JPS62201824A

JPS62201824A - 血液凝固第９因子複合体の製造方法

Info

Publication number: JPS62201824A
Application number: JP61044941A
Authority: JP
Inventors: Hideo Nishimaki; 西槙　秀雄; Matsuhisa Kameyama; 松寿亀山; Yukihiko Nakamura; 中村　幸彦; Yoshiro Iga; 伊賀　善郎; Tadakazu Suyama; 須山　忠和
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1986-02-28
Filing date: 1986-02-28
Publication date: 1987-09-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は血液凝固第Ｘ因子複合体（以下単に第Ｘ因子複
合体と省略）の製造方法に関する。詳細には、第Ｘ因子
複合体製剤中に夾雑する活性型凝固因子を除去すること
による第Ｘ因子複合体の製造方法に関する。

〔従来技術〕

第Ｘ因子複合体は血漿由来の第■因子、第■因子、第Ｘ
因子および第Ｘ因子からなる複合体である。

この第Ｘ因子複合体は、臨床的にはｉ）血友病Ｂ患者に対する第Ｘ因子の補充、ｉ＋）血友
病Ａ患者（第■因子抗体保有者）に対するバイパス療法
、１ｉｉ）凝固因子生合成不全症（薬物投与による）に対
する凝固因子補充原注などに用いられる。

第Ｘ因子複合体は不活性型であるが、静注後に生体中で
活性化され、凝固活性を発現する。

ところが、第Ｘ因子複合体の製造過程で第■因子、第■
因子、第Ｘ因子あるいは第Ｘ因子が活性化してしまうこ
とがある。このような活性型因子が混入している製剤を
静注すると播種性器管内凝固症候群（ＤＴＣ）等の副作
用が生じ易い。

そこで、従来はヘパリンナトリウム等の活性化因子のイ
ンヒビターを中間工程で添加する方法がとられてきた。

しかしこの方法ではインヒビターが最終製剤にまで混入
する等の問題点がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

そこで、第■因子複合体中に含まれる活性型凝固因子を
効率的に、しかも簡便に除去する方法について検討した
結果、アミノベンズアミジン、アミノフェニルグアニジ
ン並びに、アルギニンおよびリジン等の塩基性アミノ酸
を水不溶性担体に結合させた固定化担体を用いることに
より、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完
成した。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、血液凝固第■因子複合体製剤中に夾雑する活
性型凝固因子を除くために、アミノベンズアミジン、ア
ミノフェニルグアニジン、塩基性アミノ酸から選ばれる
化合物を水不溶性担体に結合させた固定化担体を用いて
処理することを特徴とする血液凝固筒■′因子複合体の
製造方法に関する。

本発明の処理が施される第■因子複合体製剤としてはヒ
ト血齋由来のものであれば特に限定されない。

このような第■因子複合体の製造方法としては、たとえ
ば特開昭４９−８６５１５号に開示の方法などが用いら
れる。また、第■因子復合体の純度は特に限定されない
が、−ｇには高度精製品の方が効果が大である。

複合体の組成比（活性比で表わす）としては、第■因子
ｌに対して、第■因子　０．６４〜１．８第■因子　０，０２〜１．２第Ｘ因子　０．４４〜２．３であることが好ましい。

本発明で用いられる固定化担体はアミノベンズアミジン
、アミノフェニルグアニジンあるいは塩基性アミノ酸を
水不溶性担体に共有結合させたものである。

本発明で使用される塩基性アミノ酸としては、たとえば
アルギニン、リジン等が例示される。

水不溶性担体としては、自体既知のものを使用すればよ
く、たとえばセルロース、アガロース、デキストラン、
ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体などが好適に使
用される。

固定化は公知の方法に準じて行えばよい、たとえば、特
公昭５７−１３２６６号にその開示がある。また、共有
結合のために架橋剤および縮合剤を用いることも可能で
ある。−例を挙げると、シアン化ブロムで活性化したア
ガロースをε−アミノカプロン酸（架橋剤）と結合させ
た後、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）−カルボジイミド（縮合剤）の存在下偽前記化合物（
たとえば、アミノベンズアミジン）と結合させて、固定
化担体を得る。かかるものの市販品としては、たとえば
ベンズアミジン−セファロース６Ｂ（登　・録商標、フ
ァルマシア社製）などがあげられる。

