよく知られでいる。「発現
制御配列」は腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子の転写
を調節するプロモータの如きＤＮＡ配列を意味する。「
プロモータ」なる語はＲＮＡポリメラーゼの結合および
転写が起こることを可能とする腫瘍誘発性ＤＮＡ／＠瘍
誘発遺伝子の上流のいずれの領域も意味する。「作動可
能に連結した」は腫瘍誘発性ＤＮＡ／＠瘍誘発遺伝子が
適当な発現制御配列に対しご転写可能な状態でまたは翻
訳用能な状態で連結していることを意味する。リポソー
ムの調製および抗体波ＷＩＪポソームの調製は当該分野
でよく知られている。
原決定基に対して特異的な抗体で被覆されたリポソーム
内に封入できる。「適当ζ組換体ＤＮＡベクター」はそ
れが含む腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子に作動可能
に連結した発現制御配列を含有する組換体ＤＮＡ技術；
こよって調製されたベクターを意味する。組換体ＤＮＡ
ベクターの調製は当該分野でよく知られでいる。「発現
制御配列」は腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子の転写
を調節するプロモータの如きＤＮＡ配列を意味する。「
プロモータ」なる語はＲＮＡポリメラーゼの結合および
転写が起こることを可能とする腫瘍誘発性ＤＮＡ／＠瘍
誘発遺伝子の上流のいずれの領域も意味する。「作動可
能に連結した」は腫瘍誘発性ＤＮＡ／＠瘍誘発遺伝子が
適当な発現制御配列に対しご転写可能な状態でまたは翻
訳用能な状態で連結していることを意味する。リポソー
ムの調製および抗体波ＷＩＪポソームの調製は当該分野
でよく知られている。
好ましくは、正常な、活性化／刺激された一次細胞およ
び腫瘍誘発性ＤＮＡ／肺瘍誘発遺伝子を共に含有する懸
濁液をエレクトロポレーションに暴露する前に約２〜４
℃（こて約５〜約１０分間インキュベートする。次いて
、１〜１０回、好ましくは３〜５回の高電圧電気パルス
を懸濁液に与え、それによって正常な、活性化／刺激さ
れた一次細胞を腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でト
ランスフェクトスル。ＢＴＸエレクトロ・セル・マニピ
ュレーター（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅ１ｌ Ｍｏｎ１ｐ
ｕｌａｔｏｒ ）、モデル４０１による電気パルスの好
ましい長さは約５０〜約９９マイクロセカンドであり、
９９マイクロセカンドが最も好ましい。ＢＴＸエレクト
ロ・セル・マニピュレーター（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌ
ｌＭａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ） 、 モデル４０１に
よる電気パルスの好ましい振幅はそれが実現できる最大
のものである。細胞／ＤＮ、〜懸副液に与えるべき電気
パルスの最適電圧、長さ、振幅および数は本発明の方法
を用いて当業者が決定でき、それは用いる− ′次細
胞の性質、腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子源の性質
、懸濁液中の一次細胞の濃度、＠濁液中の腫瘍誘発性Ｄ
Ｎ Ａ ／ ＋連給誘発遺伝子の濃度、用いる保護培
地および用いるエレクトロポレーション装置の性質の如
き種々のファクターに依存する。
び腫瘍誘発性ＤＮＡ／肺瘍誘発遺伝子を共に含有する懸
濁液をエレクトロポレーションに暴露する前に約２〜４
℃（こて約５〜約１０分間インキュベートする。次いて
、１〜１０回、好ましくは３〜５回の高電圧電気パルス
を懸濁液に与え、それによって正常な、活性化／刺激さ
れた一次細胞を腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でト
ランスフェクトスル。ＢＴＸエレクトロ・セル・マニピ
ュレーター（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅ１ｌ Ｍｏｎ１ｐ
ｕｌａｔｏｒ ）、モデル４０１による電気パルスの好
ましい長さは約５０〜約９９マイクロセカンドであり、
９９マイクロセカンドが最も好ましい。ＢＴＸエレクト
ロ・セル・マニピュレーター（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌ
ｌＭａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ） 、 モデル４０１に
よる電気パルスの好ましい振幅はそれが実現できる最大
のものである。細胞／ＤＮ、〜懸副液に与えるべき電気
パルスの最適電圧、長さ、振幅および数は本発明の方法
を用いて当業者が決定でき、それは用いる− ′次細
胞の性質、腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子源の性質
、懸濁液中の一次細胞の濃度、＠濁液中の腫瘍誘発性Ｄ
Ｎ Ａ ／ ＋連給誘発遺伝子の濃度、用いる保護培
地および用いるエレクトロポレーション装置の性質の如
き種々のファクターに依存する。
好ましくは、エレクトロポレーションを行った後、懸濁
液を約２〜約４℃にで約５〜約１０分間放置し、次いで
新し−・〜１培地を加えてトランスフェクトされた一次
細胞に栄養を与える。
液を約２〜約４℃にで約５〜約１０分間放置し、次いで
新し−・〜１培地を加えてトランスフェクトされた一次
細胞に栄養を与える。
エレクトロポレーションを行った後、不滅化細胞系を同
定する常法を用いることによって、トランスフェクトサ
れた一次細胞を含有する懸濁液から本発明の不滅化一次
細胞系を回収する。例えば。
定する常法を用いることによって、トランスフェクトサ
れた一次細胞を含有する懸濁液から本発明の不滅化一次
細胞系を回収する。例えば。
細胞懸濁液を９６個のウェルプレート（こ分配し、−週
間に一回または要すれば新しい培地を与える。
間に一回または要すれば新しい培地を与える。
継続的な増殖（細胞クローンの数で表示）１例えば少く
とも６週間の増殖を示す細胞のクローンを含有するウェ
ルは本発明の不滅化した一次細胞系を含有する。
とも６週間の増殖を示す細胞のクローンを含有するウェ
ルは本発明の不滅化した一次細胞系を含有する。
回収後、本発明の不滅化一次細胞系を包゛法：こよつで
クローン的（こ伸長させてかかる細胞系の均質な集団を
産生でき、該集団は適当な培地、すなわちかかる細胞系
の活性を維持しかつそれが増殖するのを可能とする培地
中で継続的；こ維持てきる。
クローン的（こ伸長させてかかる細胞系の均質な集団を
産生でき、該集団は適当な培地、すなわちかかる細胞系
の活性を維持しかつそれが増殖するのを可能とする培地
中で継続的；こ維持てきる。
また１本発明は、生物学的産生物の産生を可能とする条
件下で細胞系を培養することを特徴とするそのコーディ
ング配列が本発明の不滅化一次細胞系内に含有されるＤ
ＮＡからなる生物学的産生物の産生法を提供するもので
ある。前記の如く、「コーディング配列」なる語は１本
発明の不滅化一次細胞系を調製するの；こ用いる正常な
、活性化／刺激された一次細胞のＤＮＡ内で天然番こ見
い出されるコーディング配列ならび（こ本発明の方法で
用いる腫瘍誘発性Ｄ Ｎ Ａ ／腫瘍誘発遺伝子（こ含
まれるコーディング配列を包含する。すべでの正常一次
細胞はそのコーディング配列がかがる一次細胞内シこ含
有されるＤＮＡに含まれる生物学的産生物を十分に産生
できる。かかる一次細胞の活性化／刺激（こよりそれは
異なるまたはより多くの生物学的産生物を産生できるよ
うにζる。例えば、正常Ｂ Ｕンパ球の、注目する抗原
での活性化／刺激の後、かかる正常な、活性化／刺激さ
れたＢ細胞は抗体を産生ずる細胞に分化できる。産生さ
れた抗体は活性化／刺激抗原の１の抗原決定基ｌこ対し
Ｃ特異的である。本発明の方法（こよるかかる正常な、
活性化／刺激された１３１Ｊツバ球の不滅化（こよつＣ
１単クロ一ン抗体産生用の継続源を提供できる細胞系、
ならびにかかる不滅化一次細胞系に含まれる腫瘍誘発性
ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子コーデイノグ配列の産生物が産
生される。同様に、他の正常一次細胞の不滅化によって
、それらは（ａ）そのコーディング配列がかかる一次細
胞内に含有されるＤＮＡからなる生物学的産生物〔例え
ば、かかるコーディング配列はリンフ才力イン、例えば
インターロイキン−１（ＩＬ−１）％ インターロイキ
ン−２（ＩＬ−２）、またはインターフェロン（ＩＦ）
あるいは発育因子をコードしうる〕ならび（こ（ｂ
）不滅化一次細胞系に含まれる腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍
誘発遺伝子コーディング配列の産生物を継続的に産生で
きるよう番こなる。本発明の不滅化一次細胞系を所望の
生物学的産生物を産生てきる（産生能力のある）ように
培養する適当な培地条件は常法により当業者が容易；こ
決定でき。
件下で細胞系を培養することを特徴とするそのコーディ
ング配列が本発明の不滅化一次細胞系内に含有されるＤ
