JPS62187497A - レギオネラ ニユ−モフイラと反応するモノクロナ−ル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａと反応するクラス１ａＧａからのモノクロナール抗
体、この抗体を産生ずるハイブリドーマ、このハイブリ
ドーマの製造方法およびこのハイブリドーマを用いるこ
とによるモノクロナール抗体の製造方法に関する。

現在、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌにはたがいにきわめて近
似した２１種が知られている。これは第１表に示すとお
りである。Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕａｏｐｈｉ
ｌａＧよさらに９個の血清型に分類できる。その中の代
表的なものは、ヒト疾患の原因となることが最も多い血
清型１である。

この疾患は高熱とＸ線で判定可能な変化を伴う、急性の
重篤な肺疾患、いわゆるレジオ病である。

レジオ病はきわめて危険な疾患であって、本発明の目的
はこの疾患の病原の診断薬を提供することにある。

ＥＰＡＩＯ１１９８９３号に記載されでいる、上述の種
に対するモノクロナール抗体は、この条件を満たすには
適していない。

本発明の上述の目的は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕ
ｍｏｐｈ　ｉ　ｌ　ａの血清型１の大部分と反応し、Ｌ
ｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの血清型
１に属さない株とは反応しないことを特徴とする、上述
の種に対する抗体によって解決された。このような抗体
は、特許請求の範囲第１項に記載の寄託日に寄託された
ハイブリドーマを用いることにより得ることができる。

この抗体は、第２表に示したＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎ
ｅｕｍｏｐｈ　ｉ　ｌａの血清型１株と反応する。この
表には、これまで検討したすべての株が記載されている
。検討したすべての株について、反応が確認されている
。

この抗体が、これまで知られている血清型１株のすべて
と反応することは明白であるが、現在のところすべての
株が検討されたわけではないので、それを保証すること
はできない。血清型１の新株が将来発見された場合、こ
の抗体との反応を現時点で予言することはできないとい
う条件つきである。

もちろん、これまで検討した血清１株のすべてについて
反応が確認されていることは注目すべきである。本発明
の抗体がＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ
ａの血清型１の抗原像に対して至適な適合性を有するこ
とはほぼ確実と思われる。Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅ
ｕｍｏｐｈｉ　ｌａの診断的検出は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉ　ｌａ微生物の他の血清型との
交差反応のみならず、血清型１の微生物の複合抗原型に
よっても妨害されることを考えれば、これは画期的であ
る。この抗原型にあずかるおよそ８５の抗原が知られて
いる。この多様性は第２表の記載からも明白であろう。

本発明の抗体に特有の性質、すなわち Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ血清型
１株の大部分との反応性および血清型１に属さない株と
の非反応性は、レジオ病の病原に対する選択的かつ完全
な診断薬としてきわめて有利である。

本発明のモノクロナール抗体は凝集反応を起こし、この
反応は反応時間５分以内で起こるという事実も注目すべ
きであり、特徴的である。この凝集反応は、きわめて容
易かつ明白に認められ、急速な反応は迅速な診断に適し
ている。

この反応は微小凝集反応試験によって確認される。

例１ ｒａｒｓｈｙら（文献１参照）によって報告された微小
凝集試験をわずかに改変して使用した。すなわち、選択
されたＬｃｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｌＯｐｈｉｌａ
株を、活性炭酵母抽出液（ＣＹＥ）７ガール（Ｄｉｆｃ
ｏ製、注１参照）上で生育させた。細菌を収穫し、熱活
性化し、ＰＢＳ　（ｐＨ７，Ｏ；注２参照）を用いて３
回洗浄し、ＰＢＳ１＃＋１！中細菌数１０，０００゜Ｏ
ＯＯの濃度に懸濁した。ついで、カルホール−ツクシン
を最終濃度が０．００２％になるように加えた。室温で
約２５μｌのＰＢＳ　（ｐＨ７，０）中ＰＡＮ−ＬＰＳ
１と、対象の細菌プローベを混合比１：１で混合し、凝
集を検査した。

