JPS61500663A - 感染性嚢病ウィルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 感染性置駒ウィルスワクチン 本発明は、感染＋′４嚢病置駒ｆｎｆａｃｔｔａｕｓ　ｂｕｒｆＩａｌｄｉ＋％ ｅａｓｅ　；　ＩＢＤ　）ライｈ・スの感染性を試験管内で中和しおよび有毒な ＩＢＤウィルスによる感染に対して感染しやすい鶏（ｃ　ｂ　ｒ　ｃ　ｋ　ｅ　 ｎ　ｓ　）を保護する抗体の産生を刺激する鶏のＩＢＤウィルスの主要な構造タ ン・ぐり質（宿主保護免疫原）の同定および特性決定に関する。本発明は、さら に、前記の主要な宿主保５免疫原を用いたウィルスに対して有効なサブユニット ワクチンの製造に、ならびに診断試験、分析計価等におけるこの免疫原の使用に 関する。

感染性置駒ウィルスは、世界の家禽産業の全体にわたって主要な経済的重要性を 有する病原体であり、商業的家禽環境の至る所にちる夾雑物でちる。このウィル スは、若い鶏に高感染性で免疫抑制性の疾病を引き起こし、そして選択的に７ア ブリーキウヌγ（２つの主要な鳥類の免疫学的器官のうちの１つ）において増殖 することにょっ−こ抗体生産性血漿細胞の前駆体を破壊する。若い（４週齢まで の）鶏において、このウィルスは直接に病的状態を引き起こしそして死に至らせ る。一方、感染しながらも生きている鶏において、抗体反応生産能が阻害されま たは抑制される。かがる鶏は、他の鳥類感染を対象とした予防接種ｆａミグラム 対する応答性が乏しく、種種の細菌性、χ′イコゾシスマ性およびウィルス性病 原体に対する感染しやすさが高いままであり、セして極めて乏しい体重増加率お ｊ二び食物転換率を示す。

ＩＢＤウィルス感染に対する保護は、体液性の抗体のみで仲介され、細胞介在の 免疫学的器官の存在を必要としない。従って、卵黄嚢を介して免疫性の繁殖雌鶏 から適量の母性抗体を受けた鶏は、ｒ化後の臨界的な最初の４〜５週間にわたっ て保護される。

現在の予防接種計画は、受精卵内に高い１／・ベルの母性抗体を含有させて群化 後の前記臨界的な数週間にわたって鶏を保護することを目的としている。現在用 いられているＩＢＤＶを制御するための予防接種計画は、（予め、生ＩＢＤＶに 暴露した）繁殖雌鶏に、およそ２２２週齢産卵期の始まる前に不活性化した（１ ００倍より大きい）主要な二次抗体反応を引き起こし、生ウィルスを用いた繰シ 返しの予防接種によって得られる反応より長期間持続する。これによって、次の 約４０週間の産卵期間の全体を通じて各卵に高いレベルの保護抗体が伝達される 。抗体のレベルを十分に高めることができる場合には、６週齢で殺されるブロイ ラー鶏は母から得られる抗体によって、その飼育の全期間にわたってＩＢＤウィ ルスから完全に保護され得るであろう。

現在入手できる不活性化ＩＢＤウィルスワクチンは高価でらシ製造するのが難し い。なぜならば、単純培養系、例えば、胚形成した（　ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ 　）卵または組織培養ではウィルスを十分に高い力価まで増殖させることができ ないからである。現在、ワクチン製造に必要なウィルス材料は、６週齢の特に指 淀された病原体を含まない（ＳＰＦ　）鶏を感染させ、次いで感染後３日または ４日月に感染した嚢からウィルスを収穫することによって得ている。この感染し たＳＰＦ鶏からＩＢＤウィルスワクチンを製造する方法は困難なものであシかつ 費用のかかるものである。

本発明による主要な宿主保護免疫原の同定および分離は、雌鶏における延長され た高力価の抗体反応を刺激して少なくとも群化後の臨界的な最初の数週の間十分 な母性抗体を移して若鶏を保護し得るに有効な、安全で費用のかからないサブユ ニットワクチンの開発の道を開くものである。

本発明に至る仕事の１つの目的は、自然感染の後または市販の油乳濁性不活性化 全ウィルスワクチンの注射の後局に抗体を誘起する、ＩＢＤウィルスによりコー ドされたタン・ぐり質を同定することであった。

この仕事において、それぞれショ糖および塩化セシウムな用いた連続的な速度ゾ ーン（ｒａｔａ−ｚｏｎａｌ　）および密度平衡遠心分離による鶏の嚢からのオ ーストラリア株のＩＢＤウィルスの精製を研究した。このようにして精製したウ ィルスを分析して、このウィルスが分子量（ｙｒｗ　）約３７キロダルトン（ｋ ｄ）および３２　ｋｄの２つの主要な構造タン・ぐり質またはポリペプチド成分 、および分子量約９１．５　ｋｄ　、４１．５ｋｄおよび２９　ｋｄの他の３成 分からなっていることを見い出した。前記の主要なポリペプチドだけが、ＩＢＤ ウィルスに自然感染したまたはそれを高度免疫した鶏の血清と強く反応した。そ の中で、３２　ｋｄのポリペプチドと抗体との反応が特徴的に最も強いものであ りた。この３２ｋｄ、ｆｆ１ｊイア’チドは、精製した嚢増殖オーストラリアＩ ＢＤウィルスの（グルのクマシーブルー染色によって示されるように）すべての 調製物の主要成分であシ、ＣｓＣ１中浮遊密度１．３３みゲを有していた。他の ポリペプチドの相対量は調製物間で異なっていた。これに関する予備的な研究か ら、この３２　ｋｄのポリペプチドが標準分子量マーカーと比較して約３１　ｋ ｄの分子量を有していると概算されたことに注意されたい。しかしながら、一層 の研究の結果として、約３２　ｋｄの分子量がよシ正確な値でちると考えられる 。

オーストラリア単離体の主要な３２　ｋｄボＩＪ　＜グチドは、試験管内または 生体内で増殖したＩＢＤウィルスのＣｕ　−１単離体に関して外国の研究で検出 されたＶＰ　−３タン／ぐり質（３２〜３５　ｋｄの分子量）の大きさと同じで ちる〔ニック（Ｎｉｃｋ）等、１９７６年；ドゴス（Ｄｏｂｏｓ　）、１９７９ 年：トッド（Ｔｏｄｄ）およびマックナルティ（ＭｃＮｕｌｔｙ　）、１９７９ 年；ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）およびペクト（Ｂｅｃｈｔ　）　、１９８２年〕 。しかしながら、主要な３７　ｋｄポリベグチドは外国の単離体であるＶＰ−２ （４０〜４１　ｋｄの分子量）よシ小さく、一方、ｖｐ−ｘタン・ぐり質（分子 量４７〜４８　ｋｄ−ドボス、１９７９年；ミュラーおよびペクト、１９８２年 ）は完全なオーストラリアウィルスの調製物中には検出されなかった。しかしな がら、オーストラリア単離体の４１．５　ｋｄポリペプチドは３７　ｋｄのポリ ペプチドの前駆物質であシ、４１．５ｋｄのポリペプチドは外国の単離体である ｖｐ−ｘに類似していることが示唆される。

今や、自然感染したまたは高度免疫した鶏の血清は、主要でない９１．５　ｋｄ ポリペプチド以外のオーストラリア単離体のすべてのポリペプチドに対する抗体 を含んでいることが証明された。さらにＩＢＤウィルスの３２　ｋｄポＩＪ　” ２グチドに特異的な抗体がこの感染性ウィルスに対するＳＰＦ鶏の一次免疫応答 の間の最初に現われること、およびさらにこの抗体は嚢内で増殖したＩＢＤウィ ルスから調製した不活性化全ウィルスワクチンに対する鶏の一次応答において検 出された主要な抗体であることが示された。生ウィルスに対する応答の遅くにま たは不活性化ワクチンによる再予防接種の後に初めて、他の構造ポリペプチドに 対する抗体を容易に検出することができた。従って、３２　ｋｄのポリペプチド はＩＢＤウィルスの主要な免疫原の１つ、または最も主要な免疫原であると思わ れる。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したウィルスポリペプチドについてのウェスタン プロ、ティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析によって評価した、３ ２ｋｄポリベゾチドに特異的な抗体のみを含有する鶏血清の保護能力は、試験管 内でＩＢＤウィルスの感染性を中和しおよび極めて感染しやすい２日齢のＳＰＦ 鶏を受動的に保護するかかる血清の能力によりて証明される。さらに、精製した ３２ｋｄのポリペプチドで免疫した鶏はエリザ（ＥＬＩＳＡ　）およびウィルス 中和アッセイによって検出可能な抗体を産生じ、一方、３７　ｋｄｔたは４１． ５　ｋｄのポリペプチドで免疫した鶏はエリザによって検出可能な抗体を産生ず るが、そのウィルス中和能は低いレベルでしかない。３７　ｋｄ　−ｊたは４１ ，５ｋｄのポリペプチドによる抗３２　ｋｄ血清の吸着は抗３２ｋｄ血清のウィ ルス中和力価を減少させない。この結果から、３２ｋｄポリペプチドがＩＢＤウ ィルスの主要な保護免疫原であることが確められる。

