JPS61500201A - アスコルビン酸の生物転化による製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アスコルビン酸の生物転化による製造 本発明はＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の醗酵による製造方法、この種の醗 酵に特に適する微生物および醗酵培地に関する。

発明の背景 Ｌ−アスコルビン酸は人間にとつて必須食品成分であり、自然界においては柑橘 類の果物および植物中に含まれている。Ｌ−アスコルビン酸は通常既知方法によ り、例えば出発物質としてＤ−グルコースを用いるライヒシュタイン（Ｔ．Ｒｅ ｉｃｈｓｔｅｉｎ）の米国特許第２２６５１２１号に記載のほうほうにより合成 される。

Ｌ−アスコルビン酸のその他の化学的合成法方および生物学的製造方法も種々知 られており、例えば米国特許第２７０２８０８号、同第２８４７４２１号および 同第３７２１６６３号に記載の方法が知られており、これらは一般に上記のライ ヒシュタイン方法の変法である。しかしながら、これらの方法は開示されるごと く出発物質としてグルコースを用いる比較的複雑な方法である。他の出発物質を 利用する商業規模での新規方法が望まれるであろう。

英国特許第７６３０５５号に記載される化学的−生物学的方法では、動物または 植物の酵素組織に存在するデヒドロゲナーザ（ＥＣ１．３．２．３）を用いてガ ンマラクトンの最終酸化を行うことによりＬ−アルコルビン酸を得ている。同様 の方法が米国特許第４２５９４４３号に記載されており、ここではラクトースの 加水分解糖とエンドウ豆由来の植物デヒドロゲナーゼ酵素（Ｅ　Ｏ１，３，２， ３）を利用してＬ−アスコルビン酸を製造している。この方法の効率については 開示されていないが、商業規模でのこの方法の使用は制限をうけると思われる。

パン酵母および／またはビール酵母がＬ−ガラクトノ−ラクトンオキシダーゼ（ 類）を含むことはすでに認められており、この酵素（類）がＬ−アスコルビン酸 生合成の最終酸化工程、すなわちＬ−ガラクトノ−ガンマラクトンを酸化してＬ −アスコルビン酸と過酸化水素とを製造する工程を触媒すると思われた〔エンザ イモロジア（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ）　、３１　ｆｒ２（１９６６）　；ユー ロ、ジエイ、バイオヶム　（Ｅｕｒ、Ｊ　、ＢｉｏＣｈｅｍ、）　、　１２７　 ＋３９１　（１９８２）；およびエム、ニシキミ（Ｍ、ＮｉＮ１５ｈｉｋｉ　） らのアーチ、バイオタム。バイオフィシ　（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｐｈｙｓ、）、１９１　、４７９　（１９７８）を参照〕。炭素エネルギー 源としてＤ−グルコース（１０％）を含む栄養培地内で増殖する酵母がエンジグ オール構造のアスコルビン酸類似体を生産する能力についても研究された〔ヘイ ク（Ｈｅ１ｃｋ　）らのカナ。

ジエイ、マイクロバイオロ、（Ｃａｎ、Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　、　１８ 　。

５９７　（１９７２）　を参照〕。類似の研究において、カンディダ（Ｃ１ａｎ ｄｉｄａ　）酵母株を蔗糖、ヘキソースまたはペントース上で増殖させてアスコ ルビン酸類似体（Ｄ−エリトロアスコルビン酸）を製造した〔ニス、ムラカワ（ Ｓ、Ｍｕｒａｋａｗａ　）らのアグリク、バイオロ、ケム、　（Ａｇｒｉｃ、Ｂ ｉｏＪＣｉｈｅｍ＋）　、　４０（６）　。

１２５５　（１９７６）および同書４１（９）　、１７９９　（１９７７）を参 照〕。Ｌ−ガラ゛クトノーガンマラクトンを培地に添加して酵母を増殖させた場 合にはＬ−アスコルビン酸も確認された。Ｄ　−エリトロアスコルビン酸は種々 の炭素源から作られたが、Ｌ−アスコルビン酸は発酵培地中にＬ−糖−ラクトン が存在するときに生産されるにすぎなかった。

また、かなりの量のラクトースはチーズ製造の際の副産物としてホエー（乳漿） 、ホエー透過物またはミルク透過物の形で利用可能であることが知られている。

これらの副産物の利用は長い間チーズ製造業者らにとって関心の的であった。

ホエーまたは他のミルク由来の流動状副産物から得られるラクトースを加水分解 するとグルコースおよびガラクトースが得び同第２６８１８５８号を参照）、ま たホエーを発酵させるとエタノールが生ずることも知られている〔例えばフード ・エンジニアリング（Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　）　、　１１月、１ ９７７年、７４〜７５頁：英国特許第１５２４６１８号を参照〕。酪農副産物と してのラクトースを利用するのに適したＬ−アスコルビン酸の新規製造方法がと ９わけ望まれるであろう。

従って、本発明の主な目的はＬ−アスコルビン酸を製造するための商業規模で実 施しうる新規生物転化方法を提供することである。本発明の他の目的は、酪農副 産物であるラクトース源（例えばホエー、ホエー透過物およびミルク透過物）を Ｌ−アスコルビン酸の製造に利用しうる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトンのような種々のＤ −およびＬ−ガラクトース誘導体の存在下にエタノールの好気的発酵によりＬ− アスコルビン酸を製造することができる微生物を提供することである。さらに他 の目的はＬ−アスコルビン酸の微生物学的製造に特に適する発酵培地を提供する ことである。これらおよび他の目的は添付の図面および以後の詳細な説明から一 層明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は本発明に従って酪農副産物であるラクトースからし−アスコルビン酸を 製造する方法の１つの実施態様を示す一連の工程図であり、 第２図はＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ活性につ〜・てのミト コンドリア検定を示すグラフでウリ、第３図はＬ−ガラクトノ−１，４−ラクト ンからのミトコンドリアでのアスコルビン酸製造を温度の関数として示すグラフ であり、 第４図はＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンからのミトコンドリアでのアスコル ビン酸製造をｐＨの関数として示すグラフであり、 第５図１ｄ、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン基質濃度に対するミトコンドリ アでのＬ−アスコルビン酸反応速度Ｖ○を示すグラフであり、そして 第６図ばＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンからのミトコンドリアでのアスコル ビン酸製造についてのＫｍおよびＶｍａｘ　を測定する際の逆基質濃度に対する 逆ミトコンドリア反応速度ｖＯを表わすグラフである。