５分以内に細菌の凝塊もしくは凝集が認められるか、ま
たは反応をまったく生じなかった。

例１に記載した微小凝集試験によって、第２表に記載し
たＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｎ＋ｏｐｈｉｌａ血
清型１の８株および、さらに約１００種類の株について
試験を行った。Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｏ＋ｏ
ｐｈｉｌａ血清型１の試験した全株が、凝集により上述
の反応を示した。

この微小凝集試験を用い、第１表に示したＬｃｇｉｏｎ
ｅｌｌａ種にライても試験した。ＬｅｌＪｉＯｎｅｌｌ
ａｐｎｅｕｍｏｐｈｉ　Ｉａ血清型１を除き、すべてが
６０分以上経過してもまったく反応を示さなかった。

本発明のモノクロナール抗体によるＬｅＱｉＯｎｅｌ１
８ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ血清型１の検出には、以下に
述べる公知の試験方法を使用できる。

（１）　　例１との関連で上述したような微小凝集試験 （２）　　各種の被検物質に応用されている直接または
間接免疫蛍光法により、被検材料から病原を直接検出す
る免疫蛍光試験 （３）　　被検材料からＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅ
ｕｉｏｐｈｉｌａ微生吻まタハ溶解したＬｅｇｉｏｎｃ
ｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原を検出する固相お
よび／またはサンドイッチＥＬ／ＳＡ試験 （４）　　被検材料からＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅ
ｕｍｏｐｈｉｌａ抗原を検出するスタヒロコツカス共凝
集試験固相Ｊ３よび／またはサンドイッチＥｌ／ＳＡ試
験は、ＬｅＱｉＯｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｌｌＯｐｈｉｌ
ａ血清型１の溶解した抗原の検出にも適している。本発
明の抗体は、病原の直接的な検出のみでなく、溶解した
抗原の検出にもとくに適している。

上記（１）〜（４）の試験の被検材料としては、たとえ
ば、尿、血清、痰、胸ＩＩ！Ｊ滲出液、灰の穿刺採取物
および水標本を挙げることができる。

本発明のモノクロナール抗体は、マウス−マウス−ハイ
ブリドーマ−細胞培養から得られる。すなわち、あらか
じめＬｅ（ｌｉｏｎｅｌｌａ　１）ｎｅｕｌＯＤｈｉｌ
ａ［ｌ［ｌ清型１−ＯＬＤＡ株（ＣＤＣ）で免疫処置し
たマウスのｐｓｍｍ胞をマウスのミエローマ細胞と体細
胞融合し、さらに融合および選択をくり返し連続するこ
とにより得られる。この場合、マウス−ミエローマ細胞
、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ　８．６５３がとくに適している
。このハイブリドーマは、特許請求の範囲第１項に記載
の日付で寄託されている。

このハイブリドーマは、以下の工程を特徴とする製造方
法で製造できる。

（２）　免疫抑制マウスのＬｃｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎ
ｅｕｍｏｐｈｉｌａ血清型１−ＯＬＤＡ株（ＣＤＣ）腹
腔内注射による刺激 （へ）数日後、マウスから牌臓細胞の摘出（ハ）　この
牌臓細胞のマウス−ミエローマ細胞との融合 ゆ　ハイブリドーマ細胞の選択 （ｅ）　　ハイブリドーマのクローニングおよび培養（
ｆ）　　特許請求の範囲第１項および第２項に記載の反
応によるハイブリドーマの試験および選択（２）選択さ
れたハイブリドーマの培養ハイプリ゛−マ　゛のための
　　　　ム免疫処置マウスの牌臓を、最後のブースター
注射から３〜４日後に、無菌条件下に摘出した。牌臓細
胞を、ステンレス製篩（孔径１００μｍ＞上に注意深く
押しつけて組織結合から単離し、ＰＢＳ　（リン酸緩衝
食塩溶液、注２参照）中に取つた。細胞をＤＰＢＳ　（
注３参照）中で２回洗浄しく１．ＯＯＯｒＤｍ　、５分
間遠心分離）、ツイテＤＰＢＳに取った。この沈殿物中
に、牌臓細胞とマウス−ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−
ＡＱ８．６５３が２：１の割合になるように混合した。