本発明の１つの特徴によシ、ＩＢＤウィルス中に含まれている分子量約３２ｋｄ の構造ポリペプチド、またはその構造ぼり（グチドから由来した免疫原性ペプチ ドを、所望によシ、アジュバントと共に含んでいる、ＩＢＤウィルスに対して用 いるための非感染性サブユニットワクチンを提供する。

関連した特徴によシ、本発明は、前述したワクチンを家禽に投与することを含む 、家禽、と９わけ繁殖雌鶏におけるＩＢＤウィルスに対する保護抗体会のレベル を高める方法を提供する。

さらに別の特徴によシ、本発明は、３２　ｋｄ構造ポリイゾチドまたはその構造 ポリペプドから由来した免疫原性Ｒプチドに特異的な抗体を含有する抗血清な家 禽に投与することを含む、家禽にＩＢＤウィルスに対する受動免疫を与える方法 を提供する。

３２ｋｄの２リペプチドは、ＩＢＤウィルス、例えば、鶏の感染したファビリキ ウス嚢内で増殖しそこから精製されたＩＢＤウィルスから単離することができる 。

前述したように、本発明のワクチンは、例えば、「遺伝子工学」または化学合成 によって３２　ｋｄのポリペプチドから由来の免疫原性ペプチドを含んでいてよ い。適当な免疫原性−ｅ′ｆチドを得て、それがＩＢＤウィルスに含まれた３２ ｋｄポリペグチドのすべてのまたは少なくとも主要な免疫原性決定基を有し従っ て３２　ｋｄポリペプチドと同一のまたは類似した免疫原性を示すようにするこ とができる。必要ならば、３２　ｋｄのポリペプチドを担体分子に結合させてそ の免疫原性を高めそれによりてワクチンとしての効能を高めることもできる。

好ましくは、本発明の非感染性サブユニットワクチンはアジュバントを含んでい る。ワクチ、ンは、例えば、水性鉱油乳濁液、例えば、１９７８年、ストーン（ ５ｔｏｎｅ　）等によって記載のように油相乳化剤（例えば、アーラセル８０） および水相乳化剤（例えば、ツイーン８０）を用いることによって達成した乳濁 液の状態で供給することができる。必要ならば、追加のアジュバント、例えば、 ＡｔＯＨ，（ウェルズ（ｗｅｌｌｇ）等１９７９年〕、サポニンまたはムラミル （ｍｕｒａｍｙｌ　）ジペプチドの誘導体（ウェルズ等、１９８２年）を含んで いてもよい。

本発明の他の特徴によシ、繁殖雌鶏およびその子孫を含む家禽の保護抗体のレベ ルを定量的および定性的に検定する方法、および実験用のおよび市販の不活性化 ワクチンとして製造したＩＢＤウィルスの製剤中の保護抗原の相対濃度を検出す る方法を提供する。これらの方法は、ＩＢＤウィルスから単離した分子量約３２ 　ｋｄのポリペプチド、またはそのプリー２７゜チドから由来した免疫原性ペプ チドを免疫原として用いることを特徴とＬ７ている。これらの免疫検定法を実施 することができる方法の一層の詳細は、当業者によく知られているので、ここで は詳細に記載しない。これらの方法は十分に公知のエリザおよびラジオイムノア ッセイを含んでいる。

以下の詳細な記載は、ＩＢＤウィルスのオーストラリア単離体の電気泳動および ウェスタンブロッティングによる単離および特徴付けに関する。添付した図面を 説明すると次の通シである。

第１図は、９０分間２８．０００　ｒｐｍで２５〜５０チシヨ糖勾配（ＩＣ）ｍ Ａ’）によって分画したＩＢＤウィルスから単離した全ＲＮＡの電気泳動の特徴 を示すものである。この勾配から得た画分３，４および９のダルの上部の方にあ る白色の二重線はＩＢＤウィルス中に存在するｄｓ−ＲＮＡの２つのセグメント を含んでいる。矢印はショ糖濃度の増加を示している。

第２図は、（、）レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　、　１９７０年）によって記載の不 連続５ＤＳ−グル系を用いた１２．５％ｒルによる精製ＩＢＤウィルスのポリア クリルアミドゲル電気泳動を示している。グルをクマシーブリリアントプルーを 用いて染色したところ、分子量約３７　ｋｄおよび３２ｋｄの２つの主要なバン ドおよび分子量約９１．５　ｋｄ　、　４１．５　ｋｄおよび２９　ｋｄの他の ３つのバンド（矢印で示した）が示された。（ｂ）は、２か月前に生ＩＢＤウィ ルスを実験的に感染させた鶏から得た血清を用いて検出した後の、ＧＬ）からの ウィルス調製物のウェスタンプロットのオートラジオグラフを示している。分子 量標準物は各グルの左側に示してちる〔（ａ）ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ　）スタンダードおよび（ｂ）アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　”Ｃ− スタンダード〕。

第３図は、感染後３．５，７．ｉｏおよび１４日０に集めた血清の１：５００の 稀釈液を、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したウイルスポリベゾチドのウェスタ ンプロットと反応させることによって評価した、生ＩＢＤウィルスに対する６週 齢の鶏の血清抗体反応の特異性を示している。１４Ｃ−分子量マーカー（英国、 アマ−ジャム）を左側に示してちる。

第４図は、６週齢の鶏からＩＢＤウィルスに感染させた１４日後に集めた血清中 の抗体の特異性（トラック１〜６）または２８日前に感染させた鶏の血清中の抗 体の特異性（トラ、り７）を示している。６羽の鶏のうちの１羽（トラック１） だけが、感染後１４日までに３２　ｋｄ以外の構造ポリペプチドに対する特異性 を示す抗体を有していた。オートラジオグラフは７日間暴露した。アマ−ジャム 　Ｃ−分子量マーカーは左側に示しである。

第５図は、５週齢のときに市販の不活性化ワクチンワクチンを注射した２羽のＳ ＰＦ鶏（１および２）の−次抗体反応の特異性を示している。最初の予防接種後 ４および８週目の鶏から得た血清（ａおよびｂ）を、１３週齢のときに２回目の 不活性化ワクチンの注射をしその４週間後に得られた血清（ｃ）と比較している 。アマ−ジャム１４Ｃ−分子量マーカーを左側に示しである。

第６図は、４および２０週間の後感染を試験した場合の５週齢のとき生ウィルス を感染させた鶏から得た血清中の抗体の特異性を示している（ａおよびｂ）。次 いで２５週齢のときに鶏に市販の不活性化全ウィルスワクチンを再免疫して、そ の応答の特異性を４および８週間後に試験した（Ｃおよびｄ）。

アマ−ジャム　Ｃ−分子量マーカーを左側に示す。

材料および方法 ＩＢＤウィルスの増殖および精製 ＩＢＤウィルスの単離体００２／７３は、最初は、オーストラリアにおいてファ ース（Ｆｉｒｔｈ　）によシ（１９７４年）、種々の程度の滑液嚢炎を有する商 業的な家禽から得られ、英国ウェイブリッジ（Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ　）の中央家 畜研究所（ＣｅｎｔｒａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｌａｂａｒａｔｏｒｙ　）で 血清学的にＩＢＤクイルスであることが確認された。感染性の限界稀釈で増殖し た後、ウィルスを、４〜６遥齢の特に指定された病原体を含まない（ＳＰＦ　） 白色レグオン種の鶏〔オーストラリア、ビクトリア州マリビルノン（Ｍａｒｉｂ ｙｒｎｏｎｇ　）クシ口（Ｃ３ｌＲＯ）　ＳＰＦブリトウリーユニット（Ｐｏｕ ｌｔｒｙ　Ｕｎｉｔ　）　）の眼内接種によって通常の方法で増殖させた。感染 した７アプリキウス嚢のホモジネートを、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ　）中１０％ （Ｗ／ｖ）Ｈ，濁として調製して一８０℃で保存した。このＩＢＤウィルス保存 物は、電子顕微鏡試験によシ他の家禽ウィルスによる汚染がないものと思われ、 そしてトリレオウィルスに対する抗血清を用いた寒天ダル沈降試験では交差反応 を起こさなかった。