ＮＡからなる生物学的産生物の産生法を提供するもので
ある。前記の如く、「コーディング配列」なる語は１本
発明の不滅化一次細胞系を調製するの；こ用いる正常な
、活性化／刺激された一次細胞のＤＮＡ内で天然番こ見
い出されるコーディング配列ならび（こ本発明の方法で
用いる腫瘍誘発性Ｄ Ｎ Ａ ／腫瘍誘発遺伝子（こ含
まれるコーディング配列を包含する。すべでの正常一次
細胞はそのコーディング配列がかがる一次細胞内シこ含
有されるＤＮＡに含まれる生物学的産生物を十分に産生
できる。かかる一次細胞の活性化／刺激（こよりそれは
異なるまたはより多くの生物学的産生物を産生できるよ
うにζる。例えば、正常Ｂ Ｕンパ球の、注目する抗原
での活性化／刺激の後、かかる正常な、活性化／刺激さ
れたＢ細胞は抗体を産生ずる細胞に分化できる。産生さ
れた抗体は活性化／刺激抗原の１の抗原決定基ｌこ対し
Ｃ特異的である。本発明の方法（こよるかかる正常な、
活性化／刺激された１３１Ｊツバ球の不滅化（こよつＣ
１単クロ一ン抗体産生用の継続源を提供できる細胞系、
ならびにかかる不滅化一次細胞系に含まれる腫瘍誘発性
ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子コーデイノグ配列の産生物が産
生される。同様に、他の正常一次細胞の不滅化によって
、それらは（ａ）そのコーディング配列がかかる一次細
胞内に含有されるＤＮＡからなる生物学的産生物〔例え
ば、かかるコーディング配列はリンフ才力イン、例えば
インターロイキン−１（ＩＬ−１）％ インターロイキ
ン−２（ＩＬ−２）、またはインターフェロン（ＩＦ）
あるいは発育因子をコードしうる〕ならび（こ（ｂ
）不滅化一次細胞系に含まれる腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍
誘発遺伝子コーディング配列の産生物を継続的に産生で
きるよう番こなる。本発明の不滅化一次細胞系を所望の
生物学的産生物を産生てきる（産生能力のある）ように
培養する適当な培地条件は常法により当業者が容易；こ
決定でき。
それはとりわけ、含まれる一次細胞系のタイプおよび産
生されるべき所望の生物学的産生物に依存する。本発明
の方法により本発明の一次細胞系によって産生される生
物学的産生物はかかる細胞系により直接培地中に分泌さ
れることもあり、その場合、単離を所望するならば、当
業者は通常の蛋白質単離技術を用いてかかる生物学的産
生物をかかる培地から単離できる。また、生物学的産生
物は分泌されないかも知れず、その場合、単能を所望す
るならば、かかる生物学的産生物は常法を用いＣかかる
細胞系の培養溶解物から単離される。
生されるべき所望の生物学的産生物に依存する。本発明
の方法により本発明の一次細胞系によって産生される生
物学的産生物はかかる細胞系により直接培地中に分泌さ
れることもあり、その場合、単離を所望するならば、当
業者は通常の蛋白質単離技術を用いてかかる生物学的産
生物をかかる培地から単離できる。また、生物学的産生
物は分泌されないかも知れず、その場合、単能を所望す
るならば、かかる生物学的産生物は常法を用いＣかかる
細胞系の培養溶解物から単離される。
また、本発明は。
（ａｌ正常な、活性化／刺激された一次細、胞を供し：
（ｂｌエレクトロポレーションによつでかかる一次細胞
を腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子および外来の嘱能
性ＤＮＡ配列・で共トランスフェクトして共トランー尺
フエクトされた一次細胞を産生し：次いて ｉｃ）かかる共トランスフェクトされた一次細胞から外
来の機能性ＤＮＡ配列を含有する不滅化一次細胞系を回
収することを特徴とする外来の既能性ＤＮＡ配列を含有
する共トランスフェクトされた不滅化一次細胞系の産生
法を提供するものである。
（ｂｌエレクトロポレーションによつでかかる一次細胞
を腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子および外来の嘱能
性ＤＮＡ配列・で共トランスフェクトして共トランー尺
フエクトされた一次細胞を産生し：次いて ｉｃ）かかる共トランスフェクトされた一次細胞から外
来の機能性ＤＮＡ配列を含有する不滅化一次細胞系を回
収することを特徴とする外来の既能性ＤＮＡ配列を含有
する共トランスフェクトされた不滅化一次細胞系の産生
法を提供するものである。
また、本発明は本発明の方法；こよって産生される共ト
ランスフェクトされた不滅化一次細胞系を提１共するも
のである。
ランスフェクトされた不滅化一次細胞系を提１共するも
のである。
「機能性ＤＮＡ配列」なる語は１本発明の共トランスフ
ェクトされた不滅化一次細胞系中で遺伝子発現ユニット
、構造遺伝子、プロモータまたは調節領域として機能す
るいずれかの源由来のＤＮＡのいずれかの区分された領
域をも意味する。「遺伝子発現ユニット」する語はその
転写および翻訳に必要な構造遺伝子およびプロモータな
らびに調節領域を意味する。「プロモータ」なる語はＲ
ＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こるのを可能と
する構造遺伝子の上流のいずれの領域も意味する。「調
節領域」ぼる語は構造遺伝子の転写を調節するＤＮＡ配
列を意味する。「構造遺伝子コなる語はＭＲＮＡの合成
の鋳型として働くポリペプチドについてのコーディング
配列を意味する。
ェクトされた不滅化一次細胞系中で遺伝子発現ユニット
、構造遺伝子、プロモータまたは調節領域として機能す
るいずれかの源由来のＤＮＡのいずれかの区分された領
域をも意味する。「遺伝子発現ユニット」する語はその
転写および翻訳に必要な構造遺伝子およびプロモータな
らびに調節領域を意味する。「プロモータ」なる語はＲ
ＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こるのを可能と
する構造遺伝子の上流のいずれの領域も意味する。「調
節領域」ぼる語は構造遺伝子の転写を調節するＤＮＡ配
列を意味する。「構造遺伝子コなる語はＭＲＮＡの合成
の鋳型として働くポリペプチドについてのコーディング
配列を意味する。
「外来の機能性ＤＮＡ配列」なる語は１本発明 ゛の
方法で用いる正常な、活性化／刺激された一次細胞のＤ
ＮＡ中に天然には存在せず、かつ本発明の方法によるか
かる細胞の不滅化５こ関与する、唾０誘発性ＤＮＡ／腫
瘍誘発遺伝子の部分ではＣい機能性ＤＮＡ配列を意味す
る。好ましい外来のｈ能性ＤＮＡ配列はインシュリン、
成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、−
１−抗トリプシン、ヒルジン、ワクチン生産で用いる抗
原。
方法で用いる正常な、活性化／刺激された一次細胞のＤ
ＮＡ中に天然には存在せず、かつ本発明の方法によるか
かる細胞の不滅化５こ関与する、唾０誘発性ＤＮＡ／腫
瘍誘発遺伝子の部分ではＣい機能性ＤＮＡ配列を意味す
る。好ましい外来のｈ能性ＤＮＡ配列はインシュリン、
成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、−
１−抗トリプシン、ヒルジン、ワクチン生産で用いる抗
原。
リンフ才力イン、発育因子およびレセプターの如き医薬
上重要ないずれのポリペプチド産生物もコード付けする
ＤＮＡ配列、ならびに本発明の共トランスフェクトされ
た不滅化一次細胞の増殖を促進することができる産生物
をコード付けするＤＮＡ配列を包含するが、これら（こ
限定されるものではない。
上重要ないずれのポリペプチド産生物もコード付けする
ＤＮＡ配列、ならびに本発明の共トランスフェクトされ
た不滅化一次細胞の増殖を促進することができる産生物
をコード付けするＤＮＡ配列を包含するが、これら（こ
限定されるものではない。
本発明の共トランスフェクトされた不滅化一次細胞系を
産生ずるのに用いる一般法は、それが腫瘍誘発性ＤＮＡ
／腫瘍誘発遺伝子および外来の機能性ＤＮＡ配列の共ト
ランスフェクションヲ含む以外は本発明の不滅化一次細
胞系を産生ずるのに用いる方法と実質的；こ同一である
。かかる共トランスフェクションは同時にまたはひき続
いて行ってよい。「ひき続いて」は活性化／刺激された
一次細胞をまず本発明の方法によって不滅化一次細胞系
とし、次いでしかる後、ｉエレクトロポレーションまた
は他のいずれかのＤＮＡトランスフェクション技術によ
って外来の機能性ＤＮＡ配列でトランスフェクトできる
ことを意味する。外来の機能性ＤＮＡの好ましい量は約
１μｇ ／ ｍＱ〜約１００μｇ ／ ｍｌである。用
いるべき外来の機能性ＤＮＡの最適量は本発明の方法を
用いて当業者が決定でき、それは用いる外来の機能性Ｄ
ＮＡの性質および本発明の不滅化一次細胞系を産生ずる
方法に関して前記で概略を述べた他のファクターに依存
スる。かかる外来の機能性ＤＮＡ配列は、（用いるべき
腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子も含有してよい）適
当な組換体ＤＮＡベクター中；こ一体化した、あるいは
共トランスフェクションで用いるべき一次細胞の表面上
の抗原決定基に対する抗体を担持するリポソーム内に含
まれた遊ＡＩ’ Ｄ Ｎ Ａとして懸副液に加えること
