JPS61501955A - チ−ズ製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 チーズ製造法 （発明の分野） この発明は、チーズの製造工程中において、不活性な凝乳酵素をチーズミルク中 に添加することからなるチーズ製造法に関する。

（技術の背景） 伝統的なチーズ製造法では、チーズはスターター・カルチャーとレンネットとを 温乳に添加して凝乳（ｃｕ　ｒｄ　）を形成させること（セツティング、　ｓｅ ｔｔｒｎｇ　）によって製造されている。凝乳が所望のかたさと強度になったな らば、カットされ次いでその凝乳から、例えばドレイニング（ｃｌｒａｉｎｉｎ ｇ）によってホエー（乳漿）が分離され、最後に食塩が加えられ、圧縮され、次 いで得られたチーズは、２〜１６℃で２〜２４ケ月貯蔵（熟成）される。

しかしこの方法では、ホエーを除去する際に多量の乳蛋白が失われそのためチー ズの収量が減少する。収量改善を目的として最近開発されたチーズ製造法では、 乳は、その脂肪と蛋白がスターター・カルチャー、レンネット及び食塩が添加さ れて得られた最終製品上所望されるのとほぼ同じ含有量にまで濃縮される。得ら れる凝乳からは有意な陽のホ１−は除去されないので、ホエーが除去されるとき に通常量われるホエー蛋白の全部が前記濃縮乳中に残りその結果収量が約１５％ 増加する。

濃縮乳を用いるこの方法でチーズを製造する場合、通常量のレンネットを添加す ると〔使用される１ノンネツト製剤が、後記定義の、シーエイチアール・ハンセ ン社の標準レンネットの場合、約３０〜４０ｙｌ／　１００ｋｇ乳〕凝固が急速 なためにレンネットの均一な混合が達成される前に凝乳を固化させてしまうので 好ましくない。レンネットの添加量は、（特に５倍以上に濃縮された乳には）凝 固時間を約２０〜３０分に保持しかつ１ノンネットの適確な混合を達成するため に約１０〜２０ｘｌ／　＋０Ｏｋａ乳にまで減少４る必要があることが、実験に よって分かつている。、凝乳中のカゼインの加水分解はレンネットにより行われ （熟成に必要）、レンネットのこの作用によって形成されたペプチド類はさらに 、主としてスターター・カルチャー酵素類によってより小さなペプチド類やアミ ノ酸類に分解されるので、レンネットの添加量が減少するとチーズの熟成速度が 減少する（ｄｅ　）（ｏｎｉｎｇ　ｅｔａｔ　、　Ｎｅｔｈ６Ｍｉｌｋ　［）ａ ｉｒｙ　Ｊ、、第３５巻、　１９８１年、第３５〜４６頁参照）、すなわち貯蔵 時間が長期化し、コストからみて効率的でない。

（発明の開示） この発明の目的は、乳に不活性の凝乳酵素を添加し、その後この酵素を製造工程 中で活性化することによってチーズの熟成を促進することである。

したがってこの発明は、乳に、不活性の凝乳酵素と、任意にキモシンもしくは他 の適切な蛋白分解酵素を、スターター・カルチャーの添加と同時にもしくはその 添加後に加えて凝乳を形成し、 前記不活性酵素の少なくとも一部を活性化し、次いで得られた凝乳を熟成チーズ に変換する ことからなる乳からのチーズ製造法に関ηる５゜この明細再において、゛不活性 な凝乳酵素″という用語は、チーズ製造開始時に乳中に添加されたときにはほと んど効力がないか又は全く効力がなく、すなわち認識１−ノうるような凝固活性 をもたず、製造工程申付われる特定の条件に付されないならば実質的に不活性の ままであり、活性化されるとチヘ・ズの熟成を促進する、不活性形の酵素と定義 される。カゼインの初期加水分解と凝乳の形成とを行うために、キモシ〕／又は 例えばペプシン又は微生物由来のプロデア−げ類のような他の適切な蛋白分解酵 素のごとき活性蛋白分解酵素のひとつ以上を添加するのが好ましい。そしてその 唯一の要件はそのプロテア−・ゼがチーズ製造の通常の工程に有害でないもので あることである。

不活性酵素の活性化はそのＷ９索の性質にしたがって種々の方法で行うことがで きる。しかし、不活性酵素を活性化する方法もしくはむしろその活性化を促進す る方法で好ましいのは、不活性酵素を含有する凝乳の声を６．８以下の声、特に ４．６〜６．２のような６．５と４．０との間の声に調節することである。通常 ４．７〜５．５の範囲の−はこの発明の目的に対して適切であると考えられる。