ウィルスは、トッドおよびマツクナルティー（１９７９年）の方法の変法によシ 精製した。同量の冷却したＰＢＳを新たに収穫した嚢に加え、これを設定値５で ポリトｏ　ｙ　（Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ　）　（ＰＴ　−１０−ＯＤ、キネマチ力（ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ　）、ＧＭＢＨ、ルツェルン（Ｌｕｚｅｒｎ　）、シュバ イラ（Ｓｃｈｗｅｉｚ　）　）の３Ｘ２０ｓパース）　（ｂｕｒｓｔｓ　）によ って水浴中でホモジネートした。このホモジネートを一８０°に凍結し、迅速に 解凍した後、同量のフルオロカービンアルクロン（Ａｒｋｌｏｎｅ　）　（オー ストラリア、メルがルン、ワーテイム研究所（Ｗｅｒｔｈｅｉｍ　Ｌａｂｓ、　 ）　）を加え、この混合物を再度ホモジネートした。５℃で３０分間１０．０Ｏ ＯＦの遠心を行なった後、０．１　Ｍ　ＮａＣ４，０，０１Ｍ　）リスーＨＣＺ 緩衝液（ＰＨ７，６）の水性相（約７ｍ１）を調製した。５℃でベックマン（Ｂ ｅｃｋｒｍｎｎ）ＳＷ２８０−ターによ９１．５時間２８．００　Ｏｒｐｍの遠 心を行なった後、ｌ　ｍ６画分の底から勾配を収穫した。

次いで、これをグル電気泳動、高度免疫血清を用いたウェスタンブロッティング 、エリザおよびｄ　ｓ　−ＲＮＡ用の検定（ウィルスの完全または不完全粒子お よびウィルスの可溶性タンパクの位置を決定するためのもの）によって試験した （後者の調製において、ウィルスは、６０％ショ糖５ｔｎｌの上に４０％ショ糖 １０ｍ１を重層することによって調製した段階（ｓｔｅｐｗｉｓｅ　）勾配の界 面から収集した）。完全な（そのままの）ウィルスを含有する画分をプールして 、予め形成した冷却の２０〜４０　％　（ｗ／ｖ　）　ＣｓＣ１勾配（１０ｍＡ ’）上に重層し、これをベックマン５ｗ４ｏＴｉ　ローターによシ５℃で１８時 間３０，０００ｒｐｍで遠心し、ＩＢＤウィルスのバンドを試験管のわきから収 穫した。ウィルスなＮａＣＬ　−）リス緩衝液に対して透析してＣｓＣ１を除去 し、次いで０．０５％（ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムを含有するＮａＣｔ−）リス 緩衝液に対して透析した後、４℃で保存し、またはグリセロール濃度５０％（ｖ ／ｖ）にして−２０℃で保存した。

ＩＢＤウィルスに対する鶏の抗血清 ＳＰＦ鶏にＩＢＤウィルスを眼内的に感染させて０゜３．５，７，１０および１ ４日後、次いで２週間毎に採血した。市販の不活性化油−乳濁性ワクチン〔オー ストラリア、ニューサウスウェールズ州、ノースミード（Ｎｏｒｔｈｍｅａｄ　 ）、アープ−ウェブスタータ４０社（Ａｒｔｈｕｒ　Ｗｅｂｓｔｅｒ　Ｐｔｙ、 　Ｌｔｄ、　）　）　０−５ｍ１を筋肉内的に注射した鶏を２週間毎に採血し、 ＩＢＤウィルスを２回眼内的に感染させた鶏、または予め感染させた後に市販の 不活性化ワクチンを筋肉内的に注射した鶏も同様に２週毎に採血した。１５分間 ４００ｇの遠心によって血清を集め一２０℃で保存種々の勾配画分中のｒＢＤウ ィルス抗原またはＩＢＤウィルスに対する鶏の抗体の存在を評価するために用い たエリザ法は、マイクロタイタートレー〔ナンクィムノグレート（Ｎｕｎｃ　Ｉ ｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ　）　Ｉ　）が、００２／７３でラビットを高度免疫する ことによって調製したラビットの抗ＩＢＤウィルスＩｇＧで塗布されているとい う点を除いては、ヨーク（Ｙｏｒｋ）等（１９８３年）によって記載の方法と本 質的に同じであった。勾配中のウィルス抗原を検出するために、画分の連続的稀 釈液をウェルに加え、次いで、１．０の最大ＯＤ　を生ずるＩＢＤウィルスに対 する鶏の５０１ｍ 抗血清の稀釈液を用いてこれを処理した。ＩＢＤウィルスに対する抗体を滴定す るために、初めにラビットの抗体を塗布しておいたウェルに、鶏の血清の稀釈液 を加え、次いで感染した嚢の標準化濃度の抽出物を加えた。次いで、各アッセイ 中のウィルス抗原に結合している鶏の抗体の量を、ヒツジＩｇＧ抗鶏ＩｇＧ−セ イヨウワサビペルオキシダーゼ抱合体ヲ加え、次いで５−アミンサリチル酸を加 えることによシ定量した。このトレーを３０分間振盪させ、次いで直ちにタイタ ーチックマルチスキャン（ＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｔｓｃａｎ　）　（オース トラリア、フロー研究所（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　）を用い てこのＯＤ　を４５００ｍ 読み取った。

ポリアクリルアミドダル電気泳動（ＰＡＧＥ　）およびウェスタンブロッティン グ 各ショ糖勾配画分のアリリート（４０μｔ）を減圧下に乾燥させ、ＳＤＳおよび 痕跡量の固体プロ七フェノールブルー染料を含有したレム！ｊ　（Ｌａｅｍｍｌ ｉ　。

１９７０年）によりて記載の試料緩衝液２０μを中に再懸濁し、次いで熱湯浴中 で３分間加熱した。この試料を、クマシーゾルー染色を用いた不連続ＰＡＧＥ（ レムリ、１９７０年）によって試験した。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって分離した ウィルスの構造タンノクク質をさらにバーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ　、　１９ ８１年）によって記載のウェスタンプロ、ティング法によって試験した。ウィル スタンパク質を、ニトロセルロース膜フィルター〔シュリーチエル（５ｃｈｌｅ ｉｃｈｅｒ　）およびシ、　＃　（Ｓｃｈ’ｕｌｌ　）　ＢＡ８３０．２μｍ〕 に移し、ＮａＣ６−トリス緩衝液中１　％　（ｗ／ｖ　）ゼラチン中で１：５０ ０に稀釈した鶏血清を用いて検出した。ウイルスポリペゾチドに結合した鶏抗体 を、ＮａＣｔ−）リス−ゼラチン緩衝液中で１：１０００に稀釈したラビ、）Ｉ ｇＧ抗鶏ＩｇＧ　（米国、コクランビル（Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ）、キャベ ル研究所（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｓ、　）　）　、次いで同緩衝液中１μＣｉの １２５１−プロティンＡ（英国、アマ−ジャム）を用いて同定した。ニトロセル ロース膜のオートラジオグラフは、フジ（Ｆｕｊｉ　）　ＲｘメディカルＸ線フ ィルムおよびイルフォードファーストタングステート（ｌ１ｆｏｒｄ　Ｆａｓｔ 　Ｔｕｎｇｓｔａｔｅ　）増感紙を通常に一７０℃で１６〜２４時間用いること によって調ショ糖勾配画分を、１０　ｍＭ　）リス−ＨＣ１，５０ｍＭＮａＣｔ 、０．２％ＳＯ３緩衝液、ｐＨ７，０５を用いて１：４に稀釈し、す？ヌクレア ーゼを含まないＱ　、　５　ｍｇ７１ｎｌのグロナーゼ〔米国、ワーシントン（ Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ））を用いて３７℃で１時間処理した。この溶液なＮａ ＣＡに関して帆３Ｍになるようにし、核酸をフェノール１容量を用いて５６℃で ５分間抽出した。クロロホルム１容量をこの混合物に添加し、次いでこれを室温 で１０分間振盪させた後、マイクロ遠心機〔西ドイツ、エッペンドルフ（Ｅｐｐ ｅｎｄｏｒｆ　）　）で２分間１２，０００　ｒｐｍで遠心分離を行なった。上 部の水性相中の核酸を、−２０℃で３０分間エタノール２容量を用いて沈殿させ 次いでこれを遠心を行なうことによって回収した。このＲＮＡペレ、トを６７チ （ｖ／ｖ　’）のエタノールを用いて十分に洗浄し、乾燥させ、次いで２０μＬ の水中に溶解した。ＲＮＡ　、試料を、２０ｍＭリン酸塩緩衝液中１％（Ｗ／ｖ ）アガローススラブダルを用いて非変性条件下に、ＤＮＡ標準物〔西ドイツ、ベ ーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　）　）と共に電気泳動した。グルなアクリ ジンオレンジを用いて染色しこれに紫外線を当てると、ｄｓ−ＤＮＡまたはＲＮ Ａがグリーンのバンドとして現われ、一方、１本鎖（３ｓ）ＲＮＡがレッドのバ ンドとして現われた〔マツクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ　）およびカーマイケ ル（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ）、１９７７年〕。

