JPS62165152A - カルシウムイオン分析用一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は水性液体試料中のカルシウムイオン分析用一体
型多層分析要素に関し、さらに詳しくは生物体液１例え
ば血液（全血、血漿、血清）、髄液、リンパ液、唾液、
尿等の水性液体試料中のカルシウムイオン定量分析用の
乾式操作可能で臨床診断に特に有用な一体型多層分析要
素に関するものである。

［従来技術］ 水性液体試料、殊に生物体液中のカルシウムイオンの定
量分析は広く一般に行なわれているが。

簡便で精度の高い測定方法が特に臨床診断分野で望まれ
ている。

水性液体試料のカルシウムイオンの定量方法は大別する
と原子吸光法、キレート試薬による方法。

電極法等がある。従来臨床診断分野ではキレート試薬を
用いる定量方法が広〈実施されている。この方法では水
性液体試料中に含まれるカルシウムの全量が定量されて
いることが知られている。

ところで臨床診断分野における水性液体試料。

例えば血液においてはカルシウムはイオン型とアルブミ
ン等の蛋白質等に結合した結合型の２種の存在形態があ
ることがしられている。近年臨床診断分野ではイオン型
カルシウムの分別定量が望まれている。

電極法によるカルシウムの定量においてはカルシウムイ
オンが定量されるが、電極法特有のドリフト（突発的に
生ずる測定電位の予期せざる変動）。

電極の保守点検に労力を要する。測定装置が高価格等の
諸種の問題点がある。

一方、水性液体試料を５μｍないし３０１１程度の少量
用いてカルシウムの定量分析が実施できる一体型多層分
析要素が特開昭５４−２９７００　、特開昭５８−１７
８２５６゜特願昭６０−２５８２８等の明細書に記載さ
れている。これらの特許請求の範囲明細書に記載の一体
型多層分析要素においてはいずれも全カルシウム量定量
を目的としたものであり、カルシウムイオンの分別定量
を意図した分析要素ではない。

［発明の目的］ 本発明目的は簡便な乾式操作で水性液体試料中のカルシ
ウムイオンを定量分析できる一体型多層分析要素を提供
することである。

本発明の他の目的は水性液体試料中のカルシウムイオン
を独立した分別操作なしに定量分析できる一体型多層分
析要素を提供することである。

本発明他の目的は無希釈又は低希釈率の血液試料（全血
、血漿、血清）を用いて血液試料中のカルシウムイオン
を定量分析できる一体型多層分析要素を提供することで
ある。

「発明の構成」 本発明は、光透過性水不透過性支持体の上に。

カルシウムイオンと結合して光学的に検出可能な変化を
しうる指示薬を少なくとも１種含有する試薬層、蛋白質
を実質的に透過させない親水性非孔質中間層、および多
孔性展開層をこの順に有し。

かつ少なくともいずれか１層にｐＨ桜衝剤を含有するカ
ルシウムイオン分析用一体型多層分析要素である。

［発明の構成の詳細な説明］ 本発明のカルシウムイオン定電用一体型多層分析要素（
以下、多層分析要素ということがある）の特徴は第１に
多層分析要素内の多孔性展開層（以下、展開層というこ
とがある〉と試薬層の間に蛋白質不透過性の中間層を設
けてアルブミン等の血清蛋白の試薬層への拡散移行を阻
止し蛋白結合カルシウムの試薬層への拡散移行を実質的
に阻止することにより拡散移行可能なカルシウムイオン
を試薬層で検出できること、すなわち独立した分別操作
なしにカルシウムイオンの定量分析が実施できること、
第２に水性液体試料を希釈せずに、又は１０倍以下の希
釈率でカルシウムイオンの定量分析が実施できること、
第３に水性液体試料点着時の多層分析要素内、好ましく
は展開層内のｐＨを約８．０から約１１．０．好ましく
は約９．０から約１０５に保つことて展開層内にとどま
っているカルシウム−アルブミン結合体の安定化をはか
ることにより高精度でカルシウムイオンの定量分析が実
施できること等である。

