JPS62190076A - 生長促進細胞培養基およびそれを使用する細胞の培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、基本細胞培養基又は基本細胞培地（ｂａｓｉ
ｃ　　ｃｕｌｔｕｒｅ　　ｍｅｄｉｕｍ）およびさらに
細胞の生長を促進するために十分な量の二価の亜鉛を含
んでなる細胞培養基に関する０本発明は、また、前記生
長促進細胞培！Ｉ基を使用する細胞を培養する方法に関
する。

この分野において従来使用されてきている細胞培養基は
、無機成分および有機成分を含有する。

従来の細胞培養基は、ある程度の細胞の生長を可能とす
るが、満足すべき安定な細胞の生長を生じさせず、ある
いは満足すべき細胞および細胞蛋白質の収率を生じさせ
ず、すなわち、細胞の生長を促進しないので、不利であ
る。

本発明の１つの［目的は、細胞の安定な生長を可能とす
る細胞培養基を提供することである。

本発明の他の目的は、高い細胞収率および細胞蛋白質収
率を可能とする細胞培養基を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、真核細胞、例えば、哺乳動
物の細胞を生長させて高い細胞の生長および細胞蛋白質
の収率を達成するためにとくに有用な細胞培養基を提供
することでる。

なお１本発明の他の目的は、その生長を促進する細胞の
培養法を提供することである。

本発明の前述の目的は、基本細胞培養基および二価の亜
鉛を含んでなり、ここで二価の亜鉛が細胞培養基の１文
につき約０．８〜約）、６ｍｇのＺｎ”の濃度で存在す
る、本発明の細胞生長ｊ８養基によって満足された。

本発明の基本細胞培養基は、炭素源、窒素源および他の
無機および有機の成分、例えば、ビタミン類、アミノ酸
類などを含有する任意の普通の基本細胞培養基、例えば
、Ｈ，Ｊ、モルトン（Ｍ。

ｒｔ　ｏｎ）　　、’−１４ｆｌ　（Ｉ　ｎ　　Ｖｉ　
ｔ　ｒｏ）　６　：　８９−１０８　（１９７０）（そ
の開示を引用によってここに記載する）に開示されてい
るものであることができる。本発明において使用する基
本細胞培養基は、培品する細胞の種類、すなわち、哺乳
動物、は虫類、鳥類または虫類（ｉｎｓｅｃｔ）に依存
し、それらの各々はこの分野においてよく知られており
、異なる生長の要件を有する。さらに１本発明のス（本
細胞１？Ｊ五基は、＋４ｔｉ乳動物、は虫類、虫類また
は鳥類の形質転換された細胞または形質転換されない急
速に分割する細胞を培養するために使用できるものであ
る。本発明を適用できる、商業的に入手可能なこのよう
な基本細胞培養基の例は、ＨＡＭ　　Ｆ−１０、ＨＡＭ
Ｆ−１２、イーグル最少必須培＃ｌ！（ＭＥＭ）、バッ
ク（Ｐｕｃｋ）のＮ−１５およびバック（Ｐｕｃｋ）　
ノＮ−１６、マツコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ［変性（ｍｏ
ｄ、）］、ＲＰＭＩ　　１６０３．１６３４４．１６４
０などを包含する０本発明において使用する好ましいス
（本細胞培五基は、マツコイ（ＭｃＣｏ　Ｖ）　　５Ａ
　［変性（ｍｏｄ、）］である。

ここで使用するとき、用語「形質転換されないＪ　　（
ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）Ｊ急速に分割する細
胞は胚および上皮に由来する細胞を包含し、そして用語
「形質転換された」　（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）Ｊ細
胞は悪性またはハイブリドーマの由来（ヒトまたはヒト
以外）の細胞を包含する。

このような形質転換された細胞の例は、次のものを包含
する：胚の癌（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ　　ｃａｒｃｉｎｏ
ｍａ）、、Ｉ４丸（ｔｅｓｔｉｓ）、リンパｆｆｉへの
転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　　ｔ。