結　果 感染した嚢からのＩＢＤＶの精製 清澄化した嚢ホ七ジネートの２５〜５０チ連続シヨ糖勾配による遠心の後、材料 の主要なバンドが勾配の上から約３１５のところに見えた。ショ糖画分のＳ　０ Ｓ−ＰＡＧＥ分析によシ、最高濃度のウイルスタンノ９り質は可視バンドのとこ ろにあシ、この主要なバンドのすぐ上のおよびすぐ下の画分中に含まれるウイル スタンノ４り質の量は少量であることが示された。同様に、ウィルス抗原に対す るエリザは勾配の全体にわたるＩＢＤウィルス抗原のピークを示したが、この場 合にも可視バンドが最高の相対濃度を含んでいた。

種々のショ糖勾配画分から得られた全ＲＮＡの電気泳動に見られる特徴では、主 要な可視バンドに対応する画分３および４におよび勾配の頂部に近い画分９にウ ィルスＲＮＡの２つのセグメントが位置していた（第１図）。アクリジンオレン ・ノとの呈色反応は、２つのウィルスＲＮＡセグメントが２本鎖でおることを示 した。画分１０は低分子量のＲＮＡ　（例えば、ｔＲＮＡ　）のみを含み、画分 ６〜９は主綽りメソームＲＮＡ　（１８Ｓおよび２．８３　）および低分子量の ＲＮＡを含んでいた。ウィルスのｄｓ−ＲＮＡバンドは、す？ンームの５ｓ−Ｒ ＮＡよシリゴヌクレアーゼ消化に対してはるかに耐性であった。標準物としてｄ ｓ−ＤＮＡを用いた非変性条件下で電気泳動を行なった場合には。

２つのウィルスＲＮＡセグメントはそれぞれ２．５Ｘ１０６および２．２　Ｘ　 １０’の分子量を有していると考えられ連続ショ糖勾配からの完全ウィルスのＣ ５ＣＬ密度平衡遠心により、反射光のもとで見ることができおよび１．３３　ｇ ７ｒｎｔの平均浮遊密度を有する１つの主要なバンドが示された。４０〜６０チ の段階ショ糖勾配の界面からの粗製ウィルスをさらにＣ５ＣＬで精製した場合、 第２の稠密性が低いバンドでおって、電子顕微鏡によって高い割合の「コア」粒 子を含有していると考えられるバンドがしばしば観察された。

ウィルスの収　への感染期間の影響 感染の２日後に鶏から収穫した嚢からのウィルスのＣｓＣ１勾配中に、ＩＢＤウ ィルスのバンドを見ることはできなかった。ウィルスの明瞭なバンドは、３日間 感染した鶏からの嚢のＣ５ｅｔ勾配中に見ることができたが、感染後４日目に収 穫した嚢からウィルスを精製した場合によシ拡散的であった。さらにＩＢＤウィ ルス抗原に対するエリザによシ、感染の３日または４日後に得られた嚢のホモジ ネート中に最大力価の抗原があることが見い出された。従って、ウィルスは、感 染の３日後に集めた嚢から通常の方法で調製した。

酸氷解物のアミノ酸分析は平均アミノ酸残基重量１１０と仮定し、２５０μｇま でのウィルスタン／？り質を１つの嚢から得ることができるということを示した 。

精製したつ、イルスの５ＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色第２図に示したよ うに、完全ウィルスの精製調製物は、分子量約３７ｋｄおよび３２　ｋｄを有す る２つの主要なポリペプチド、および分子量約９１．５　ｋｄ。

４１．５　ｋｄおよび２９　ｋｄを有する（第２図に矢印で示す）他の３成分を 含んでいた。分子量３２　ｋｄのポリ４プチドはウィルスのすべての調製物の主 要な成分で６６だが、ウィルスの種々の調製物のポリアクリルアミドゲルからの デンシトメーターの記録（ｔｒａｃｔｎｇｓ　）は、ポリペプチドの相対量は調 製物間で変化するととｔ示した。

ＩＢＤウィルスを感染させた鶏の一次抗体反応の動力６週齢のときに単離体００ ２／７３を眼内的に感染させた６羽のＳＰＦ鶏において、エリザによる測定でＩ ＢＤウィルスに対する血清抗体の出現を観察した。

抗体は５日目に初めて検出しく平均力価２５０）。

これは１００回目平均力価１０，０００そして１４４回目平均力価１７．０ＯＯ ４で増加した。前記鶏の中の１羽から得た血清のウェスタンブロッティングを第 ３図に示しておる。ＩＢＩ）ウィルスの３２　Ｋｄポリペプチドに結合している 抗体は５日目に検出した。その結合の強さは感染後経時的に増加した。この鶏の 循環中に存在する抗体は、少なくとも反応の１４４回目で、３２　Ｋｄポリベグ チドに対して相対的に特異的であった。６羽のすべての鶏から感染の１４日後に 得た血清中に存在する抗体のウェスタンプロットは第４図（トラック１〜６）に 示しである。これら６羽の鶏の中の５羽からの血清は、オートラジオグラフを７ 日間暴露した場合でさえ、３２　Ｋｄポリペプチドに対する特異性を示した。最 初の感染の２８日後までには、鶏は、９１．５Ｋｄポリペゾチドを除くすべての ＩＢＤウィルスの、ｔ？　Ｉ）ペプチドに対する抗体を産生じた（第４図、トラ ンク７）。

不活性化した油乳濁性ＩＢＤワクチンを用いた予防液６羽の鶏に、５週齢のとき に、市販の不活性化全ウィルスワクチン０．５　ｍｌを筋肉内的に注射した。予 防接種後８週目に最高のエリザ力価を示した２羽の鶏（それぞれの力価は２５， ６００および５ｔ２００）からの血清をウェスタンブロンティングによって分析 した。予防接種後４週および８週目に、不活性化ワクチンに対する両方の鶏の一 次抗体反応は、ＩＢＤウィルスの３２Ｋｄのポリペプチドに対して相対的に特異 的でありた（第５図、トラックａおよびｂ）。しかしながら、１３週齢における 不活性化ワクチンの２回目の筋肉内注射の４週後までには、両方の鶏は、３つの 最も豊富な構造タンパク質と反応する血清抗体を産生じた（第５図、トラックＣ ）。

不活性化した油乳濁性ＩＢＤウィルスに感作した鶏の応答 ５週齢のときに生ＩＢＤウィルスを与えた鶏に、２５週齢のときに市販の不活性 化ワクチンを注射した。

最初の感染の４週および２０週後に血清を得、次いで再予防接種の４週および８ 週後に血清を得た。ウェスタンブロッティングによる分析は、初めに４つの構造 タンパク質に対する反応があシ、それは２０週の後感染までには弱まりていたこ とを示した（第６図）。七のときに行なった不活性化ワクチンの注射によシ、９ １．５Ｋｄポリペプチドを含むすべてのＩＢＤウィルスの４リペプチドに対する 反応が高まった（第６図、トラックｄ）。