本発明の多層分析要素の光透過性水不透過性支持体とし
ては従来公知の多層分析要素に用いられている光透過性
（透明な）水不透過性支持体を用いることができる。そ
の具体例として、ポリエチレンテレフタレート、ビスフ
ェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロ
ースエステル（例、セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートピロビオネー
ト等）等のポリマーからなる厚さ約５０ｕｍから約１ｍ
ｍ、好ましくは約８０ｕｍから約３００　Ｌｆｆｎの範
囲の透明な、すなわち波長約２００ｎｍから約９００ｎ
ｍの範囲内の少なくとも一部の波長範囲の電磁輻射線を
透過させる平滑な表面を有するフィルム状（シート状）
または平板状の支持体を用いることができる。支持体中
には必要に応して二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微
粒子、カーボンブラック等を分散含有させて光学的性能
を調節することができる。支持°体の表面ζこは必要に
応じて公知の下塗層または接着層を設けて支持体の上に
設けられる吸水層または試薬層等と支持体との接着を強
固にすることができる。

本発明の多層分析要素においては支持体と後述する試薬
層の間に吸水層を設けることができる。

吸水層は水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主成分
とする層で、吸水層の界面に到達または浸透した水性液
体試料の水を吸収できる層であり。

全血試料を用いる場合には水性液体成分である血漿の試
薬層への浸透を促進する作用を有する。吸水層に用いら
れる親水性ポリマーは水吸収時の膨潤率が３０℃で約１
５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約
１５００％の範囲のポリマーである。親水性ポリマーの
具体例として特開昭５９−１７１８６４．特開昭６０−
１１５８５９等に記載の酸処理ゼラチン、脱イオンゼラ
チン等のゼラチン、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアク
リレートグラフトゼラチン等のゼラチン誘導体、特開昭
５９−１７１８６４　、特開昭６０−１１５８５９等に
記載の７ガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、特願昭６０−１７１１３４に記載のメタリルア
ルコール二元又は三元コポリマー等がある。

これらの親水性ポリマーは単独で、あるいは２種以上を
組合せて用いることができる。吸水層には一般的にはゼ
ラチンまたはゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、ポ
リビニルアルコールを用いるのが好ましく、これらのう
ちではゼラチン（脱イオンゼラチン）が最も好ましい。

吸水層の乾燥時の厚さは約３１７ＩＴｌから約１１００
１Ｊ、好ましくは約５Ｌｆｆｒｌから約３０ｕｍの範囲
、被覆量では約３３／ｍ２から約１００３／ｍ２．好ま
しくは約５ｇ／ｍ２から約３０ｇ／ｍ”の範囲である。

吸水層には後述するｐ＋＋緩衝剤。

公知の塩基性ポリマー等を含有させて使用時（分析操作
実施時）のｐＨを調節することができる。さらに吸水層
には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含有させること
ができる。

試薬層は水性液体試料中のカルシウムイオンと反応して
検出可能な色（好ましくは可視光領域の色）変化を生じ
させる少なくとも１種の指示薬を含む試薬組成物がポリ
マーバインダーとしての親水性ポリマー中に実質的に一
様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。

試薬層に用いられる親水性ポリマーとしては前述の吸水
層に用いられるのと同様な親水性ポリマーがある。試薬
層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポリ
アクリルアミド、ポリビニルアルコール等を用いるのが
好ましく、これらのうちではゼラチン（脱イオンゼラチ
ン）が最も好ましい。試薬層の乾燥時の厚さは約５ＬＩ
Ｉ１１から約５０１ｍ。

好ましくは約７−から約３０−の範囲、被覆量では約５
ｇ／ｍ２から約５０ｇ／ｍ２．好ましくは約７３／ｍ２
から約３０ｇ／ｍ２の範囲である。試薬層には後述する
ｐＨ緩衝剤。

