JPS62175667A

JPS62175667A - 抗原又は抗体の検出方法及びそれに用いるマイクロウエルスライド

Info

Publication number: JPS62175667A
Application number: JP1670686A
Authority: JP
Inventors: Shigeki Fujinaga; 藤永　茂樹; Toru Sugano; 徹菅野; Yasuhiko Masuyasu; 安彦増保
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-01-30
Filing date: 1986-01-30
Publication date: 1987-08-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野本発明は、ハイブリドーマのスクリーニング。

血清中の抗体価の測定、あるいはまた、血液、唾液、涙
液、尿、糞便、咽頭ぬぐい液、喀痰、水痘等の臨床検査
サンプルや注射剤、液剤、軟膏剤等の医薬品や培養細胞
中の抗原（例えば、ウィルス。

細菌等）の検出に役立つ方法と、その方法に使用するマ
イクロウェルスライドに関する。

（０）従来技術とその問題点抗原又は抗体を検出する方法には、酵素抗体法。

ラジオイムノアッセイ法、螢光抗体法などが知られてい
る。しかしながら、細胞を抗原とした酵素抗体法は、非
特異反応が強く、対象によっては使えない場合がある。

ラジオイムノアッセイ法は、アイソトープを用いる為特
別の施設を必要とし、安全面に問題がある。−５螢光抗
体法はこの様な欠点がなく優れた方法である。そして、
螢光抗体法における測定器具として、抗原をアセトン固
定する場合には、市販品としてアセトン耐性のリングの
付いたスライドガラス等があるが、リングの数が少ない
等のため、ハイブリドーマのスクリーニングの様な多量
の検体を検出対象とする様な場合には、不便であった。

また、アセトン固定を行なわない場合では、ティシュカ
ルチャーチャンバースライド等があるが、やはり多量の
検体を検出対象とする場合には、チャンバーの数が少な
くまた洗浄操作等に不便であり、使いにくいという問題
があった。

（／９　問題点を解決するための手段本発明者らは、マイクロプレートの複数のウェル（例え
ば６．１２．２４．４８．　ｆ３０．９６．　１２８）
に、数と位置の対応したウェルを有するマイクロウェル
スライドを用いることにより、多数の検体をまちがえる
ことなく測定することができることを知見した。

即ち、本発明は、抗原抗体反応を利用して抗原又は抗体
を検出する方法において、マイクロプレートの複数のウ
ェル中に存在する特定の抗原又は抗体を、特定の抗体又
は抗原を固定した該マイクロプレートのウェルに対応し
たウェルを有するマイクロウェルスライドに移し、次い
で常法に従って、マイクロウェルスライドのウェル中で
形成された抗原抗体複合物を検出し、それによって抗原
又は抗体を検出する方法である。そして、また、本発明
はかかる方法に使用するマイクロウェルスライドを提供
する。

本発明のマイクロウェルスライドは、その材質・形状が
、厚さｏ、ｉ〜５ｍｍ、好ましくは０．３〜２履のガラ
ス、プラスチック、セラミック、金属等の平板である。

そして、かかる平板の片面の、使用するマイクロプレー
トのウェルと数と位置が同じ場所に、時計回の様にくぼ
みをつけるか、または、マイクロプレートのウェルと数
と位置が同じ場所を型抜きしたガラス、プラスチック、
セラミック、金属等の板を、前記平板に貼り付けるか、
あるいはまた、前記平板の片面のマイクロプレートのウ
ェルと数と位置が同じ場所を、適当な塗料でプリントす
るかして、ウェルの数と位置が解かる様にしたものであ
る。