不活性酵素を活性化するのに必要な酸性化は例えば、適切な酸、特に乳酸のごと き有ｆｆｌ酸又はグルコノ・デルタ・ラフ１ヘンを所望の岬、乳中の固体の濃度 などによって決まる間で、乳に、その凝固する前に添加することによって行うこ とができる。この酸性化は、通常のチーズ製造工程において、ラクｌ−−スを醗 酵させさらに乳蛋白をより小分子噴のペプチド類及びアミノ酸類に分解させるた めに添加されるスターター・カルチャー細菌の作用によって一層簡便に行うこと ができる。スターター・カルチャー類は、カゼインの加水分解反応の開始には関 与しないがカゼイン凝塊の前記分解に関与する蛋白分解酵素を提供するのみなら ず、乳酸の産生によって、不活性酵素の活性化に関与する酸性条件を提供するた めに、この発明にしたがって乳に添加されるカルチャーである。スターター・カ ルチャーが添加されると、一般に、産生された乳酸の作用によって不活性酵素の 少なくとも一部が徐々に活性化される。更に活性化は、例えばスターター・カル チャー細菌によって提供されうるプロテアーゼ類の作用によって一層進行させる ことができる（下記参照）。

スターター・カルチャーは、約ｌＸ１０＠〜１ＸＩＯ’コロニー形成単位／１ｇ 　（チーズミルク）の量で、凍結乾燥カルチャー、急速冷凍カルチャーもしくは 液体カルチャーの形態で添加してもよい。このスターター・カルチャーは、不活 性酵素の添加及び任意の活性プロテアーゼの添加の前か又は同時に添加してもよ い。

この発明によれば、不活性凝乳酸素としては、酵素の潜在活性（ｐｏｔｅｎｔｉ ａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）に左右されるが、商業的に精製された酵素が、１０〜 １１０００Ｉ１／１００ｋｇ乳、好まり、　＜　ハ２０〜２００ｍｇ　／１０Ｑ ｋＱ乳の量で乳に添加される。この明細書において、“潜在活性“という用語は 、不活性酵素が活性化されたときに有する活性を意味する。実用上、潜在活性は 少なくとも１０ＣＨＵ／ｙｆであるのが好ましい。１　ＣＨＬＪ　（Ｃｈｒ、　 Ｈａｎｓｅｎ　’　ｓ　Ｕｎｉｔ　）は、１１！の１ｉｆ素溶液が（低熱処理脱 脂乳粉末の１１０（Ｊを　４．５−ＭＣａＣ４２溶液に溶解して作製された）基 質の５０ｇを−６，５，４２０秒、３２℃で凝固させることができる場合に存在 する凝乳活性と定義される（Ｇ、　Ａ、　Ｌ、Ｒｏｔｈｅ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、 　ｏｆ［］ａｉｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　、第４３巻、　１９７６年、第８１頁 参照）。“商業的に精製された”という用語は、好ましくない酵素活性及び他の 好ましくない含有物もしくは不純物が、最終の不活性酵素製剤から実質的に除去 されたことを意味するよう意図したものである。

換言すれば、比較対照として標準レンネット製剤の、例えば約１ｍｇ活性酵素／ ν！の酵素に製剤に概略相当し、５７ＣＨｔＪ　／ν！を含有するシイエイチア ール・ハンセン社の標準レンネットを用いる場合、不活性酵素の添加量は通常、 その潜在活性（活性化されたときの活性）が典型的なチーズ製造法での添加量（ １００ｋａ乳当りシイエイチアール・ハンセン社標準レンネットの約２０〜４０ 浦）の標準レンネット製剤の活性に相当するように通常調節される。これに基づ いてｉｏｏｋｇ乳当りの好ましいＣＨＵ含量と潜在活性が知られている不活性酵 素の添加すべき量を計算することができる。しかし、不活性酵素は、この酵素全 部が活性化されないとか、又はチーズの熟成が所望の期間内により速やかに確実 に行なわれるよう充分速やかに活性化されない場合の補償のために過剰に添加さ れる場合が多い。この過剰の程度は通常、計算添加量の１〜５倍のオーダーであ る。

特に牛、羊もしくは山羊のごとき半襲動物の乳のいずれのタイプのものもこの発 明の方法の出発原料として用いることができるが、例えば再生乳（ｒｅｃｏｎｓ ｔｉｔｕｔｅｄ　ｍ１ｌｋ）　、全乳、濃縮全乳、脱脂乳、又は粉末の植物蛋白 の一種以上のスラリー形態の各種植物蛋白く大豆、落花生、小麦及び他の穀類、 アルファルファ、又はこれらの混合物）と混合された乳がある。しかしこの発明 に使用される乳としては濃縮乳が好ましい。

乳は種々の方法で濃縮することができる。例えば蒸発もしくは噴霧乾燥しその後 再生する方法がある。しかし、膜濾過法で濃縮するのが好ましく、すなわち分子 量が約２０，０００までの分子を膜を通過させる限外濾過法があり、または限外 濾過法の前後に任意にダイヤフィルトレイジョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ 　）を行ってもよく、又はある場合には約５００までの分子量の分子を膜を通過 させる超濾過法でもよくこの場合多量の乾燥成分が残され凝乳を形成することを 意味する。膜濾過は、所望量の蛋白が得られるまで、適切な有機高分子もしくは 無機セラミック物質の膜のごとき膜を通じて高圧下で乳を循環させることによっ て行うことができる。この方法において、低９分子量成分のみならず水と可溶性 成分とは膜を通過しくＩＩの孔の大きさに左右される）、一方蛋白類（カゼイン 、アルブミン及びグロブリン）、脂肪類、不溶性塩類及び細菌類（これらのもの がすでに乳に添加されていた場合）は残る。また濃縮法は予備濃縮をひとつのシ ステムで行ない次いも予備濃縮された乳をもうひとつのシステムを通過させて的 確な濃縮を行う方法であってもよく、この方法によれば特に高濃度の固体が得ら れる（米国特許第４，３５５，０４８号参照）。