発明の説明 一般に本発明によれば、Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトン、Ｌ−ガラクトン酸の 低級アルキルエステル、Ｌ−ガラクトン酸およびこれらの混合物よりなる群から 選ばれるＬ−ガラクトン酸系基質の水性相での好気的生物転化によるＬ−アスコ ルビン酸の製造方法が提供される。以後にさらに詳しく論じるように、Ｌ−ガラ クトン酸系基質は適当な方法で、例えばＤ−ガラクトースの酸化および柑橘類に 含まれるペクチンのようなペクチン質の加水分解により得られる。特に好適なし 一ガラクトン酸系基質はＬ−ガラクトノ−ガンマラクトンである。また、この種 の方法によれば、エタノール、グリセロールおよびこれらの混合物よりなる群か ら選ばれる短鎖の炭素発酵エネルギー源をその発酵において利用することができ る。特に好適な炭素源はエタノールである。

好気的生物転化に適する微生物の選択および利用は本方法の重要な特徴になって いる。これに関して、Ｌ−アスコルビン酸の合成において過剰生産性でありかつ Ｌ−ガラクトン酸系基質からＬ−アスコルビン酸を蓄積する微生物を発酵培地に 供給することが望ましい。ＩＩ　Ｌ−アスコルビン酸の生合成において過剰生産 性である１１微生物とは、自然突然変寞または遺伝子操作のいずれかによって発 酵プロスの全容量に基づいて発酵培地１を当たり少な（とも約０．３％の量で代 謝産物としてのＬ−アスコルビン酸の高められた生産が可能である微生物を意味 する。

Ｌ−アスコルビン酸の生産は特定の微生物を用いてＬ−ガラクトン酸系基質の存 在下にエタノールを発酵させることにより実施される。Ｌ−ガラクトン酸系基質 からのＬ−アスコルビン酸の製造において過剰生産性でありかつ短鎖炭素源を利 用しうる酵母およびカンデイダ属の特定酵母が特に好ましい。しかし、他の適当 な微生物（適切に遺伝子修飾された微生物を含む）、例えばハンセヌラ（Ｈａｎ ｓｅｎｕｌ？Ｌ）　、サツカロミセス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃ８Ｓ　）　 、フリユベロミセス（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）　、デバロミセス（Ｄｅ ｂａｒｏｍｙｃｅｓ　）　、ナソニア（ＮａｄＳＯｎｉａ　）　、リポミセス（ Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　）　、　）ルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　）　、フ レケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ　）　、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ　）　、シゾサツカ ロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　、　）リボノブシス （Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　）　。

プレツタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　）　またはシュワニオミセス （Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　）のような他の属の酵母もいくつかの情況で は使用することができる。

本発明の種々の観点によれば、使用する微生物は酸化的発酵における主な炭素源 としてエタノールを利用することができ、その結果Ｌ−ガラクトノーガンマラク トンの生物転化を行って少なくとも約１１／ｌの収量でＬ−アスコルビン酸を生 産することができるものであればよい。しかし、カンデイダ属に属し、かつＬ− アスコルビン酸の生産に必要とされる特性を有し、さらに生物転化プロス中への 生産物の輸送および好気的条件下でのアルコールの高められた代謝能力などの特 性を有する突然変異株が好適な微生物である。しかし、ある場合には細胞内に有 意量の生産物を蓄積する株も利用価値がある。また、特に好適な炭素源はエタノ ールであるが、グリセロールも増殖用炭素源および／またはＬ−アスコルビン酸 もしくはその他のエンジオール化合物の生産用発酵炭素源として有用であること が認められている。炭素源を選ぶための決定的要因はそれがＬ−アスコルビン酸 の異性体へ転化されないということである。酵母はそれらがＬ−アスコルビン酸 を生産しかつ蓄積する能力を有するものでありさえすれば自然界に存在する株、 人工的に突然変異を起こされた株または遺伝子操作により作られた株であってよ く、とりわけカンデイダ属のものが好適である。

適切な突然変異株は紫外線（ＵＶ）の照射およびまたは化学的突然変異原（例え ばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチ ル、亜硝酸、アクリフラビンおよびカフェイン）への暴露のような通常の突然変 異方法によシ誘発される。組換えＤＮＡ技術もそうであるが、プロトプラスト融 合または電気融合を行って改良された組換え体を作るところの過剰生産性酵母株 のハイブリダイゼーションも使用できる。また、多くの属の酵母は適当な条件下 でＬ−アスコルビン酸またはその類似体を生産するように誘導されうることが認 められている。アスコルビン酸の製造において過剰生産性のこの種の株はアスコ ルビン酸の大部分を細胞内に蓄積してもよく、従って細胞の自己分解が起こるま でアスコルビン酸は放出されない。しかし、Ｌ−アスコルビン酸を発酵培地から 非常に簡単に回収する発酵方法においては、微生物が生産物を培地へ輸送するの が望ましい。

従って、本発明の特徴はＬ−アスコルビン酸生産物を細胞内に保持することなく 、むしろ生産場所から発酵培地中へ輸送できる特定の微生物株を提供することで ある。Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトン基質からのＬ−アスコルビン酸の製造に 携わる酵素系は酵母のミトコンドリアと関係があるように思える。従つて、Ｌ− ガラクトノ−ガンマラクトン基質は発酵培地から細胞壁を横切り、さらにミ）？ ンドリア膜を通って輸送されねばならない。同様に、Ｌ−アスコルビン酸反応生 産物はミトコンドリア膜と細胞壁とを通って発酵培地に入るよう運ばれねばなら ない。Ｌ−アスコルビン酸を発酵培地に蓄積させるために、細胞壁とミトコンド リア膜を通過するこのような望ましい輸送特性を有する微生物株が提供される。

これに関して、本発明の特に好適な実施態様では、Ｌ−アスコルビン酸またはそ の類似体生産物の大部分をトロボ相（ｔｒｏｐｏｐｈａｓｅ　）およびイデイオ 相（１ｄｉｏｐｈａｓｅ　）　の生長段階中に発酵培地へ輸送するところの後で 述べるカンデイダ属変異株のような選ばれた酵母種および株が利用される。本発 明によれば、Ｌ−ガラクトン酸系基質（特にＬ−ガラクトノ−ガンマラクトン） を好気的に酸化してＬ−アスコルビン酸を製造しかつ実質的にそのＬ−アスコル ビン酸のみを蓄積するのに特に適した新規微生物が提供される。