以下の詳細な記載は、ＩＢＤウィルスの主要な免疫原を明らかにし、試験管内お よび生体内でのその免疫原に対する抗体の保護能を評価するための実験を述べて いる。

第７図は、３羽の１０週齢の鶏（トラック１．２および３）からＩＢＤウィルス （００２７７３）の感染後１４４回目集めた免疫血清のウェスタンプロットを示 シテいる。ニトロセルロースストリップを１＝１００に稀釈した血清２５μｌと 反応させた。高度免疫血清（トラック４）を陽性の対照として含めた。

第８図は、（ａ）ＩＢＤウィルス（００２／７３　）を感染させた１０週齢の鶏 から得た１００回目免疫血清の８２００力ラム分画のタンパク質の特徴（ＯＤ２ ８０ｎｍ　）、および（ｂ）各画分の１：１０稀釈液中エリザ（００４５０ｎｍ 　）によって検出可能な抗体活性を示している。

第９図は、ＩＢＤウィルス（００２／７３　）を感染させた２羽の１０週齢の鶏 （１および２）から得た１００回目免疫血清の（ａ）ＩｇＭおよび（ｂ）ＩｇＧ 画分のプールを用いた全ウィルスのウェスタンプロットを示している。

第１０図は、成熟鶏から、ＩＢＤウィルス（００２／７３）の精製構造ポリペプ チド約５０μｇを免疫感作した３週間後に得た血清のウェスタンプロットを示し ている。鶏Ａ％ＢおよびＣは３２Ｋｄボリイプチドを免疫した。鶏り、Ｅおよび Ｆは３７Ｋｄポリペグチドを免疫した。鶏Ｇ、ＨおよびＩは４１．５Ｋｄポリベ グチドを免疫した。トラックには高度免疫血清と反応させた。アマ−ジャムＣ１ ４−分子量マーカーを左側に示してちる。

第１１図は、吸着前（ａ）および３７　Ｋｄポリペゾチドによる吸着後（ｂ）　 ｔたは４１．５Ｋｄポリペグチドによる吸着後（ｃ）の２つの抗３２Ｋｄポリペ ゾチド血清（ＡおよびＢ）のウェスタンプロットおよび吸着前（ａ）および３２ Ｋｄポリペグチドによる吸着後（ｄ）の２つの抗３７Ｋｄポリにプチド血清（Ｅ およびＦ）のウェスタンプロットを示している。吸着によって除去された外来の 抗体活性を最初の各血清（、）に矢印で示す。第５表を参照されたい。

第１２図は、吸着前（、）および３２Ｋｄポリペプチドによる吸着後伽）、３７ Ｋｄポリペグチドによる吸着後（Ｃ）、または４１．５Ｋｄポリペプチドによる 吸着後（ｄ）の、００２／７３を感染させた鶏からの１００回目免疫血清（Ｌ） および不活性化ワクチンを免疫した鶏からの２８日目の免疫血清（Ｋ）のウェス タンプロットを示している。第５表を参照されたい。

材料および方法 動物 「クシローダプリュー（Ｃ３ｌＲＯ−Ｗ　）　Ｊ系の白色レグホン種の鶏を、グ イクトリア州マリビルノンのクシ口　スベシファイドノンソーノエン　フリー　 プルトウ　リ　−　ユ　ニ　ッ　ト　（Ｃ３ｌＲＯ５ｐｅｃｉｆｉｅｄ　Ｐａｔ ｈｏｇｅｎＦｒｅｅ　（ＳＰＦ）　Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｕｎｉｔ　）によって供給 し、１日齢のときに軟質フィルムプラスチック家禽隔離装置〔デネット（Ｄｅｎ ｅｔｔ　）およびパガスト（Ｂａｇｕｓｔ　）（１９７９年）〕に移した。

２／ルス 試Ｍに用いたＩＢＤウィルスのオーストラリア単離体（００２／７３　）は、最 初にファース（１９７４年）によって記載され、英国ウェイブリッジの中央家畜 研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）で 血清学的にＩＢＤウィルスであることが確認された。感染性の限界稀釈での１回 の継代の後、ウィルスを通常方法で４〜６週齢のＳＰＦ鶏の眼内的（ｉ、ｏ、） 感染によって継代した。ウィルスの感染性を、感染した嚢の１０％（ｗ／ｖ）ホ モジネートのｔｏｇ、０稀釈２５　ｐｌを眼内的に３日齢のＳＰＦ鶏に接種する ことによって滴定した。７２時間後、これらの鶏から嚢を収穫し、ホモジネート し、そして酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）によってＩＢＤウィル ス抗原を検出した。ウィルスの力価は、接種した鶏の５０％を感染させたウィル スの稀釈度の逆数として表わした（ＣＩＤ５ｏ）。

鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ　）培養で増殖するように適合させたＩＢＤウィルスは 、オーストラリア、シトニーのニー、ウェブスター　タイ、社（Ａ、　Ｗｅｂｓ ｔｅｒＰｔｙ、　Ｌｔｄ、　）によって初めて入手できるようになった。このウ ィルスをＴＣ−ＩＢＤウィルス（ＧＴ　１０１　）　ト呼び、ＣＥＦ培養で通常 の方法によシ継代した。ＧＴ１０１ウィルスは、タイプ−１のＩＢＤウィルスに 対する鶏血清によって試験管内で中和されるが、タイプ−２のウィルスに対する 鶏血清によっては中和されない（英国ウェイプリツノの中央家畜研究所の発行さ れていないデータ）。

ウィルスの精製 ＩＢＤウィルス（００２７７３）を嚢中で増殖し、次いで前述した如くに精製し た。簡結に述べると、０、　ＯＩ　Ｍ　）リス−ＨＣｌ、　０．１５　ＭＮａＣ ６，ｐＨ７，６（ＴＢＳ　）中の感染した嚢の５０チホモノネートを凍結／解凍 し、同容量のフルオロカーボンアルクロン〔オーストラリア、メルゴルン、ワー ティム研究所（Ｗｅｒｔｈｅｉｍ　Ｌａｂｓ、　）　〕を用いてホモジネートし た。

清澄化した水性相を、４０％および６０％（−／’−）ショ糖の段階勾配で遠心 した。このショ糖界面を集めて、予め形成した２５％　〜５０％（ｗ／ｖ　）　 ＣｓＣ１勾配で遠心した。精製した完全ウィルスは１．３３　ｆ１７ｆｎｌのＣ ５ＣＬの密度に集まった。

ウィルスのポリペプチドは、レムリ（１９７０年）の不連続ＳＤＳグル系を用い た１２．５％（Ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドスラブダルで分析した後、パーネ ット（１９８１年）によって記載されたウェスタンブロッティンク法ニよってグ ルからニトロセルロースペーパー上だ移してル述の如くに鶏抗体と反応させた。

簡結に述べると、ニトロセルロース膜フィルターをＴＢＳ中乾燥スキムミルク粉 末の５％（ｗ／ｖ）溶液〔プロット−（ｂｌｏｔｔｏ　）　）で閉塞し、これを ５ｍのストリップに切断した後、プロット−中鶏血清の１：１００稀釈液、続い てプロット−中ラビット抗鶏ＩｇＧ［：米国、コクランビル、キャベル研究所（ Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｓ、　）　）の１　：　１０００稀釈液、そして最後に１ μＣｉの　Ｉ−プロティンＡ（英国、アマ−ジャム）と反応させた。フジメディ カルＸ線フィルムおよびイルフォードファースト　タングステート増感紙を用い てオートラノオグラフを調製した。

ＩＢＤウィルスの構造ポリペプチドの精製精製したウィルスを、還元剤の不存在 においてＳＤＳと共に２分間煮沸し、Ｋゾチドを５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離 した。グルをクマシーブルーで軽く染色し、脱色し、２９Ｋｄ、３２Ｋｄ、３７ Ｋｄ、４１．５Ｋｄおよび９１．５　Ｋｄのタンパク質のバンドなグルから切シ 離した。ポリペプチドを、４０時間５０メルトで、グルメ）　＋Ｊタングら０． １％（ｗ／ｖ　）　ＳＤＳ含有０、０５　Ｍ　）リス−酢酸緩衝液（ｐｉ−１８ ，０）中へ溶離した。溶離したポリペプチドを４８時間多数回取シカえの蒸留水 に対して透析し、既知濃度の分子量マーカー（スウェーデン、ファーマシア）に 対スる５ＤＳ−ＰＡＧＥによってポリペプチドのおよその濃度を評価した。ポリ ペプチドの純度は、高度免疫鶏血清を用いたウェスタンブロッティングによって 評価した。