本発明のマイクロウェルスライドは、特にいわゆる螢光
抗体法に好ましく用いられるが、その他酵素染色法等に
も使用することができる。

本発明においては、マイクロブ、レートの複数のウェル
中に存在する特定の抗原又は抗体を、特定の抗体又抗原
を固定した、該マイクロプレートのウェルに対応したウ
ェルを有する本発明のマイクロウェルスライドに移し、
次いで常法に従って、（マイクロウェルスライドのウェ
ル中で形成された抗原抗体複合物を検出するのであるが
、かかる方法はハイブリドーマのスクリーニングに最適
に用いられる。例えば、９６ウェルのマイクロプレート
を用い、ウェル中に生育したハイブリドーマの産生ずる
抗体の中から、特定のウィルスの表層抗原に対する抗体
を選択するに際して、該マイクロプレートのウェル中の
ハイプリドーマ培養上清を、５ないし１００μ文好まし
くは１０ないし５０μ旦量ずつ、ウィルス感染細胞を生
育させた９６マイクロウェルスライドのそれぞれ対応す
る位置のウェルに移し、その後１０分ないし１２０分反
応させる。そして培地（例えば、イーグルＭＥＭ、ＲＰ
Ｍ１１６４０等）又は緩衝液（例えば、ＰＢＳ　ｐＨ７
，２，ＨＥＰＥＳ　ｌ）Ｈ７，２等）で、抗原抗体複合
物を作らなかった抗体を洗い流し、マイクロウェルスラ
イドのウェル中に形成された抗原抗体複合物に、螢光物
質、例えば、Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ、Ａ　ｃｒｉｆ’１ａｖｉ
ｎ。

Ｄａｎｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄ、　Ｔｈ１ｏｆｌａｖｉｎ
、ＢＡＯ，Ｓ　Ｉ　ＴＳ。

ｆｖｌ　ｐ　３　、　Ｔ　ｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、Ａ
ｔｅｂｒｉｎ、　Ｑ　Ｍ　。

Ａ　ｃｒｉｂｉｎｏｒａｎｏｅ、　Ａ　ｕｒａｍｉｎ、
　Ｅ　ｖａｎｓ　−Ｂ　ｌｕｅ。

Ｆｅｕ＋ｇｅｎなどで標識した該抗体に対する抗体（螢
光物質標識抗体）を、添加する。そして、１０分ないし
１２０分間反応させ、前記の如き培地もしくは緩衝液で
、該抗体に結合しなかった螢光物質標識抗体を洗い流し
、次いで９０％グリセロールにて処理し、カバーガラス
をのせ又は乾燥させた後、螢光顕微鏡を用いて抗原抗体
複合物の存在を判定する。

実施例１　マイクロウェルスライドの作製厚さ１＃１Ｉ
１１．大きさ１３５Ｘ　８５．５＃Ｉ１１のガラス板に
９６ウェルマイクロプレートと同位置、同数、同大のウ
ェルを、アセトン耐性の黒色塗料でプリントしてふちど
りをし、更に手で持ち易い様に、右端の幅１５＃ｌＩＩ
＋をすりガラスとした。すりガラス部分には、えんぴつ
等で文字等の記入できるという効果がある。

得られたマイクロウェルスライド（実物大）の平面図を
第１図に示した。

なお、第１図のマイクロウェルスライド用のカバーガラ
スとして、大きさが８３Ｘ　　１２０＃ｌｌ１１．厚さ
０．１５．のちのを作製し、本発明の方法に使用した。

実施例２　マイクロウェルスライドの滅菌マイクロウェ
ルスライドで細胞を増殖させこれを抗原として用いる為
に、実施例１で得られたマイクロウェルスライドの滅菌
について検討した。

スライドをアルミホイルで包み、これをオートクレーブ
法（１２０℃、２０分）、乾熱滅菌法（１６０℃。

４０分）、または角シャーレに入れガス滅菌法（エチレ
ンオキサイドガス）、電子レンジ法（３０秒。

６０秒）を行なったところ、いずれの方法でも滅菌可能
であった。なお、無菌試験は、各ウェルに３０μ文のイ
ーグルＭＥＭを入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３日
培養し、雑菌の増殖の有無を観察した。