エタノールを好気的条件下で代謝する優れた能力をもつ微生物であって、かつＬ −アスコルビン酸を水性発酵培地中に供給するように細胞壁とミトコンドリア膜 を横切ってＬ−アスコルビン酸を輸送できる微生物が特に好ましい。

エタノール含有標準発酵培地（ＳＭ−１）および特別のグリシン含有培地（グリ シン培地）（各培地は０．５重量％のＬ−ガラクトノ−ガンマラクトンもまた含 有する）で増殖させるとき、Ｌ−アスコルビン酸を生産しかつ蓄積する人工的に 突然変異を起こさせた酵母の特に好ましい例はカンデイダ　ノルベゲンシス　ク ラフト社　ＭＦ−５６（Ｃａｎｄｉｄａ　Ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ　Ｋｒａｆｔ 。

■ｎＣ０ＭＦ−５６）　である。この菌株はメリーランド州ロックビルのアメリ カン・タイプ・カルチャー−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ１ ｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）にＡＴＣＣ２０６８６として寄託され た。その他の改良された突然変異株はカンデイダ　ノルペゲンシス　クラフト社 ＭＦ−７８であり、この菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション にＡＴ　ＣＣ１２０７３２として寄託された。これらの酵母類は一連の突然変異 誘発方法によってカンデイダ　ノルベゲンシスＣＢＣ２１４５から誘導、単離さ れた突然変異株である。

Ｌニアスコルビン酸過剰生産性菌株ＭＦ−５６（ＡＴＣＣ２０６８６）の系図、 ならびに標準発酵培地およびグリシン発酵培地でのＬ−アスコルビン酸の収量を 次の表に示す。

表１ カンデイダノルベゲンシスからのＬ−アスコルビン酸過剰生産性菌株の系図 生産されたＬ　−’アスコルビン酸 Ｃ１Ｂ５２１４５（ｇＭｓ）　０．０９　０．３０ＭＦ−２７（ｕｖ）　０．０ １５　０．６０Ｍ　Ｆ　−３４（ｕｖ、ｔＡＦ）　０．０２０　０．７２ＭＦ　 ３９（Ｕｖ）　’　０．３０　０．７５ＭＦ　４２　（ＮＴＣ）　０．３０　０ ．６９ＭＦ−５４（ＮＡ）　０．３３　０．７５ＭＦ　５５（Ｎ工＋２）　０． ３４　０．８０Ｍ１ｌ”−５６、，０，３４１，０７ 発酵はエタノール１５％（重量／容量）およびＬ−ガラクトノ−ガンマラクトン ０．５％を含有する発酵培地を入れた耐化学光線（７）　５００　ｍｌエルレン マイヤーフラスコ内で３０℃において４８時間実施した（４０ＯＲＰＭ）。先代 の菌株から後代の菌株をつくるのに用いた突然変異誘発薬剤または選択薬剤を次 の略号：ｕｖ＝紫外線；ＥＭＳ−メタンスルホン酸エチル；　ＮＴＧ：Ｎ−メチ ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン；ＮＡ−亜硝酸；　Ｃ１ＡＦ−カフ ェイン；　Ｎｉ＋２＝　Ｌ−ガラクトン酸ニッケル；に従ってカッコ内に示す。

Ｌ−アスコルビン酸過剰生産性突然変異株のスクリーニング方法は、大多数の酵 母細胞に対して突然変異誘発処理を施し、次にアスコルビン酸の生産レベルに基 づいて酵母コロニーを選択することにより行われる。アスコルビン酸の生産レベ ルは、酸生産に感受性の培養培地で突然変異処理酵母の単離細胞を培養すること により監視できる。例えば、炭酸カルシウム粉末のような酸感受性物質を用いて 培養培地を不透明にする。増殖している酵母コロニーが酸を生産すると炭酸カル シウムが溶けることによりそのコロニーをとり囲む区域が透明になる。その透明 区域の直径は酵母コロニーの高められた酸生産の関数として増大する。

Ｃ，ノルベゲンシスＭＦ　３９と命名した表Ｉの系図の培養物の１つに関して、 その突然変異誘発処理およびスクリーニングのだめのデータを次の表■に示す。

表■に記載の実験において、優れた生産性の変異株はそれらの酸単位値（ＡＵ） を基準にしてスクリーニングした。これに関して、突然変異誘発処理後に親株お よび生存株を酸指示培地に装置し、３０℃で９６時間インキュベートしてそれら のＡＵ値を測定した。この１記の酸指示培地は寒天、エタノール１．５％（重量 ／容量）、Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトン０．５％、グルタミン酸モノナトリ ウム塩０２％、および不透明化剤としてのＣａＣ１０３０，３係を含有する５Ｍ −１培地であった。ＡＵ値とは透明区域の直径（ｇ）／コロニー区域の直径を意 味する。表Ｕ７　では、その第１欄に０．１５，３０，４５．６０および７０秒 の突然変異誘発ＵＶ照射時間を示し、その下のカッコ内にその照射時間での全生 存培養物のパーセントを示す。各照射時間に関して、酸単位値の５つの異なる区 域寸法のそれぞれに対する生存コロニーの数およびそのパーセントを表Ｕのそれ ぞれの欄に示す。

生産性の評価については表１に関して述べたような振とうフラスコ試験を用いる 。最高の酸単位値を有する突然変異株の中からＭＦ−４２株が選ばれた。

すでに示したように、本発明によればＬ−アスコルビン酸生産性菌株の突然変異 株ならびにその菌株の系図的誘導株が提供されかつ利用される。これに関して、 ＭＦ−５５株（表■参照）のその後の突然変異は、次の表に示すように、Ｌ−ア スコルビン酸に関してさらに一層過剰生産性の突然変異株を提供すべく行われる 。

