JPS62107789A - ピキア・パストリス アルギニノコハク酸リア−ゼ遺伝子およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えＤＮＡ技術分野に関するものである。

本発明の局面の一つは、酵母（ｙｅａｓｔ）株Ｐｉｃｈ
ｉａ属からの機能的遺伝子の単離に関するものである。

異なる局面では、本発明はピキア（ＰｉＣｈｉａ）属酵
母株の形質転換における選択マーカーとしての上記遺伝
子の使用に関するものである。更に異なる局面において
、本発明はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の新しい酵母株に
関するものである。

現在まで、多様なポリはプチド産生のための組み換えＤ
ＮＡ技術を行なう商業的成果は、宿主生物体として大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　が中心と
なってきた。しかしながら、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は
宿主として不適合である場合もある。例えば、大腸ｍ　
（Ｅ、ｃｏｌｉ）は、薬学的製品として有用なあらゆる
ポリペプチドから除去されねばならない多数の毒性発熱
物質性因子を含んでいる。上記精製が可能である有効性
は、各々のポリペプチドによって異なる。さらに、大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の夕／・２り質加水分解活性によっ
て、ある種の有用な産物の収量が著しく制限される。上
記の点および他の点を考慮し、ポリはプチド産生のため
の代わりとなる宿主に対する関心が高まシ、特に、ポリ
ペプチド産物産生のための真核生物の使用が注目されて
いる。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のような原核生物系を組み換え
ＤＮＡによってコードされたポリペプチドの産生に使用
することに比較して、例えば酵母（ｙｅａｓｔ）のよう
な真核生物系においてポリペプチドを産生させる方法の
有効性は、顕著な利点を含む。比較的最近登場した大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）大規模発酵に比べ、酵母（ｙｅａｓ
ｔ）の大規模発酵は数世紀にわたって行なわれてきた。

酵母（７ｅａｓｔ）は一般的に１細菌よりも高い細胞密
度で成長でき、連続的な発酵過程に容易に適合する。実
際に、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ）のような酵母（ｙｅａｓｔ）の極く高い細胞密
度、すなわち１ｏｏ９／Ｌ以上の細胞密度までの成長は
、ウニブナ−（Ｗｅｇｎｅｒ）によって米国特許第４４
１４．３２９号明細書に開示されている。酵母（ｙｅａ
ｓｔ）宿主の別の利点としては、例えば酸化的リン酸化
のような、生物体の決定的な多くの機能が細胞内小器官
で行なわれておシ、従って、野性型宿主にとって外来性
のポリペプチドを生物体が産生することによって起こり
うる有害な効果にさらされない。真核生物として、酵母
（ｙｅａｓｔ）は、グリコジル化（ｇｌｙｃｏ日ｙｌａ
ｔｉｏｎ）が生物的活性に重要であるような発現された
ポリペプチド産物のグリコジル化が可能なことが確かめ
られる。また、酵母（ｙｅａｓｔ）　　は真核生物であ
り、高等生物と同じコドン選択性を示すため、咄乳動物
遺伝子あるいは例えば哺乳動物ｍＲＮＡからの逆転写に
よって得られた相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの発現産物
のよシ効率的な産主に貢献することが可能である。

解析の進んでいない酵母（ｙｅａｓｔ）　　種の宿主／
ベクター系としての発展は、形質転換条件および適当な
ベクターに関する情報の欠如のために非常に困難となっ
ている。さらに、独立栄養変異がしばしば利用できず、
独立栄養相補によって形質転換体の直接的選択が妨げら
れる。組み換えＤＮＡ技術が、その展望を完全に維持す
るためには、目的のポリペプチド産物が制御された条件
下で高収量で調製されるように、ＤＮＡの操作を容易に
し、挿入されたＤＮＡ塩基配列の発現を効果的に活用で
きるような新しい宿主／ベクター系が考案されねばなら
ない。

組み換えＤＮＡ技術に使用される基本的な要素は、数種
の微生物中に見いだされる、染色体外性二重鎖ＤＮＡ　
である、プラスミドである。プラスミドが天然に微生物
内に見いだされる場合、しばしばＩｖ＋ｉＢ胞あた９複
数のコピーが存在するのが見られる。天然に存在するプ
ラスミドに加え、多数の人ニブラスミド、あるいはハイ
ブリッドベクターが調製されている。プラスミドＤＮＡ
　Ｋコードされる情報には、娘細胞中でプラスミドを複
製するのに必要な情報、すなわち自律性複製配列（ａｕ
ｔｏｎｏｍｏｕ日ｒｅｐ１ｉｃａｔｉｏｎ　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ）　　が含まれる。プラスミドＤＮＡ　にコード
される情報には、１種以上の表現型選択形質も含まれな
ければならない。表現型選択形質は、選択培地における
細胞の優性的成長によって、問題のプラスミドを含む宿
主細胞のクローンを確認し、選択することを可能にする
。

以上のように、本発明の目的は、例えば表現型選択マー
カーのような、有用なピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母（
ｙｅａｓｔ）株由来の機能的遺伝子である。

本発明の別の目的は、ピキア・パス）　ＩＪス（Ｐｉｃ
ｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のアルギニノコハク酸
リアーゼ（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ　１ｙ
ａｅｅ、　ＡＲＧ４　）をコート９する遺伝子の単離お
よび解析である。

本発明のさらに別の目的は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属
酵母株を、ＡＲＧ４遺伝子をマーカー遺伝子として含む
形質転換ＤＮＡで形質転換することである。

本発明のさらに別の目的は、アルギニノコノ・り酸リア
ーゼ（ＡＲＧ４）欠損性の新規な、ピキア（Ｐｉｃｈｉ
ａ）属酵母味である。

本発明の上記目的および別の目的は、前述の特許請求の
範囲および以下の記述により明確になるであろう。

本発明に従い、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母株由来の
アルギニノコ・・り酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードす
る遺伝子が発見され、単離され、精製された。

単離された新しい遺伝子は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属
酵母株を宿主とする、宿主／ベクター系において表現型
選択マーカーとして有用である。

本発明の別の実施態様により、アルギニノコノ・り酸リ
アーゼ（ＡＲＧ４）　　遺伝子活性を欠損するピキア（
Ｐｉｃｈｉａ　）属酵母株が得られた。上記新酵母株は
、ＡＲＧ　４　遺伝子機能を表現型選択性マーカーとす
る形質転換ＤＮＡ　Ｋよる形質転換のための宿主生物と
して有用である。

以下の略号は、使用された制限酵素を表すために本明細
書中で使用したものである。

ＢＢａＩｎＨＩ Ｂ２　　　　　　　ＢｇｌｌＩ Ｈ３Ｈｉ　ｎ　ｄ　１ｌｌ ＨｐＩ　　　　　　ＨｐａＩ Ｎｒ　　　　　　　Ｎｒｕｌ Ｐｓ’　　　　　　Ｐｓｔ） ”　Ｖ　２　　　　　　Ｐ　ｖ　ｕ　［ＲＩＥｃｏＲＩ Ｒ５ＥｃｏＲＶ Ｓ　　　　　　　　５ａ１１ Ｓｐ　　　　　　　５ｐｈｌ Ｓ　３Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａ　Ｉ Ｘｈ　　　　　　　Ｘｈｏｌ 添付した図中で、ＤＮＡ　フラグメントの操作には使用
されたが、連結反応で破壊された制限部位は、破壊され
た部位をカッコでくくった略号で示している。

ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）　’１４およびサツカロミセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）属酵母由来の機能的
遺伝子は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）　：属由来の相補性
機能的遺伝子を単離するためにサツカロミセス・セレビ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）の詳細に解析された欠損株を利用するのに十分類
似していることが明らかになっている。上記のように、
本発明によって、ピキア（Ｐｔｃｈｔａ）からサツカロ
ミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　ＡＲＧ４遺伝
子と同等の遺伝子が単離されている。上記単離された新
しい遺伝子は、本開示の目的のために、ピキアＡＲＧ４
遺伝子（Ｐｉｃｈｉａ　ＡＲＧ、ｌ　ｇｅｎｅ）と呼ぶ
。上記新遺伝子は、Ｓ、セレビジｘ　（Ｓ、　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ノ適当な変異株をピキア（Ｐｉｃｈｉａ
）染色体ＤＮＡ　ライブラリで形質転換し、アルギニン
の添加をしない培地中で生存する形質転換株を選択する
ことによシ単離した。