この発明の方法の好ましい態様において、不活性凝乳Ｆ！素は、減少させた量の キモシンのごとき活性蛋白分解酵素と共に、例えば濃縮乳を用いるときに必要な 標準レンネット製剤の形態で濃縮乳に添加される。そして不活性酵素の少なくと も一部が前記のように後の方のｗＪ造工程もしくは熟成工程で活性化される。

これは、長期間の熟成を要するので濃縮乳からチーズを製造する際の欠点であっ たレンネットｍの少ないのをおきなうためである。この発明のしたがって不活性 酵素もしくはその少なくとも一部（その活性化は時間、−及び酵素濃度に左右さ れるが漸進的である）が活性化されると、カゼインの蛋白分解速度が増大し、そ の結果チーズの熟成が促進される。このように、この発明によって、濃縮乳の使 用により得られるより大きな収量とチーズの熟成に必要な貯蔵期間の短縮という 利点を結合することが可能になったのである。

活性キモシンもしくは他の適切な蛋白分解酵素は、その酵素の活性に左右される が商業的にＦ＃製された酵素を、Ｏ〜２０ｈｇ／ＩＱＯｋｇ乳（０はかような活 性酵素を添加しない場合を意味する）好ましくは２０〜１００１１１＋１　／１ ００ｋｏ乳の量で添加するのが有利である。添加されるべき活性酵素の量は、活 性が、濃縮乳に充分な凝固期間をもたらす活性に相当するようなしかたで前記の ごとく計算することができる。活性酵素と不活性酵素との比率も前記のようにし て計算できる。

この発明の製法で有利に製造できるチーズ類のタイプは、カマンベール又プリイ チーズに相当するチーズのごとき軟質チーズ類（約４０％の乾燥成分含有）とイ ーダム、チェダー又はダンボチーズに類似の硬質又は半硬質チーズ類（約５０〜 ７０％の乾燥成分含有）であると現在考えられる。この発明の方法によって最も 有利に製造されると考えられるチーズ類は、半硬質又は硬質チーズ類のような、 伝統的なチーズ製法でも熟成に長期間を要するチーズ類である。なお、ある種の 半硬質もしくは硬質のチーズ類を製造する場合でも、減圧蒸発のような蒸発、ホ エー・ドレイニングくレンネットのロスが酸牲岬値の場合の方が少ないので低− 値の場合が最もよい）、又は乳の５倍以上の濃縮によって液体の吊を一層減少さ せることが必要なことは明らかである。

この発明の方法で用いられる不活性凝乳ＭＭとしてはチモーゲンが好ましい。チ モーゲンは、酵素の不活性な前駆体であり、その不活性性はその蛋白鎖中の特定 の塩基配列（Ｓｔ）ｅｃｉｆｉｃ３６ｑｕｅｎｃｅ　）　（活性化セグメント） の存在による。活性化反応においてこの塩基配列は、酸の存在下で分子を開裂す る活性プロテアーゼの作用によって活性酵素から脱離される。そしてこのプロテ アーゼは問題のチモーゲンに相当する活性酵素であってもよいが（口触作用）、 他のプロテアーゼでもよい。この開裂反応は分子量の低下によって測定される。

通常消化酵素である動物由来の蛋白分解酵素類において、前記不活性凝固酵素は 胃粘膜細胞からヂし一ゲン形で分泌される。この発明のためには、哺乳動物の消 化酵素が特に有用であり、牛、豚、羊、及び山羊から得られる酵素、特に反部動 物の酵素、並びに特にこわらの種の若い動物の酵素である。またそのチモーゲン は家禽類の洞化器官から得られるものでもよい。■乳プロテアーゼの本来の目的 は、若い哺乳動物がその母親の乳を消化するのを助けることであるからこの発明 の方法に用いられる凝乳酵素及びその前駆体は、その乳を与えるのと同じ動物種 から得られるものが有利である。

チモーゲンは絹換えＤＮＡ技術によって産生きれてもよい。

この方法において不活性凝乳酵素はチモーゲンが右利であり、上記例示のごとき 動物由来のもの特にブ［１キモシン（ｐｒｏ−ｃｈｙｍｏｓｉｎ）又は遺伝学的 もしくは化学的に改質されたプロキモシンが好ましい。遺伝子組換えＤＮＡ法に よれば、特定のチモーゲンの遺伝情報を指定する単一もしくは複数の遺伝子から なるＤＮＡフラグメントが、プラスミドのような適切なベクター上のこれらの遺 伝子を表現しうる微生物に挿入される。ついでこの微生物は、当該技術分野で公 知の醗酵技術によって工業規模で培養され、チモーゲンは培養物から回収するこ とができる（プロキモシンの遺伝子組換えＤＮＡ技術による生産のさらに詳しい 記事は、例えば英国公告特許第２．１００．７３７＠明細囚にみられる）。