６〜１０週齢のＳＰＦ鶏に、眼内的に感染性ウィルス（００２７７３）を接種し １０日および１４日後に採血した。血清を遠心で集めて一２０℃で保存した。

他に、ＳＰＦ鶏に市販の不活性化ＩＢＤワクチン（アーサー　ウェブスター、タ イ、社）Ｑ、５ｍ／を筋肉内的に（ｉ、ｍ、　）注射し、−次抗体反応のピーク である２８日後に血清を集めた。

成熟ＳＰＦ鶏に、２容量のフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ　）　［米国 、ディ７＝ｒ　（Ｄｔｆｃｏ　）　〕中に乳化したＩＢＤウィルスの３２Ｋａ、 ３７Ｋａまたは４１．５　Ｋｄボリベゾチドのいずれか約５０μ夕を筋肉内的に 注射した。３週間後、フロイントの不完全アジ−パン）　（ＦＩＡ　）　（ディ フコ）中間食の各ポリペプチドを鶏に再度筋肉内的に注射した。約４ｏｍｌの採 血した血液を、およそ１週間１回の間隔で保存薬を含まないヘパリン中に集め（ 最終濃度Ｉ　Ｑ　ＩＪ７ｆｎｌ　）、血漿を集めて一２０℃に凍結した。血漿を 解凍して、遠心によってフィブリン凝塊を除去した。他の鶏に２９　Ｋｄおよび ９１．５　Ｋｄのポリペプチドを免疫した。

但し、注射したポリペプチドの量は極めて少量であシ、抗体反応は相応して弱か った。

鶏血清中の抗−ＩＢＤウィルス抗体および嚢ホモ・ゾネート中のＩＢＤウィルス 抗原の両方を、前述したエリザを用いて定量した。

バイオカーボネート緩衝培地１９９〔米国、ノプコ（Ｇｉｂｃｏ　）　Ｅ中の熱 不活性化した（５６℃／３０分間）血清の一連の稀釈液を、約５００ｆラーク形 成単位（ｐｆｕ）／ｍｔ−まで稀釈しておいた同容量のＴＣ−ＩＢＤウィルスに 加えた。ウィルス−血清混合物を待時振盪しながら室温で６０分間インキュベー ションした後、各混合物０．１　ｍｌを３つの二次ＣＥＦ培養〔南オーストシリ ア、ケイライン（Ｋａｙｌｉｎｅ　）、３５ｍ直径のプラスチック製にトリ皿〕 中に接種して、残存するウィルスの感染性を試験した。ウィルスを３７℃におい て６０分間単層に吸着させた後、６皿に、５　％　（Ｗ／Ｖ　）子牛血清含有Ｈ ＥＰＥＳ　（０，０１５Ｍ　）緩衝培地１９９中０．７　％　（ｗ／ｖ　）寒天 〔米国、・マコーディフコ（Ｂａｃｏ−Ｄｉｆｃｏ　）　）　２　ｍｌを重層し た。この培養を３７℃でさらに６日間インキュベーションし、１％寒天の重層に ０１１５％（ｗ／ｖ　”）中性赤を添加することによって染色した。中和アッセ イの終点は、ＩＢＤウイルスグラークの数の５０チ減少を惹起する血清の稀釈度 であった。

ミクロ−３Ｎアツセイ 不活性化血清の一連の稀釈液を、１０　％　（ｗ／ｖ　）ＴＰＢ　（ディフコ） および２％の熱不活性化胎児子牛血清を含有する１９９の２５μ！容量中に、平 底マイクロタイタートレー〔米国、リンプロ（Ｌｉｎｂｒｏ　）　）を用いて調 製した後、同容量のＴＣ−ＩＢＤウィルス（５００ｐｆｕ／ｍｌ　）を加え３７ ℃において１時間インキュベーションした。インキュベーションの後、二次ＣＥ Ｆ細胞の７．５Ｘ１０　細胞／ｍｌの懸濁液５０　ｔｔｌ　を加え、トレーを３ ７℃で５日間インキュベーションした。次いで、トレーをメタノール中１％（Ｗ ／ｖ）のクリスタルバイオレットで染色し、終点を、ウィルス複製を完全に阻止 する最終稀釈度として読み取２日齢の鶏に、種々の免疫血清またはＩＢＤウィル スに対する抗体を含まない対照血清を、腹腔内的に（ｉ−ｐ−）注射した。１日 後、鶏に、通常最低限１０００ＣＩＤ５０のＩＢＤウィルスＯＯ２／７３を含有 する嚢のホモジネート２５μｌを眼内的に感染させて試験した。感染の３日後、 鶏を瀉血して、その嚢を取シ出し、秤量しそして生理的食塩水中５％のホモジネ ートにした。血清中の抗体のレベルおよび嚢中のウィルス抗原の存在の両方をエ リザによって定量した。

免疫血清５　ｒｎｌを、０．　ＯＩ　Ｍす／酸塩、０．１５ＭＮａＣｔ、　ｐＨ ７，６（ＰＢＳ　）を用いた溶出によって２．５　ｃｍＸ　１００ｃｒｎＳ２０ ０　（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　〕カラムで分離した。この画分 をエリザによりて抗体活性について分析評価した後、ＩｇＭ領域およびＩｇＧ領 域をプールして、この２つの領域が重なる１つの６ｍ１画分を取シ除いた。プー ルしたものを店１００Ａ膜〔米国、アミコｙ　（Ａｍ１ｃｏｎ　）　’）を用い て４　ｍｌまで濃縮し無菌涙過した。

７７４　ラｊ−＜　ニク７７士ユ４５７　＜　−３２Ｋｄ、３７Ｋｄおよび４１ ．５　Ｋｄのポリペプチドだけが、吸着カラムを調製するに十分な量で得られた 。ポリペプチドは、グルの各端から取シ出したクマシー染色ストリップによって 案内して、未染色グルから得た。溶離したポリペプチドの純度は、高度免疫血清 を用いたウェスタンブロッティングによって評価した。ポリペプチドをローリ− （Ｌｃ）ｗｒｙ　）のタンパク質アッセイ〔）１−トリー（Ｍａｒｔｒｅｅ　） 、１９７２年〕によって定量し、１５０〜３００μ夕の各ポリペプチドを、製造 業者の使用説明書に従って、アフィグ＃　（Ａｆｆｉｇｅｌ　）　１０　（米国 、／マイオラクド（Ｂｉｏｒａｄ　）　〕ｌ　ｍｌと反応させた。

６抗Ｉり被プチド血清１　ｍｌを、吸着カラムにゆりくシと流し、３容量のＰＢ Ｓを用いて溶離した。１Ｍプロピオン酸５　ｍｌをカラムに通し続いてＰＢＳ　 ２０　ｍｅを通すことによってカラムを再活性化した。全ウィルスまたは不活性 化ワクチンを用いて免疫した鴫から得た血清は、血清０．２５　ｍｌをカラムに 流しＰＢＳｌ、７５ｙｆ！を用いて溶出することによってカラムに吸着させた。

吸着の有効性をイムノブロンティングによって評価した。

結　果 単−特異性抗３２　Ｋｄ血清による受動保護６週齢の鶏からＩＢＤウィルスを感 染させた１４日後に得た抗血清をウェスタンブロッティングによって分析したと ころ、５つは３２Ｋｄ構造ポＩＪ　ｄプチドに特異的な抗体だけを含有している ことが見い出された。血清は６．６２０〜５１，２００のエリザ力価および６． ２５０もしくはそれ以上のウィルス中和力価を有していた（第１表）。鶏を受動 的に保護するこれらの血清の能力は、４羽の２日齢の鶏のそれぞれに各血清１　 ｍｌを注射し、１日後に１０００Ｃより５ｏの００２／７３を感染させて試験す ることによって評価した。免疫血清を受けた鶏はすべて感染に耐性であ〕、感染 の３日後に瀉血したところ循環性の抗体を有していたが、抗体陰性の血清を受け た鶏は抗体を有しておらず感染しやすかった（第１表）。

ＩＢＤウィルスを感染させた１００週齢鶏３羽からの１００回目よび１４４回目 免疫血清を用いて実験を繰ｐ返した。再び、これらの血清はウェスタンブロッテ ィング（第７図）によって単一特異性であシ、１００回目は５７，０００〜７７ ．０００のエリザ力価および１４４回目は７０，０００〜１６６．０００のエリ ザ力価を有していた。各血清２ｍｌを３羽の鶏のそれぞれに注射した。１０００ 　ＣＩＤ５ｏの００２／７３を感染させて試験した鶏の群の他に、プールした免 疫血清または対照血清のいずれかを受けた鶏の小群は感染させず接触状態の（１ ｎ−ｃｏｎｔａｃｔ　）対照として用いた。免疫血清およびウィルスを受けたＢ （第２表）も接触状態の鶏も感染しなかった。通常の鶏血清およびウィルスを与 えられた鶏はすべて感染しやすかった。