ＡＲＧ　４　　遺伝子はＰ、パストリス（Ｐ、ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ）ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３０株から、５ａｕ３
ＡＩによる全染色体ＤＮＡの部分的切断およびそれに続
く蔗糖密度勾配遠心によって単離した（実施例■参照）
。

５ｋｂｐから２０　ｋｂｐのフラグメントをＳ、セレビ
シェ−大腸菌シャトルベクター（Ｓ、ｃθｒ＋ｌ１ＩＶ
ｉｓｉａｅ−Ｅ、ｃｏｌｉ　　５ｈａｔｔｌｅ　　ｖｅ
ｃｔｏｒ）　　ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５；第１
図）のＢａｍＪ切断部位にクローン化し、大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）の形質転換を行なった。

約５０．　ＯＯＯコロニーが形成され、全プラスミドゝ
ＤＮＡを抽出した。ａｒｇ　４変異株である、Ｓ、セレ
ビジｘ　（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｓ　２０７２
Ａ株（ａｒｇ　４１ｅｕｌ　ｔｒｐｌ　　ｇａ１２　ｚ
　　米国カリフォルニア州バークレー、イースト・ジエ
ネティツク・ストック・センターよシ入手可）のスフェ
ロプラストをＹＥｐ１３ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）　　Ｉ
ＩＨｉＡ　ライブラ’）約１μひとヒンネ７　（Ｈｉｎ
ｎｅｎ）池（１９７８）の方法により混合し、アルギニ
ン欠損培地中で増殖した。上記形質転換によシ、１×１
０　の全増殖可能なスフェロプラストから、４５の酵母
原栄養株（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃｐａ日ｔ）コロニ
ーを得た。ＤＮＡを加えずにインキュベートした対照試
料は１コロニーを生成した。

プラスミドを、７種のＡｒｇ＋Ｓ、セレビシェ（Ｓ、ｃ
ｅｒθＶｉｓｉａθ）コロニーから、酵母細胞から全Ｄ
ＮＡ　を抽出し、大腸菌を形質転換することにより回収
した。上記７種のプラスミドは、それぞれＳ、セｖビジ
ｘ　（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ａｒｇ４５２０７
２Ａ株を高頻度で形質転換し、アルギニ／原栄養株とす
ることから、それぞれＡＲＧ　４遺伝子を含むことが判
明した。プラスミドは制限酵素マツピングによって解析
した。６種のプラスミドはＹＥｐ１３およびピキア（Ｐ
ｉｃｈｉａ　）　ＤＮＡ　　の８．２　ｋｂｐの同等な
挿入物から構成されていた。１種のプラスミドはＹＥｐ
１３および、６（重のより小さいプラスミドに見いださ
れるほとんどあるいは全ての塩基配列を象む１０　ｋｂ
ｐの挿入物から構成されていた。

小型のプラスミドの１種であるｐＹＡ３３　　（第２図
）はさらに分析して選択した。大腸菌宿主ＭＣ１０６１
に導入された上記プラスミドは、本出願が特許として発
布された際に、一般の使用を保証するため、米国イリノ
イ州にオリアの米国ｔＡ　ｔｉ省北部研究センター（ｔ
ｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ＲｅｇｉｏｎａＩＲｅｓｅａ
ｒｃｈＣｅｎｔｅｒ　ｏｆｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅａ　５ｔ
ａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒｅ）に寄託されている。ＭＣ１０６１−ｐＹＡ３
３株は、受入番号Ｂ−１８０１６号を与えられている。

ＡＲＧ４遺伝子を含むｐＹＡ３３由来のＤＮＡ　フラグ
メントの詳細な制限酵素切断地図を第３ａ図に示す。８
．２　ｋｂｐ　ＤＮＡ　フラグメントの５／　（左側）
　Ｂａｍ　ＨＩ／Ｓａｕ　３　Ａ工連結部を起点とする
と、以下の切断パターンが得られる：Ｒ□３　　　４０
００；　　５，５００；ｆｉｏ００Ｈ３２λ０００；　
　６，０００ Ｂ２２　　　５９００；　　ａ７００ Ｓ　　　　　　１　　　へ８００ Ｓｐｌ　　　　３，９００ Ｘｈ　　　　　　１　　　３，７００ ｐＹＡ３３　由来の制限酵素切１！；ｆフラグメントを
緩やかな条件下（ハイブリッド形成後、２　ｘＳＳ　Ｃ
を用いて５５℃で洗浄；　ＳＳＣは０．１５　Ｍ　　Ｎ
ａ（４および１５　ｍＭクエン酸ナトリウムをＮａＯＨ
でｐＨ７．０にしたもの）でＳ、セレビジｘ　（Ｓ、ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＧ４遺伝子を含むラベルされ
たフラグメントとハイブリッド形成させるサザン・プロ
ット分析（Ｓｏｕｔｈθｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓ
ｉｓ）により、プラスミドｐＹＡ３３　　はＳ、セレビ
ジｊ−（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＧ４遺伝子と
同等の塩基配列を含み、同塩基配列ばｐＹＡ３３　への
８．２　ｋｂｐピキア（Ｐｉｃｈｉａ　）ＤＮＡ挿入物
の３′側の大部分に位置することが明らかとなった。

上記８．２　ｋｂｐフラグメントのサブクローン化によ
り、上記ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）　ＤＮＡ　（Ｄ２．７
ｋｂｐＥｃｏＲＶ−８ｐｈエフラグメントがピキア（Ｐ
ｉｃｈｉａ）　　あるいはサツカロミセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅθ）アルギニノコハク酸リアーゼが欠損
株を形質転換する能力を保持することが決定された。以
上のように、ａ　ｒ　ｇ　、４変異株である。ピキア・
パストリス（ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ）ＮＲＲＬ
　Ｙ−１８０１４（ＧＳ１９０）は、第５図に示すよう
に、プラスミドｐＹＭ３Ｑで形質転換されるとアルギニ
ンを添加しない培地で増殖すること：゛バできる。プラ
スミドｐｌ′Ａ３Ｃ）は第３ｂ図に示すようにＤＮＡ　
の２．７　ｋｂｐ　ＥｃｏＲＶ−３ｐｈエフラグメント
を含む。

本発明の別の実施態様により、栄養要求性変異株Ｇ５１
９０（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１４）が単離され、アルギ
ニン経路に欠陥のあることが判明した。同株は、アルギ
ニノコハク酸リアーゼ活性を有さない。

詳細は実施例Ｈのアッセイ法参照。

本分野の技術では、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ′−二ト
ロアーＮ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン
駿、紫外線照射などの多様な突然変異誘発物質で指数増
殖細胞を処理するなどの多様な方法によシ突然変異発生
率が増大することが知られている。ある特異的な代謝経
路に欠陥のある突然変異株の単離および同定は、例えば
実施例Ｉで詳述するように、同株が増殖に要求する栄養
素を決定することによって行なわれる。次に、突然変異
株が欠損している遺伝子および遺伝子童物は、例えば実
施例■に述べるように、欠損している酵素活性を同定す
ることによシ決定される。

本発明によって得られる栄養要求性変異株Ｇ５１９０（
ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１４）　　およびピキア（Ｐｉｃ
ｈｉａ）由来ＡＲＧ４遺伝子は、トモニヒキア（Ｐｉｃ
ｈｉａ）に不均質なＤＮＡ　を導入する際に有効な形質
転換系を与える。ＡＲＧ４遺伝子は、栄養要求性変異宿
主が欠損する活性をコードする遺伝子を供給し、それに
よって形質転換ＤＮＡ　を取り込んだ上記宿主の選択を
容易にする。