ができる。かかる共トランスフェクションを利用するエ
レクトロポレーションの好ましい条件、すなわち電気パ
ルスの数、振幅、電圧および長さは本発明の不滅化一次
細胞系の調製−ごついて概説したのと同じである。
産生ずるのに用いる一般法は、それが腫瘍誘発性ＤＮＡ
／腫瘍誘発遺伝子および外来の機能性ＤＮＡ配列の共ト
ランスフェクションヲ含む以外は本発明の不滅化一次細
胞系を産生ずるのに用いる方法と実質的；こ同一である
。かかる共トランスフェクションは同時にまたはひき続
いて行ってよい。「ひき続いて」は活性化／刺激された
一次細胞をまず本発明の方法によって不滅化一次細胞系
とし、次いでしかる後、ｉエレクトロポレーションまた
は他のいずれかのＤＮＡトランスフェクション技術によ
って外来の機能性ＤＮＡ配列でトランスフェクトできる
ことを意味する。外来の機能性ＤＮＡの好ましい量は約
１μｇ ／ ｍＱ〜約１００μｇ ／ ｍｌである。用
いるべき外来の機能性ＤＮＡの最適量は本発明の方法を
用いて当業者が決定でき、それは用いる外来の機能性Ｄ
ＮＡの性質および本発明の不滅化一次細胞系を産生ずる
方法に関して前記で概略を述べた他のファクターに依存
スる。かかる外来の機能性ＤＮＡ配列は、（用いるべき
腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子も含有してよい）適
当な組換体ＤＮＡベクター中；こ一体化した、あるいは
共トランスフェクションで用いるべき一次細胞の表面上
の抗原決定基に対する抗体を担持するリポソーム内に含
まれた遊ＡＩ’ Ｄ Ｎ Ａとして懸副液に加えること
ができる。かかる共トランスフェクションを利用するエ
レクトロポレーションの好ましい条件、すなわち電気パ
ルスの数、振幅、電圧および長さは本発明の不滅化一次
細胞系の調製−ごついて概説したのと同じである。
エレクトロポレーションを行った後、前記で概説した如
き不滅化細胞系を同定する常法を用いることにより、お
よびいずれのかかる不滅化細胞系が外来の機能性ＤＮＡ
配列を含むかを同定する常法を用いること１こより６本
発明の共トランスフェクトされた不滅化一次細胞系を懸
肉液から回収する。
き不滅化細胞系を同定する常法を用いることにより、お
よびいずれのかかる不滅化細胞系が外来の機能性ＤＮＡ
配列を含むかを同定する常法を用いること１こより６本
発明の共トランスフェクトされた不滅化一次細胞系を懸
肉液から回収する。
回収後、本発明の共トランスフェクトされた不滅化一次
細胞系を常法によつＣクローン的に伸長させでかかる細
胞系の均質な集団を産生でき、これは適当な培地、すな
わちかかる細胞系が活性を保持しかつ増殖を継続できる
ようにする培地中で継続的に維持できる。当業者はかか
る培地を決定できる。
細胞系を常法によつＣクローン的に伸長させでかかる細
胞系の均質な集団を産生でき、これは適当な培地、すな
わちかかる細胞系が活性を保持しかつ増殖を継続できる
ようにする培地中で継続的に維持できる。当業者はかか
る培地を決定できる。
また１本発明は生物学的産生物の産生を可能とする条件
下で細胞系を増殖させることを特徴とするそのコーディ
ング配列が本発明の共トランスフＤＮＡに含まれる生物
学的産生物を提供するものである。前記の如く、「コー
ディング配列」なる語は、外来の機能性ＤＮＡ配列のコ
ーディング配列ならびに本発明の共トランスフェクトさ
れた不滅化一次細胞系を調製するのに用いる正常な、活
性化された／刺激された一次細胞のＤＮＡ内に天然に見
い出されるコーディング配列、ζらひにかかる細胞系の
調製に用いる腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子に含ま
れるコーディング配列を含有する。
下で細胞系を増殖させることを特徴とするそのコーディ
ング配列が本発明の共トランスフＤＮＡに含まれる生物
学的産生物を提供するものである。前記の如く、「コー
ディング配列」なる語は、外来の機能性ＤＮＡ配列のコ
ーディング配列ならびに本発明の共トランスフェクトさ
れた不滅化一次細胞系を調製するのに用いる正常な、活
性化された／刺激された一次細胞のＤＮＡ内に天然に見
い出されるコーディング配列、ζらひにかかる細胞系の
調製に用いる腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子に含ま
れるコーディング配列を含有する。
当業者は常法によつＣ１太発明の共トランスフェクトさ
れた不滅化一次細胞を所望の生物学的産生物を産生でき
る（産生能力がある）よう（こ培養する適当ζ培地条件
を容易番こ決定でき、該条件はとりわけ含まれる一次細
胞系のタイプおよび産生ずべき所望の生物学的産生物；
こ依存する。本発明の方法により本発明の共トランスフ
ェクトされた不滅化一次細胞系によって産生される生物
学的産生物はかかる細胞系番こよって直接培地中に分泌
されることがあり、その場合、単離を所望するならば、
当業者は通常の蛋白質単離技術を用いてかかる生物学的
産生物をかかる培地から単離できる。
れた不滅化一次細胞を所望の生物学的産生物を産生でき
る（産生能力がある）よう（こ培養する適当ζ培地条件
を容易番こ決定でき、該条件はとりわけ含まれる一次細
胞系のタイプおよび産生ずべき所望の生物学的産生物；
こ依存する。本発明の方法により本発明の共トランスフ
ェクトされた不滅化一次細胞系によって産生される生物
学的産生物はかかる細胞系番こよって直接培地中に分泌
されることがあり、その場合、単離を所望するならば、
当業者は通常の蛋白質単離技術を用いてかかる生物学的
産生物をかかる培地から単離できる。
生物学的産生物はかかる細胞系から分泌されないかも知
れず、その場合、単離を所望するへらば、常法を用いＣ
かかる生物学的産生物はかかる細胞系の培養溶解物から
単離される。
れず、その場合、単離を所望するへらば、常法を用いＣ
かかる生物学的産生物はかかる細胞系の培養溶解物から
単離される。
従って１本発明の共トランスフェクトされた不滅化一次
細胞系は（ａ）該細胞系を調製するのに本発明の方法で
用いる正常な、活性化／刺激された一次細胞中で天然に
見い出されるＤＮＡによってコード付けされるポリペプ
チド；（ｂ）本発明の方法で用いるｊ１瘍誘発性ＤＮＡ
、／腫瘍誘発遺伝子によってコード付けされるポリペプ
チド、および（ｃ）本発明の共トランスフェクトされた
不滅化一次細胞系に含まれ外来の機能性ＤＮＡ配Ｊｌ
ｉこよってコード付けされるポリペプチドについての継
続源を供給する。
細胞系は（ａ）該細胞系を調製するのに本発明の方法で
用いる正常な、活性化／刺激された一次細胞中で天然に
見い出されるＤＮＡによってコード付けされるポリペプ
チド；（ｂ）本発明の方法で用いるｊ１瘍誘発性ＤＮＡ
、／腫瘍誘発遺伝子によってコード付けされるポリペプ
チド、および（ｃ）本発明の共トランスフェクトされた
不滅化一次細胞系に含まれ外来の機能性ＤＮＡ配Ｊｌ
ｉこよってコード付けされるポリペプチドについての継
続源を供給する。
実質的に腫瘍誘発遺伝子よりζるＤＮＡを用いて正常一
次細胞を不滅化できることを見い出した。
次細胞を不滅化できることを見い出した。
かくしで、また、本発明はかかる不滅化が正常一次細胞
の、実質的に腫瘍誘発遺伝子よりなるＤＮＡでのトラン
スフェクションの結果である場合の不滅化一次細胞系を
提供するものである。かかる不滅化一次細胞系を調製す
る好ましい方法は１本発明の方法による正常一次細胞の
エレクトロポレーション−伝達トランスフェクション（
こよるものである。
の、実質的に腫瘍誘発遺伝子よりなるＤＮＡでのトラン
スフェクションの結果である場合の不滅化一次細胞系を
提供するものである。かかる不滅化一次細胞系を調製す
る好ましい方法は１本発明の方法による正常一次細胞の
エレクトロポレーション−伝達トランスフェクション（
こよるものである。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
１本発明はこれらに限定されるものではない。
１本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
リンパ球の刺激／活性化
リンパ球の刺激／活性化は以下の一般法を用いることに
よる如き常法によって達成される：（ａ＋種々の経路に
より抗原を動物（こ注射することによって正常ヒトまた
はマウスリンパ球を所望の抗原（量は変化させる）でｉ
ｌ ｖｉｖｏ にで活性化／刺激する。本発明の方法
ならびに注射数によって活性化／刺激とトランスフェク
ションとの間の時間を変化させることができる。ケネッ
トら（Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ、 ） 、カラント
・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・
イミュノロジー（ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ、
） 、 ８１．７７〜９４ （１９７８）によって報告
されでいる如くにマウス肝臓から正常な。
よる如き常法によって達成される：（ａ＋種々の経路に
より抗原を動物（こ注射することによって正常ヒトまた
はマウスリンパ球を所望の抗原（量は変化させる）でｉ
ｌ ｖｉｖｏ にで活性化／刺激する。本発明の方法