この発明の方法に用いられる最も好ましい不活性酵素はキモシンの不活性前駆体 であるブロキ［シン（例えば小生の第４番目の胃の腺状層（ｇｌａｎｄｕｌａｒ 　１ａｙｅｒ　）から得られる）である。

プロキモシンは、−消化器官の蛋白分解酵素の多くの他の不活性前駆体と同様に 一胃中に分泌される前、胃のライニング（ｌｉｎｉｎｇ）中の酸く塩酸）産生細 胞を通過する際に活性化される。

ブロキ王シンの分子量はアミノ酸の塩基配列分析法（３ｅｔ＋ｔＦｏｌｔａａｎ ｎ　ｅｔ　ｓｌ、“Ｔｈｅ　Ｃ０１ｉｌｌｌｅｔｅ　Ａｌ１１ｎＯＡｅｉｄ　５ ｅＱｕｅｎＣｅＯｆ　Ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ”、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｉ：Ｉ、Ａ ＣＯｄ、ＳＣＩ、　ｔＪｓΔ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｎａｌ　 △ｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｔ＋ｅＵｎｉｔｅｄ　５ｔａ ｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）　、第７４１．１９７７年、第２３２１〜２３ ２４頁（米）参照〕によって４０，７７７と測定された。そしＣその等電点は約 ５．０のｍ個でありこれはペーパー電気泳動法（［３ｅｎｔ　Ｆｏｌｔｍａｎｎ 、”ＡＲｅｖｉｅｗｏｎ　ｐｒｏｒｅｎｎｉｎａｎｄＲｅｎｎｉｎ　”　、　Ｃ ｏｌｌ１ｐｔｅ　Ｒｅｎｄｕｓ　ｄｅ　Ｔｒａｖａｕｘ　ｄｕ　Ｌ　ａｂｏｒａ ｔｏｉｒｅＣａｒｌＳｂｅｒ（１，第３５巻、コペンハーゲン、　１９６６年、 第１７３頁（デンマーク）参照〕によって測定された。プロキモシンは、空温下 で約９の一値までの中位のアルカリ性条件下では比較的安定である。それは１１ 以上の一層で潜在的凝乳活性を急速に喪失する。プロキモシンは実施例１に記載 のように、実質的に小生の胃から抽出して得られる。このチモーゲンは、沈澱法 及び再沈澱法によって更に精製してもよい〔次いで任意に例えば溶離剤として約 ５．５〜５．８の−のリン酸塩緩衝液のごとき緩衝液を用いるＤＥＡＥセルロー スカラムのイオン交換クロマトグラフィ（Ｆ　０ＩＩ１１ａｎｎ、上掲書第１６ ４〜１６９頁参照）に付してもよい〕。

プロキモシンは、凍結乾燥、減圧乾燥もしくは液体の形態で、約Ｏ〜２０℃、及 び約６．５〜８．５の−で殺菌条件下で貯蔵するのが好ましい。これらの条件下 でプロキモシンは数ケ月間安定である。

プロキモシンのキモシンへの活性化は、プロキモシン分子中の第１番目の４２の Ｎ末端アミノ酸をはずすことによってその分子量を４０，７７７から３５，６５ ２に減少させる限定加水分解反応よって起こる。この活性化過程は非可逆であり 、その活性酵素は分離されたペプチドと再結合してコンプレックスを形成するこ とばない。プロキモシンのキモシンへの変換反応は５以下のｒ＠値で促進される ことが見出された（　ＦＯｌｔｌｌｌａｎＴｌ、上掲濁第１７４〜１８９頁参照 ）。例えばｐｈ　４，７で空温下では、プロキモシンの活性化は約１ｔｌｌ（Ｊ ／ｉｆの濃度で７〜１５時間内で完了するく緩衝液中で行われた実験、凝乳中で はもつと長時間を要する）、、５を越える声、例えば約５．２の−（チーズが通 常製造される場合の−）では活性化は幾分おそい。そして用いられる酵素濃廓で は、プロキモシンのキモシンへの活性化反応は数週間〜数ケ月の期間にわたる連 続工程で起こると考えられる。約４．８の−の凝乳中で、３週間後に約３０％の プロキモシンが活性化されたことが実験によって分った。

プロキモシンのキモシンへの変換反応は口触反応の結果であるから（形成される キモシンはこの変換反応を触媒する）、この発明にしたがってキモシンをチーズ 乳にプロキモシンと同時に添加するのが有利であり、ペプシノーゲンのごとき他 のチモーゲンを用いる際は、初期の反応速度を増大させるために対応する活性酵 素（例えばペプシン）を同様に添加してもよい。しかし他の蛋白分解酵素類が類 似の効果を示すことがあることに留意すべきである。この知見は蛋白分解酵素類 を添加することによって活性化反応を゛さらに促進するのに利用することができ る。これらの酸素類は強すぎる蛋白分解活性を有するものであってはならない。