以下に制限を与えない実施ｆｌＪによって本発明を詳細
に述べる。

実施例 以下の実施例で使用した緩衝液および溶液は、下（て示
す組成を持つ： １Ｍ　　）リス緩衝ＱＨ２０ｓｏｏｍＬ中１２１．１！
Ｊトリス塩基； 濃ＨＣＱ　　　溶液　（３５％　）　の添υ口により目
的のｐＨに調製する； 最、柊ｐＨ調製、１娘て室温まで冷却；・股７終体、Ｉ
ＲＩ　Ｌに希釈する。

ＴＥ　　緩衝液　　　　　０．０ＩＪｐＨ７，４）　　
）リス４榎衝液中（て１．　ＯｍＭのＥＤＴＡ ＬＢ（ルリアーベルタ＝　（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎ
ｉ乃培地水ＩＬにつき ５９　バクトートリプトン ５９　バクトー酵母抽出物 ２．５’）　　ＮａＣ１ ＮａＯＨでｐ　Ｈ７，５に調製 ２Ｂ培地　０．２％　ＮＨ４ＰＯ４ １，２％！’Ｊａ２ＨＰＯ４ ０，０１３％　Ｍｇ５ｏ４−７Ｈ２Ｑ Ｏ，０７４％　ＣａＣｆ１２　・２Ｈ２０１μ牙／ｍＬ
チアミン ０４％デキストローズ ＹＰＤ培地　１％　バクトー酵母抽出物２％　バクトー
はプトン ２％　デキストローズ ＳＤ培地　６７５ｇ　アミノ竣非含有酵母窒素ベース（
ディフコ（、り工ＦＣＯ）社） ２％　デキストローズ（水ＩＬあたり）ＳＥＤ　　　Ｉ
Ｍ　　ソルビトール ２５　ｍＭ　ＥＤＴＡ ５０ｍＭ　　ＤＴＴ ＳＣＥ緩衝液　　９．１９　ソルビトール１．４７９　
　クエン酸ナトリウム ０．１６８ｇ　ＥＤＴＡ ５０　ｍ　Ｌ　　Ｈ２Ｏ −−−ＨＣρ　でｐ　Ｈ５，８に調製 ＣａＳ　　　　　　ＩＭ　　ソルビトール１０　ｍ　Ｍ
　　ＣａＣＱ　２ −ｍ−濾過滅菌 ＰＥＧ　溶液　　２０％　ポリエチレングリコール３３
５゜１０　ｍ　Ｍ　　ｃａｃＱ２ １ＱｍＭ　　）リス−ＨＣ，（（ｐＨ７，４）−ｍ−濾
過滅菌 ＳＯ３Ｉ　Ｍ　　ソルビトール ０．３Ｘ　　ＹＰＤ培地 １０　ｍ　Ｍ　　ＣａＣｆｌ　２ ＭＭ（最小培地）０．８７５　ｇＫＨ２ＰＯ４０，１２
５ｇＫ２ＨＰＯ４ １・０９　（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０、５９ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ０、ｌ　９Ｎａ（４ ００５ｍ７Ｆ′ｅＣＱ３・６Ｈ２０ ０、０７ｍｙ　ＺｎＳＯ４−７Ｈ２゜ ０３０１ηＨ３Ｂ０３ ０、０１　ｍｙ　ＣｕＳＯ，、−５Ｈ２Ｏ０、ｏ１ｍｌ
ｌＫ工 ０．１９　　ＣａＣｆ１２・２Ｈ２０ −ｍ−滅菌水１リットルあたシ ＭＭ質マイナス“　　（ＮＨ４）　２　ＳＯ４を含まな
いＭＭの組成りエン酸緩衝液　９．７９９　　クエン酸
ナトリウム３．２９　クエン酸 −−−Ｈ２Ｏで５００ｍ６に希釈 −−−ＩＮＮａＯＨでｐ　Ｈ５，５に調製ナイスタチン
溶液　４．４　ｍｇ　　ナイスタチン（５６８０ユニツ
ト／１り） １ｍＬ　　ジメチルホルムアミド 一一一水で１０ｍＬに希釈 アルギニのコハク酸溶液　５０７ｑ　　アルギニノコハ
ク酸バリウム ９、８５　ｍ　Ｌ　　Ｈ２Ｏ ０，１５ｍＬ　　Ｏ，ｌ　Ｍ　　Ｋ２ＳＯ３−ｍ−透明
にするため遠心し、上清をとるＢＵＮ　　試薬　　ＢＵ
Ｎ酸試薬３部及びＢＵＮ色試薬２部の割合； シグマ（Ｓｉｇｍａ　　社から診断用キット≠５３５と
して入手可能 ビタミン混合液　ｐ−アミノ安息香酸　５ｏ■／１００
ｍＪｐ−ヒドロキシ安息香酸　５゜ リボフラビン　２５ パントテン酸塩　５゜ 葉酸　　　　　　５゜ ピリドキシン　　５゜ ビオチン　　　　　　５ チアミン　　　　１０ ニコチン酸　　　５０ イノシトール　２０００ 次に挙げる略号は、本実施例中で以下の意味で使用され
る。

ＥＤＴＡ　　エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　トゝデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ　　　ジチオトレイトール ＮＴＧ　　　Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロン
グアニジン ＢＵＮ　　　血中尿素窒素（Ｂｌｏｏｄ　ｕｒｅａ　ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎ）ａｌａ　　　アラニン ａｒｇ　　　アルギニン ａｓｎ　　　アスパラギン ａｓｐ　　　アスパラギン酸 ｃｙｓ　　　システィン ｇｌｕ　　　グルタミン酸 ｇｌｎ　　　グルタミン ｇｌｙ　　グリシン ｈｉｓ　　　ヒスチジン ｉｌｅ　　　インロイシン １ｅｕ　　　ロイノン ｌｙｓ　　　リシン ｍｅｔ　　　メチオニン ｐｈｅ　　　フェニルアラニン ｐｒｏ　　　プロリン 日ｅｒ　　　セリン ｔｈｒ　　　）レオニン ｔｒｐ　　　）リプトファン ｔｙｒ　　　チロシン Ｖａｌ　　　バリン （Ａ、　ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）　　ミュータジエネシ
ス）例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓ
ｔつｒｉｓ　）ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３０のような、選
択された酵母株培養ｅ、を１００　ｍＬのＹＰＤ培地中
に注入し、振とり器上で１２時間から２０時間３０℃で
インキュベートした。得られた培養液のうち約４０　ｍ
Ｌを約′２．ｏｏｏｇで５分間遠心沈降させた。次に細
胞を滅菌した０、　１　Ｍクエン酸緩衝１ｆｆｌ（ｐＨ
５，５）４゜ｍＬで２回洗浄した。洗浄した細胞を３（
５ｍＬの滅菌クエン酸緩衝液３５　ｍＬに再懸濁し、次
に１ｍＬ　　当たり５ｍｇのＮＴＧ　を含有するＮＴＧ
溶Ｌ４ｍｌ　テ処Ｍ　Ｌ、最終ＮＴＧ　濃度を５００μ
ｊＪ／ｍＬとした。ＮＴＧ存在下における細胞は、攪拌
するこ−となく室温で約３０分間生存可能である。

次に、細胞を滅菌脱イオン水４０　ｍＬ　で２回洗浄す
ることにより、ＮＴＧ　を除去した。ＹＰＤ培地十分量
を、洗浄した細胞に再懸濁し、次にフラスコに移し、Ｙ
ＰＤ培地の添加により諾体積を１００　ｍＬ　　とした
。続いて、上記ミュータジエナイズ（ｍｕｔａｇｅｎｉ
ｚｅ　）された細胞は振とう器上で約４８時間３０℃で
インキュベートした。