ｌｙｍｐｈ）ケイルス（Ｃａｌｅｓ）−１Ｂ（ＡＴＣＣ
Ｎｏ　、　　ＨＴＢ−１０４）、乳房（ｂｒｅａｓｔ）
ＨＢＬ−１００（ＡＴＣＣＮｏ　、　　ＨＴＢ−１２４
）、子宮内膜腺癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ　　ａｃ！
ｅｎｏｃａｒｃｉｎ。

ｍａ）ＨＥＣ−１−Ａ　　（ＡＴＣＣＮｏ　、　　　Ｈ
ＴＢ−１１２）、ウォーカー（Ｗａ　ｌ　ｋ　ｅ　ｒ）
ラット癌ＬＬＣ−ＵＲＣ２５６（ＡＴＣＣＮｏ　　。

ＣＣＬ−３８）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣＮｏ　。

ＨＴＢ−３８）および５Ｋ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣＮｏ　
、ＨＴＢ−３０）、本発明は、とくに、形質転換された
哺乳動物の細胞、例えば、悪性の細胞およびハイブリド
ーマの細胞とともに用いることができる。

このような形質転換されない細胞の例は、ヒト肺二倍体
ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−
３８（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ−７５）およびＩＭＲ−９
０（ＡＴＣＣＮｏ　。

ＣＣＬ−１８６）を包含する。

この分野において従来使用されている基本細胞培養基は
、無機成分および有Ｉａ成分を、例えば、ＺｎＳＯ４の
形態の、微量の二価の亜鉛と一緒に含有する。このよう
な基本細胞培養基、例えば、ＨＡＭ　　Ｆ−１０および
ＨＡＭＦ−１２［セルバ・カンバ＝−（Ｓｅｒｖａ　　
Ｃｏｍｐａｎｙ）］中の二価の亜鉛の濃度は、培養基の
１父につき約０．００７〜０．２ｍｇのＺｎ”十である
。しかしながら、このような微量の二価の亜鉛を含有す
る細胞培養基は生長促進作用を生じない０本発明におい
て、培養基中の二価の亜鉛の、＋７Ｂが微量より多くか
つ前述の範囲内であるとき、生長促進作用が達成される
ことが発見された。

本発明による基本細胞培養基は、二価の亜鉛を、生長を
促進するために十分な量、例えば、約０．８〜約１．６
ｍｇのＺｎ＋＋／文、好ましくは約１．０〜約１．４ｍ
ｇのＺ　ｎ　”　”　／　ｆｌの量で含有する。

二価の亜鉛の最も好ましい濃度は約１　、２ｍｇのＺ　
ｎ　”　”　／　ｆＬである。なぜなら、最大の細胞収
率がこのような濃度を用いて達成されるからである。

本発明において使用する二価の亜鉛は任意に亜鉛源であ
ることができ、そして源は制限されない。このような二
価の亜鉛の源は、無毒の有機二価の亜鉛化合物または無
毒の無機二価の亜鉛化合物を包含する。このような無毒
の無機二価の亜鉛化合物例はＺｎＣｌ２　、ＺｎＯ，Ｚ
ｎＣＯ３およびＺｎＳＯ４を包含する。本発明において
使用できる好ましい無毒の無機二価の亜鉛化合物はＺｎ
Ｃｌ２である。本発明において使用できるこのような無
毒の有機二価の亜鉛化合物は有機化合物の亜鉛塩、例え
ば、酢酸亜鉛を包含する。前述の二価の亜鉛化合物の混
合物を、また、必要に応じて本発明において用いること
ができる。

二価の亜鉛は任意の方法を使用して基本細胞項五基に混
入することができ、例えば、前述の二価の亜鉛化合物は
固体の形態で基本細胞項五基に添加することができるが
、溶液、例えば、水溶液、水性酸性溶液または水性緩衝
化溶液の形態で添加することが好ましい。