ポリエチレングリコール溶液−ＰＥＧ　　４０００（注
４参照）７１％、ＤＮＳＯ（注５参照）６％をＤＰＢＳ
中に取って加え、細胞集団の融合を開始させた。１分後
にＤＰＢＳを加えてＰＥＧを希釈した。ＰＥＧが完全に
除去されるまで細胞懸濁液を洗浄し、ついでＨＡＴ−培
地（注６参照）中に細胞濃度が約１．０００．０００個
／Ｉｄになるようにした。この選択培地中で、最終的に
融合した細胞は生存するが、懸濁液中でまだ融合してい
ない牌ｙａａ胞ないしはマウス−ミエローマＰ３−Ｘ６
３−Ａｇ　８．６５３は生存テキない。

本発明のモノクロナール抗体は、以下の製造工程を特徴
とする製造方法によって製造できる。

（２）　ＢＡＬＢ／Ｃ株マウスの腹膜の調整υ　調整後
７〜６０日の期間内に特許請求の範囲第２項に記載のハ
イブリドーマ細胞懸濁液の腹腔内適用 に）適用数日後、ＷＩＩ！穿刺による腹腔内の細胞含有
腹水の抽出 （へ）　取り出した腹水から、細胞含有成分の分離（ｅ
）　　上清から精製によるモノクロナール抗体の取得 鳳ユ モノクロナール抗体の製造方法 腹水マウス（ｉｎ’ＶｉＶｏ　）での拡大ＢＡＬＢ／Ｃ
株マウスに０．５ａｉ！の鉱油ブリスタン（注７参照）
を腹腔的投与して、腹膜を調整する。

７〜６０日の期間内に、あらかじめ処置した動物１匹あ
たりｉ、ｏｏｏ、ｏｏｏ〜１０．０００゜０００のハイ
ブリドーマのＰＢＳ中懸中波濁腹腔的投与した。８〜１
０日後にカニユーレで腹腔を刺し、細胞を含む腹水液を
集める。