インキュベーション後、約４０　ｍＬの酵母溶、夜を２
．ｏｏｏｓで５分間遠心沈降させた。細胞ズレットは４
０ｍＬ　　の滅菌脱イオン水で２回洗浄し、次に４　＋
）ｍＬ　のＭＭｌｌマイナス９培地に１％グルコース炭
素源および５μ１ｍ：Ｌ　　ビオチンを添加したものを
加え、振とう器上で１２時間から２０時間３０℃でイン
キュベートした。

（Ｂ、ナイスタチン強化） 上記グルコース上で培養した培養液５ゴを１００ｍＬの
１制限培地７に加えた。制限培地は、ＭＭの組成に、欠
損のある生合成経路で生成される代謝物を含まない、適
当な炭素源（一般的には１％グルコース）、ビタミン／
アミノ酸（上記６ビタミン混合液”のようなもの）を添
加したものである。

例えば、ロイシン要求株が求められている場合、ロイシ
ンの添加は行なわない。制限培地に培養液を加えたもの
は、３０℃でフラスコで振とうし、５００〜５７０ナノ
メートル緑色フィルターを装着したクッットーサ７−ソ
ン光電比色計（Ｋｌｅｔｔ−３ｕｍｍｅｒｓｏｎｐｈｏ
ｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ）で定
期的に追跡した。インキュベーションは、開始時の直（
光学的ａ度に比例）に対して２０〜３０％値が増加する
壕で継続した。

比色計の読み値が上記の様に増加した際、溶液ｔ１ｍＬ
のナイスタチン溶液で処理し、溶液中のナイスタチン含
量が約２５ユニツト／　ｍＬ　となるようにした。ナイ
スクチン処理溶液は、３０℃で９０分間振とうせずにイ
ンキュベートし、続いて４０１Ｌの上記溶液を遠心沈降
させ、細胞を４０　ｍＬの脱イオン水で２回洗浄した。

洗浄した！［ｅｌは次にプレート１枚あた。９１００〜
１５０コロニーが得られるように適当に希釈した。コロ
ニーは、ＭＭ　　培地、炭素源（一般的には１％グルコ
ース）、５μ９ビオチンおよび突然変異による欠損を求
める生合成経路によって生成されるあらゆる代謝物の添
加から成る突然変異株成長培地上にブレーティングした
。

突然変異株成長培地上にブレーティングされたコロニー
は、代謝物を添加しない培地にレプリカ・ブレーティン
グした。原プレートおよびレプリカ・プレートＨ３０℃
で少なくとも４８時間インキュベートした。原プレート
（突然ス異株成長培地）上で成長するがレプリカ・プレ
ート上では成長しない上記コロニーを選択し、引き続き
解析した。

選択された栄養要求性突然変異株は代謝プールプレート
に移し、３０℃で少なくとも４８時間インキュベートし
、どの代謝経路に突然変異的欠損がちるかを決定した。

プールプレートは、以下のように、それぞ、れ５種の異
なるアミノ酸のＬ−異性体をＬｏｗ！／ｍＬ溶解して調
製した： ６　　　ｇｌｙ　　　ａｓｎ　　　ｃｙｓ　　　ｍｅｔ
　　　ｇｌｕ７　　　　ｈｉｓ　　　　ｌｅｕ　　　　
ｉｌｅ　　　　ｖａｌ　　　　１ｙｓ８　　　　ｐｈｓ
　　　　ｔｙｒ　　　　ｔｒｐ　　　ｔｈｒ　　　　ｐ
ｒ。

９　　　　ｇｌｕ　　　　ｓｅｒ　　　　ａｈａ　　　
　ａｓｐ　　　ａｒｇ上記のように、プレート１ばそれ
ぞれ１０〜／ｍＬのグリシン、ヒスチジン、フェニルア
ラニンおよびグルタミン酸を含み；プレート２はそれぞ
れ１０■／ｍＬ　のアスパラギン、ロイシン、チロンン
、およびセリンを含み、以下同様である。第１０首目の
プレートは、１９のカサミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ　ａ
ｃｉｄ）をＩＬの滅菌水に溶解することにより調製した
。

アミノ酸プール１〜１０はそれぞれ２５０μΩずつ最小
培地に１％グルコースを添加したプレートに加え、プレ
ートを一晩乾燥させた。

与えられた突然変異株の突然変異的欠損は、多種のプー
ルプレートの成長パターンの検定によって決定し得る。

上記のように、アルギニ／経路に欠損のある変異株、Ｇ
５１９０はプールプレート５．９および１ｏのみで成育
し、それ以外のアルギニンが添加されていないプールプ
レート上では成１ない。

（Ａ、プレート試験） 上記実施例Ｉで述べたように調製されたアルギニン要求
性突然変異株の最初のスクリーニングはａｒｇ４遺伝子
１坐に欠陥のある（すなわち、アルギニノコハク酸リア
ーゼ活性金欠く）突然変異株全同定するために行なった
。アルギニン要求性突然変異株のマスター・プレートは
、ＭＭ培地、１％グルコース、ビタミン混合液（培地Ｉ
Ｌあたり１ｍＬ）および０．２％カサミノｐ　（Ｃａｓ
ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）で調製した。マスター・プレー
トは３０℃で少なくとも４８時間インキュベートし、次
にマスター・プレートから５枚のレプリカ・グレートを
調製した＝（１）　ＭＭ培培地＋１ググルコース＋ビタ
ミン混液十０．０２％シトルリン； （２１ＭＭ培地＋１％グルコース＋ビタミン混合液＋０
，０２％オルニチン； （３）　　ＭＭ培培地＋１ググルコース＋ビタミン混１
夜→−０，０２％アルギニ／； （４）　ＭＭ培培地＋１ググルコース＋ビタミン混液； ＋Ｆ））　　ＭＭ培培地＋１ググルコース＋ビタミン混
Ｃ夜＋０２％カサミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
）。

上記５ｉ−！のプレートは３０℃で少なくとも４８時間
インキュベートした。プレート（３）および（５）上で
成育するが、プレート（１）、　（２）、（４）上で成
育しない上記コロニーを選択し、さらに分析した。

（Ｂ、酵素分析） アルギニノコハク酸リアーゼアッセイ法の第１段階は、
ＹＰＤ培地中のある株の培養液１００ｍＬを３０℃で０
Ｄ６ｏｏ１，０まで成長させることである。

次に、上記培養液は約１２．０００９で５分間遠心し、
滅菌１悦イオン水で１回洗浄し、細胞は５ｍＬの最小培
地（ＭＭ）＋１％グルコース＋０．１％ビタミン混合液
に再懸濁し、３０℃で１２〜１５時間振とうした。

次の段階は、培養族から１刑胞抽出物を調製することで
あった。細胞は約１２．０００９で５分間遠心すること
によシ回収し、０．２Ｍリン酸カリウム緩衝Ｑ（ｐＨ９
，０）で１回洗浄し、次に５ｍＬの０．２　Ｍ　！Ｊン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に再懸濁した。細胞は
サンプルを、セル圧力約１　ａ　ＯＯＯＰＳ工　で、ア
ミンコ・フレンチ・プレス（Ａｍｉｎｃｏ　Ｆｒｅｎｃ
ｈ　ｐｒθθＳ）を用いた直径２．５４センチ（１イン
チ）のピストンを持つアミンコ・フレンチ圧力セルを通
過させることによって破裂させた。圧力セルは使用する
まで水中に保存しておき、上記方法は４℃で行ない、試
料溶液は細胞破壊後氷上に保存した。細胞破壊を追跡す
るために、１０μＬ　の試料を１０　ｍＬ　ｔＤ　Ｈ２
Ｏに加え、その０Ｄ６００を測定し、同様に調製した圧
力セルを通過させていない対照試料と比較した。処理を
行なった試料の光学的濃度が対照試料の５０％よりも大
きい場合、試料をもう一度破壊法に付した。