本発明の細胞培養基を用いて得られる高い細胞および細
胞蛋白質の収率は、分析実験において、例えば、細胞質
蛋白質の処理において、かなりの利点を有する。これは
木質的にハイブリドーマの加速された生長およびそれら
の最終産生物、例えば、抗体に当てはまり、これらは細
胞の二次培養および培地の交換を用いないで急速にかつ
効率よく収穫することができる。

本発明において使用する細胞は、本発明の細胞培養基中
で、特定の細胞にとって最適の既知の項五条件、典型的
には３６．５℃±０．５℃、０゜５％Ｃｏ２７９５％空
気において培養する。

本発明の次の非制限的実施例は、例示の目的でのみ提供
され、そして本発明の範囲を限定することはいかなる方
法でも意図されない。ここで特に示さないかぎり、すべ
ての部および比などは重４１゜による。

尖及勇 この実施例において、アメリカン・タイプ争カルチャー
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ。

ｎ）から入手した悪性の形質転換されたヒト細胞系、す
なわち、結腸のヒト腺癌の癌細胞系、ＨＴ−２９（ＡＴ
ＣＣＮｏ　、　　ＨＴＢ−３８）および乳房のヒト腺癌
の癌細胞系、５Ｋ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣＮｏ、　　ＨＴ
Ｂ−３０）を使用した。形質転換されないヒト線維芽細
胞［Ｅ５、インスチチュートーオブ会アプライド・セル
ｅカルチュアー、リミテッド（Ｉｎｓｔｉｔｕｅｔｅｏ
ｆ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
、Ｌｔｄ、）］を対照として使用した。前記細胞系はア
メリカン・タイプ・カルチャー書コレクション（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）から凍結した状態で入手した。細胞を
再活性化するために、１５％（Ｖ／Ｖ）のウシ胎児血清
を含有するマツコイ（ＭｃＣｏ　ｙ）５Ａ　［変性（ｎ
ｏｄ、）］培地［セルバ・カンパ＝−（Ｓｅ　ｒｖａ　
　Ｃｏｍｐａｎｙ）］中で前記細胞を二次培養した。

再活性化された細胞を対数生長期に到達させ、次いで脱
トリプシンし、そして収穫した。収穫した細胞を１５％
（ｖ／ｖ）のウシ胎児面７「νを含有するマツコイ（Ｍ
ｃＣｏｙ）５Ａ　［変性（ｍ。

ｄ、）］培地で２回洗浄し１次いで同−培地中に１０６
細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。集められた細胞濃度
はネウベウエルーターク（Ｎｅｕｂｅｕｅｒ−Ｔｕｒｋ
）計数室を使用して決定し、ここで細胞の生存率をまた
トリパン（Ｔｙｒｐａｎ）ブルーの着色により決定した
［フレッシネイ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、Ｉ　、Ｒ−、臥
惣巖四ｎ遥１（Ｃｕｌｔｕｒｅ　　ｏ工　Ａｎｉｍａｌ
　　Ｃｅｌｌ５）、アラン拳リス・パブリケイション・
カンパニー（Ａｌａｎ　　Ｒ１５ｓ　　Ｐｕｂｌ、　　
Ｃ００）、ニューヨーク州、ニューヨーク市（１９８３
）参照］。ＨＴＢ−２８細胞の生存率は９５％であり、
そしてＨＴＢ−３０細胞の生存率は７８％であった。ヒ
ト線維芽細胞（Ｅ５）の生存率は９５％であった。

２００．０００個のＨＴＢ−３０細胞または２００．０
００個のＨＴＢ−３８細胞を含有する管に、後述する細
胞Ｊ８五基Ｎｏ、１．．２．３．４または５を添加し、
そして細胞を８０時間インキュベーションするか、ある
いは後述する細胞培養基Ｎ０１６および７を添加し、そ
して細胞を９６時間インキュベーションした。さらに、
２００゜０００個のヒト線維芽細胞を含有する管に、後
述する細胞項五ノ！Ｎｏ、ｌおよび４を添加し、そして
細胞を７２時間インキュベーションした。すべての細胞
は３６．５℃（±０．５℃）、０．５％のＣＯ２および
９５％の空気においてインキュベーションした。５本の
反復実験の管を、各細胞のための各細胞培養基について
使用した。