公知の塩基性ポリマーを含有させて分析操作時のｐＨを
調節することできる。さらに試薬層には公知の媒染剤、
ポリマー媒染剤等を含有させることができる。試薬層お
よび／または吸水層は実質的に透明であることが好まし
いが、必要に応じて層中に二酸化チタン微粒子、硫酸バ
リウム微粒子、カーボンブラック等を少量分散含有させ
て光学的性能を調節することができる。

試薬層に含有される試薬組成物中の指示薬としては、カ
ルシウムと結合して色変化する指示薬のうちで、カルシ
ウムとの結合が最も安定する環境ｐＨ（以下、最適ｐＨ
という）値１０以上の指示薬が用いられる。カルシウム
との結合の最適ｐ）Ｉ（ｆｆｉｌｏ以上の指示薬の具体
例として、０−クレゾールフタレインコンプレクソン（
３，３’−ビス［［ジ（カルボキシメチル）アミノ］メ
チル］−０−クレゾールフタレイン［２４１１−８９−
４１，最適ｐ）Ｉ値約１０．５　；以下［コ内の数字は
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　Ｒｅｇｉｓｔ
ｒｙＮｕｍｂｅｒを表す）。

エリオフロームブラックＴ　（１−（１−ヒドロキシ−
２−ナフチルアゾ）−６−二トロー２−ヒドロキシナフ
タレン−４−スルホン酸モノナトリウム塩［＋７８７−
６１−７３　。

最適ｐｉ値約１０．０）、メチルチモールブルーコンブ
レクソン（３，３’−ビス［［ジ（カルボキシメチル）
アミノコメチルコチモールスルホンフタレインテトラナ
トリウム塩［＋９４５−７７−３］、最適１ｕｌｌ値約
１１．０〜１２．０）。

チモールフタレインコンブレクソン（３，３’−ビス［
［ジ（カルボキシメチル）アミノ］メチルコチモールフ
タレイン［１９１３−９３−５］、最適ｐＨ値約１０．
０〜１１．５）等「ドータイト試薬総合カタログ第１２
版」（熊本型。

−同仁化学研究所、１９８０年発行）等に記載の指示薬
がある。これらの指示薬のうちでは０−クレゾールフタ
レインが最も正確なカルシウムイオンの定量分析が可能
な点で好ましい。また、必要に応じて試薬組成物を２Ｐ
ｉ以上の別個の層に分けて（例えは試薬層と吸水ｆｆ１
）含有させることもできる。

本発明の多層分析要素には水性液体試料を点着しての分
析操作実施時の環境ｐＨ値を約８．０から約１１．０．
好ましくは約９．０から約１０．５の範囲の所望の値に
緩衝できる公知の緩衝剤から適宜選択して含有させる。

分析操作実施時の環境ｐＨ値は、アルブミンとカルシウ
ムの結合が安定し、結合型カルシウムが測定されないｐ
Ｈ値である約８．０以上であって、しかもアルブミンと
カルシウムの結合力が増大してイオ、ン型カルシウムを
もアルブミンが結合してしまうような高いｐＨ値でない
約１１．０以下、好ましくは約９．０から約１０．５の
範囲になるように設定する。

用いろる緩衝剤としては２日本化学会編「化学便覧　基
礎編」（東京、丸善曲、　１９６６年発行）　１３１２
−１３２０頁、　Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａ
ｌ［ｒＤａｔａ　ｆｏｒＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｌｌ」第２版（０ｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈ
ｅＣＩａｒｅｎｄｏｎ　Ｐ　ｒｅｓｓ、　１９６９年発
行）　４７６−５０８頁。

ｒ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　５．４６７頁以降
（１９６６年）＋’Ａｎａ−Ｉｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　１０４．３００−３１０頁（１
９８０年）等に記載のｐｌ（緩衝剤系がある。