次に抽出液は約１２．０００９で４℃１ｏ分間細胞残査
を除くために遠心した。上清）ま除き、酵素活性のアッ
セイ中は氷上に保存した。

細胞抽出液のアルギニノコハク酸リアーゼ活性は、アル
ギナーゼを含む共役アッセイ系でアルギニノコハク酸の
尿素への転換率を測定することによって決定した。尿素
組成はＢＵＮ試薬キットを使用して決定した。アッセイ
を行なう各抽出液の反応混合液は以下のように調製した
： Ｑ、１ｍＬ　アルギナーゼ（１ユニツト）０、１　ｍＬ
　　０．１　Ｍ　　Ｍｎ（４２−一一５分間混合、次に ０．１ｍＬ　　アルギニノコハク酸溶液０．２５ｍＬ　
　Ｏ，２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ９，０）０．１
ｍＬ　　細胞抽出液を加え 一一一説イオン水で認体積を１ｍＬとする上述のように
調製した２０〜１００μＬの反応混合液試料を１３Ｘ１
００ｍｍガラス試験管中のＢＵＮ試薬に加えた。試験管
を正確に１０分間沸１違水中（で入れ、次に沸１１８　
しているウォーターバスから出し、直ちに氷上に３〜５
分間置く。

各反応試験管の光学的濃度を、０．０，０．３３゜１．
０．および１３０時間後に緑色フィルターを用いてクレ
ット（Ｋｌｅｔｔ）の手法によシ決定した。

対照として、ピキア・パストリス（ＰｉｃｈｉａＰａｓ
ｔｏｒｉｓ）　ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３０由来の抽出物
を併行してアッセイした。

アミノ僚の添加を必要としない野生株のピキア・パスト
リス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＮＲＲＬＹ
−１１４３０の０，０．３３，１．０．および１３．０
時間後における０Ｄ３４０の値は約０．６．１４および
３７８であった。それに対して、Ｇ５１９０と呼ばれ、
ノーザン・リージョナル・リサーチ・センターに受託番
号ＮＲＲＬ　’Ｉ’−１８０１４として寄託しである上
記ピキア・パストリス（Ｐｌ、ｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉ
ｓ）変異株の一つは、どの時点においても実質的に０Ｄ
３４０の値はＯを示した。Ｓ、セレビシェ（Ｓ、Ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）　　に対して使用される突然変異遺伝
子型命名法に準じ、ＧＳ　１９０はａｒｇ４変異株と呼
んでいる。

形質転換法 （Ａ、細胞成育） １、　ピキア−パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ）ＧＳ１９ｏ（ＮＲＲＬ　　Ｙ−１８０１４）の
コロニーを約１０ｍＬのＹＰＤ培地に注入し、培養液を
３０℃で１２〜２０時間振とうする。

２、１２〜２０時間後、０Ｄ６００がおよそ０．０１〜
０１となるように細胞を希釈し、ＹＰＤ培地中３０℃で
６〜８時間対数増殖期を維持する。

３．６〜８時間後、１００　ｍＬのＹＰＤ培地にｏｆ）
６ｏｏが約０．１となるような（あるいは等量の）原培
養ｉ！Ｏ，ｓｍＬ１加える。３０℃で約１６〜２０時間
後とうする。

４、　０Ｄ６００がおよそ０．２〜０．３（約１６〜２
０時間後）となった時に１５００９で５分間遠心して培
養細胞を回収する。

（Ｂ、スフェロプラストの調製） １、）細胞を１ｏｍＬの滅菌水で１回洗浄する。

（１〜５の各段階での遠心は全て１５００９５分行なう
。） ２　細胞を新しく１調製したＳＥＤ　　１０ｍＬで１回
洗浄する。

３、細胞を滅菌した１Ｍソルビトール１０　ｍＬで２回
洗浄する。

４、細胞を１０ｍＬ　の　ＳＣＥ緩衝液て再懸濁する。

５．５〜１０μＬ　の４　ｍｙ　／　ｍＬ　ｆ　モリア
ーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）　　６　Ｑ　ＯＯＯ（マイ
ルス・ラボラトリーズ社）を加える。細胞を３０℃で約
３０〜６０分インキュベートする。

スフェロプラストの調製は形質転換法においては重要な
段階であるので、以下のようにスフェロプラスト形成を
追跡するべきである：１００μＬの細胞を５％ＳＤＳ　
　９００μＬおよび１Ｍソルビトール９００μＬに、チ
モリアーゼ添加前あるいは直後に加え、インキュベーシ
ョン中の様々な時点に加える。細胞がＳＤＳ中で溶解す
るがソルビトール中では溶解しない時点でインキュベー
ションを止める（一般的ンこインキユベーション３０分
カラ６０分）。

６　スフェロプラストを滅菌１Ｍソルビトール１ｏｍＬ
中で１０００ｇで５〜１０分間遠心することによ９２回
洗浄する。（遠心速度および時間は変化し得る；スフェ
ロプラストがベンツト状になるのに充分でちるが遠心力
により破裂しない程度に遠心する。） ７、　細胞を滅菌ＣａＳ１０ｍＬ　で１回洗浄する。

８、細胞を総量Ｑ、５ｍＬのＣａＳに再懸濁する。

（Ｃ０形質転換） １、　　ＤＮＡ試料（体積２ｏμＬまで）を１２×７５
順滅菌ポリプロピレンチユーブに加える。

（ＤＡＴＡは水あるいはＴＥ緩衛液に溶解する；少量の
ＤＮＡの最大形質転換頻度で行なうには、各試料に５■
／ｍＬのソニケーションした大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　
ＤＮＡ　を約１　ｍＬ加えルコとカ望マシい。） ２、　１００μＬのスフェロプラストを各ＤＮＡ試料に
加え、室温で約２０分インキュベートする。

３．１ｍＬのＰＥＧ　ｌ液を各試料に加え、室温で約１
５分間インキュベートする。

４　試料を１００（ｌで５〜１０分遠心し、ＰＥＧ溶液
をデカンテーションで除く。

５、試料を１５０μＬのＳＯ８に再懸濁し、室温で３０
分間インキュベートする。

６．８００μＬの滅菌１Ｍソルビトールを加え、試料を
以下のようにブレーティングする。

（Ｄ、スフェロプラストの再形成） １、再形成寒天培地の組成： ａ、寒天−Ｋ（４２−（ｌバクトー寒天、１３．４９Ｋ
Ｃ１１，２４０ｍＬ　Ｈ２Ｏ、オートクレーブ。

ｂ、ＩＯＸグルコース−２０９デキストロース、１００
　ｍＬ　　Ｈ２Ｏ、オートクレーブ。

ｃ、　１０　Ｘ　５Ｃ−６，７５９アミノ酸を含まない
酵母窒素源、１００　ｍＬ　Ｈ２Ｏ、オートクレーブ。

（オートクレーブ前あるいは後に２００μ９／ｍＬの濃
度まで望みのアミノ酸あるいは核酸を加える。）ｄ、３
０ｍＬのＩＯＸグルコースおよび３０　ｍＬのＩＱｘＳ
Ｃを３００　ｍＬの融解した寒天−ＫＣ４溶液に加える
。０．２　ｙｎｇ　／　ｍＬのビオチンＱ、６ｍＬおよ
び他の望みのアミノ酸あるいは核酸を２０μ９／ｍＬ　
の濃度まで加える。融解した再形成寒天を５５〜６０°
に保つ。

２、形質転換試料のブレーティング： 形質転換試料の準備ができる少なくとも３０分前にプレ
ート１枚あたｐｌＱｍＬの再形成寒天の下層寒天を注ぐ
。形質転換試料がＳＯ８中にある間にｉｏｍＬの再形成
寒天を４５〜５０℃のウォーターバス中の試験管に分配
する。上記形質転換試料を再形成寒天の入った試験管に
加え、プレートの下層寒天上に注ぐ。各試料量をｔｏｍ
Ｌの４５〜５０℃に保った融解した再形成寒天に加え、
それぞれ再形成寒天の固体下層寒天１０　ｍＬを含むプ
レート上に注ぐ。