表■ ＭＦ−５６（ＡＴＣＣ２０６８６）からのＬ−アスコルビン酸先代菌株から後代 菌株をつくるのに用いた突然変異誘発薬剤または選択薬剤をカッコ内に示す。突 然変異処理または選択処理は次のように表わされ、４：ＩＣＭＳ−メタンスルホ ン酸エチル；ＵＶ＝’ｌＲ外線；　ＮＴＣ，−ニトロソグアニジン；Ｎｉ＋２− ニッケル塩錯体；Ｃｅ１３７＝セシウム１３７ガンマ線；　ＥｔＢｒ−臭化エチ ジウム；　Ｎａ−亜硝酸；　Ｖｎ−１−２−メタバナジウム酸アンモニウム。表 ■に記載のＬ−アスコルビン酸生産量は表１に関して先に述べたような振と５フ ラスコ発酵によって得られる。

Ｃ，ノルベゲンシスクラフト社ＭＦ−５５変異株（ＡＴＣＣ２０６８６）、Ｃ， ノルベゲンシスクラフト社ＭＦ−７８変異株（ＡＴＣＣ２０７３２）、およびＣ ，ノルペゲンシスＣ１ＢＳ２１４５親株の形態学的、生理学的ならびに培養上の 特性は、ＩＩ酵母、分類学的研究（Ｔｎｅ　Ｙｅａｓｔｓ、　ａ　ｔａｘｏｎｏ ｍｉｃ　５ｔｕｄｙ　）　”　Ｃジェイ、ロダー（Ｊ　、Ｌｏｄｄｅｒ　）　編 集、１９７０年、北オランダ発行所、アムステルタ弘〕および１１酵母の新解説 書（Ａ　Ｎｅｗ　Ｋｅｙｔｏ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔｓ　）　”　［ジェイ、エイ 、バーネット（Ｊ　、Ａ　、Ｂａｒｒ＋ｅｔｔ）およびアール、ジェイ、パーク バースト（ａ、Ｊ、ＰａｒｋｈｕｒＳｔ　）編集、１９７４年、化オランダ発行 所、アムステルダム〕に示される酵母に関する記述と一致する。形態学的試験お よび同定試験を表■に示す。

２５℃において麦芽エキス上で増殖させる場合、細胞は（２〜８）ｘ（５〜１３ ）ミクロンの円筒形ないし卵形である。コロニーはクリーム色をしており、光沢 があり、軟らかく平坦である。ホルウエル（ＦＯＩＷ６１１Ｓ　）のアセテート 寒天培地上では子嚢胞子を作らない。

表■ 炭素の同化 化合物： シュークロース　−　エリトリトール　−マルトース　−　リビトール　− セロビオース　＋　ガラクチノール　−可溶性澱粉　−コハク酸　十 り−キジロス＋潜在または−　クエン酸　十し−アラビノース　−　イノシトー ル　オＤ−アラビノース　−　グルコノ−デルタラクトン　−Ｄ−リボース　− ２−ケト−グルコネート　−Ｌ−ラムノース　−５−ケトークルコネ−）　−− Ｄ−グルコサミン　＋ ＫＮＯ３の同化：陰性 添加ビタミン類なしての増殖：陰性；チアミン、ビオチンおよびピリドキシンを 必要とする 増殖のための最高温度：４１〜４５°Ｃ本　場合によりわずかに同化する 本発明の他の特徴は、エタノールからのグルコース生成の代謝過程を抑制しかつ Ｄ−エリトロアスコルビン酸の形成を最小限に抑える水性発酵培地ならびにその 発酵条件を提供することである。特に好適な水性発酵培地はＬ−アスコルビン酸 の回収が簡単でありかつＬ−アスコルビン酸の微生物学的製造を高めるものであ る。適当な水性発酵培地を提供することは本発明方法にとってかなり重要であり 、そして望ましい発酵培地の選択Ｘよび提供は発酵で使用する特定の微生物の機 能にも一部関係する。また適当な発酵培地の提供は以後に詳しく述べるイオン交 換樹脂分離方法を含む分離技術による一層効果的なＬ−アスコルビン酸の回収方 法をも提供する。

発酵培地においてエタノールは炭素源として利用され、その初期濃度は使用する 特定の菌株に応じて約０．０１〜２．０チ重量（Ｐ）／容量（ｍｌ）（以後Ｗ／ Ｖと記す）の範囲が好ましい。エタノールが生物転化中に消費されると、それは 酵母が耐えられる濃度でありかつ増殖またはＬ−アスコルビン酸の生産を阻害し ない最適濃度（約００１〜２．０　％　ｗ／ｖ　）へと断続的に補足される。

この種の方法のいろいろな観点によれば、生物転化用の水性培地はエタノール、 グリセロールおよびこれらの混合物よりなる群から選ばれる４個より少ない炭素 原子をもつ炭素発酵エネルギー源と、Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトン、Ｌ−ガ ラクトン酸およびこれらの混合物よりなる群から選ばれるＬ−ガラクトン酸系基 質とを含むものが用意される。一般に、その発酵培地は選ばれた微生物の増殖に とって必要な栄養素をさらに含み、また培地のｐＨは約２．５〜６，５の範囲で あるのが好ましい。一般に、水性発酵培地には、発酵培地の全重量を基準にして 、少なくとも約０．０１重量世襲好ましくは約０．１〜２．０重世襲の炭素源が 加えられるだろう。炭素源は発酵中に消費され、そして発酵期間中に定期的にま たは連続的に添加される。同様に、発酵培地の全重量を基準にして少な（とも約 ０１重世襲の発酵基質がその培地に加えられるのが望ましい。酵母による発酵の ためには、一般に発酵培地は窒素源、種々の有機栄養素および種々の無機物質も 含むだろう。

窒素源（一般に水性発酵培地の全重量を基準にして約０．１〜０．５重世襲の量 で用いられる）は、それを最大利用するそれぞれの菌株の能力に応じて、硫酸ア ンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素ま たは水酸化アンモニウムの形のアンモニウムイオンなど、およびこれらの混合物 からなる代謝可能な窒素化合物群から選ばれる。培養培地または発酵培地を調合 するにはさらに様々な量のアミノ酸（例えばグルタミン酸モノナトリウム塩、グ ルタミン、アスパラギン酸など）、プリン類（アデニン、チミン）、トウモロコ シ浸出液、酵母エキス、蛋白質加水分解物のような有機栄養素；　Ｃａ、Ｍｇ、 Ｎａ、に、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｇｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｚｎの硫酸塩または塩酸塩の ような無機塩；およびビタミン類（例えば水溶性のビタミンＢ類）が添加される 。この種の作用を効果的に行う培地の１つに先に述べた５Ｍ−１エタノール培地 がある。この培地の組成特性は次の通りである。