得られた腹水液から、遠心分離により、細胞含有成分を
分離した（１．０００ｒｐａ＋　、１０分）。

モノクロナ゛−ル抗体を含有する上滑を、ついで、アフ
ィニティークロマトグラフィーで精製する。

腹水液の精製は、Ｂｒｕｃｋら（Ｊ、　ｌ１ｌｌｕｎＯ
Ｉ。

Ｍａｔｈ、、　　５３：３１３〜３１９．１９８２）の
方法に従って行う。

注１）活性炭酵母抽出液（ＣＹＥ）アガール（Ｄｉｒｃ
ｏ＞ 酵母抽出液　　　　　　　　　　　１０．０　　ｇ活性
炭　　　　　　　　　　　　　　１，５ｇＬ−システィ
ン塩酸塩・−水和物　０．４　９可溶性ピロリン酸鉄　
　　　　　　　０．２５９アガール　　　　　　　　　
　　１７５ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　１１
注２）　　ＰＢＳ＝リン酸緩衝波緩衝液１）９．６ｍＭ
、ｐＨ−７，４ ＮａＣ１８，０ ＫＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，２Ｎａ　　
ＨＰＯ−２８２０１，４４ ＫＨ２ＰＯ２Ｇ、２ 注３）　　Ｄ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　＝ダルベツコのＰＢＳ　（
ｇ／ｌ　）Ｎ　ａ　０１　　　　　　　　　　　　　　
　　８０００Ｋ　Ｃ１２０Ｏ Ｎ　ａ　２　ＨＰ　Ｏ４１１５０ ＫＨ２ＰＯ４２００ ＭｇＣ１・６Ｈ２０１００ ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　１００注４）ＰＥＧ＝
ポリエチレングリコール４００Ｓｅｒｖａ社 注５）　　Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ＝ジメチルスルホキシドＨｅ
ｒＣｋ社（［ｌａｒｍｓｔａｄｔ　）注６）ＩＩＡＴ培
地／ＨＴ培地 Ａニアミノプテリン３．８２ｒＩｔｇ／２００ｍ１！再
蒸留水 ＨＴ：ヒボキサンチン２７２．２０１９チミジン７６．
５０η／２０〇−再蒸 留水 ＨＡＴ−培地：主液Ａ　１０Ｉ１１＋主液ＨＴ１０ｄを
ＲＰＭＩ　　１６４０（注８参照）１．０ＯＯＩＩｌ中
に添加して調整 ＨＴ−培地：主液ＨＴ１０ｄをｉ、　ｏｏｏｊｌＩｅの
ＲＰＭＩ　　１６４０に添加して調整性７）　　Ｐｒ１
Ｓｔａｎ−鉱油 組成”　１９８４０１分子ｆｌｔ：２６８．５１Ｐｒｉ
Ｓｔａｎの語はｆｌｏｔｈ社の登録商標性８）メジウム
ＲＰＭＩ　　１６４０　（ＩＩＩ／１）Ｎ　ａ　Ｃ１６
００Ｇ Ｋ　Ｃ１４０Ｏ Ｎ　ａ２　ＨＰＯ４・７　Ｈ２０１５１２ＭＱＳ０　　
・７ＨＯ１００ Ｃａ（Ｎｏ　　）　　−４Ｈ０１００ Ｄ−グルコース　　　　　　　　２０００フエノールロ
ート　　　　　　　　　５ＮａＨＣ０３２０ＧＯ Ｌ−アルギニン　　　　　　　　２ＧＯＬ−アスパラギ
ン　　　　　　　　５０Ｌ−アスパラギンＩＩ！　　　
　　　　　２ＯＬ−シスチン　　　　　　　　　　５０
Ｌ−グルタミン　　　　　　　　３０ＧＬ−グルタミン
Ｉｌｌ　　　　　　　　　２０グリシン　　　　　　　
　　　　　１０Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　　　１５
Ｌ−ヒドロキシプロリン　　　　　２０Ｌ−イソロイシ
ン　　　　　　　　５０Ｌ−ロイシン　　　　　　　　
　　５０Ｌ−リジン塩ｉ１！塩　　　　　　　　４０Ｌ
−メチオニン　　　　　　　　　１５し一フェニルアラ
ニン　　　　　　１５Ｌ−プロリン　　　　　　　　　
　　２０Ｌ−セリン　　　　　　　　　　３０ Ｌ−スレオニン　　　　　　　　　２０Ｌ−トリプトフ
ァン　　　　　　　５ Ｌ−チロシン　　　　　　　　　　２０Ｌ−バリン　　
　　　　　　　　２０ グルタチオン　　　　　　　　　　　１ビオチン　　　
　　　　　　　　　　０．２ビタミン８１２Ｇ、００５ Ｄ−パントテン酸カルシウム　　　０．２５コリンクロ
リド　　　　　　　　　３ 葉酸　　　　　　　　　　　　　　１ １−イノシトール　　　　　　　　３５ニコチンアミド
　　　　　　　　　　１ｐ−アミノ安息香酸　　　　　
　　　１ピリドキシン塩酸塩　　　　　　　１ リボフラビン　　　　　　　　　　０．２チアミン塩酸
塩　　　　　　　　　１ ８液体メジウムは１０Ｉ！Ｉｇ／ｊ！のフェノール　ロ
ートを含有する。組成： ０．００２１ｏ１／ｊ！　　１−グルタミン１０５Ｕ／
１　ペニシリン−ストレプトマイシン ２Ｘ１０’ｌｏｊ！／ｊ！　　メルカプトエタノール　
１０〜１５％　Ｆｅ２　（胎仔ウシ血清） 文献１） Ｆａｒｓｈｙ、　Ｃ，Ｅ、、　Ｃｒｕｃｅ、　Ｄ、　Ｄ
、、にＩｅｉｎ、　Ｇ。