本発明の処理方法としてはカラム法、バッチ法のどちら
を用いてもよい。

バッチ法の場合、ｐ１１５〜９の緩衝液〔たとえば５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）　、１．５％塩化ナトリウ
ム＋０．５％クエン酸ナトリウム（ｐｌ＋７）等〕に溶
解した第■因子複合体（蛋白濃度としては０．５〜１０
％であることが好ましい）を同じ緩衝液で平衡化した固
定化担体と吸着させる。その条件としては、固定化担体
１　ｍｌに対して溶液１〜１００−と混合させ、４±２
℃で３０分〜２時間であることが好ましい、その後、遠
心分離して上清のみを採取する。

カラム法の場合は、ｐＨ５〜９の緩衝液（前記と同様）
に溶解した第■因子複合体（蛋白濃度としては０．５〜
ｌＯ％であることが好ましい）を同じ緩衝液で平衡化し
た固定化担体（カラム）において展開させる。非吸着の
ｉ３遇両分を回収する。

こうして得られた第■因子複合体は、必要に応じて、さ
らに精製された後、公知の方法により製剤化される。

（効果）本発明の方法によれば、安定化剤等を加えるなどの複雑
な工程を必要とせず、簡便の処理工程ですむので工業的
である。

しかして、本発明により得られた第■因子複合体は活性
型凝固因子が取り除かれるため、安全な第■因子複合体
製剤を提供することができる。

（実施例・実験例〕本発明をより詳細に説明するために、実施例および実験
例を挙げるが、本発明はこれらによって限定されるもの
ではない。

実施例１第■因子１０４４単位、第■因子１１６６単位、第Ｘ因
子４２単位および第Ｘ因子４９２単位からなる第■因子
複合体製剤を１．５Ｗ／Ｖ％塩化ナトリウムー〇、５Ｗ
／Ｖ％クエン酸ナトリウム（ｐｌ！　７．０　）４Ｑｍ
ｌに溶解した。一方、ベンズアミジン−セファロース＠
６Ｂ（ファルマシア社製）２ｇ　（湿重量＞を上記溶解
液で平衡化した。

第■因子複合体製剤と、ベンズアミジン−セファロース
を混合し、４℃で１時間攪拌した後、遠心分離して上清
を分取した。

こうして得られた第■因子複合体製剤はフィブリン凝固
時間が６．０時間以上であり、生物学的製剤基準の活性
凝固因子否定試験を充分にバスするものであった。

実験例１実施例１で得られた複合体につき、本発明の処理方法の
効果について検討した。試験項目は蛋白量として２００
ｎｍの吸光度、第Ｘ因子活性（ＦＩＸ活性）、フィブリ
ノーゲン凝固時間（ＦＣＴ）を挙げ、結果を表１に示す
。

表１実験例２実施例１で得られた複合体につき、各因子の残存量につ
いて検討し、その結果を表２に示す、各因子の測定方法
は以下の通りであった。

第■因子・・・・・・ＲａｐｐａｐＯ「１法（１段法）
第Ｘ因子活性型　・・Ｃ１ｏｄｌ　らの凝固時間法第■
因子・・・・・・プロトロンビン単独測定法第■因子活
性型　・・発色性合成ペプチド基質法第■因子・・・・
・・第Ｘ因子欠乏血漿を用いた一段測定法第Ｘ因子活性型　・・凝固時間法と発色性合成ペプチド
基質の組み合わせ法第Ｘ因子・・・・・・第Ｘ因子欠乏血漿を用いた一段測
定法第Ｘ因子活性型　・・発色性合成ペプチド基質法（以下
余白）表２手イイεネＦＩＴ正書（自発）昭和６１年５月Ｚ日昭和６１年特許願第０４４９４１号２、発明の名称血液凝固筒■因子複合体の製造方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人氏名（名称）　株式会社ミドリ十字４、代理人　■５４１住所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライフ
平野町４０６号Ｔｈｔ　（０６）　２２７−１１５６明細書の「発明の詳細な説明」の欄６、補正の内容（１１明細書第７頁、第１４から１５行の「フィブリン
」を「フィブリノゲン」に訂正する。

（２）回書第８頁、第２行の「フィブリノーゲン」を「
フィブリノゲン」に訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】

血液凝固第 I Ｘ因子複合体製剤中に夾雑する活性型凝
固因子を除くために、アミノベンズアミジン、アミノフ
ェニルグアニジン、塩基性アミノ酸から選ばれる化合物
を水不溶性担体に結合させた固定化担体を用いて処理す
ることを特徴とする血液凝固第 I Ｘ因子複合体の製造
方法。