抗３２　Ｋｄ血清中の保護抗体の特性づけ１００週齢鶏２羽から、ＩＢＤウィル スによる感染の１０日後に得た血清を８２００カラムクロマトグラフイーによっ て分画しエリザによシ検出可能な抗体について分析評価したところ、すべての活 性はカラム・ぜターン（第８図）のＩｇＧ領域に限られていた。

ＩｇＭ領域およびＩｇＧ領域をプールしてミクロ−８Ｎアツセイによりて滴定し た。これらの血清のＩｇＭおよびＩｇＧプールの両方がウィルス中和活性を有し 、ＩｇＧ　７’−ルがＩｇＭグールのＳＮ力価の２倍の力価を有していることが 見い出された（第３表）。これらの抗体プールを用いた全ウィルスのイムノプロ ッティングにより、このアッセイでも３２Ｋｄｆ！リペプチドに特異的なＩｇＧ 抗体が最初に検出されるということが示された（第９図）。

各血清からのＩｇＭおよびＩｇＧｆ−ル１　ｍｌを２日齢の鶏４羽の群に注射し 、次いで１日後に１０ＣｘＤ５゜のウィルスを感染させて試験した。ＩｇＧ抗体 抗体ルール護を与えることが見い出されたが、抗体のＩｇＭプールを注射した鶏 はすべて感染しやすかった（第３表）。

精製したウィルスポリペプチドに対する抗体反応成熟ＳＰＦ鶏は、ＦＣＡ中３２ Ｋｄ、３７Ｋｄまたは４１．５　Ｋｄのいずれかの精製したウィルスポリペプチ ド約５０μｙに対する反応の初期の間、エリザまたはミクロ−ＳＮアッセイのい ずれかによって検出することができる実質的力価の抗体を産生しなかった。

しかしながら、免疫感作の３週間後に得た血清を用いたイムノプロッティングで は、鶏がそれぞれのポリペプチドに対する合成された抗体を有していることが示 された（第１０図）。３２Ｋｄポリペプチドに最強の反応を生じた鶏Ｂは、さら に３７Ｋｄおよび４１．５Ｋｄ４リペプチドに対する抗体を産生じ（第１０図、 トラックＢ）、３７Ｋｄポリペプチドを注射した３羽の＠（Ｄ、ＥおよびＦ）か らの血清は、４１．５ＫｄポＩＪ−ｅグチドを注射した３羽の鶏（Ｇ％Ｈおよび Ｉ）からの血清とほとんど区別がつかなかった（第１０図、トラックｐ〜工）。

３７Ｋｄまたは４１．５Ｋｄｌリイプチドのいずれかを注射した鶏はすべて、さ らにプロットで低分子量の物質と反応する抗体を産生ずることが注目された。こ の物質は予防接種した鶏からの高度免疫血清によっては認識されなかった（第１ ０図、トラックＫ）。

ＦＩＡ中ウイつスポリイグチドの２回目の注射の１週間後、３２Ｋｄポリペプチ ドを注射した３羽の鶏のうちの１羽は２５６のミクロ−８Ｎ力価を有していた（ 第４表）。さらに、２回目の免疫感作の３．４および６週間後に行なった採血で 、３２Ｋｄポ＋Ｊ　ｄプチドを注射した鶏のうちの２羽は１６０〜１２８０のＩ ＢＤウィルスに対する中和力価を有しているが、３７Ｋｄまたは４１．５　Ｋａ ポリペグチドを注射した鶏は４０もしくはそれよシ少ない中和力価を有している ことが示された。４１．５　ＫｄポＩＪ　４プチドを注射した鶏のうちの１羽は 、２回目のポリペプチドの注射後、最も高いエリザ力価を有していた（第４表） 。

精製したポリペプチドの２回目の注射の３〜６週間後に得た血清とウィルスとの ウェスタンプロットを調べることによって、七の血清のすべてが他のポリ被プチ ドに対する抗体を含有していることが示された。アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ　 ）　−１０に種々のウィルスポリペプチドを結合させることによって調製した吸 着カラムに抗ポリペプチド血清を通すことによシ単−特異性の抗血清を調製した 。

３７　Ｋｄカラムに抗３２　Ｋｄ血清を通すことによつて、３７Ｋｄおよび４１ ．５　Ｋｄボリベグチドに対するすべての抗体活性を除去した（第１１図、Ａお よびＢ）が、ミクロ−３Ｎ力価は減少しなかった（第５表）。

４１、５　Ｋｄカラムは有効性が低かったが、抗３２　Ｋｄ血清のＳＮ力価を減 少させないという同じ結果を与えた。最も高いＳＮ活性を有する２つの抗３７　 Ｋｄ血清を３２Ｋｄ吸着カラムに通すことによって、すべての抗３２Ｋｄ抗体を 除去した（第１１図、ＥおよびＦ）が、これらの血清中に存在する低レイルのＳ Ｎ抗体は減少しなかった（第５表）。よシ識別力のあるプラーク減少アッセイで 、抗３２　Ｋｄ血清を３７　Ｋｄカラムに通すことによって血清中の活性が減少 しないことが確認された（第６表）。相応する吸着カラムに抗ポリベゾチド血清 を通した場合、ミクロ−６Ｎ力価についての効果が検出できないかまたはその力 価がせいぜい５０％だけ減少した（第５表）。

感染した鶏から１０日口の得た血清および不活性化したＩＢＤワクチンを注射し た鶏から２８日０に得た血清も吸着カラムに通した。いずれの場合にも、３７　 Ｋｄおよび４１．５　Ｋｄカラムはウェスタン−プロッティング・ぐターン（第 １２図）または血清のミクロ−８Ｎ力価（第５表）に影響を及ぼさなかった。し かしながら、血清を３２　Ｋｄカラムに通すことによって、ウェスタン−プロッ ティング／マターンの強さが顕著に減少しく第１２図）、血清のミクロ−３Ｎ力 価が半分まで減少した（第５表）。吸着の有効性を改善するために、３２Ｋｄカ ラムに通す前に１０日口の血清を１：１００に稀釈した。この場合に、プラーク 減少アッセイ（第６表）は、血清の１：２０．ＯＯＯ稀釈液中のウィルス中和活 性がほぼ５０％だけ減少することを示した。

抗ポリペゾチド血清間の相乗作用 検出し得るミクロ−３Ｎ力価を有していない抗３２Ｋｄ血清と３つの異なる抗３ ７Ｋｄ血清とを同容量で混合しても、抗３７Ｋｄ血清単独の活性によって説明で きる以上には混合物のＳＮ力価は高まらなかった（第７表）。同様に、３２０の ミクロ−８Ｎ力価を有する抗３２　Ｋｄ血清と３つの抗３７　Ｋｄ血清との混合 で、抗３２Ｋｄ血清の活性によって完全に説明することができるＳＮ力価を有す る混合物が生じた（第７表）。

抗３２　Ｋｄポリペゾチド血清による受動保護抗３２Ｋｄポリベゾチド血清１〜 ’ｌ　ｍｌ中の抗体濃度は低すぎて、若い鶏に腹腔内的に注射した場合に検出可 能なレベルの循環抗体を産生できないことが見い出された。抗３２Ｋｄポリペプ チド血清２０　Ｉｎｔ　（５ｉｌＢ）の（ＮＨ４）２Ｓ０４沈殿を調製し、ＰＢ Ｓ　４　ｍｌ中に再び溶解し、無菌涙過し、そして１　ｍｌを２日齢の３羽の鶏 のそれぞれに注射した。３羽の対照の鶏と共にこれらの鶏に、１日後に１０Ｃよ り５ｏの００２／７３を感染させて試験し、感染の３日後に瀉血して嚢および血 清なエリザによって評価した。沈殿した抗体を受けた３羽の鶏は１６０〜３２０ の残存するエリザ力価を有しており、その中の２羽は嚢中に検出可能なウィルス 抗原を有していないなかった。３羽の対照鶏は検出可能な抗体を有しておらず、 すべてが１２８を越えるウィルス抗原のエリザ力価を有していた。