Ｃ，、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、　Ｈ，Ｈ，＆　Ｆｅｅｌｙ
、　Ｔ、　Ｃ，：Ｉａ＋ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　５
ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅｓｉｃｒｏａｇｇ
ｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　　ｔｅｓｔ　　ｆｏｒ　　ｔｈ
ｅＬｅｇｉＯｎｎａｉｒｅ’Ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　　ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、　　Ａｎｎ。

Ｉｎｔｅｒｎ、　　Ｗｅｄ、、　　９０　：　６９０．
　１９７９゜にｎｏｘｖｉｌｌｅ　１　（ＤＦＡ）　　
　　　３３１５３２　　　■ｏｇｕｓｉ　　　　　　　
　　　　３３１５４３　　　　　Ｂｌｏｏｇ＋ｉｎｇｓ
ｔｏｎ　　２　　　　　　　　　　　　　３３１５５４
　　　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ　１　　　　　　　３３
１５６５　　　Ｄａｌ　ｌａｓ　１　　　　　　　　　
　３３２１６６　　Ｃｈｉｃａｇｏ　２　　　　　　　
　３３２１５７　　Ｃｈｉｃａｏｏ　８　　　　　　　
　３３８２３８　　　Ｃ０ｒｌＣＯｒｄ３　　　　　　
　　　３５０９Ｂ９　　１Ｎ−２３−Ｇ２−Ｃ２３５２
８９Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｂｏｚｅｓａｎｉｉ　　　　
　　Ｉ　　　ＭＩＣＡ　　　　　　　　　　　３３２１
７２　　　ＴＯｒＯｎｔＯ３ ＬｅＯｉｏｎｅｌ　ｌａ　ｄｕｌｌｏｆｆｉ　ｉ　　　
　　　　Ｉ　　　ＭＹ−２３３３２７９Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａｇｏｒｌｌａｎｉｉ　　　　　　１　　１３−１
３　　　　　　　　　　３３２９７Ｌｃｏｉｏｎｅｌ　
ｌａ　ａ＋１ｃｄａｄｅｉ　　　　　　　Ｉ　　　Ｔ＾
ＴＬＯＣに　　　　　　　　　第２１８Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａｌｏｎｇｂｃａｃｈａｅ　　　　　Ｉ　　　Ｌｏ
ｎｇＢｅａｃｈ４　　　　　　　３３４６２２　　　Ｔ
ｕｃｋｅｒ　１　　　　　　　　　　３３４８４Ｌｅｇ
ｉｏｎｅｌ　ｌａ　ｊｏｒｄａｎｉｓ　　　　　　Ｉ　
　　ＢＬ−５４０３３６２３Ｌｃｇｉｏｎｅｌｌａｏａ
ｋｒｉｄｇｅｎｓｉｓ　　　　１　０ａｋＲｉｄｇｅ１
０　　　　　　　３３７６１Ｌｅｇｉｏｎｅｌ　ｌａ　
ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉ　ｉ　　　　　１　　８１−７１
６　　　　　　　　　３３８７７Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
ｆｅｃｌｃｉｉ　　　　　　　Ｉ　　　ｌｌ−４４Ｃ−
Ｃ３３５０７２２６９１−賀１−Ｈ３５８４９

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）第２表に示したＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕ
   ｍｏｐｈｉｌａの血清型１株と反応し、Ｌｅｇｉｏｎｅ
   ｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに近縁の第１表に示し
   たＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ株とは反応せず、５分以内の反
   応時間で凝集反応を起こし、ナショナル・コレクション
   ・オブ・アニマル・セル・カルチャー〔Ｎａｔｉｏｎａ
   ｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ
   ｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＮＣＡＣＣ）、Ｐｏｒｔｏｎ　
   Ｄｏｗｎ　Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ　
   ＳＰ４　ＯＪＧ、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ〕に１
   ９８５年１０月８日、第８５，１００，８０１号として
   寄託されたハイブリドーマから製造されることを特徴と
   する、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ
   と反応するクラスＩｇＧ３からのモノクロナール抗体。
2. （２）特許請求の範囲第１項に記載の抗体を産生するこ
   とを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の日付で寄
   託されたハイブリドーマ。