８Ｍ−１培地 量 ７ｔ Ａ、炭素−エタノール（重量／容量）　１５．０Ｂ、窒素−尿素　２．０ Ｃ１補助成分−トウモロコシ浸出ｉ　５０Ｄ、無機塩 ＭｇＳＯ４，７Ｈ２００，５ Ｍａｉｌ　Ｏ，Ｉ ＫＯＩ　Ｏ，Ｉ Ｈ３ＢＯ３０，０００５ ＦｅＣｌ２，６Ｈ２００，０００２ Ｍｎ５Ｏ４Ｈ２０’　０．０００４ Ｚｕ３ｏ４，５Ｈ２００，０００４ ＣＵＳＯ４，５Ｈ２００，０００４ ＫＩ　Ｏｌｏｏｏｌ （ＮＨ４）６ＭＯ７０□４．４Ｈ２００，０００２Ｅ、ビタミン−チアミンＨＯ Ｉ　Ｏ，００４ビオチン　０．００００２ Ｆ、生物転化化合物−Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトン　５．０ＪｐＨ４，Ｑに 調節 選ばれた酵母変異株を適当な培養条件下にこの培地で増殖させると、本質的にＬ −アスコルビン酸のみがＬ−ガラクトノ−ガンマラクトンの生物転化生成物とし て培地中に生産される。

この培地の修飾培地またはその他の培地（以後に詳しく述べる）もより一層有利 であることが見出されている。培養条件は一般に約２０〜３７℃の温度範囲、好 ましくは約３０℃である。生物転化は約６．５〜２．５のｐＨ範囲、好ましくは 約４０のｐＨで行うのが望ましい。最適培養条件は使用するそれぞれの酵母株に よって決まるだろう。発酵方法は１〜７日間を要し、好気的条件下に行われる。

Ｌ−アスコルビン酸を生産する生物転化方法において高密度の酵母細胞バイオマ ス（生物転化培地１を当たり２５〜２４０Ｊの生細胞）を使用する場合、酸素欠 乏条件の発生を防ぐためにその通気方法に対して純粋酸素または酸素に富む雰囲 気を補足する必要があり、またこうすることが収量を高めるために望ましいかも 知れない。水性培養培地は少なくとも約２．５ｐｐｍの酸素を保つようにするの がよく、好適には約３〜５１）Ｉ）ｍの範囲の所定のレベル以下に酸素含有量を 低下させない方がよい。

前記の５Ｍ−１培地のような標準培養培地は本発明によるし一ガラクトノーガン マラクトン基質からのＬ−アスコルビン酸の製造において有利に利用されうるが 、全ての増殖または発酵は、培地の全重量を基準にして少なくとも約０．５重量 ％（好ましくは約０．６〜０．８重量φ）のグリシンを含む培地を用いて行うの が特に好適である。培地中の約０，７重世襲のグリ′シンは収量増加という点で とりわけ効果的であることがわかった。これに関して、この種の高グリシン培地 はＬ−アスコルビン酸の収量生産性を約３倍またはそれ以上高めるらしいことが わかった。

本明細書に記載の発酵において特に有用であることが立証されかつ本明細書で” グリシ／培地１１として認められるグリシン発酵培地の成分は次の通りである。

エタノール　２０．０ グリシン　７０ ＣｉＳＬ　Ｗ、／Ｖ　５．０ グルタミン酸モノナトリウム塩　２．０無機混合物　２．０ｍｌ 上記無機混合物は次の成分からなる： ＥＤＴＡ　（２Ｎａ）　５．０　ｇ−／１ｚｎＳＯ４，７Ｈ２００，２２〃 ０ａＣ１□、２Ｈ２００，７３５ｔｔ ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ０，６７２５／／ ＦｅＳＯ４，７Ｈ２００，９１５ｐ （ＮＨ４）６Ｍｏ、０２４，４Ｈ２００，１０〃ＣｕＳＯ４，５Ｈ２００，２５ ｔｔ ＣｏＣ１゜−６Ｈ２００，２９３ｐ 高グリシン培地は高グリシン含量のゼラチンのような蛋白質を加水分解し、その 加水分解生産物をアスコルビン酸過剰生産性微生物用の増殖培地の発酵に直接利 用することにより商業規模での操作に対して提供される。

さらに詳しく述べると、Ｌ−ガラクトン酸系基質はチーズ製造または酪農の際の 副産物であるラクトースを加水分解してグルコースとＤ−ガラクトースとなし、 次にＤ−ガラクトースを酸化してＤ−ガラクツロン酸をつくることにより前記ラ クトースから製造するのが望ましい。

Ｄ−ガラクツロン酸はこの他に柑橘類のペクチンなどのペクチン質今加水分解（ 例えば酵素による加水分解）しても得られる。

このＤ−ガラクツロン酸は還元してＬ−ガラクトースとなし、これを脱水してＬ −ガラクトノ−ガンマラクトンを製造する。

Ｌ−ガラクトン酸の各種誘導体（特に低級アルキルエステルを含む）はＬ−ガラ クトン酸の慣用エステル化反応によって製特に好適な生物転化方法では、細胞バ イオマスを作るための過剰生産性微生物の増殖を、第１段階の発酵として、Ｌ− ガラクトン酸系基質を含む適当な増殖培地中で行い、こうしてその後の生物転化 方法で利用するための細胞量を得る。望ましくは、この増殖培地は先に述べたよ うに少なくとも約０．０２％Ｗ／Ｖ（ｇ−／１００ｍｌ　）の高グリシン含量を 有するだろう。第１段階の発酵はＬ−アスコルビン酸を直接生産しないので、こ の増殖用発酵培地はエタノールを含む必要がなく、容易に利用し５る普通の炭素 源（例えばグルコース）を用いることができる。第１段階の増殖発酵系（好適に は細胞増殖を最大限とすべく処方される）からの細胞バイオマスを回収し、これ を使用して高細胞密度の生産転化用培地（この培地は細胞増殖を最大とするよう に処方される必要がない）を用意する。望ましくは、この高細重量）のアスコル ビン酸過剰生産性微生物を含むだろう。この種の高細胞密度系にエタノール炭素 源とＬ−ガラクトン酸系基質とを加えると、Ｌ−アスコルビン酸を高濃度で生産 する生物転化反応が生ずる。