３　スフェロプラスト調製の特性の決定：１つの試料か
ら１０／’Ｌ　をとシ、９９０μＬの１Ｍソルビトール
に加えることにより１００倍に希釈する。１００倍希釈
液から１　Ｏｒ”Ｌ　とシ、１Ｍソルビトール９９０μ
Ｌにさらに加えることによシ、さらに１００倍に希釈す
る。双方の希釈液１００μＬをＹＰＤ寒天培地上に広げ
てブレーティングし、調製液中に残存するスフェロプラ
ストになっていない完全な細胞の濃度を決定する。各希
釈液１００μＬを５０μ９／ｍＬアルギニンを含む再形
成寒天１０ｍＬに加え、全再形成可能スフェロプラスト
を決定する。形質転換実験における良い値は、１〜３×
１０　全再形成可能スフエロプラス）　／　ｍＬおよび
およそ１×１０３全ａ胞／ｍＬである。

４フＬ／−）を３０℃で３〜５日間インキュベートする
。

（Ａ、菌株） 使用した菌株は： （ａ）　　ピキア轡パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３０株； （ｂ）　　ピキア・パストリス　ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０
１４株（ＧＳ１９０−ａｒｇ　４　）　； （ｃ）　　Ｓ、　　セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）Ｓ２０７２Ａ株（ａｒｇ４　／ｅｕ　ｌ　ｔｒｐ
　１　ｇａｌ　１２　；　　イースト・ジエネテイツク
・ストック・センター、米国カリフォルニア州バークレ
ーから入手可能）；および（ｄ）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
）　８−４８株（Ｆ−ｍｅｔ　ｔｈｉｇａｌ　Ｔ１φ８
０　　ｈｓａＲ−ｈｓｄ　Ｍ＋）。

（Ｂ、　　プラスミド） ｐＹＭ２５（第６図参照）は、ｐＧＴ２７　　由来のプ
ラスミド９であり（チャンバー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ）
およびカーボｙ　（Ｃａｒｂｏｎ）による）、ｐＢＲ３
２２のＨｉｎａ　Ｉ１１部位に挿入された３、　１　ｋ
ｂｐ　Ｈｉｎａ　ｍフラグメント上ノＳ、セレビジ：Ｉ
−（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＧ４遺伝子を含み
、Ｓ、セレビシェ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＡＲＧ４遺伝子フラグメント
源でちった。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主ＭＣ１０６１
に働びこまれたプラスミドｐＹＭ２５　は、米国イリノ
イ州ペオリアの米国農業省のノーザン・リージョナル。

リサーチ・センター（ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅ
ｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託
してあり、一般にはＮＲＲＬ　Ｂ−１８０１５として人
手可能である。

ＹＥｐ１３　はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クショ７　（ｔｈｅ　Ａｎｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能でち
ゃ、受託番号ＡＴＣＣ３７１１５を与えられている。

（Ｃ，培地） ピキア−パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ
）はＹＰＤ（高栄養）あるいはＳＤ（最小）培地で培養
した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）はＬＢ培地あるいは１００μ９
／ｍＬ　　）リプトファン、および０．２％カザミノ酸
（Ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）を添加した２Ｂ培地の
いずれかで培養した。

（Ｄ、ＤＮＡの単離） １、酵母ＤＮＡの大規模調製 ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ
）およびＳ、セレビジ−？−（Ｓ、ｃｅｒｓｖｉｓｉａ
ｅ）のＤＮＡ調製は、ともに、酵母細胞をＡ６００が１
〜２となるまで最小培地１００　ｍＬで培養させ、次に
ＩＩａ胞を２．０００９で５分間遠心して集めることに
よシ実施された。細胞をＨ２Ｏで１回、ＳＥＤで１回、
１Ｍソルビトールで１回洗浄し、次にＩＭメソルビトー
ル中、　１　Ｍ　）リス−ＨＣｆｆｉ　（ｐＨ７，０）
５ｍＬに懸濁させた。細胞を５０〜１００μＬ（Ｄ４Ｔ
ｎ９／ｍＬｆモラーゼ（Ｚｙｍｏｌａｓｅ）　６ＱＯＯ
Ｏ溶液（マイルス・ラボラトリーズ）と混合し、３０℃
で１時間インキュベートシ、その細胞壁を消化させた。

次に、スフェロプラストの調製を、１０００９で５〜１
０分遠心し、分解緩ｉ液（Ｌｙｓｉｓ　　ｂｕｆｆｅｒ
）　　（０，１％ＳＤＳ、　１０　ｍＭ　）リス−Ｈ（
４（ｐＨ７，４）、５　ｍ　Ｍ　　ＥＤＴＡおよび５０
ｍＭＮａＣｆ１）中に懸濁した。プロテイナゼＫ（ボー
リンガ−〇マンハイ４社）　（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ
ａｎｎｈｅｉｍ）　）およびＲＮアーゼＡ（シグマ社（
Ｓｉｇｍａ）　）をそれぞれ１００μｌ）／ｍＬとなる
様に加え、混合液を３７℃で３０分間インキュベートし
た。ＤＮＡ　を、調製液と等容のイソアミルアルコール
を含むクロロホルム（１：２４、ｖ／ｖ）と静かに混合
することにより脱タンパク化し、相ｉ１ｚｏｏｏｇで２
０分間遠心することによって分離した。上層（水層）を
新しい試験管に移し、’４　容（Ｄフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／
ｖ／ｖ）　　で抽出した。相を前述と同様に分離し、上
層を２〜３倍容の冷ｌＯＯ％エタノールの入っている試
験管に移した。試料を静かに混合し、ＤＮＡをプラスチ
ックロンドに巻きつけて集めた。ＤＮＡを直ちに１ｍＬ
のＴＥ緩衝液に溶解し、１００倍容のＴＥ緩衝液に対し
て一晩４℃で透析した。

２、小規模酵母ＤＮＡの調製 ５ｍＬの酵母培養液をＡ６００が１〜５になるまで最小
培地で培養し、２０００ｇで５分間遠心して集めた。細
胞は１　ｍＬのＳＥＤ　に懸濁し、１．５ｍＬの微量遠
心チューブに移し、１Ｍソルビトールで１回洗浄し、０
．５ｍＬ　　のＩＭソルビトール中０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７，４）に再懸濁した。チモラーゼ６ＱＯＯＯ
（マイルス・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）　；　４　’ｎｑ／　ｍＬ浴溶液１０
μＬ）を各試料溶液に添加し、細胞を３０℃で３０〜６
０分間インキュベートした。続いて、細ｆ＠を１分間遠
心して、分解緩衝液に溶解し、６５〜７０℃でインキュ
ベートした。１５分後試料溶液’ｋｌｏｏμＬ　の５Ｍ
酢酸カリウムと混合し、水箱中に１５分間置き、５分間
遠心した。上清はデカンテーションでｌ　ｍＬの１００
％エタノールを含む新しい微小遠心チューブに移し、混
合し直ちに１０秒遠心した。最終的に、ＤＮＡペレット
を１０〜１５分間風乾し、５０μＬのＴＥ緩衝液に溶解
した。

大観　（０，５〜ＩＬ）プラスミド調製のための大腸菌
培養液を、前述の添加物及び適当な抗生物質を加えた２
Ｂ培地中で３７℃で振とうしながら培養した。ｐＢＲ３
２２由来プラスミドを含む細胞の場合は、Ａ３５０がお
よそ０．７になるまで培養し、その際に１００　／ｉｇ
／ｍＬの濃度になるように充分なりロラムフエニコール
を加え、約１５時間後に細胞を回収した。ｐＢＲ３２５
由来プラスミドを含む株では、添加物含有２Ｂ培地中で
Ａ３５ｏがおよそ０．０１〜０．０５から始まるように
菌を加え、振とうしながら３７℃で、回収するまで２０
〜２４時間インキュベートした。プラスミドを、ビルン
ボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドーリ−（Ｄｏｌｙ
）　ＶＣヨって示された、アルカリ分解法（ａｌｋａｌ
ｉｎｅ　ｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ、　１９７９　）によ
って単離した。