ならびに注射数によって活性化／刺激とトランスフェク
ションとの間の時間を変化させることができる。ケネッ
トら（Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ、 ） 、カラント
・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・
イミュノロジー（ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ、
） 、 ８１．７７〜９４ （１９７８）によって報告
されでいる如くにマウス肝臓から正常な。
刺激／活性化されたリンパ球を取り出す。
（ｂｌ刺激／活性化剤として抗原またはマイトジェンを
用いることによって正常なヒトまたはマウスリンパ球を
ｉｎ ｖｉｔｒｏ で刺激／活性化する。特異的抗原
での刺激／活性化のための該ｉｎ ｖｉｔｒ。
用いることによって正常なヒトまたはマウスリンパ球を
ｉｎ ｖｉｔｒｏ で刺激／活性化する。特異的抗原
での刺激／活性化のための該ｉｎ ｖｉｔｒ。
法はヨナークら（Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｌ、 ）、
／１イブリド−７（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ） 、３
．１０７〜１１８（１９８４）＋こよって記載されたも
のの変法である。
／１イブリド−７（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ） 、３
．１０７〜１１８（１９８４）＋こよって記載されたも
のの変法である。
（ｃｌ ｉｎ ｖｉｖｏ で初回抗原刺激を受けた正
常ヒトまたはマウスリンパ球を所望の抗原／マイトジェ
ンでｉｎ ｆｖｌｔｒｏ にて再度刺激する。
常ヒトまたはマウスリンパ球を所望の抗原／マイトジェ
ンでｉｎ ｆｖｌｔｒｏ にて再度刺激する。
実施例２
ヒトリンパ球の不滅化
本発明の方法による腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子
での不滅化一次細胞の産生の一般例として、正常なヒト
リンパ球の懸濁液および腫瘍誘発遺伝子ＤＮＡを混合し
、以下の実験法；こよつで高電圧電気パルスに暴露する
。
での不滅化一次細胞の産生の一般例として、正常なヒト
リンパ球の懸濁液および腫瘍誘発遺伝子ＤＮＡを混合し
、以下の実験法；こよつで高電圧電気パルスに暴露する
。
リムフオプレプ（Ｉｙｍｐｈｏｐｒｅｐ ） を用い
、遠心により、正常なヒトリンパ球（末梢血液リンパ球
）を精製する。実施例１に記載した如く番こ細胞を活性
化／刺激する。かかる正常な、活性化／刺激された一次
細胞を水冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ。
、遠心により、正常なヒトリンパ球（末梢血液リンパ球
）を精製する。実施例１に記載した如く番こ細胞を活性
化／刺激する。かかる正常な、活性化／刺激された一次
細胞を水冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ。
ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２ の添加なし）中に懸局
し、再び遠心する（２００Ｘｇ／１０分間）。ペレット
を１〜５×１０７ 細胞／ｒｎ！ｌの濃度でＰＢＳ中に
再ＨＵＢする。その由来が機能性腫瘍誘発遺伝子（１〜
２０μｇ ／ ｍＱ ）を含有するＢリンパ球細抱タイ
プまたはプラスミドＤＮＡ （ｐ５３−Ｈ７）に対応す
るヒ＋−肺ｉ細胞系（バーキットリンパ腫、ＢＪＡＢ
）から精製したゲノムＤＮＡ（４０〜５０μｇ ／ ｍ
Ｑ ）を細胞！ｖ局液に加え、ＢＴＸ エレクトロ・
セル・マニピュレーター（Ｅｌｅｃｔｒｏ ＣｅｌｌＭ
ａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ） 、モデル４０１のエレクト
ロポレーションチャンバー中、０℃にで１０分間インキ
ュベートする。ＢＴＸエレクトロ・セル・マニピュレー
ター（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅ１ｌ Ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｏｒ ） 。
し、再び遠心する（２００Ｘｇ／１０分間）。ペレット
を１〜５×１０７ 細胞／ｒｎ！ｌの濃度でＰＢＳ中に
再ＨＵＢする。その由来が機能性腫瘍誘発遺伝子（１〜
２０μｇ ／ ｍＱ ）を含有するＢリンパ球細抱タイ
プまたはプラスミドＤＮＡ （ｐ５３−Ｈ７）に対応す
るヒ＋−肺ｉ細胞系（バーキットリンパ腫、ＢＪＡＢ
）から精製したゲノムＤＮＡ（４０〜５０μｇ ／ ｍ
Ｑ ）を細胞！ｖ局液に加え、ＢＴＸ エレクトロ・
セル・マニピュレーター（Ｅｌｅｃｔｒｏ ＣｅｌｌＭ
ａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ） 、モデル４０１のエレクト
ロポレーションチャンバー中、０℃にで１０分間インキ
ュベートする。ＢＴＸエレクトロ・セル・マニピュレー
ター（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅ１ｌ Ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｏｒ ） 。
モデル４０１によって３〜５回の電気パルス（電気パル
スを与えた後、細胞およびＤＮＡを０℃にで１０分間放
置し、次いで調整ＴＹ培地（ヨナークら（Ｊｏｎａｋ
ｅｔ ａｌ、 ）、「モノクローナル・アンテイボデイ
ズ・アンＦ゛・ファンクショナル・セル・ライング（Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅ１ｌ Ｌｉｎｅｓ ） ｊ
、 プレラム・プレス（Ｐｌｅｒｕｍ Ｐｒｅｓｓ
） 、 ４１８〜４２２．１９８４）５ｍＱに加え、
９６個のウェルプレートに分配する。新しい培地を週−
回または要すれば細胞に与える。
スを与えた後、細胞およびＤＮＡを０℃にで１０分間放
置し、次いで調整ＴＹ培地（ヨナークら（Ｊｏｎａｋ
ｅｔ ａｌ、 ）、「モノクローナル・アンテイボデイ
ズ・アンＦ゛・ファンクショナル・セル・ライング（Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅ１ｌ Ｌｉｎｅｓ ） ｊ
、 プレラム・プレス（Ｐｌｅｒｕｍ Ｐｒｅｓｓ
） 、 ４１８〜４２２．１９８４）５ｍＱに加え、
９６個のウェルプレートに分配する。新しい培地を週−
回または要すれば細胞に与える。
エレクトロポレーションによりＢＪＡＢ ヒトバーキッ
トリンパ腫細胞系からの腫瘍誘発性ＤＮＡまたは腫瘍誘
発遺伝子（発現ベクター中に挿入した機能性腫瘍誘発遺
伝子）ｐ５３でヒトリンパ球をトランスフェクトする実
験においで、好結果の高効率不滅化が達成された。この
成功は、得られた細胞の継続的に増殖するものの数が多
いことによって明確に証明された。対照実験においでは
。
トリンパ腫細胞系からの腫瘍誘発性ＤＮＡまたは腫瘍誘
発遺伝子（発現ベクター中に挿入した機能性腫瘍誘発遺
伝子）ｐ５３でヒトリンパ球をトランスフェクトする実
験においで、好結果の高効率不滅化が達成された。この
成功は、得られた細胞の継続的に増殖するものの数が多
いことによって明確に証明された。対照実験においでは
。
腫瘍誘発性Ｄ Ｎ Ａ／ＩＩＩｇ誘発遺伝子を正常ＤＮ
Ａで置き換えるかまたは省略する以外はリンパ球を同一
処理した。腫瘍誘発性Ｄ Ｎ Ａ／ＩＩＩ瘍誘発遺伝子
でトランスフェクトした培養物を対照と比較することに
より、（クローンの数で示す）増殖を示す細胞数は＠瘍
誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子についでかなり多いこと
が示された。対照実験における細胞は３週間以内に死滅
した。１１１！瘍誘発・隨ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でト
ランスフェクトした細胞は６週間ζいし数ケ月にわたる
継続的な増殖を示し、それによりその不滅化が蒔認され
た。
Ａで置き換えるかまたは省略する以外はリンパ球を同一
処理した。腫瘍誘発性Ｄ Ｎ Ａ／ＩＩＩ瘍誘発遺伝子
でトランスフェクトした培養物を対照と比較することに
より、（クローンの数で示す）増殖を示す細胞数は＠瘍
誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子についでかなり多いこと
が示された。対照実験における細胞は３週間以内に死滅
した。１１１！瘍誘発・隨ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でト
ランスフェクトした細胞は６週間ζいし数ケ月にわたる
継続的な増殖を示し、それによりその不滅化が蒔認され
た。
実施例３
マウスリンパ球の不滅化
Ｂａ１ｂ／ｃ マウス（チャールズ・リバー・ラボラ
トリーズ（ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ ）からの雌）からの肝臓細胞を全肝