というのはプロキモシン分子の部分的開裂というよりむしろ完全な開裂及び／又 は形成されたキモシンの不活性化をもたらすことがあるからである。この目的の ために適切なプロテア−ぜ類は、スターター・カルチャー細菌によって提供され るプロテアーゼ類を含む微生物プロテアーゼ類のごとき他の凝乳プロテアーゼ類 である。上記のように凝乳中に蛋白分解酵素類が存在するということも、これら が乳蛋白の小さなペプチド類やアミノ類への分解（すなわちチーズの熟成）に一 層寄与するので望ましいことである。

プロキモシン／キモシンはこの発明の方法に用いられる好ましい凝乳酵素である が、他のかような酵素類や酵素前駆体類も上記のように用いることができる。乳 を凝固しうる他の適切な酵素（及びその類縁チモーゲン）は、家禽類はもとより 牛、羊、山羊及び豚のごとき殆んどの哺乳動物の背中に産生きれるペプシンとペ プシノーゲンである。ペプシンは、分子量と他の物理的性質に関してむしろキモ シンに著しく似ていることが見出された。またペプシノーゲンのペプシンへの変 換反応も、約５．０以下の−では促進され、５の近傍の声価では上記の如く他の プロテアーゼ類によって触媒されうるけれども主として口触作用である。

チモーゲン類に加うるに、この発明の方法に用いられる不活性酵素は阻害剤によ って不活性化された活性酸素であってもよい。それは乳に添加されると活性形に 変換される。したがってこの阻害反応は可逆的でなければならずしたがって阻害 剤は選択されねばならない。凝乳酵素類に対する阻害剤の例は次のとおりである 。

１）　活性化中にペプシノーゲンから放出されたペプチド類２）　ポリリシン ３）　ペプスタチン及びペプスタチン類似化合物４）　拮抗阻害剤としての合成 ペプチド類これら阻害剤（酵素分子を破壊しないもの及び非可逆反応を起こさな いもの）の少なくともいくつかは、活性凝乳酵素を、乳に添加する前に完全にも しくは部分的に不活性化するためにこの反応の方法に用いることができると考え られる。この不活性化反応は、主として岬について適切な条件下で適切な量の問 題の阻害剤を酵素に混合し、使用までこれらの条件を保持することによって行う ことができる。

また再活性化反応は凝乳中で、阻害剤を破壊（分解）する蛋白分解酵素類の存在 によって起こるか、又は拮抗阻害剤〔その阻害剤は酵素の同じ結合サイトに対し て基質（カゼイン）と拮抗し、その酵素阻害百分率は阻害剤と基質との濃度比率 の関数である〕が用いられる場合、乳中の阻害剤を希釈してその効果を減少させ ることによって起こると考えられる。

この発明によって不活性化されその後再活性化されるべき酵素類は上記のいずれ のチモーゲン類の活性形態であってもよい。

一方これらの酵素は微生物由来のものでもよい。問題の酵素を産生ずるために用 いられる微生物は、乳を凝固させるのに適切な酵素を現実に産生するものか又は その前駆体であってもよ（、例えば種々の菌類が挙げられ、次のような倒がある 。ムコール・ミニヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ａ＋１ｅｈｅｉ　）　（Ｍ、　０ｔｔｅｓ ｅｎ　ａｎｄ　Ｗ。

Ｒ１ｃｋｅｒｔ、“７ｈｅ　Ａｃ１ｄ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｏｆ　Ｍｕｃｏｒ　 ｍ１ｅｈｅｉ　”　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｉｏ＋ｏｏｙ、第１９巻、　１９７０年、第４ ５９〜４６０頁参照）、ムコール・ブシルス（Ｍｕｃｏｒ　Ｐｕ５ｉｌｌｕｓ　 ）　（Ｋ。

Ａｒｉｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　”Ｍｉｌｋ　−ｃｏｌｔｔｉｎｏ　ＥｎｚｙＩｌ ｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｍｕｃｏｒｐｕｓｉｌｌｕｓｖａｒ、　Ｌｉｎｄｔ″　、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙＩｌｏｌｏｇｙ、第１９１、１９７０年、第４４６ 〜４５９頁参照）、及びエンドチア・バラシチカ（［：ｎｄｏｔｈｉａ　ｐａｒ ａｓｉｔｉｃａ）　（Ｊ、　Ｒ，Ｗｈｉｔａｋｅｒ。

“Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｔｈｉａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃａ″、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９巻、　１９７０年、第４３ ６〜４４５頁参照）である。

充分な量の酵素もしくは酵素前駆体を生産するために、かような微生物類は当該 技術分野で公知の醗酵方法で大規模に培養することができ、その酵素はそれ自体 公知の方法で培養物から回収することができる。またその微生物は、例えば紫外 線照射法、電離性放射線法もしくは適切な化学的突然変異誘発物質によってその 生物を突然変異させるとか、又は上記のごとき組換えＤＮＡ技術ただしプロキモ シンの遺伝子の代わりにキモシンの遺伝子を用いる技術によるとかなどの遺伝学 的改質法によって所望の酵素を産生するために作製される微生物でもよい。