４、大腸菌ＤＮＡ小規模調製 小規模で迅速なプラスミド単離には、抗生物質を加えた
添加物入り２Ｂ培地中２ｍＬの培養ｇ１．を３７℃で振
とうしながら一晩培養し、１．５ｍＬ微小遠心チューブ
で遠心して集菌した。プラスミドをビルンボイム（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ）およびドーリ−（Ｄｏｌｙ）てよるアル
カリ分解法（１９７９）に従って単離した。

（Ｅ、　　ＤＮＡ１７）制限酵素処理とフラグメントの
単離）制限酵素はニューイングランド・バイオラブズ（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　　および
ベセスダ・リサーチ−ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｒｏｒｉ　ｅｓ　）
から入手され、切断を一般的な手法によって行なった。

制限酵素マツピングを、挿入ＤＮＡを持つプラスミド及
び持たないプラスミドの並列した切断の比較により行な
った。制限フラグメントを、アガロースゲルから、透析
管に裏うちされたホワットマン３ＭＭ紙片に電気的溶出
を行なうことによって精製した。フラグメントを紙およ
び管から３〜４回０．１〜Ｑ、２ｍＬ容の０．１Ｍ　　
ＮａＣ［、５０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）およ
び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液で洗浄して回収した。

最終的に、フラグメントをフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコールで抽出し、エタノールで沈殿させ
、少量のＴＥ緩衝液に再溶解した。

（Ｆ″、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）　　内のピキア・パス
トリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ライブラリ
の作製）ピキア−パストリ、Ｘ　（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）　ＤＮＡ−ＹＥ、１３ライブラリの作製
のために、１００μ９のＹＥｐ１３をＢａｍ　ＨＩで完
全に分解し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、
ＤＮＡの５′端リン酸を除去した。ピキア・ノミストリ
ス（Ｐｉｃｈｉａｐａ８ｔｏｒｉ８、ＮＲＲＬ　Ｙ−１
１４３０）　　由来の野生型ピキア・ノミストリスＤＮ
Ａ　　ＩＱＱμ９　を総容積ｌ　ｍＬ中で、１０ユニツ
トのＳａｕ　３ＡＩ　で５分３７℃インキュベーション
することにょシ部分分解した。

５〜２０　ｋｂｐのフラグメントを、５〜２０％蔗糖密
度勾配遠心によって大きさで選択した。１μ９のベクタ
ーと、２μ９のピキア５ａｕ３ＡＩフラグメントを混合
し、総体積２００μＬ中で２０ユニツトのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）を加え
、−晩４℃でインキュベートした。連結したＤＮＡ　を
、２ＩｎＬ　のコンピテント大腸菌８４８細胞に全連結
反応混合液を加え、１５分間Ｏ℃でインキュベートする
ことにより大腸菌中に形質転換した。混合溶液を３７℃
で５分間加温後４　Ｑ　ｍｕのＬＢ培地を加え、さらに
１時間３７℃でインキュベーションを継続した。次にア
ンピシリンを総濃度１００μ９／ｍＬとなるように加え
、さらに一時間インキュベーションを続ケた。最後に、
細胞をλｏｏｏｇで１０分間遠心し、１ｍＬの新しいＬ
Ｂ　培地ｌ　ｍｌに再憑濁し、１００μ９／ｙｔｌのア
ンピシリンを含む１０枚のＬＢ寒天プレートに等容広げ
た。得られた約５ＱＯＯＯコロニーをプレートからかき
取シ、細胞の一部を、Ａ３５０が０１から開始されるよ
うに５００　ｍＬの添加物含有２Ｂ培地に加えた。培養
液を、培養し、プラスミドを上述のように抽出した。ラ
イブラリのためにプールしたコロニーのうち、テストし
た１００のうち９６はテトラサイクリン耐性であり、テ
ストした１０のうち７は挿入プラスミド全持つプラスミ
ドヲ含んでいた。

（Ｇ、サザン・ハイズリラド形成） ハイブリッド彩成を、サチン法（１９７５）に従って行
なった。大きい、あるいはスーパーコイルＤＮＡ分子？
ニトロセルロースに移しとるために、ＤＮＡをまずアル
カリ實性に先立ち、１０分間０．２５ＭＨ（４中にアガ
ロースゲルを浸すことにより、部分的に加水分解した。

ラベルしたフラグメントの全てのハイブリッド形成は、
５０％ホルムアミド、６×５ＳＣ１５×デン・・ルト溶
液、０．１　％　ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、および１０
０μｊＪ／ｍＬ変性ニシン精子ＤＮＡの存在下で４２℃
で行なった。Ｓ、セレビジｘ　（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）　ＡＲＧ４遺伝子由来（Ｄ−ｙベルしたフラグメ
ントのピキア・パストリス（ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒ
ｉｓ）　ＤＮＡへのノーイブリッド形成のためのノ１イ
ブＩＪ　ツト形成後洗浄は、２ｘＳＳＣ１１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ。

０１％ＳＤＳ　および０．１％ピロリン醒ナナトリウム
存在下５５という緩やかな条件下で行なった。

（Ｈ，−Ｐ−ラベル） リグビー（Ｒｉｇｂｙ）他（１９７７）による方法に従
って、ニックトランスレーションを行なった。

（工、酵母形質転換） Ｓ、−ｔｖビジーｃ（Ｓ−ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　
形質Ｅ換を、ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）他のスフェロプ
ラスト形成法（１９７８）によって実施した。

ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ
）形質転換を、上述の方法に従って実施し・た。

（Ｊ、　　ピキアＡＲＧ　４遺伝子の単離〕ピキア（Ｐ
ｉｃｈｉａ）　ＡＲＧ４遺伝子を含むＤＮＡ　フラグメ
ントを、Ｓ、セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ、ｅ
）ａｒｇ　４株を相補する能力によってピキアＤＮＡ　
ライブラリから単離した。ライブラリは、Ｓ、セレビシ
ェ−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ１３のＢａｍＨ工部
位に挿入された野生型ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）　（ＮＲ
ＲＬＹ−１１４３０）ＤＮＡの５〜２０　ｋｂｐ　５ａ
ｕ３Ａ工部分的切断フラグメントから成る。Ｓ、セレビ
シェＳ２Ｓ２Ｏ７２Ａ（ａｒ株）のスフェロプラストを
、ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らの方法（１９７８）によ
って形成し、ピキアＤＮＡ　ライブラリと混合し、アル
ギニンを除いた培地中で再形成させた。形質転換によっ
て１　ｘ　１　ｏ　７全再形成可能スフエロプラストか
ら４５の原栄養株酵母コロニーが得られた。７個のＡｒ
８＋コロニーから全酵母ＤＮＡを抽出し、大腸菌を形質
転換した。各々の回収されたプラスミド・は、ＹＥｐ１
３と挿入ＤＩＪＡから成るものであった。Ａｒｇ＋形質
転換プラスミドが、ピキアＡＲＧ４遺伝子を含み、サプ
レッサー活性を持つＤＮＡフラグメントを含むのではな
いことを確認するために、プラスミドの一つ（ｐＹＡ３
３；　　第２図参照）の制限酵素切断物をＳ、セレビシ
ェＡＲＧ　４遺伝子を含む、ラベルしたＤＮＡフラグメ
ントとハ・イブリッド形成させ、緩やかな条件で洗浄し
た。プラスミドのピキアＤＮＡ部分は、Ｓ、セレビシェ
ＡＲＧ４遺伝子とハイブリッド形成する塩基配列を含ん
でいた。