臓の静流によって調製し、赤血球細胞を浴解させるため
に４℃にで５分間、０．８３％ＮＨ４Ｃｌで処理した。
トリーズ（ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ ）からの雌）からの肝臓細胞を全肝
臓の静流によって調製し、赤血球細胞を浴解させるため
に４℃にで５分間、０．８３％ＮＨ４Ｃｌで処理した。
次いで。
リンパ球を遠心し、多量のグルコースを含むダルベラコ
ラの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ ）５ｍＱでペレット
を再懸濁しくセロツテイニイら（ｃｅｒｏｔｔｉｎｉｅ
ｔ ａｌ、 ）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メデイシン（Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 ） 、１
４０ 。
ラの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ ）５ｍＱでペレット
を再懸濁しくセロツテイニイら（ｃｅｒｏｔｔｉｎｉｅ
ｔ ａｌ、 ）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メデイシン（Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 ） 、１
４０ 。
７（１１）〜７１７ （１９７４） 参照）、ナイロ
ンウールカラム上に加えた（該カラム上の充填ナイロン
ウールは１０ｍＱ、であった）。該カラムを３７℃に４
５分間保ち、３７℃まで加温した５％胎児ウシ血清（Ｆ
Ｃ３） を補足したＤＭＥＭ培地２培地２蛋ρ過によ
り１９２８球を除去した（シュリアスら（ Ｊｕｌｉｕ
ｓ ｅｔ ａｔ． ） 、ユ，７．アラーピーアン・ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ−Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． ） 、３ ： ６４５、１９７３ ）。次
いで、該ナイロンウールを同一培地２０ｍｆｆ１と混合
することによつｒＢｌ）ンパ球をカラムから回収した。
ンウールカラム上に加えた（該カラム上の充填ナイロン
ウールは１０ｍＱ、であった）。該カラムを３７℃に４
５分間保ち、３７℃まで加温した５％胎児ウシ血清（Ｆ
Ｃ３） を補足したＤＭＥＭ培地２培地２蛋ρ過によ
り１９２８球を除去した（シュリアスら（ Ｊｕｌｉｕ
ｓ ｅｔ ａｔ． ） 、ユ，７．アラーピーアン・ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ−Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． ） 、３ ： ６４５、１９７３ ）。次
いで、該ナイロンウールを同一培地２０ｍｆｆ１と混合
することによつｒＢｌ）ンパ球をカラムから回収した。
細胞を遠心し，ペレット（１の肺臓から約４ｘｌＯ１固
のＢ細胞）を５％ＦＣ３ を補足したＤＭＥＭ の
イスコブ（ ｌ５ｃｏｖｅ ）修正物（ ＲＰＭＩ １
６４０ ）（ムーアら（ Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．
） 、シイ・エイ・エム・エイ（ ＧＡＭＡ ） 、
１９９， ５１９〜５２４（１９６７）参照）で再懸濁
した。細胞（ａｘｉｏ ） を、５％加熱不活性化
ＦＣＳ、 ２ｍＭグルタミン、５Ｘ１０−５Ｍ２−メル
カプトエタノールおよびゲンタマイシンを補足したＲＰ
ＭＩ １６４０ 培地２０ｍＱと共に組織培養フラス
コ中，７％ＣＯ２ においで３７℃にでインキュベート
した。
のＢ細胞）を５％ＦＣ３ を補足したＤＭＥＭ の
イスコブ（ ｌ５ｃｏｖｅ ）修正物（ ＲＰＭＩ １
６４０ ）（ムーアら（ Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．
） 、シイ・エイ・エム・エイ（ ＧＡＭＡ ） 、
１９９， ５１９〜５２４（１９６７）参照）で再懸濁
した。細胞（ａｘｉｏ ） を、５％加熱不活性化
ＦＣＳ、 ２ｍＭグルタミン、５Ｘ１０−５Ｍ２−メル
カプトエタノールおよびゲンタマイシンを補足したＲＰ
ＭＩ １６４０ 培地２０ｍＱと共に組織培養フラス
コ中，７％ＣＯ２ においで３７℃にでインキュベート
した。
マイトジェン誘発刺激に１２、精製したＢリンパ球を２
０μｇ ／ ｍＱ ’Ｊポ多糖類（ＬＰＳ） と共にイ
ンキュベートした。最大刺激は細胞をＬＰＳで２４〜４
８時間刺激した後に達成された（ Ｈ−チミジン０ＤＮ
Ａ中への一体化を刺激の程度を示すのに用いた）。培養
の２４〜４８時間後、細胞（リンパ芽球）をＰＢＳ緩衝
液（ ＣａＣｌ２ およびＭｇＣ＋２なし）で２回洗浄
し、２Ｘ１０６〜２×１０７細胞／ｍＱの細胞濃度で再
懸濁し，０℃に保った。腫瘍誘発性ＤＮＡ源はＥＬ４ネ
ズミ胸腺腫細胞系（ＡＴＣＣ ＴｌＢ５９ ）からの精
製したゲノムＤＮＡまたは適当な表現ベクターに挿入し
た（Ｔ２４（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４ ） から単離Ｌ タ
） Ｍ瘍誘発遺伝子Ｈａ−ｒａｓ であった。（ａｌ
ＢＴＸセル・マニピュレーター（ Ｃｅ１ｌ Ｍａｎｉ
ｐｕｌａｔｏｒ ） 、モデル４０１のエレクトロポレ
ーションチャンバー中にＰＢＳの１０６〜１０７細胞１
０．５−をゲノムＤＮＡ４０μｇまたは＋ａ瘍誘発遺伝
子１０〜１００”？と共に）び局し１次いで（ｂ）３〜
５回の電気パルスＣ最大の時間および振幅）を与えるこ
と（こよつでエレクトロポＬ／ーションヲ達成シｆ．：
、。エレクトロポレーションの後、細胞を０℃にで１０
分間放置し１次いてそれをＴＹ培地〔ヨナークら（ Ｊ
ｏｎａｋ’ ｅｔ ａｌ． ） 。
０μｇ ／ ｍＱ ’Ｊポ多糖類（ＬＰＳ） と共にイ
ンキュベートした。最大刺激は細胞をＬＰＳで２４〜４
８時間刺激した後に達成された（ Ｈ−チミジン０ＤＮ
Ａ中への一体化を刺激の程度を示すのに用いた）。培養
の２４〜４８時間後、細胞（リンパ芽球）をＰＢＳ緩衝
液（ ＣａＣｌ２ およびＭｇＣ＋２なし）で２回洗浄
し、２Ｘ１０６〜２×１０７細胞／ｍＱの細胞濃度で再
懸濁し，０℃に保った。腫瘍誘発性ＤＮＡ源はＥＬ４ネ
ズミ胸腺腫細胞系（ＡＴＣＣ ＴｌＢ５９ ）からの精
製したゲノムＤＮＡまたは適当な表現ベクターに挿入し
た（Ｔ２４（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４ ） から単離Ｌ タ
） Ｍ瘍誘発遺伝子Ｈａ−ｒａｓ であった。（ａｌ
ＢＴＸセル・マニピュレーター（ Ｃｅ１ｌ Ｍａｎｉ
ｐｕｌａｔｏｒ ） 、モデル４０１のエレクトロポレ
ーションチャンバー中にＰＢＳの１０６〜１０７細胞１
０．５−をゲノムＤＮＡ４０μｇまたは＋ａ瘍誘発遺伝
子１０〜１００”？と共に）び局し１次いで（ｂ）３〜
５回の電気パルスＣ最大の時間および振幅）を与えるこ
と（こよつでエレクトロポＬ／ーションヲ達成シｆ．：
、。エレクトロポレーションの後、細胞を０℃にで１０
分間放置し１次いてそれをＴＹ培地〔ヨナークら（ Ｊ
ｏｎａｋ’ ｅｔ ａｌ． ） 。
「モノクローナル・アンテイボデイズ・アンド・ファン
クショナル・セル・ライング（プログレス・アンド・ア
プリケーションズ） （Ｍｏｎｏ。１ｏｎａｌＡｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅ１
ｌ Ｌｉｎｅｓ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｒ＋ｓ） ） Ｊ 、 プレナム・
プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ ）、４１８〜４２
２（１９８４）参照〕で１０ 細胞／ｍρの濃度に希
釈した。次いで、９６個のウェルプレート中、３７℃に
で、２Ｘ１０” 細胞／ウェルの濃度で細胞をインキ
ュベートした。各ウェルの細胞（こ新しい培地を与えた
。３〜４週間の培養の後、細胞増殖を示すウェルを伸長
した。かかる細胞は芽細胞の形態を有しでおり、培地中
で数カ月間増殖した。これらの実験の結果は、腫瘍誘発
性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でのエレクトロポレーション
伝達トランスフェクションの後、未刺激リンパ球は増殖
しなかったので、刺激が不滅化（こおいて本質的役割を
演じでいることを示すものであった。
クショナル・セル・ライング（プログレス・アンド・ア
プリケーションズ） （Ｍｏｎｏ。１ｏｎａｌＡｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅ１
ｌ Ｌｉｎｅｓ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｒ＋ｓ） ） Ｊ 、 プレナム・
プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ ）、４１８〜４２
２（１９８４）参照〕で１０ 細胞／ｍρの濃度に希
釈した。次いで、９６個のウェルプレート中、３７℃に