細胞培養基Ｎｏ、１は”’Ｆ　ッＤイ（ＭｃＣｏｙ）５
Ａ［変性（ｍｏｄ、）］培地＋１５％（Ｖ／Ｖ）のウシ
胎児血清からなり、二価の亜鉛を添加しなかった。マツ
コイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ　［変性（ｍｏｄ、）］培地は
、ＩＩ！ｉ量の二価の亜鉛、すなわち、０．０±０．０
０１ｍｇのＺｎ＋＋／ｆＬを含有するのみである。

細胞培養基Ｎ００２は、ＺｎＣｌ２を０．２ｍｇのＺｎ
＋“７文の最終濃度に添加した以外、細胞培養２１Ｎｏ
、ｌと同一であった。

細胞培−７７ｇＮ　ｏ　、　３は、ＺｎＣｌ２を０．８
ｍｇのＺ　ｎ＋　＋　７文の最終濃度に添加した以外、
細胞項五スＴ：Ｎｏ、１と同一であった。

細胞培養基Ｎ００４は、ＺｎＣｌ２を１．２ｍｇのＺｎ
＋＋／文の最終濃度に添加した以外、細胞培養基Ｎ０．
１と同一であった。

細胞培養３Ｎｏ、５は、ＺｎＣｌ２を１．６ｍｇのＺｎ
＋＋／文の最終濃度に添加した以外、細胞培養基Ｎｏ、
１と同一であった。

細胞培養基Ｎｏ、６は、ＺｎＣｌ２を２．１ｍｇのＺｎ
＋＋／又の最縛汝度に添加した以外、細胞培Ｒ基Ｎ　ｏ
　、　１と同一であった。

細胞培養基Ｎｏ、７は、ＺｎＣｌ２を２．８ｍｇのＺ　
ｎ　”　”　／　ｌの最終濃度に添加した以外、細胞培
養基Ｎ０１１と同一であった。

インキュベーション時間の終りにおいて、培養基を除去
し、そして細胞をダルベツコ（Ｄｕｌｂｅ　ｃ　ｃ　ｏ
）の緩衝溶液で３回洗浄した［ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏ）、Ｒ，Ｕ、、ヴオウグトｅｄ、）　９８：１６
７−１８２　（１９５４）参照１０次に、細胞を乾燥し
、そして２０μｌ／ｍｌの１．ＯＮのＮａＯＨがさらに
添加されている各管にオクチルフェノールポリエチレン
グリコールエーテルを０．２％（Ｖ／Ｖ）の濃度で添加
した。

試料をよく混合し、そして２０〜２５℃で３０分間放置
した後、得られた細胞抽出液の各２００ｋｌをロウリイ
（Ｌ　ｏ　ｗ　ｒ　ｙ）の方法に従い蛋白質の決定に使
用した［ロウリイ（Ｌｏｗｒｙ）。

エエ）１９３：２６５　（１９５１）参照］。

得られた結果を下表に示す、下表中の対照は、細胞が添
加されていない、４℃における細胞培養基ＮＯ，１であ
る。この表において、生長百分率は細胞ｋｆ５養基Ｎｏ
、１に基づいて計算し、前記細胞培養基Ｎｏ、１は微量
より多い二価の亜鉛を含有せず、１００％の生長値を生
ずる。すべての生長値は、５回の反復実験の管からの平
均値上標準偏差である。

対照のパーセントとしての生長値は、次式に従って決定
した： さらに、この表において、平均の吸収値は細胞中の蛋白
質濃度を決定し、そして６６０ｎｍにおいて評価した。

ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）の２つのｅｇ！につ
いての平均の吸収値を下に示すように測定し、そして蛋
白質濃度の決定のための対照として使用した： （ａ）　　　ＢＳＡ　　　Ｉ００μｇ／’ｔ？：０．２
７００．２８０　０．２４８　０．２６５ （ａ）　　　ＢＳＡ　　　５０ｕｇ／’ｉ’ｉ：０．１
３５０．１４６　０．１４３　０．１２５ 表（続き） ヒト線維芽細胞 試ネ２１　　　　　　　平均の吸収値　　　　　　　生
長％対照　　　　　　　０．１７９±０．０２７　　　
　−−−培養基Ｎｏ、１　　０．５１９ｆＯ，Ｏ１２１
００培養基Ｎｏ、２−−− 培養３Ｎｏ、３−−− ｊ？Ｊ五７．Ｌ：Ｎｏ、４　　０．５４３ｆＯ，０２５
１０７培養基Ｎｏ、５−−− 培養７！Ｎ０．６木　　　　　−一− ｊｐ五基Ｎｏ、７本　　　　−一一 木培ａ基Ｎ　ｏ　、　６および培養基Ｎｏ、７を使用す
るアッセイにつぃり、そして培養基Ｎｏ、１についての
平均吸収４ｆｊは１．２３２±０て、対照の平均吸収値
は０．２２１±０．０４６であ、０９８であった。

上の表に示すＨＴＢ−３８細胞およびＨＴＢ−３０細胞
についての生長値は、第１図にグラフで表示されている
。この第１図が示すように、約０．８〜約１．６ｍｇの
Ｚ　ｎ　”　”　／　ｆｌの二価の亜鉛を含有する基本
細胞培養基中で生長させるとき、蛋白質濃度として表わ
される生長速度はＨＴＢ−３８細胞およびＨＴＢ−３０
細胞について促進される。

詳しくは１表および第１図から明瞭に明らかなように、
二価の亜鉛を約０．８〜約１．０ｍｇのＺ　ｎ　”　”
　７文の量で基本細胞培養基中に使用するとき、細胞系
ＨＴＢ−３ＪｌｌよびＨＴＢ−３０の両者は蛋白質収率
の増加２８．９％を示す、さらに、表中の結果が立証す
るように、二価の亜鉛を基本細胞培養基の１１につき１
．０ｍｇのＺ　ｎ　”　”　７文の量で使用するとき、
最大の細胞の生長が達成される。すなわち、細胞系ＨＴ
Ｂ−３８は細胞培養基Ｎｏ、ｌより６７．９％だけ大き
い収率を有し、そして細胞系ＨＴＢ−３０は細胞培養基
Ｎｏ、１より１１１．２％だけすぐれた収率を有した。

表および第１図中の結果が、また、示すように、二価の
亜鉛を０．２ｍｇのＺ　ｎ＋　＋　／交項五基、すなわ
ち、基本細胞培養基中に通常存在する二価の亜鉛の微量
より高い水準、の最終濃度で添加するか、あるいは２．
１ｍｇのＺｎ“／旦以上の水準で添加するとき、生長の
増加作用は見られず、そして事実、ＨＴＢ−３８の場合
、生長の減少作用が見られる。

表が、また、明瞭に立証するように、微量より多い量で
二価の亜鉛を含有する基本細胞培養基中で生長させると
き、急速に分割していない、形質転換されない細胞の生
長は十分に促進されず、こうして二価の亜鉛は急速に分
割する細胞の生長の促進のために予期せざることには必
要である。