実施例３　マイクロウェルスライドでのウィルス抗原の
作製と血中抗体価測定１０％仔牛血清加イーグルＭＥＭ培地でｉｏｓ〜１０６
ｃｅｌｌｓ　／ｌｎＲに調整したＶｅｒｏ細胞浮遊液３
０μ文を、実施例１で作製した９６マイクロウェルスラ
イドに、１２１マルチチヤンネルピペツトを用いて分注
し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２日間培養した。ｙ
　ｅｒｏ細胞は、ウェル中で単層に生育した。この９６
マイクロウェルスライドに、２Ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｅの
単純ヘルペスウィルス希釈液５μすを、１２連マルチチ
ヤネルピペツトを用いて接種し、２４時間培養したもの
をウィルス抗原とした。

一方、抗単純ヘルペスウイルスヒトモノク０−ナル抗体
、抗水痘帯状痔疹ウィルスヒトモノクローナル抗体、被
検ヒト血清を、それぞれ、Ｕ底９６穴マイクロプレート
を用いて３倍段階希釈した。

前記のウィルス感染細胞を生育させた９６マイクロウェ
ルスライドを、リン酸緩衝液を満たした角シャーレに静
かに入れて３回洗った後、０．５％牛アルブミン添加ハ
ンクス液に入れ、次いで風乾し、Ｕ底９６穴マイクロプ
レートにて希釈された抗体液２０μ文を、マイクロウェ
ルスライドの同じ位置に入れ、３７℃、１時間反応させ
た後、これをリン酸緩衝液を満たした角シャーレに静か
に入れて３回洗った後、０．５％牛アルブミン添加ハン
クス液に入れた。風乾後、ＦＩＴＣラベルひつじ抗ヒト
１（ＩＧ抗体（Ｔ　ａｇｏ社）を、０．５％牛アルブミ
ン添加ハンクス液で１００倍希釈したものを２０μ立入
れ、暗所で３０分反応させた後、リン酸緩衝液を満たし
た角シャーレに入れて３回洗い、次いで風乾した。次い
で、９０％グリセロール数滴で処理し、実施例１で作製
したカバーガラスをのせ、螢光顕微鏡を用いて判定した
。結果を第１表に示した。

第１表実施例４　マイクロウィルスライドを用いて単純ヘルペ
スモノクローナル抗体のリーニング実施例３で作製した単純ヘルペスウィルスを生育させた
９６マイクロウェルスライドに、９６ウェルマイクロプ
レートで生育しマウスヒイブリドーマの上清を、それぞ
れ対応する位ウェルに２５μｄずつのせ、３７℃で１時
間反応だ。

そして、実施例３で示した方法で、螢光抗による抗体の
検出を行った。その結果Ｈ１ののウェルのみ、抗原抗体
反応をおこしていた

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のマイクロウィルスライ説明図である
。特許出願人　帝　人　株　式　会代　　理　　人　　弁理士　　前　　１）　純の抗

Claims

【特許請求の範囲】１、抗原抗体反応を利用して抗原又は抗体を検出する方
法において、マイクロプレートの複数のウェル中に存在
する特定の抗原又は抗体を、特定の抗体又は抗原を固定
した該マイクロプレートのウェルに対応したウェルを有
するマイクロウェルスライドに移し、次いで常法に従っ
て、マイクロウェルスライドのウェル中で形成された抗
原抗体複合物を検出し、それによって抗原又は抗体を検
出する方法。２、ハイブリドーマをスクリーニングするに際して用い
る特許請求の範囲第１項記載の抗原又は抗体を検出する
方法。３、マイクロプレートの複数のウェル中に存在する特定
の抗原又は抗体を、特定の抗体又は抗原を固定した該マ
イクロプレートのウェルに対応したウェルを有するマイ
クロウェルスライドに移し、次いで常法に従って、マイ
クロウェルスライドのウェル中で形成された抗原抗体複
合物を検出し、それによって抗原又は抗体を検出する方
法において使用するマイクロウェルスライド。４、マイクロウェルスライドのウェル数が９６ウェルで
ある、特許請求の範囲第３項記載のマイクロウェルスラ
イド。