で、２Ｘ１０” 細胞／ウェルの濃度で細胞をインキ
ュベートした。各ウェルの細胞（こ新しい培地を与えた
。３〜４週間の培養の後、細胞増殖を示すウェルを伸長
した。かかる細胞は芽細胞の形態を有しでおり、培地中
で数カ月間増殖した。これらの実験の結果は、腫瘍誘発
性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でのエレクトロポレーション
伝達トランスフェクションの後、未刺激リンパ球は増殖
しなかったので、刺激が不滅化（こおいて本質的役割を
演じでいることを示すものであった。
実施例４
エレクトロポレーション／ＤＮＡ−リポソーム送達
本発明のエレクトロポレーション技術は、腫瘍誘発遺伝
子／腫ＧＫ発性ＤＮＡを含有する抗体／蛋白質Ａ担持リ
ポソームの使用をエレクトロポレーションと組み合せる
ことができる。
子／腫ＧＫ発性ＤＮＡを含有する抗体／蛋白質Ａ担持リ
ポソームの使用をエレクトロポレーションと組み合せる
ことができる。
逆相蒸発法（スゾカおよびパパハジョポウロス（５ｚｏ
ｋａ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ）
、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ｋａ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ）
、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
）ＵＳＡ 、７５ ： ４１９４〜４１９８、（１９７
８） ）の変法により、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオプロピオネート）（ＳＰＤ
Ｐ ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） ）
で修飾した５４モル％シミリストイルホスファチジル
コリン（アバンテイ（Ａｖａｎｔｉ ）極性脂質）、１
０モル％シミリストイルホスファチジルセリン（アバン
テイ（Ａｖａｎｔｉ ） ）、３５モル％コレステロー
ル（シグマ（Ｓｉｇｍａ ） ）および１モル％ジパル
ミトイルホスファチジルエタノールアミン（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ ） ）の脂質組成物の大きな単層小胞を調製
した。脂質を１ｍｆｆ１クロロホルム／ ２ ｍＱジイ
ソプロピルエーテル（メルク（Ｍｅｒｋ））に溶解シた
。すでに記載（マシイおよびレーザーマン（Ｍａｃｈｙ
ａｎｄ Ｌｅｓｅｒｍａｎ ）、ビオフイジ力・工ｅ
ビオシミ力・アクタ（Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ。
８） ）の変法により、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオプロピオネート）（ＳＰＤ
Ｐ ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） ）
で修飾した５４モル％シミリストイルホスファチジル
コリン（アバンテイ（Ａｖａｎｔｉ ）極性脂質）、１
０モル％シミリストイルホスファチジルセリン（アバン
テイ（Ａｖａｎｔｉ ） ）、３５モル％コレステロー
ル（シグマ（Ｓｉｇｍａ ） ）および１モル％ジパル
ミトイルホスファチジルエタノールアミン（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ ） ）の脂質組成物の大きな単層小胞を調製
した。脂質を１ｍｆｆ１クロロホルム／ ２ ｍＱジイ
ソプロピルエーテル（メルク（Ｍｅｒｋ））に溶解シた
。すでに記載（マシイおよびレーザーマン（Ｍａｃｈｙ
ａｎｄ Ｌｅｓｅｒｍａｎ ）、ビオフイジ力・工ｅ
ビオシミ力・アクタ（Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ。
Ａｃｔａ、 ） 、 ７３０ ： ３１３〜３２０ に
枇ホ、 （１９８３）。
枇ホ、 （１９８３）。
マシイおよびレーザーマン（Ｍａｃｈｙ ａｎｄＬｅｓ
ｅｒｍａｎ ） 、 ｒリポソーム８テクノロジー（
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） Ｊ （
グレゴリアゾイス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ）編）シ
イ・アール・シイ・プレス（ｃＲＣＰｒｅｓｓ ） 、
クリーブランド（ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ ） 、Ｉ巻：
２２１〜２３４ 、 （１９８４））されでいる如くに
、水性相（緩衝液食塩水中の同位元素標識した一部と共
にプラスミドＤ Ｎ Ａの１ ｍ９〜２ ｍＷを含有す
る１ ｍＱ ）および有機相をルーエルロック付きの別
々の気密ガラスシリンジ中に入れた。金属製三方ストッ
プコックにより該シリンジを連結した。水性相を有機相
中ζこ注入し、次いで混合物をすばやくシリンジからシ
リンジに１０〜２０回通した。脂質−水性エマルジョン
を１４ｍＱの回転蒸発管（こ移し、４５℃まで加温し、
有成相を圧力３５０〜４００ ｍｍＨｇ で除去した
。次いて、０．４μｍのユニポア（Ｕｎｉｐｏｒｅ ）
ポリカーボネートフィルター（パイオーラド（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ））を通す一過によって、逆相蒸発小胞（Ｒ
ＥＶ ） を大きさに基づいて選択した（オルソンら
（０１ｓｏｎ ｅｔ ａｔ、 ）、ビオシミ力・工・ヒ
オフイジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、 Ａｃｔａ ） 。
ｅｒｍａｎ ） 、 ｒリポソーム８テクノロジー（
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） Ｊ （
グレゴリアゾイス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ）編）シ
イ・アール・シイ・プレス（ｃＲＣＰｒｅｓｓ ） 、
クリーブランド（ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ ） 、Ｉ巻：
２２１〜２３４ 、 （１９８４））されでいる如くに
、水性相（緩衝液食塩水中の同位元素標識した一部と共
にプラスミドＤ Ｎ Ａの１ ｍ９〜２ ｍＷを含有す
る１ ｍＱ ）および有機相をルーエルロック付きの別
々の気密ガラスシリンジ中に入れた。金属製三方ストッ
プコックにより該シリンジを連結した。水性相を有機相
中ζこ注入し、次いで混合物をすばやくシリンジからシ
リンジに１０〜２０回通した。脂質−水性エマルジョン
を１４ｍＱの回転蒸発管（こ移し、４５℃まで加温し、
有成相を圧力３５０〜４００ ｍｍＨｇ で除去した
。次いて、０．４μｍのユニポア（Ｕｎｉｐｏｒｅ ）
ポリカーボネートフィルター（パイオーラド（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ））を通す一過によって、逆相蒸発小胞（Ｒ
ＥＶ ） を大きさに基づいて選択した（オルソンら
（０１ｓｏｎ ｅｔ ａｔ、 ）、ビオシミ力・工・ヒ
オフイジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、 Ａｃｔａ ） 。
５５７ ： ９〜２３ （１９７９）。
１０モル５ＰＤＰ１モル蛋白質Ａ（終濃度２００μｇ
／ｒｎρ）メこよって修飾したヨウ素化蛋白質Ａ（エヌ
・イー・ニス（ＮＥＮ ）） の一部を含む蛋白質Ａ
（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） ）と共に
リポソームをインキュベートした（レーザーマンら（Ｌ
ｅｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ、 ） 、ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、２８８ ： ６０２〜６０４．（１９
８０）；マシイら（Ｍａｃｈｙ ｅｔ ａｔ、 ）、ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、 ）、１２９ ： ２０９８〜２１０２．（１
９８２））。脂質の終濃度は２０ｍＭ近傍であった。室
温にで２０時間、Ｌ緩衝液（１４５ｍ（！ＮａＣ１，１
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８）中でカップリング反応を
行った。結合するに先立ち、ＤＮＡ含有含有蛋白質波覆
リポソームを以下の如くに精製した： １０ ｍＲＭｇ
ＣＩ Ｍｇ Ｃ］ ２ を補足したし緩衝液中、Ｄ
Ｎアーゼ■（シグマ（Ｓ ｉｇｍａ ） ） ５０μｇ
／ｍＱ と共にリポソームラ２５℃にて３０分間イ
ンキュベートした。次いで、ＤＮＡ を含有する蛋白質
Ａ被覆−リポソームをＬ緩衝液（＋）Ｈ７，４５） で
平衡化したセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ） ４