本発明をその特定の実施態様に関して詳述したが、本発
明の精神および範囲を逸脱しないで変化および変更を行
うことができることは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、形質転換された細胞系ＨＴＢ−３８またはＨ
ＴＢ−３０のための、蛋白質濃度で表わした細胞生長を
示す。 第１図 磯田月８４ト茎／）番号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、基本細胞培養基およびさらに細胞の生長を促進する
   ために十分な量の二価の亜鉛を含んでなることを特徴と
   する細胞培養基。 ２、前記二価の亜鉛は約０．８〜約１．６ｍｇのＺｎ＾
   ＋＾＋／ｌの量で存在する特許請求の範囲第１項記載の
   細胞培養基。 ３、前記二価の亜鉛は約１．０〜約１．４ｍｇのＺｎ＾
   ＋＾＋／ｌの量で存在する特許請求の範囲第２項記載の
   細胞培養基。 ４、前記二価の亜鉛は約１．２ｍｇのＺｎ＾＋＾＋／ｌ
   の量で存在する特許請求の範囲第３項記載の細胞培養基
   。 ５、前記基本細胞培養基は形質転換された細胞または形
   質転換されない急速に分割する細胞の生長のための細胞
   培養基を含んでなる特許請求の範囲第１項記載の細胞培
   養。 ６、前記基本細胞培養基は形質転換された哺乳動物の細
   胞の生長のための細胞培養基を含んでなる特許請求の範
   囲第５項記載の細胞培養基。 ７、前記基本細胞培養基はハイブリドーマ細胞の生長の
   ための細胞培養基を含んでなる特許請求の範囲第５項記
   載の細胞培養基。 ８、前記二価の亜鉛の源は無毒の有機二価の亜鉛化合物
   および無毒の無機二価の亜鉛化合物から成る群より選択
   される特許請求の範囲第１項記載の細胞培養基。 ９、前記無毒の有機二価の亜鉛化合物は有機化合物の亜
   鉛塩である特許請求の範囲第８項記載の細胞培養。 １０、前記無毒の無機二価の亜鉛化合物はＺｎＣｌ＿２
   、ＺｎＯ、ＺｎＣＯ＿３およびＺｎＳＯ＿４から成る群
   より選択される特許請求の範囲第８項記載の細胞培養基
   。 １１、前記無毒の無機二価の亜鉛化合物はＺｎＣｌ＿２
   である特許請求の範囲第１０項記載の細胞培養基。 １２、細胞培養基の存在下に細胞を培養することからな
   る細胞を培養する方法であって、前記細胞培養基は基本
   細胞培養基およびさらに細胞の生長を促進するために十
   分な量の二価の亜鉛を含んでなることを特徴とする細胞
   を培養する方法。 １３、前記二価の亜鉛は約０．８〜約１．６ｍｇのＺｎ
   ＾＋＾＋／ｌの量で存在する特許請求の範囲第１２項記
   載の細胞を培養する方法。 １４、前記二価の亜鉛は約１．０〜約１．４ｍｇのＺｎ
   ＾＋＾＋／ｌの量で存在する特許請求の範囲第１３項記
   載の細胞を培養する方法。 １５、前記二価の亜鉛は約１．２ｍｇの Ｚｎ＾＋＾＋／ｌの量で存在する特許請求の範囲第１４
   項記載の細胞を培養する方法。 １６、前記基本細胞培養基は形質転換された細胞または
   形質転換されない急速に分割する細胞の生長のための細
   胞培養基を含んでなる特許請求の範囲第１２項記載の細
   胞を培養する方法。 １７、前記基本細胞培養基は形質転換された哺乳動物の
   細胞の生長のための細胞培養基を含んでなる特許請求の
   範囲第１６項記載の細胞を培養する方法。 １８、前記基本細胞培養基はハイブリドーマ細胞の生長
   のための細胞培養基を含んでなる特許請求の範囲第１６
   項記載の細胞を培養する方法。 １９、前記二価の亜鉛の源は無毒の有機二価の亜鉛化合
   物および無毒の無機二価の亜鉛化合物から成る群より選
   択される特許請求の範囲第１２項記載の細胞を培養する
   方法。 ２０、前記無毒の有機二価の亜鉛化合物は有機化合物の
   亜鉛塩である特許請求の範囲第１９項記載の細胞を培養
   する方法。 ２１、前記無毒の無機二価の亜鉛化合物はＺｎＣｌ＿２
   、ＺｎＯ、ＺｎＣＯ＿３およびＺｎＳＯ＿４から成る群
   より選択される特許請求の範囲第１９項記載の細胞を培
   養する方法。 ２２、前記無毒の無機二価の亜鉛化合物はＺｎＣｌ＿２
   である特許請求の範囲第２１項記載の細胞を培養する方
   法。