ｐｉ（８，０から１１．０の範囲のｐＨ緩衝剤の具体例
としてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒ
ｉｓ）を含む緩衝剤：燐酸塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含
む緩衝剤；炭酸塩を含む緩衝剤ニゲリシンを含む緩衝剤
；　Ｎ、Ｎ−ヒス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（
Ｂｉｃｉｎｅ）　；　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラ
ジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸
（１１εＰＰ５）Ｎａ塩またはに塩等；Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ′−３−スルホン酸（ＥＰＰ
Ｓ）Ｎａ塩またはに塩等；Ｎ−［）リス（ヒドロキシメ
チル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡ
ＰＳ）Ｎａ塩またはに塩等；Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ″−２−エタンスルホンＭ（ＨＥＰＥＳ
）Ｎａ塩またはに塩等；およびこれらのいずれかと必要
により組合せられる酸、アルカリまたは塩がある。好ま
しい緩衝剤の具体例として、Ｔｒｉｓ−硼酸ナトリウム
；　Ｂｉｃｉｎｅ　；　ＨＥＰＰＳ　；　ｌＩ［：ＰＰ
Ｓナトリウム塩；　ＥＰＰＳ；ＥＰＰＳナトリウム塩；
　ＴＡＰＳ；ＴＡＰＳナトリウム塩等がある。試薬層、
吸水層又は後述する親水性非孔質中間層の親水性バイン
ダーポリマーとしてゼラチン又はゼラチン誘導体を用い
る場合には、ビニルスルホン構造含有架橋剤でこれらの
層の適当な架橋硬化ができ、塗布によりこれらの層が安
定に設けられ、高精度の定量分析が実施可能という観点
から硼酸又は硼酸ナトリウム含有ｐ）ｌ緩衝剤が好まし
い。ｐＨ緩衝剤は試薬層、吸水層、　１１水性非孔質中
間層等に含有させろことができる。

本発明の多層分析要素においては展開層と試薬層の間に
少なくとも蛋白質を透過させない親水性非孔質中間層が
設けられる。親水性非孔質中間層は吸水層に用いられる
のと同様な親水性ポリマーバインダー又は架橋された親
水性ポリマーバインダーからなり、高分子量の蛋白質、
殊にアルブミンやグロブリンを通過させない厚さを有す
る層である。親水性非孔質中間Ｎ（以下、中間層という
ことがある）には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘
導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール等を
用いるのが好ましく、これらのうちではゼラチン（脱イ
オンゼラチン）が最も好ましい。

中間層に用いられる親水性ポリマーは架橋剤（硬化剤）
を用いて適宜に架橋硬化された中間層とすることができ
る。架橋剤の例として、ゼラチンに対する１、２−ビス
（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン、ビス（ビニ
ルスルホニルメチル）エーテル等の公知のビニルスルホ
ン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリ
マーに対するアルデヒド、２個のグリシジル基含有エポ
キシ化合物等がある。中間層の乾燥時の厚さは約５１Ｊ
ＩＴ＋から約５０１ＪＩｎ、好ましくは約７１．ＩＩｎ
から約３０１．１ｌＴｌの範囲、被１ｆｉｔては約５Ｊ
ｔ／ｍ２から約５０ｇ／ｍ２．好ましくは約７ｇ／ｍ”
から約３０ｇ／ｍ２の範囲である。中間層には前述のｐ
ｌ＋緩衝剤、公知の塩基性ポリマー等を含有させて分析
操作時のｐＨを調節することができる。中間層中には二
酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子等を非孔質を損
なわない範囲で分散含有させて光遮蔽層の機能もあわせ
持たせることができる。

中間層の上には展開層を強固に接着一体化する目的でゼ
ラチンに代表される吸水層に用いられるのと同様な親水
性ポリマーからなる公知の接着層を設けることができる
。接着層の乾燥時の厚さは約０．５−から約５ｕｍの範
囲である。