Ａｒｇ＋形質転換プラスミドの一つを、さらに解析する
ために選択した。ｐＹＡ３３　に存在する８、２ｋｂｐ
のピキアフラグメントの制限酵素マツプを第３図に示し
た。大腸菌宿主ＭＣ１０６１に導入されたプラスミドｐ
ＹＡ３３は、米国イリノイ州はオリアの米国農業省ノー
ザン・リージョナル・リサーチ・センターに寄託し、受
託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０１６を与えられている。ピ
キアａｒｇ４変異株ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１４（ＧＳ１
９０）を高頻度で形質転換できるｐＹＡ３３　ｏサブフ
ラグメントハ、２．７　ｋｂｐ　ＥｃｏＲＶ−ｓｐｈ　
エフラグメントでちった（第３図参照）。

例えば、ｐＹＭ３Ｑ（第５図参照）は、上記以二ＲＶ−
３ｐｈ工２．７ｋｂｐフラグメント、ピキア（Ｐｉｃｈ
ｌａ）自律複製配列（Ｐｉｃｂｉａ　ａｕｔｏｎｏｍｏ
ｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｒ８ｅｑｕｅｎｃｅ、　Ｐ
ＡＲＳ　１　）、およびｐＢＲ３２２から成るプラスミ
ドであり、Ｇ５１９０を高頻度で形質転換する。他の例
として、ｐＹＭ３２　　（第４図参照）は、ＰＡＲ３Ｉ
がないこと以外ｐＹＭ３０と同等なプラスミドであシ、
同様にＧ５１９０　　を高頻度で形質転換する。ｐＢＲ
３２２配列は、Ｐ、パストリスにおいて、ＡＲ８活性を
持たないことが知られているので、ピキアＡＲＧ４遺伝
子を含む’１．７　ｋｂｐフラグメントが、形質転換頻
度−エンノ１ンス定攪により、明確なＡＲ８活性を有し
ているはずである。上記ＥｃｏＲＶ−８ｐｈＩ　７７　
クメン）　！ｄ、Ｉた、Ｓ、セレヒジエａｒｇ４変異株
をも形質転換できる。より短いフラグメントはまだ研究
されておらず、機能的ピキアＡＲＧ４遺伝子の全体をコ
ードするのに十分であることも期待される。上記のよっ
て、本発明によって単離され、解析されたＡＲＧ４遺伝
子は、Ｓ、セレビシェで同定されたものと同じ遺伝子機
能、すなわちアルギニノコハクｔＪ　ＩＪアーゼのａ能
を含むと考えられている。

次に挙げるものは本明細書に引用したもので、ろる。

ビルンポイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）、トゞ−リー（ＤＯ
１７）（１９７９）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄＳ、　Ｒｅ
Ｓ、　　７．　１５３１−１５２３； ヒンネｙ　（Ｈｉｎｎｅｎ）他（１９７８）　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｐ　ＵＳＡ　　７５，１９２９−１
９３３；リグビー（Ｒｉｇｂ７）他（１９７７）　　Ｊ
、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

１１３．２３７； サブ７　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　（１９７５）　　Ｊｏ
Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ。

９８．５０３−５１８；　　および チャンバー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ）およびカーボン（Ｃ
ａｒｂｏｎ　）（１９８２）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１
５６，２９３−３０７゜

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミ）ＹＥｐ１３の制限酵素マツプであシ
： 第２図はプラスミドｐＹＡ３３　の制限酵素マツプであ
り； 第３図はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）　ＡＲＧ４遺伝子を含
む８．２　ｋｂｐピキア染色体ＤＮＡ　フラグメントの
制限酵素マツプであって、さらに同遺伝子の特異的サブ
フラグメントを示したものでちシ；第４図はプラスミド
ｐＹＭ３２の制限酵素マツプであり； 第５図はプラスミド’１）ＹＭ３０　の制限酵素マツプ
であシ；そして 第６図はプラスミドｐＹＭ２５の制限酵素マツプである
。 ＲＩ　　　　　Ｂ ｈ ＦＩＧ、　　ｌ Ｓρ　［８／５３１ ＦＩＣ，２ Ｐｖ２ ＦＩＧ、　　４ ｖ２ Ｆｌに、　　Ｓ Ｆｌに、　　Ｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）アルギニノコハク酸リアー
   ゼあるいはそのサブユニットの産生をコードする遺伝子
   、又は同遺伝子に同等な遺伝子。 ２、図面第３ｂ図の制限酵素地図によつて特徴づけられ
   る、特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ３、図面第３ａ図の制限酵素地図で特徴づけられる、染
   色体ＤＮＡに隣接した領域をさらに含む、特許請求の範
   囲第１項記載の遺伝子。 ４、特許請求の範囲第１項記載の遺伝子； 細菌の複製起点を有し、細菌中に少なくとも一つの選択
   可能なマーカーを有するＤＮＡ配列；および 調節領域、ポリペプチドコード領域又は酵母自律複製配
   列あるいはそれらの２個以上を含む付加的なＤＮＡ からなるハイブリッドプラスミド。 ５、図面第４図に示す制限酵素地図を有する特許請求の
   範囲第４項記載のハイブリッドプラスミド（ｐＹＭ３２
   ）。 ６、図面第５図に示す制限酵素地図を有する特許請求の
   範囲第４項記載のハイブリッドプラスミド（ｐＹＭ３０
   ）。 ７、特許請求の範囲第４項記載のハイブリッドプラスミ
   ドによつて形質転換された実質的に均一な大腸菌（Ｅ．
   ｃｏｌｉ）株。 ８、上記大腸菌が￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥　￥ｃｏ
   ｌｉ￥ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０１６である、特許請求の範
   囲第７項記載の株（ＭＣ１０６１−ｐＹＡ３３）。 ９、（ａ）ピキア　アルギニノコハク酸リアーゼあるい
   はそのサブユニットの産生をコードする遺伝子、又は、
   同遺伝子に同等な遺伝子を含むベクターで形質転換され
   た宿主を栄養培地中で培養し；（ｂ）培養細胞を破壊し
   ； （ｃ）上記ベクターを破壊細胞から回収し；（ｄ）上記
   ベクターを少なくとも１種の制限酵素で切断し；そして （ｅ）上記遺伝子あるいはそのサブユニット、又は、上
   記遺伝子に同等な遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを回
   復させること； を含む、￥ピキア￥アルギニノコハク酸リアーゼあるい
   はそのサブユニットの産生をコードする遺伝子又は、上
   記遺伝子に同等な遺伝子を単離する過程。 １０、上記ベクターがプラスミドｐＹＡ３３、プラスミ
   ドｐＹＭ３０、あるいはプラスミドｐＹＭ３２である、
   特許請求の範囲第９項記載の過程。 １１、上記少なくとも一種の制限酵素が￥Ｅｃｏ￥ＲＶ
   あるいは￥Ｎｒｕ￥Ｉあるいは￥Ｓｐｈ￥Ｉの組み合わ
   せである、特許請求の範囲第９項又は第１０項記載の過
   程。 １２、上記ベクターがプラスミドｐＹＡ３３である、特
   許請求の範囲第９項から第１１項のいずれかの過程。 １３、上記ＤＮＡフラグメントが２．７ｋｂｐの長さで
   ある、特許請求の範囲第９項〜第１２項のいずれかに記
   載の過程。 １４、上記形質転換された宿主が大腸菌 （￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥　￥ｃｏｌｉ￥）ＮＲＲ
   Ｌ　Ｂ−１８０１６（ＭＣ１０６１−ｐＹＡ３３）であ
   る、特許請求の範囲第９項〜第１３項のいずれかに記載
   の過程。 １５、酵母細胞がアルギニン生合成経路を欠損し、組み
   換えＤＮＡ物質で形質転換され得る宿主としてのピキア
   属酵母細胞。 １６、上記アルギニン生合成経路の、アルギニノコハク
   酸リアーゼ活性が欠損している、特許請求の範囲第１５
   項記載の酵母細胞。 １７、上記酵母細胞がピキア・パストリス（￥Ｐｉｃｈ
   ｉａ￥　￥Ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０
   １４（ＧＳ１９０）である、特許請求の範囲第１６項の
   酵母細胞。