生物転化を行う場合に、好気的条件は微生物が基質を酸化して、その微生物学的 酸化によってＬ−アスコルビン酸のみが実質的に生産される条件下に維持される 。その後、以後に詳しく述べる適当な方法で好気的発酵により生じたＬ−アスコ ルビン酸を回収する。

生物転化の間は好気的条件を保つことが必要であり、これに関して、水性発酵培 地は発酵中に少なくとも２０％（例えば２０〜３０チ）の酸素飽和度（例えば２ 〜３ｐｐｍｉ酸素）を保つようにするのが望ましい。好気的条件はば素に富む気 体を発酵培地に導入し、エアーリフト反応器（ａｉｒ　１ｉｆｔ　ｒｅａｃｔｏ ｒｓ：発酵培地中に酸素を効果的に分散する）のような発酵装置を利用すること によって維持される。

すでに述べたように、生物転化条件下に主な炭素エネルギー源としてエタノール を利用すると、Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトンは実質的に全部Ｌ−アスコルビ ン酸へ転化される。例えば、０．５重量％のＬ−ガラクトノ−ガンマラクトンを 含む５Ｍ−１培地中でエネルギー源としてヘキソース糖（６−炭素エネルギー源 ）を用いるよりもむしろエタノール（２−炭素エネルギー源）を用いてカンディ ダ属酵母を増殖させるとき、実質的にＬ−アスコルビン酸のみが形成されて他の アスコルビン酸類似体（例えばＤ−工ＩＪ　）ロアスコルビン酸）の生産は最小 限に抑えられる。このことはＬ−アスコルビン酸を産業的興味の水準で生産する 実用的方法の実現において重要な要素となる。

生物転化方法において、Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトンは細胞内の１種または 少数の酵素によって構造的に同族の生成物へと転化される。この方法は増殖しつ つある細胞、休止している栄養細胞、乾燥細胞、または各種の有機ポリマー（例 えばに−カラジーナン、アルギン酸ナトリウム、ポリアクリルアミド。

ゼラチン、寒天またはその他のマクロ孔質樹脂）あるいは無機化合物（例えば菫 青石およびシリカ）に固定された細胞を用いて行われる。活性酵素を含む細胞の ミトコンドリアを生物転化を行わせるべく単離して固定化することもできる。

Ｌ−アスコルビン酸の生物転化方法は通常の好気的発酵方法、例えばバッチ法、 連続法、半連続法で操作される。また、高密度のバイオマスを得るのに使用でき る培養方法、例えば透析培養法、細胞分離器を備えた半バッチ法およびフェト− バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　）法も夏用でき、この場合は空気への酸素の補足 が必要となる。

本発明について一般的に述べてきたので、本発明９種々の面を今や第１図のブロ ックダイヤグラムに示す方法の具体例に関してより詳しく説明するであろう。

第１図はホエー、ホエー透過物またはミルク透過物のような酪農副産物のラクト ース溶液基質１０からＬ−アスコルビン酸を製造する方法の１つの実施態様を図 式的に示す。酪農副産物のラクトース溶液は一般に約４．５〜５．０重量％のラ クトースを含み、これを加水分解するとグルコース−ガラクトース溶液１２の形 でその構成成分糖のグルコースとガラクトースとを生ずる。この加水分解はに、 フラギリス（Ｋ、ｆｒａｇｉｌｉｓ　）またはに、ラクチス（Ｋ、１ａｃｔｉｓ 　）　由来の酵母ラクターゼ酵素もしくはＡ％ガー（Ａ　、　ｎｉｇｅｒ　）ま たはＡ、オリゼ（Ａ、０ｒｙＺａ８　）由来のカビ酵素を用いて慣用方法で行わ れる。酵素は遊離のもの、封じ込められたものまたは固定されたもののどれを使 用してもよい。

グルコース−ガラクトース溶液１２またはラクトース溶液１０は、アルコール発 酵を行う際に必要または所望により慣用方法で蛋白質または無機物質を除去する ことができる。加水分解処理工程によって得られたグルコース−ガラクトース溶 液を濃縮して、例えば溶液の全重量を基準にして約１５〜３０重量％の範囲の固 形分を含む溶液を得てもよい。一般に、ラクトース以外の固形分含量は全固形分 の約０５〜１．０重量％の範囲であり、従ってこの溶液のグルコースおよびガラ クトースの全含有量は溶液の全重量を基準にして約２００〜約２２５重量係の範 囲であるのが望ましい。

通常の酵母発酵方法に従ってトウモロコシ浸出液または酵母エキスのような適当 な栄養素を補足した後、グルコースからのエタノール発酵用の適当な酵母菌株、 例えばビール酵母（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）の選ばれた菌株を使用して嫌気的条件下にグルコース −ガラクトース溶液１２を発酵させ、発酵培地のガラクトース成分を実質的に消 費することなくグルコースをエタノールと二酸化炭素へと転化する。この方法で エタノール−ガラクトース溶液１４が得られる。

準で少なくとも約５％のエタノール、および発酵物１４の容量および重量基準で 少なくとも約１０重量％のＤ−ガラクトースをそれぞれ含む。発酵物１４を蒸留 してアルコール１６を除き、その後所望によりアルコール１６を精留して１９０ プルーフのエチルアルコールを得てもよい。このアルコール１６は発酵において 使用する選ばれた微生物のための炭素エネルギー源として役立てるために、Ｌ− アスコルビン酸発酵方法で利用することができる。

続いて、エタノールの除去後に回収されたＤ−ガラクトース含有蒸留残液をさら に適当な方法で濃縮して、溶液の全重量基準で約２０〜７５重世襲の範囲の全固 形分含量を有するガラクトース溶液を得る。望ましくは、全溶液重量基準で約１ ６〜６２重世襲のガラクトースを含む。−このガラクトース溶液を結晶化すると 、精製されたＤ−ガラクトース１８が得られる。所望により、発酵培地への無機 栄養素の補給として、Ｌ−アスコルビン酸発酵において無機塩２０を利用し得る 。また、イオン排除によってガラクトースを発酵成分の残部から分離することも できる。この種のガラクトースは直接反応工程１８の原料としてＤ−ガラクトー ス１８は接触酸化によってＤ−ガラクツロン酸２２へ転化される。Ｄ−糖酸のた めのこの酸化工程を行う方法は当技術分野でふく知られており、Ｔフイヒシュタ インの米国特許第２２６５１２１号に記載されている。保護Ｄ−ガラクトース（ アセトン）をＤ−ガラクツロン酸生成物へ転化するには各種の触媒、例えば白金 またはパラジウム触媒を吏用する。次に、非保護Ｄ−ガラクツロン酸を適当な水 素添加触媒（例えばラネーニッケルまたはパラジウム）および水素ガスでの還元 などの適切な還元工程で還元してＬ−ガラクトン酸２４を製造する。この化学的 還元方法も当技術分野で知られており、例えばエイチ、イスベル（Ｈ，ｌ５ｂｅ ｌｌ　）のジエイ、レス、ナト、フル。