多孔性展開層としては特開昭５５−１６４３５６　、特
開昭５７−（ｉ６３５９等に記載の織物展開層（例、ブ
ロード、ボブリン等の平織等）、特開昭６０−２２２７
６９等に記載の編物展開層（例、トリコット編、ダブル
トリコット編、ミラニーズ編等）、特開昭５７−１４８
２５０に記載の有機ポリマー繊維バルブ含有抄造紙から
なる展開層、特公昭５３−２１６７７、米国特許３９９
２１５８等に記載のメンブランフィルタ（プラッシュポ
リマーＮ）。

ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が
親水性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙
含有多孔性層等の非繊維等方的多孔性展開層、特開昭５
５−９０８５９に記載のポリマーミクロビーズが水で膨
潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連
続微空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）か
らなる非繊維等方的多孔性展開層等を用いることができ
る。

多孔性展開層に用いられる織物生地９編物生地又は抄造
紙は特開昭５７−６６３５９に記載のグロー放電処理ま
たはコロナ放電処理に代表される物理的活性化処理を布
生地の少なくとも片面に施すか、または特開昭５５−１
［３４３５６、特開昭５７−６６３５９等に記載の水洗
脱脂処理、ｉ水性ポリマー含浸等親水化処理。

またはこれらの処理工程を適宜に組み合せて逐次実施す
ることにより布生地を親水化し、下側（支持体に近い側
）の層との接着力を増大させることができる。

試薬層、吸水層、中間層、接着層、展開層等には界面活
性剤を含有させることができる。その例としてノニオン
性界面活性剤がある。ノニオン性界面活性剤の具体例と
して、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール
、ｐ−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリ
オキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェノキシポリ
グリシドール、オクチルグルコシド等がある。ノニオン
性界面活性剤を展開層に含有させることにより水性液体
試料の展開作用（メータリング作用）がより良好になる
。ノニオン性界面活性剤を試薬層または吸水層に含有さ
せることにより分析操作時に水性液体試料中の水が試薬
層または吸水層に実質的に一様に吸収されやすくなり、
また展ｒＷｉ層との液体接触が迅速にかつ実質的に一様
になる。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公
知の方法により調製することができる。

本発明の多層分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍ
の正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特公昭５７−２８３３１　、実開昭５６−１４２４５４
　、特開昭５７−６３４５２．実開昭５８−３２３５０
．特表昭５８−５０１１４４等に記載のスライド枠に収
めて化学分析スライドとして用いることが、製造、包装
、ｉｔｉ＋送、保存、測定操作等諸種の観点て好ましい
。使用目的によっては。

長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いる
こと、または小片を開口のあるカードに貼付または収め
て用いることなどもできる。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の
操作により液体試料中の被検成分の分析を実施できる。

すなわち約５ｕｌから約３０−２好ましくは８μｍから
１５ｕ１の範囲の全血、血漿、血清等の水性液体試料中
を展開層に点着し、１分から１０分の範囲で、約２０℃
から約４０℃の範囲の実質的に一定の温度で、好ましく
は３７℃近傍の実質的に一定の温度でインクベーション
し、光透過性支持体側から可視光（又は近紫外線）を用
いて試薬層又は吸水層の光学濃度を反射測光し、予め作
成した検量線を用いて比色測定法の原理により液体試料
中の被検成分（カルシウムイオン）含有量を求めること
ができる。点着する水性液体試料の量、インクベーショ
ン時間と温度は一定にすることにより被検成分の定量分
析を高精度で実施できる。この測定操作は特開昭５６−
７７７４６．特開昭５８−２１５６６、特開昭５８−１
６１８６７等に記載の化学分析装置により極めて容易な
操作で高精度の測定をすることができる。

（以下余白） 実施例１ 厚さ１８０ＬＩＩＩ＋の無色透明ポリエチレンテレフタ
レー１−（ＰＥＴ）フィルム（支持体）の上に下記の組
成の被覆量になるようにして塗布層を順次水溶液を用い
て塗布し乾燥して設け、積層した。