Ｂ ’−ＣＬ に通した。かくして。
／ｒｎρ）メこよって修飾したヨウ素化蛋白質Ａ（エヌ
・イー・ニス（ＮＥＮ ）） の一部を含む蛋白質Ａ
（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） ）と共に
リポソームをインキュベートした（レーザーマンら（Ｌ
ｅｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ、 ） 、ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、２８８ ： ６０２〜６０４．（１９
８０）；マシイら（Ｍａｃｈｙ ｅｔ ａｔ、 ）、ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、 ）、１２９ ： ２０９８〜２１０２．（１
９８２））。脂質の終濃度は２０ｍＭ近傍であった。室
温にで２０時間、Ｌ緩衝液（１４５ｍ（！ＮａＣ１，１
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８）中でカップリング反応を
行った。結合するに先立ち、ＤＮＡ含有含有蛋白質波覆
リポソームを以下の如くに精製した： １０ ｍＲＭｇ
ＣＩ Ｍｇ Ｃ］ ２ を補足したし緩衝液中、Ｄ
Ｎアーゼ■（シグマ（Ｓ ｉｇｍａ ） ） ５０μｇ
／ｍＱ と共にリポソームラ２５℃にて３０分間イ
ンキュベートした。次いで、ＤＮＡ を含有する蛋白質
Ａ被覆−リポソームをＬ緩衝液（＋）Ｈ７，４５） で
平衡化したセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ） ４
Ｂ ’−ＣＬ に通した。かくして。
カップリングが行われなかった蛋白質Ａおよび分解した
未封入ＤＮＡはリポソーム調製物から除去された。通常
、ＤＮＡの約５％が封入され、蛋白質Ａの５〜１０％が
リポソームの表面にカップリングされた。
未封入ＤＮＡはリポソーム調製物から除去された。通常
、ＤＮＡの約５％が封入され、蛋白質Ａの５〜１０％が
リポソームの表面にカップリングされた。
かかる好ましいリポソームをリンパ球と共に以下の如く
にイノキュベートした： ヒトＢ細胞（１０７）を４０μｇ／ｒｎＱの単クローン
抗体と共に４℃にて１時間インキュベートする。
にイノキュベートした： ヒトＢ細胞（１０７）を４０μｇ／ｒｎＱの単クローン
抗体と共に４℃にて１時間インキュベートする。
次いで、細胞を洗浄して未結合抗体を除去し、ＤＮＡ含
有含有蛋白質波覆リポソーム３μｇと共に４℃にて２時
間インキュベートする。リポソームは抗体で前処理した
細胞に結合する。次いで。
有含有蛋白質波覆リポソーム３μｇと共に４℃にて２時
間インキュベートする。リポソームは抗体で前処理した
細胞に結合する。次いで。
細胞を前記の如くエレクトロポレーションに付す。
リポソームの添加に先立ちこれらの細胞を抗−ＨＣＡ
抗体と共にインキュベートすると１例として、ウェルの
少くとも３５％がトランスフェクトされた細胞を示した
。不適切な抗体の場合あるいは抗体なしの場合、ウェル
の８〜１０％のみがトランスフェクトされた細胞を示し
た。細胞を抗−ＨＬＡ抗体およびリポソームと共にイン
キュベートするがエレクトロポレーションを行なわない
場合、細胞はトランスフェクトされζかった。本実施例
の結論は、エレクトロポレーションを用いることにより
、標的リポソームのみが細胞をトランスフェクトできる
ということである。
抗体と共にインキュベートすると１例として、ウェルの
少くとも３５％がトランスフェクトされた細胞を示した
。不適切な抗体の場合あるいは抗体なしの場合、ウェル
の８〜１０％のみがトランスフェクトされた細胞を示し
た。細胞を抗−ＨＬＡ抗体およびリポソームと共にイン
キュベートするがエレクトロポレーションを行なわない
場合、細胞はトランスフェクトされζかった。本実施例
の結論は、エレクトロポレーションを用いることにより
、標的リポソームのみが細胞をトランスフェクトできる
ということである。
本発明のアプローチの利点は、（リポソームに封入され
た）ＤＮＡが細胞の混合集団中の所望の細胞タイプ（例
えば、成熟したＢ細胞、単球）に特異的に与えられると
いうことである。電気パルスを適用することによってリ
ポソームの含有物〔腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子
〕は細胞に導入される。リポソームが標的細胞と融合す
ることは予期または所望されず、むしろ電気パルスを適
用することによって、ＤＮＡは標的細胞およびリポソー
ム間に形成される（電気パルスの結果からの）孔を通っ
て細胞中に挿入されることを指摘しでおこう。本修飾の
利点はリンパ球の混合集団中の所望の細胞タイプに特異
的番こ与えられたＤＮＡの量である。
た）ＤＮＡが細胞の混合集団中の所望の細胞タイプ（例
えば、成熟したＢ細胞、単球）に特異的に与えられると
いうことである。電気パルスを適用することによってリ
ポソームの含有物〔腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子
〕は細胞に導入される。リポソームが標的細胞と融合す
ることは予期または所望されず、むしろ電気パルスを適
用することによって、ＤＮＡは標的細胞およびリポソー
ム間に形成される（電気パルスの結果からの）孔を通っ
て細胞中に挿入されることを指摘しでおこう。本修飾の
利点はリンパ球の混合集団中の所望の細胞タイプに特異
的番こ与えられたＤＮＡの量である。
以上、本発明の好ましい具体例についＣ説明したが１本
発明の精神を逸脱することなく１種々の変形および修飾
を加えることができることは当業者に明らかであり、そ
れらも本発明範囲のものである。
発明の精神を逸脱することなく１種々の変形および修飾
を加えることができることは当業者に明らかであり、そ
れらも本発明範囲のものである。
Ｗ ｆｆ 出願人 ヌミスクライン・ベックマン・コー
ポレイション
ポレイション
Claims (52)
- （１）（ａ）正常な、活性化／刺激された一次細胞を供
し； （ｂ）エレクトロポレーシヨンによつて、所望によりリ
ポソームに含まれていてよい腫瘍誘発性ＤＮＡ／腫瘍誘
発遺伝子でかかる一次細胞をトランスフエクトしてトラ
ンスフエクトされた一次細胞を産生し；次いで （ｃ）かかるトランスフエクトされた一次細胞から不滅
化一次細胞系を回収することを特徴とする不滅化一次細
胞系の産生法。 - （２）該腫瘍誘発性ＤＮＡが一次細胞腫瘍または腫瘍一
次細胞系からのゲノムＤＮＡであり、かかる腫瘍または
腫瘍細胞系が不滅化されるべき一次細胞タイプに対応す
る起源を有する前記第（１）項の方法。 - （３）該腫瘍誘発遺伝子が一次細胞腫瘍または腫瘍一次
細胞系からのものであり、かかる腫瘍または腫瘍細胞系
が不滅化されるべき一次細胞タイプに対応する起源を有
する前記第（１）項の方法。 - （４）該一次細胞が造血起源のものである前記第（２）
項の方法。 - （５）該一次細胞が多潜能幹細胞、Ｂリンパ球、Ｂ系統
前駆体、Ｔリンパ球、Ｔ系統前駆体、骨髄幹細胞、単球
、マクロファージ、好中球、好エオシン球、巨大核細胞
または肥胖細胞である前記第（３）項の方法。 - （６）該一次細胞がＢリンパ球である前記第（４）項の
方法。 - （７）該Ｂリンパ球が抗原で活性化／刺激されたもので
ある前記第（５）項の方法。 - （８）該腫瘍誘発遺伝子がＨａ−ｒａｓ腫瘍誘発遺伝子
またはｐ５３−Ｈ７腫瘍誘発遺伝子である前記第（５）
項の方法。 - （９）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＢＪＡＢからのゲノムＤＮ
Ａである前記第（６）項の方法。 - （１０）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＲＥＨ細胞系からのゲノ
ムＤＮＡである前記第（６）項の方法。 - （１１）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＥＬ４細胞系からのゲノ
ムＤＮＡである前記第（６）項の方法。 - （１２）前記第（１）項の方法によつて産生された不滅
化一次細胞系。 - （１３）該腫瘍誘発性ＤＮＡが一次細胞腫瘍または腫瘍
一次細胞系からのゲノムＤＮＡであり、かかる腫瘍また
は腫瘍細胞系が不滅化されるべき一次細胞タイプに対応
する起源を有する前記第（１２）項の細胞系。 - （１４）該腫瘍誘発遺伝子が一次細胞腫瘍または腫瘍一
次細胞系からのものであり、かかる腫瘍または腫瘍細胞
系が不滅化されるべき一次細胞タイプに対応する起源を
有する前記第（１２）項の細胞系。 - （１５）該一次細胞が造血起源のものである前記第（１
２）項の細胞系。 - （１６）該一次細胞が多潜能幹細胞、Ｂリンパ球、Ｂ系
統前駆体、Ｔリンパ球、Ｔ系統前駆体、骨髄幹細胞、単
球、マクロファージ、好中球、好エオシン球、巨大核細
胞または肥胖細胞である前記第（１５）項の細胞系。 - （１７）該一次細胞がＢリンパ球である前記第（１６）
項の細胞系。 - （１８）該Ｂリンパ球が抗原で活性化／刺激されたもの
である前記第（１７）項の細胞系。 - （１９）該腫瘍誘発遺伝子がＨａ−ｒａｓ腫瘍誘発遺伝