７週齢のＳＰＦ鶏５羽にＩＢＤウィルス（００２／７３　）を感染させ、感染後 １０．１１および１２日日月採血した。１５の個々の血清をウェスタンブロッテ ィングによって評価したところ、すべての血清はＩＢＤウィルスの３２Ｋｄポリ 被ゾチドに特異的な抗体を含んでいた。血清をプールして英国ウェイプリツノの 中央家畜研究所へ送った。血清中和アッセイによって評価すると、プールした血 清はタイプ−１株ＰＧＢ−９８、Ｃｕ　−１およびＧ−１３さらにＧＴ−１０１ を中和するがタイ７’−２ＩＢＤウィルス株’ｒｙ−ｓｃ＋を中和しないことが 見い出された。

第１表　ＩＢＤウィルス（００２／７３　）の３２Ｋｄポリペプ＊　２日齢の鶏 ３羽の各群に、ＩＢＤウィルス感染の１４日後に得た５羽の相異なる供与鶏から の血清１　ｒｎｌ（群２〜６）またはＳＰＦ鶏からの抗体陰性血清１ｍ１（群ｌ ）を腹腔内的に注射−。免疫血清のウェスタンプロットを第４図に示した。

＋　鶏に、血清を受けた１日後に１ＯＯＯＣＩＤ５ｏのＩＢＤウィルスを眼内的 に感染させて試験し、３日後に瀉血した。嚢を、ＩＢＤ抗原の存在に対するエリ ザによって試験し、対応する血清を、残存する特異的抗体について評価した。

＋　く１は稀釈していない嚢のホモノネートト同一。

第２表　ＩＢＤウィルスの３２Ｋｄポリペプチドに特１９．―■■■■■−−■ ■■■喝−１−―−−１■■■１−□□□−□Φ＊　第１表による実験計画。但 し、ある鶏に対しては致死量である血清２ｍｌを３羽の鶏の群に腹腔内的に与え 、ちる群は感染させなかったが感染させた鶏と接触状態においた。

血清のウェスタンプロットを第７図に示した。

Ｎ、　Ｔ、試験せず ＊　２日齢の鶏３羽の群に、ＩＢＤウィルスを感染させた１０日後に、２羽の供 与鶏から得たＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を腹腔内的に注射した。抗体、とシわけＩ ｇＧ抗体はＩＢＤウィルスの３２ｋｄポリ（ゾチドに特異的であった（第９図） 。

ｔ　３日齢の鶏に１０ＣＩＤ５ｏのＯＯ２／７３を感染させて試験し３日後に心 崩しだ。嚢をホモジネートして、抗原の存在についてエリザによって評価し、残 存するＩｇＧ抗体にりいて血清を分析評価した。

Ｎ、Ａ、適用できず。

第４表　ＩＢＤウィルスの３２Ｋｄまたは４１．５Ｋｄ構＊　３羽の成熟ＳＰＦ 鶏に、ＦＣＡ中の各ポリペグチド約５０μＩを筋肉内的に注射した。最初の免疫 感作の３週間後、鶏に、　ＦＩＡ中ポリペゾチドを再度注射した。各群の３羽の 鶏のうちの２羽だけが、ミクロ−中和アッセイによって検出可能な抗体を合成し た。

第５表　ＩＢＤウィルス？リペグチド、不活性化全□ ＊　血清は、予防接種の２８日後＊または１０日後＊１本＊　に得、これらは第 １２図に示すようにウェスタンブロッティングによって３２Ｋｄ　ポリペプチド に特異的でらワた。

十　吸着前および吸着後の血清のウェスタンプロットを第１１図に示した。

ＫＴ、試験せず 第６表　ＩＢＤウィルスポリ被ゾチド、不活性全つｆ　纂５表による抗血清 本　吸着前に抗血清を１：１００に稀釈した。

Ｎ、Ｔ、試験せず 第７表　抗３２Ｋｄ血清および抗３７Ｋｄ崩清のｌ：１＊　ｌ：１混合物のミク ロ−８Ｎ力価を、最初の自消の力価と直接に比較するため２倍にした。

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ウェルズ、ビー、ダブリュー０．エミリー、ディー、エル、　（Ｅｍｅｒｙ、　 Ｄ、　Ｌ、　）、ヒンソ７．’／−，：Ｌ−、（Ｔ（ｉｎｓｏｎ、　Ｃ，Ａ、　 ）　％モリソン、ダブリュー、アイ−（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｗ、　１．　）お よび？　レ−、！　ムセイの変異特異性表面抗原による牛の免疫感作：種々のア ジュバントの影響（Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔｔｌｅｗｉｔｈ　 ａ　ｖａｒｉｅｎｔ　−５ｐｅｃｉｆｉｃ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｓ＋ｎ 　ｏｆＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ　：　１ｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ 　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｄｊｕｖａｎｔｓ　）。インフェクト、イミ一二ティー （Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　）、３６．１〜１０頁。

ヨーク・ジエイ・ジエイ・（Ｙｏｒｋ、　Ｊ、Ｊ・）・フ了ヘイ、ケイ、ジェイ 、　（Ｆａｈｅｙ、　Ｋ、　Ｊ、　）およびノぐガストウティー、ジェイ、　（ Ｂａｇｕｓｔ、　Ｔ、　Ｊ、　）　１９８３年。鶏における感染性喉頭気管炎ウ ィルスに対する抗体を検出するためのエリザの発色および評価（Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ＥＬＩＳＡ　ｆｏｒｔ ｈ＠　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ｉｎｆｅｃｔｉｏ ｕｓｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅＨｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ 　）。エイグイアンディズイーズイズ、２７：４０９〜４２１頁。

本発明の説明によって前述した特定の方法に多くの変形および変化を施し得るこ と、および本発明が前記に広く記載した本発明の範囲に属するかかる変形のすべ てを含んでいることが理解されよう。

Ｆｔｃ、２．　ａ　ｂ ｗ−−ｖ−Ｊ□　Ａ６ｅ−ｒ−ｋ＝−ｋ＝　ｐｃｒ／ａｔ＋　８４／（１０２５ ６

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ＩＢＤウイルス中に含まれている分子量約３２Ｋｄの構造ポリペプチド、ま たはその構造ポリペプチドから由来した免疫原性ペプチドを、所望により、アジ ュバンドと共に含んでいる、ＩＢＤウイルスに対して用いるための非感染性ザブ ュニットワクチン。
2. ２．前記３２ＫｄのポリペプチドがＩＢＤウイルスから単離したものである、請 求の範囲第１項記載のワクチン。
3. ３．前記３２Ｋｄのポリペプチドのすベてのまたは少なくとも主要な免疫原性の 決定基を有する免疫原性ペプチドを含んでいる、請求の範囲第１項記載のワクチ ン。
4. ４．前記３２Ｋｄのポリペプチドまたは前記免疫原性ペプチドが担体分子に結合 してその免疫原性を高めている、請求の範囲第１項記載のワクチン。
5. ５．前記アジュバントが水性鉱油乳濁液である、請求の範囲第１項から第４項ま でのいずれかに記載のワクチン。
6. ６．請求の範囲第１項から第５項までのいずれかに記載のワクチンを、家禽に、 イン−オボにまたは孵化後の任意の時期に投与することを含む、家禽の保護抗体 レベルを高める方法。
7. ７．前記ワクチンを、繁殖雌鶏に産卵期が始まる前に投与して、前記繁殖雌鶏の 子孫を保護する、特許請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．ＩＢＤウイルス中に含まれる分子量約３２Ｋｄの構造ペプチド、またはその 構造ペプチドから由来した免疫原性ペプチドに特異的な抗体を含有する抗血清を 家禽に投与することを含む、家禽にＩＢＤウイルスに対する受動免疫を提供する 方法。
9. ９．ＩＢＤウイルス中に含まれる分子量約３２Ｋｄの構造ポリペプチド、または その構造ポリペプチドから由来した免疫原性ペプチドを免疫原として用いること を特徴とする、家禽のＩＢＤウイルスに対する保護抗体レベルを分析評価する方 法。
10. １０．ＩＢＤウイルス中に含まれる分子量約３２Ｋｄの構造ポリペプチド、また はその構造ポリペプチドから由来した免疫原性ペプチドを免疫原として用いるこ とを特徴とする、ワクチンとして使用するために製造したＩＢＤウイルスの製剤 中の保護免疫原レベルを分析評価する方法。