ストズ　（Ｊ、ＲｅＳ、Ｎａｔ、Ｂｕ（Ｓｔｄ８．）　、　３３　、４５−６０ （１９４４）に記載されている。蒸留による水の除去および脱塩り一糖酸の縮合 はＬ−ガラクトノ−ガンマラクトン２６を生成させ、これはＬ−アスコルビン酸 を製造するための本発明の微生物学的転化方法において利用される。Ｌ−ガラク トン酸エステルおよびＬ−ガラクトン酸のような他のガラクトース誘導体も利用 できるが、利用効率が劣るためにＬ−アスコルビン酸の収量は減少する。５−ケ トーＬ−ガラクトン酸のようなケト誘導体は本明細書に記載の好適な酵母菌株に よって利用されない。Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトン２６．エタノール１６お よび適当な育生産性菌株用の発酵培地２８を処方する。

Ｌ−アスコルビン酸の発酵方法は慣用の攪拌通気発酵器、例えば３０リツトルの ニュー・プルンスウイツク・サイエンティフィック発酵器（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓ ｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）クロコンピユータ−へ 連結した物理的および化学的センサーを使用してエタノール、圧力、流入量、排 気ガス、二酸化炭素。

排気酸素ガス、ｐＨおよび溶存酸素を測定することにより行われる。

培養後、発酵によって生産されたＬ−アスコルビン酸はいろいろな方法、例えば イオン交換樹脂、吸着またはイオン遅延樹脂、活性炭、濃縮−結晶化などを用い ることにより澄明な発酵ブロスから回収できる。

発酵の経過は適当な分析方法を用いて監視する。Ｌ−アスコルビン酸およびその 類似体の定量的検定は、２，６．ジクロルインドフェノールでの酸化還元−滴定 〔エン。ジー、バートン（Ｎ。

Ｇ、Ｂｕｒｔｏｎ　）らのジエイ、アソス、パブ、アナリスツ（Ｊ。

Ａｓ５ｏｃ、Ｐｕｂ、Ａｎａｌｙｓｔｓ　）　、　１７　、１０５（１９７９） 　を参照〕２よび高性能液体クロマトグラフィー〔ジエイ、クロム、（Ｊ。

Ｃｈｒｏｍ、）、１９６，１６３　（１９８０）　を参照〕ならびに電気酸化還 元法〔エル、エイ、パチア（Ｌ　、ｈ　、ＰａＣｈｉＩａ）のアナル、ケム　（ Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、）　、　４８　、３６４　（１９７６）を参照〕を用いて 行われる。アスコルビン酸オキシダーゼ〔ベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）社製〕の使用をともなう酵素的方法も行う ことができる。

発酵ブロス中のＬ−アスコルビン酸生産量が最大になったとき発酵を終了する。

Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトンの未転化部分は再利用する。

本発明の種々の面を次の実施例に関してさらに詳しく説明するが、これらの実施 例は本発明の範囲を限定するものではない。

実施例Ｉ ３０リツトルのニュー・プルンスウイツク攪拌発酵器を用いて、Ｌ−アスコルビ ン酸製造のための攪拌バッチ発酵を行った。

ｌ・ウモロコシ浸出液０．２５％、塩化アンモニウム０．１係、グリシン０．７ ％、硫酸マグネシウム・７Ｈ２００，０！５％　、グルタミン酸モノナトリウム 塩０２％、エタノール１５％（Ｗ／Ｖ　）および微量無機質混合物０．３０ＴＬ ｌから成るグリシン培地１５ｔをｐＨ４，２に調節して、１２１℃で３０分間滅 菌した。（なおここに示した値は特に指示がない限り重世襲を意味する。）冷却 後、低温滅菌したＬ−ガラクトノ−ガンマラクトン０．５％を上記の無菌発酵ブ ロスに加えた。発酵器には３０°Ｃにおいて回転振とう器（２００ＲＰＭ）上の ２ｔエルレンマイヤーフラスコ内で増殖させたＧ、ノルベゲンシス　Ｋｃｃ　Ｍ Ｆ４２（表１）の２４時間５Ｍ−１グロス培養物５００ｍ１を接種した。

その発酵器は３０°Ｃ，２５０ＰＰＭおよび０２５容量／容量／分の通気速度で 運転し、最初ｐＨを４．０に保った。２４時間後、上清ブロスは０．０８４　Ｐ ／ｌのＬ−アスコルビン酸を含んでいた。

追加の２７．０９は酵母細胞中に存在していた。４８時間後、澄明なブロスは０ ．４３　ｆｔ／ｌのＬ−アスコルビン酸を含み、細胞は２９．６η／を含んでい た。慣用のイオン交換樹脂による吸着および溶離を行って生産物を回収し、続い そ脱色、蒸発および結晶化を行った。

カンデイダ属酵母およびその変異株を用いるＬ−アスコルビン酸の生産に対して 、高密度バイオマスを使用して生産物を回収する方法強化系が開発された。この 方法ではＫＣｉＣＭＦ−４２酵母細胞を攪拌発酵器を用いて５Ｍ−１培地（Ｅｔ ＯＨ１５％Ｗ／Ｖ、Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトン０．１％）で１８時間培養 し、そして無閑条注下に遠心分離した。遠心分離で得られた細胞ペーストはその 後無菌の新しい５Ｍ−１培地（エタノール１．５％、グルタミン酸モノナトリウ ム塩０．２％、Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトン０．５％；ｐＨ４，０）に３７ ．５ｆ／ｌの生細胞重量で雑菌の混入を避けながら再度接種した。そして飽和の ６５チの溶存酸素レベルで酸素を通した。Ｌ−アスコルビン酸の生産は２４時間 で０．４７０　Ｐ／ｌに増え、４５時間では０．５８０　ｆ／ｌに増大した。発 酵中に培地のｐＨは２６に下がった。