実施例１ キモシンとプロキモシンとを、２２５ｇの小生の胃と３５０ｇｆのＮａ　ＨＣＯ ３の２％溶液（ｓ　７，８）と約５℃で１時間混合することによって、その胃か ら抽出した。１５分間Ｏ℃に冷却し、得られた抽出物を遠心分離し、０．３３　 Ｍ　Ａｌ　２　（Ｓｏ　４　）　３を撹拌しながら加えてｐＨ４，５にすること によって透明にし次いで０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を加えて陣を６．５とした。

得られた製剤に保存剤として０．０２％のアジ化ナトリウムを添加した。

得られた製剤は、 ４５．３０　ＨＵプロキモシン／１１１（潜在性）１２．７ＣＩ−（Ｕキモシン ／１！ を含有することが見出された。

プロキモシンの活性化を試験するには、１１！のプロキモシン（＋キモシン）製 剤が種々の一値に調整された０、０８　Ｍ酢酸塩緩衝液の５０ｇに添加される。

得られた複数の試料を２２℃で一夜培養し次いで冷凍した。その凝乳活性は種々 の時間後に測定され、活性化されたブキモシンの百分率が計算された。結果を第 １表に示した。

第１表 酢酸塩！ｌ衝液中でのプロキモシンの活性化巌４日後の活性化されたプロキモシ ン プロキモシンの活性化は約４．５以下の岬では著しくはやく、一方より高い一値 ではプロキモシンを活性化するのにより長時間を要するということは第１表から 明らかである。

実施例２ 高度に低温殺菌された脱脂牛乳の４０ｇを、デンマークのＤｅｄｅｎｓｋｅ　５ ｕｋｋｅｒｆａｂｒｉｋｋｅｒ社製の商品名ＤＯ８−モジュールー２０ラブ（Ｄ ＤＳ　−ｍｏｄｕｌ　−２０−ｌａｂ　）で知られ、０．３６　ｍ’の膜面積を 有する限外濾過装置で、乾燥成分が約２５％まで濃縮した。

６０％クリームでスタンダーダイズした後、その濃縮物を７２℃に加熱し次いで 直ちに培養温度（３０℃）に冷却した。、濃縮物を６つのビーカーに分けて、そ れぞれに１．２ｋＱづつの濃縮物を入れｌこ。

得られた各試料Ｌ：、２〜５％のストレブ］・コツカス・ラクテイス（Ｓｔｒｅ ｔ＋ｔｏｃｏｅｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ）と９５−９８％のス１−レブトコッカス ・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ）との混合物か らなる急速冷凍された細菌濃縮物〔デンマーク、コペンハーゲンのシーエイチア ール　ハンゼンズ　ラボラトリラム　エイ／ニス社から商品名　１’）ＭＳ−９ ５０カルチヤーで入手可能〕の０．０１％を３０℃で接種した。１時間後に１％ のＮａ　Ｃ１を加えてさらに２０分後に、第１と２の試料にプロキモシンを加え ずに０．２ｘｌのキモシンを加え、第３と第４の試料に０．２ｆｉのキモシンと ２．３１１のプロキモシンを加え、第５と６の試料には０．２ｔｌのキモシンと ４　、６　’Ｉ！のプロキモシンを加えた。用いられたキモシンは５５．３ＣＨ Ｕ　／　ｙｌの活性を有する標準の市販レンネット製剤であり、用いられたプロ キモシンは、とくに全活性キモシンが数ケ月間−を８．２に上昇させることによ って破壊され、次いで得られた製剤を１回につき２時間づつ３回水に対して透析 させてスターター・カルチャーに対して有害なアジ化ナトリウムを除去し、次い で遠心分離し殺菌濾過すること以外、実施例１に記載したのと同様にして支質的 に得られ、３２Ｃ１」Ｕ／１！の潜在活性を有していた（活性のわずかな喪失は 高められた−での処理と透析によって起った）。

プロキモシンを牛乳濃縮物に添加した際、約１５分後、プロキモシンを全く含有 しない試料を含めて全試料に、リチンチー１・（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ　）のセツ ティング（Ｓｅｔｊ！ｎＱ　）が起こったので、プロキモシンが牛乳の凝固に寄 与することは観察されなかった。