子である前記第（１６）項の細胞系。 - （２０）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＢＪＡＢからのゲノムＤ
ＮＡである前記第（１６）項の細胞系。 - （２１）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＲＥＨ細胞系からのゲノ
ムＤＮＡである前記第（１６）項の細胞系。 - （２２）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＥＬ４細胞系からのゲノ
ムＤＮＡである前記第（１６）項の細胞系。 - （２３）（ａ）正常な、活性化／刺激された一次細胞を
供し； （ｂ）エレクトロポレーシヨンによつて、かかる一次細
胞を、所望によりリポソームに含まれていてよい腫瘍誘
発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子でトランスフエクトしてト
ランスフエクトされた一次細胞を産生し； （ｃ）かかるトランスフエクトされた一次細胞から不滅
化一次細胞系を回収し；次いで （ｄ）生物学的産生物の産生を可能とする条件下でかか
る不滅化細胞系を培養することを特徴とするそのコーデ
ィング配列が不滅化一次細胞系内に含有されるＤＮＡか
らなる生物学的産生物の産生法。 - （２４）（ａ）正常な、活性化／刺激された一次細胞を
供し； （ｂ）エレクトロポレーシヨンによつて、かかる一次細
胞を、所望によりリポソームに含まれていてよい腫瘍誘
発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子および外来の機能性ＤＮＡ
で共トランスフエクトして共トランスフエクトされた一
次細胞を産生し；次いで （ｃ）かかる共トランスフエクトされた一次細胞から外
来の機能性ＤＮＡ配列を含有する不滅化一次細胞系を回
収することを特徴とする外来の機能性ＤＮＡ配列を含有
する共トランスフエクトされた不滅化一次細胞系の産生
法。 - （２５）該腫瘍誘発性ＤＮＡが一次細胞腫瘍または腫瘍
一次−細胞系からのゲノムＤＮＡであり、かかる腫瘍ま
たは腫瘍細胞−系が不滅化されるべき一次細胞タイプに
対応する起源を有する前記第（２４）項の方法。 - （２６）該腫瘍誘発遺伝子が一次細胞腫瘍または腫瘍一
次細胞系からのものであり、かかる腫瘍または腫瘍細胞
系が不滅化されるべき一次細胞タイプに対応する起源を
有する前記第（２４）項の方法。 - （２７）該一次細胞が造血起源のものである前記第（２
４）項の方法。 - （２８）該一次細胞が多潜能幹細胞、Ｂリンパ球、Ｂ系
統前駆体、Ｔリンパ球、Ｔ系統前駆体、骨髄幹細胞、単
球、マクロファージ、好中球、好エオシン球、巨大核細
胞または肥胖細胞である前記第（２７）項の方法。 - （２９）該一次細胞がＢリンパ球である前記第（２８）
項の方法。 - （３０）該Ｂリンパ球が抗原で活性化／刺激されたもの
である前記第（２９）項の方法。 - （３１）該腫瘍誘発遺伝子がＨａ−ｒａｓ腫瘍誘発遺伝
子またはｐ５３−Ｈ７腫瘍誘発遺伝子である前記第（２
９）項の方法。 - （３２）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＢＪＡＢからのゲノムＤ
ＮＡである前記第（２９）項の方法。 - （３３）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＲＥＨ細胞系からのゲノ
ムＤＮＡである前記第（２９）項の方法。 - （３４）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＥＬ４細胞系からのゲノ
ムＤＮＡである前記第（２９）項の方法。 - （３５）前記第（２４）項の方法によつて産生された、
共トランスフエクトされた不滅化一次細胞系。 - （３６）該腫瘍誘発性ＤＮＡが一次細胞腫瘍または腫瘍
一次−細胞系からのゲノムＤＮＡであり、かかる腫瘍ま
たは腫瘍細胞−系が不滅化されるべき一次細胞タイプに
対応する起源を有する前記第（３５）項の細胞系。 - （３７）該腫瘍誘発遺伝子が一次細胞腫瘍または腫瘍一
次細胞系からのものであり、かかる腫瘍または腫瘍細胞
系が不滅化されるべき一次細胞タイプに対応する起源を
有する前記第（３５）項の細胞系。 - （３８）該一次細胞が造血起源のものである前記第（３
５）項の細胞系。 - （３９）該一次細胞が多潜能幹細胞、Ｂリンパ球、Ｂ系
統前駆体、Ｔリンパ球、Ｔ系統前駆体、骨髄幹細胞、単
球、マクロファージ、好中球、好エオシン球、巨大核細
胞または肥胖細胞である前記第（３８）項の細胞系。 - （４０）該一次細胞がＢリンパ球である前記第（３９）
項の細胞系。 - （４１）該Ｂリンパ球が抗原で活性化／刺激されたもの
である前記第（４０）項の細胞系。 - （４２）該腫瘍誘発遺伝子がＨａ−ｒａｓ腫瘍誘発遺伝
子である前記第（４０）項の細胞系。 - （４３）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＢＪＡＢからのゲノムＤ
ＮＡである前記第（４０）項の細胞系。 - （４４）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＲＥＨ細胞系からのゲノ
ムＤＮＡである前記第（４０）項の細胞系。 - （４５）該腫瘍誘発性ＤＮＡがＥＬ４細胞系からのゲノ
ムＤＮＡである前記第（４０）項の細胞系。 - （４６）（ａ）正常な、活性化／刺激された一次細胞を
供し； （ｂ）エレクトロポレーシヨンによつて、かかる一次細
胞を、所望によりリポソームに含まれていてよい腫瘍誘
発性ＤＮＡ／腫瘍誘発遺伝子および外来の機能性ＤＮＡ
配列で共トランスフエクトして共トランスフエクトされ
た一次細胞を産生し；（ｃ）かかる共トランスフエクト
された一次細胞から外来の機能性ＤＮＡ配列を含有する
共トランスフエクトされた不滅化一次細胞系を回収し；
次いで （ｄ）生物学的産生物の産生を可能とする条件下でかか
る共トランスフエクトされた不滅化細胞系を培養するこ
とを特徴とするそのコーディング配列が外来の機能性Ｄ
ＮＡ配列を含有する共トランスフエクトされた不滅化一
次細胞系内に含有されるＤＮＡからなる生物学的産生物
の産生法。 - （４７）不滅化が正常一次細胞の、実質的に腫瘍誘発遺
伝子よりなるＤＮＡでのトランスフエクシヨンの結果で
ある場合の不滅化一次細胞系。 - （４８）該腫瘍誘発遺伝子が一次細胞腫瘍または腫瘍一
次細胞系からのものであり、かかる腫瘍または腫瘍細胞
系が不滅化される一次細胞タイプに対応する起源を有す
る前記第（４７）項の細胞系。 - （４９）該一次細胞が造血起源のものである前記第（４
７）項の細胞系。 - （５０）該一次細胞が多潜能幹細胞、Ｂリンパ球、Ｂ系
統前駆体、Ｔリンパ球、Ｔ系統前駆体、骨髄幹細胞、単
球、マクロファージ、好中球、好エオシン球、巨大核細
胞または肥胖細胞である前記第（４９）項の細胞系。 - （５１）該一次細胞がＢリンパ球である前記第（５０）
項の細胞系。 - （５２）該腫瘍誘発遺伝子がＨａ−ｒａｓ腫瘍誘発遺伝
子またはｐ５３−Ｈ７腫瘍誘発遺伝子である前記第（５
１）項の細胞系。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83508986A | 1986-02-28 | 1986-02-28 | |
| US835089 | 1986-02-28 | ||
| US9420 | 1987-01-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62265982A true JPS62265982A (ja) | 1987-11-18 |
Family
ID=25268548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62046643A Pending JPS62265982A (ja) | 1986-02-28 | 1987-02-28 | 一次細胞の不滅化法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62265982A (ja) |
| KR (1) | KR870008027A (ja) |
| ZA (1) | ZA871438B (ja) |
-
1987
- 1987-02-27 ZA ZA871438A patent/ZA871438B/xx unknown
- 1987-02-27 KR KR870001686A patent/KR870008027A/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-02-28 JP JP62046643A patent/JPS62265982A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOTECHNOLOGY=1985 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR870008027A (ko) | 1987-09-23 |
| ZA871438B (en) | 1987-12-30 |
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