筬１１ 脱イオンゼラチン　　　　　　　　　２３．９ｇ／ｍ２
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（平均１ｏ
オキシ工チレン単位含有）　　　０．４１ｇ／＋ｎ２硼
酸　　　　　　　　　　　　　　　　１．１１ｇ／＋ｎ
２０−クレゾールフタレインコンプレクソン０．４６ｇ
／ｍ２ ８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸　１．６３ｇ
／ｎ＋２水溶液をＮ　ａ　ＯＩｔでｐＨｉｏ、ｏに調整
した親水性非孔質中間層 脱イオンゼラチン　　　　　　　　　　１５．６ｇ／ｍ
２ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル〈平均１
０オキシ工チレン単位含有）　　　０．３０ｇ／ｍ２１
．２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン０
．１７ｇ／ｎ＋” 接！ｕ色 脱イオンゼラチン　　　　　　　　　　１．４６ｇ／ｍ
”ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（平均１
０オキシ工チレン単位含有）　　　０．１０ｇ／ｍ２二
酸化チタン微粒子　　　　　　　　　０．８５ｇ／ｍ２
ついで接着層の表面に水をほぼ一様に供給して湿潤させ
、その上に１０Ｏ８相当のＰＥＴ紡績糸からなる厚さ約
２５０ｕｍのトリコット編物生地をほぼ一様に軽く圧力
をかけてラミネートして展開層を設けた。ついで展開層
の上から下記の被覆量になるようにメチルセルロース水
溶液を塗布し乾燥させてカルシウムイオン定量用一体型
多層分析要素を調製した。

メチルセルロース　溶ン被７組成 メチルセルロース （２１水溶液の２０℃での粘度１００ｃｐｓ）　　　５
．７５ｇ／ｍ２ポリオキシエチレンノニルフェニルエー
テル（平均４０オキシ工チレン単位含有）　　　７．４
４ｇ／ｍ２二酸化チタン微粒子　　　　　　　　１５．
５ｇ／ｍ２水溶液をＮａＯＨでｐＨ８，０に調整した得
られたカルシウムイオン定量用多層分析要素の性能評価
をするために、ヒトアルブミンとＣａＣＩ　２とをそれ
ぞれ第１表に記載の量生理食塩水に溶解し、ｐ１１約６
．５に調整して評価用水性液体試料（コントロール血清
）を調製した。

上記の水性液体試料について本発明の多層分析要素、カ
ルシウムイオン測定用イオン選択電極、全カルシウム測
定用比色試薬を用いてカルシウム含有量を測定して第１
表の結果が得られた。

第１表の結果から本発明の多層分析要素でのカルシウム
測定値はカルシウムイオン電極性での測定値とよく一致
している（直線的な相関を示す）が。

比色試薬法での全カルシウム測定値とは一致していない
。これは本発明の多層分析要素を用いて乾式操作でカル
シウムイオン含有量を測定できることが明らかである。

（以下余白） 第１表

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）光透過性水不透過性支持体の上に、カルシウムイ
   オンと結合して光学的に検出可能な変化をしうる指示薬
   を少なくとも１種含有する試薬層、蛋白質を実質的に透
   過させない親水性非孔質中間層、および多孔性展開層を
   この順に有し、かつ少なくともいずれか１層にｐＨ緩衝
   剤を含有することを特徴とするカルシウムイオン分析用
   一体型多層分析要素。
2. （２）前記指示薬がｐＨ８．０から１１．０の範囲でカ
   ルシウムイオンと結合して色変化しうる指示薬である特
   許請求の範囲１に記載の分析要素。
3. （３）前記指示薬が３，３′−ビス［［ジ（カルボキシ
   メチル）アミノ］メチル］−ｏ−クレゾールフタレイン
   である特許請求の範囲１に記載の分析要素。
4. （４）前記ｐＨ緩衝剤が水性液体試料供給時の分析要素
   内のｐＨ値を８．０から１１．０の範囲に維持しうるｐ
   Ｈ緩衝剤である特許請求の範囲１または２に記載の分析
   要素。