リチンテートの対照試料〈５１！のプロキモシンだけを添加した）には３０分間 以内に凝固は全く認められなか・、）た。

スターター　・カルチャーを接種してから２時間後、各試料を２２℃の温度の部 屋に移動ｔ、ｉｓ時間培養した。次いで冑られた凝乳を１４℃でＡ５日間貯蔵し た。

貯蔵中、間隔をおいて試料の次の事項を測定した。

（ａ）− ＋ｂ＋　乾燥成分量 （Ｃ）　乾燥成分中の全窒素量（丁Ｎ）＋ｒｂ　チーズ・エキストラクト（ｃｈ ｅｅｓｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　）中の可溶性窒素層（ＳＮ） （ｅ）　アミノ酸窒素量 チーズの乾燥成分量は約５ｇのチーズを１６時間乾燥し残渣を秤量して測定した 。チーズの全室素置は１（＋のチーズをマクロキエルダール法（Ｎｘ　６．３７ 　）によって測定した。チーズ中に存在ｔ６可Ｗ性窒ＷＧ＄ｐＨ７，５テ０．０ ３７Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　２溶液で抽出した。チーズ・エキストラクト窒素ＩＩ　（ ＳＮ）はチーズの全窒素分の百分率で示される（Ａ、　Ｎｏｏｍｅｎ　、　Ｎｅ ｔｈ、Ｍｉｌｋ　ＤａｉｒｙＪ、、第３１巻、　１９７７年、第１６３頁参照） 。さらにアミノ酸窒素はは、２０１１の可溶性窒素チーズエキストラクトの２０ １！に５滴のフェノールフタシン溶液を添加して、ピンク色になるまで０．１Ｎ 　Ｎａ○１」で滴定することによって測定した。、１０ｙｌの３７％ホルムアル デヒドを添加してピンク色になるまで０．１Ｎ　ＮａＯＨ’ｒ逆滴定した（Ｒ， Ｊｅｎｎｅｓｓ、　Ｓ、　Ｐａｔｔｏｎ　、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓＯｆ　［） ａｉｒ１７　ＱｈｅｌＢｉＳｔｒｙ、　ニー１−３−り、　１９７６年（米）参 照〕。

アミ、ノ酸窒素壇は試料中の全窒素儀の百分率として示される。

結果を第２表に示す。

（以下余白、次頁に続＜）５ 第２表 第２表に示すように、プロキモシンの添加はチーズ熟成に対して重要な効果を有 する。活性のキモシンだけを添加した第１と２の試料は４５日後に可溶性蛋白が 約５．５％増加しているのを示すことが見出されたが、一方、第３と４の試料、 及び第５と６の試料はそれぞれ、可溶性蛋白が約１１．１％及び約１５．１％増 加していることが見出された。試料中のアミノ酸窒素量はその可溶性窒素分の約 ６〜９％の一定水準にあることが見出され、可溶性窒素量の増加がプロキモシン の添加された試料中のアミノ酸窒素量の対応する増加をもたらすということを示 している。

２つの対照試料である第１と２の試料は４５日間の貯蔵後に約２０％の可溶性窒 素量を示した。２．３　ｙｌのプロキモシンの添加（第３と４の試料）及び４． ６　ｉｆのプロキモシンの添加（第５と６の試料）によって、同様水準の可溶性 窒素量が２１日間及び１４日間の熟成でそれぞれ達成された。このことはプロキ モシンの少なくとも一部がチーズ貯蔵中に活性キモシンに変換されこれがチーズ の熟成を促進するということを示している。

実施例３ 牛乳濃縮物を実施例２に記載したのと同様にて作製し、これを分けて６つのビー カーに各々１　、２　ｋｇづつのりテンテートを入れた。これらの試料に、ニス 　クレモリス（Ｓ　、　ｃｒｅＩｌｏｒｉｓ）とニス　ラクテイス（Ｓ、　１ａ ｃｔｉｓ）の６０〜８６％、ニス　ジアセチラクチス（３，ｄｉａｃｅｔｖｌａ ｃｔｉｓ　）の１０〜３０％、及びロイコノストック　クレモリス（１ｅｕｃｏ ｎｏｓｔｏｃ　ＣｒｅｌｌｌｏｒｉＳ）の４〜１０％の混合物からなる急速冷凍 細菌濃縮物（デンマーク、コペンハーゲンのシイエイチアール・ハンセンズ　ラ ボラトリラム　１１７１７社から商品名　ＤＶＳ　Ｂ−１１カルチャーで入手可 能）の０．０１％を３０℃で接種した。１時間後、１％のＮａ　Ｃ１を添加しさ らに２０分後に、第１と２の試料にはプロキモシンを加えずに０．２４　ｘｉの キモシンを添加し、第３と第４の試料には０．２４　ｘｉのキモシンと２．７５ ｘｌのプロキモシンを添加い第５と６の試料には０，２４　ｙｌキモシンと５， ５２　ｙｌのプロキモシンを添加した。この実施例に用いたキモシン製剤とプロ キモシン製剤は実施例２で使用したものと同じものである。

これらの試料をさらに、実施例２に記載したのと同様に処理し試験した。結果を 第３表に示す。

（以下余白、次頁に続く）。

第８表 第３表に示すように、キモシンだけを含有する第１と２の試料は、含有する可溶 性蛋白が４２日後に約９．９％増加し、一方同じ期間で、第３と４の試料及び第 ５と６の試料はそれぞれ、可溶性窒素分が約１６．０％及び約２５．１％増加し ていることが見出された。プロキモシンを全く含有しない第１と２の試料の４２ 日後の可溶性窒素分のレベルは、第３と４の試料では２１〜２８日間で達成され 第５と６の試料では１４日間で達成されている。このように第３表に示されたデ ータは、実施例２での結論、すなわちプロキモシンが活性化されるとチーズの熟 成を促進するという結論を確立している。第２表と第３表とのデータに見られる 可溶性蛋白量の差異は、声、乾燥成分量、牛乳の組成、酸素の添加量及び用いら れたスターター・カルチャーの差によっておそらく生ずるのであろう。

実施例４ 牛乳濃縮物を実施例２に記載したのと同様にして作製し、これを分けて６つのビ ーカーにそれぞれ１　ｋａのリチンテートを入れて実施例２に記載したのと同様 に接種した。１時間後１％のＮａＣｌを添加し、さらに２０分後に、第１と２の 試料にはプロキモシンを加えずに０．２ｘ！のキモシンを添加し、第３と４の試 料には０，２ｘｌのキモシンと５．５６　ｘｌのプロキモシンとを加え、第５と ６の試料には０．２１１のキモシンと１１．１２ｉ７のプロキモシンとを添加し た。用いたキモシンは５５．３ＣＨＵ／ｙｆの活性を有する標準の市販のレンネ ット製剤であった。この実施例で用いたプロキモシンは、ヨーロッパ公告特許第 ０．１１４，５０７号明細書に記載したのと実質的に同じ組替えＤＮＡ技術によ って得た。

これらのプロキモシン製剤は、 １１ＣＨＵのプロキモシン／１！（潜在性）ＯＣＨＵのキモシン／１！ を含有することが見出された。

次いでこれらの試料を実施例２に記載したのと同様にして処理し試験した。結果 を第４表に示す。

第４表 キモシンだけを含有する第１と２の試料は、可溶性蛋白が３６日間の貯蔵後で約 ２％増大していることが見出され、一方同じ期間で、可溶性窒素量は第３と４の 試料では約４％増加し、第５と６の試料では約６％増加した。このように、第４ 表に示すデータは実施例２と３との結論を確認しており、組換えＤＮＡ技術によ って得られたプロキモシンもこの発明の方法に用いることができることを示して いる。実施例２と３に比べて塾成の増大がむしろ低いということは、貯蔵中に各 チーズ試料にｔ７られた乾燥成分の量が比較的高いことによるのかもしれない。

ｍ　公　！１　岑　翰　牛

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．乳に、不活性の凝乳酵素と、任意にキモシンもしくは他の適切な蛋白分解酵 素とを、スターター・カルチャーの添加と同時もしくはその添加後に加えて凝乳 を形成し、前記不活性酵素の少なくとも一部を活性化し、次いで得られた凝乳を 塾成チーズに変換することからなる乳からのチーズ製造法。
2. ２．不活性の凝乳酵素が濃縮された乳に添加される請求の範囲第１項の方法。
3. ３．不活性の酵素がチモーゲンである請求の範囲第１項もしくは第２項の方法。
4. ４．チモーゲンが動物由来のものである請求の範囲第３項の方法。
5. ５．チモーゲンが牛、豚、羊もしくは山羊からの酵素のことき哺乳動物の消化酵 素又は家禽の消化酵素の前駆体である請求の範囲第４項の方法。
6. ６．不活性酵素が微生物由来のものである請求の範囲第１項又は第２項の方法。
7. ７．不活性酵素が遺伝学的に改質された微生物によって産生される請求の範囲第 ６項の方法。
8. ８．不活性酵素がチモーゲンである請求の範囲第７項の方法。
9. ９．不活性酵素がプロキモシンである請求の範囲第１〜８項のいずれかひとつの 方法。
10. １０．活性凝乳酵素が阻害剤によって不活性化され、その不活性化された酵素が 乳に添加され活性形態に変換される請求の範囲第１項又は第２項の方法。
11. １１．酵素が動物由来のものである請求の範囲第１０項の方法。
12. １２．酵素が牛、豚、羊もしくは山羊からの酵素のことき哺乳類の消化酵素又は 家禽の消化酵素である請求の範囲第１１項の方法。
13. １３．酵素が牛のペプシン、豚のペプシン、又はキモシンである請求の範囲第１ ２項の方法。
14. １４．酵素が微生物由来のものである請求の範囲第１０項の方法。
15. １５．酵素が菌類によって産生されるものである請求の範囲第１４項の方法。
16. １６．酵素産生菌類がムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｙｅｉ）、ムコ ール・プシルス（Ｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ）又はエンドチア・パラシチカ （Ｅｎｄｏｔｈｉａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）である請求の範囲第１５項の方法 。
17. １７．酵素が遺伝学的に改質された微生物である請求の範囲第１４項の方法。
18. １８．不活性の凝乳酵素が、その酵素の潜在活性にしたがって、商業的に精製さ れた不活性酵素の１０〜１０００ｍｇ／１００ｋｇ乳、好ましくは２０〜２００ ｍｇ／１００ｋｇ乳の量で添加される上記請求の範囲いずれかひとつの方法。
19. １９．キモシン又は他の適切な蛋白分解酵素が、その酸素の潜在活性によって、 商業的に精製された不活性酵素の０〜２００ｍｇ／１００ｋｇ乳、好ましくは２ ０〜１００ｍｇ／１００ｋｇ乳の量で添加される請求の範囲第１項又は第２項の 方法。
20. ２０．不活性酵素含有の凝乳のｐＨが６．８以下のｐＨ、４．６〜６．２のｐＨ のことき特に６．５と４．０との間のｐＨに調節され、酵素の活性化が促進され る上記請求の範囲のいずれかひとつの方法。
21. ２１．請求の範囲第１〜２０項のいずれかひとつの方法によって生産されるチー ズ。