冷却、澄明化した発酵ブロス４ｔはロームハース（Ｒｏｈｍ　＆Ｈａａｓ　）社 で製造したイオン交換樹脂、Ｉ　Ｒ１２０（Ｈ＋）樹脂の５００ｍ１カラムに通 した。流出液と洗浄水を集め、１００ｍ１の容量になるまで真空下３７°Ｃで蒸 発させた。冷エタノール１００ｍ１を加えて、析出物（蛋白質）を５℃で遠心分 離（５０００ＰＰＭ）することにより除去した。生産物は再び２５ｍ１の容量に なるまで蒸発させ、そして結晶化が完了するまで５日間０°Ｇで保存した。沢過 した結晶はアセトンで３回洗い、温アルコールに溶解して再結晶した。最初の収 穫では粗製Ｌ−アスコルビン酸結晶（ＨＰＬＣ）が約１．４１回収された。

この他に、回収および精製は陰イオン遅延樹脂（ダウエックス１ｍ）＋アセテー ト形へのブロスからのＬ−アスコルビン酸の吸着および０．１　Ｍ　Ｈ２ＳＯ４ での溶離によっても行うことができる。

実施例■ カンディグ属酵母およびその変異株の休止細胞を使用して緩衝塩溶液中でエタノ ールおよびＬ−ガラクトノ−ガンマラクトンからＬ−アスコルビン酸を生産する 方法が開発された。酵母はエタノールとＬ−糖ラクトンの両方を必要とする。得 られた細胞は遊離状態で、または種々のポリマーゲルに固定して、もしくはポリ マー樹脂や無機化合物へ定着させて使用する。

この実施例では、５ｕ−１Ｎ地で１８時間培養した酵母細胞カンデイダノルベゲ ンシス　ＣＢＳ＋１９１１を遠心分離にかげ、燐酸塩緩衝液（ｐＨ４，５）で洗 ℃・、そしてエタノール０．８φおよびＬ−ガラクトノ−ガンマラクトン０．５ ％を含む０．０３％燐酸塩緩衝液（ｐＨ４，５）　５０ｒｎｌ当たり生細胞重量 ３．０９−の濃度で再懸濁した。５ＱＱｍ６の耐化学光線のホウケイ酸ガラス製 エルレンマイヤーフラスコ中に混合物５０ｍ１を入れて回転振とう器に載せ、３ ００ＲＰＭ　で３０℃において通気した。エタノールの利用状態とＬ−アスコル ビン酸の生産状態を追跡するためにブロス試料を定期的に採取した。アルコール 濃度を約０．３チＷ／Ｖに保つべくエタノールの添加を定期的に行った。９６時 ゛　間抜の酵母によるＬ−アスコルビン酸の蓄積結果を表■に示す。

使用した微生物　蓄積したＬ−アスコルビン酸■ ガラクトース誘導体、好ましくはＬ−ガラクトノ−ガンマラクトンをＬ−アスコ ルビン酸へ転化できる微生物を選択するために、スクリーニングプログラムを開 始した。エンジオール化合物を生産しうると報告された種々の酵母からカンデイ ダ属の微生物が選ばれた。

多数のカンデイダ種は各地の培養物コレクション、例えばメリーランド州ロック ビルのアメリカン・タイプ書カルチャー・コレクション、デルフト（Ｄｅｌｆｔ 　）のセントラルヒュロー・フォール・シメルカルチャー（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｂ ｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ　）　、パリのパスツ ール研究所（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ）およびイリノイ州ベオリア のノザーン・リージョン拳リサーチ研究所（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、）　から容易に入手でき、スクリーニング実験の前 に培養物を人手して精製した。

これらの培養物はＧ−寒天斜面培地またはその他の栄養培地で培養した。

Ｇ−寒天で２４時間増殖させた酵母の斜面培地の食塩水＠濁液を接種物として用 いた。５００ｄの耐化学光線のエルレンマイヤーフラスコ内の無菌５Ｍ−１培地 （エタノール１５φｗ／Ｖ尿素０．２φ）５０ｍｌに細胞懸濁液０．５ｍｌを雑 菌が混入しないようにして加えた。Ｌ−ガラクトノ−ガンマラクトンを低温滅菌 して冷却フラスコに添加した。このフラスコを回転振とり器上に置き、２００ｒ ｐｍ　、３０℃で４８時間通気した。澄明化したブロスはＬ−アスコルビン酸の 生産について試験した。遠心分離にかけて洗浄した細胞ペーストを１０　％　） 　ＩＪジクロル酸３．０罰で処理し、２，６．ジクロルインドフェノールで滴定 することにより細胞内に存在する還元型化合物の量を測定した。Ｌ　−次のカン デイダ種において観察され、これを表■に示す。

に 実施例Ｖ エアーリフト発酵器は通常の攪拌−駆動軸発酵器に比べていくつかの明らかな利 点を有している。中でも、酸素の改善された大量輸送、電力要求量の低減、およ び機械的に攪拌される発酵器に存在する高度の剪断力と比べたときのより穏やか な微生物培養環境が挙げられる。これらの特徴ゆえに、エアーリフト発酵器は工 業規模で使用するのに適する。以下の実施例はカンデイダ属酵母を使ってビタミ ンＣを製造するためのエアーリフト発酵器の使用について示す。

４、ＯＬの実験室規模のエアーリフト発酵器に、エタノール２．７５％ｗ／ｖ＋ グリシン０７係およびＬ−ガラクトノ−ガンマラクトン０５％を含有する無菌の グリシン培地（ｐＨ４，１）を装填した。この発酵器に０−寒天（２，５％）フ ラスコからの洗浄したＣ、ノルベゲンシス　ＫＣｉＣＭＦ−４２細胞の２４時間 懸濁液を接塊した。０時間での生存細胞数は５．５Ｘ１０６個であった。発酵器 の通気は１．９を空気゛／１を発酵培地７分〔容量／容量／分〕に調節し、こう して５．０ｍ’のサイクル速度を得た。３０°Ｃで２４時間後、生存細胞数は１ ．１Ｘ１０８個に増え、４８時間で３．０Ｘ１０８個に、そして７２時間では２ ．８Ｘ１０８個であった。培養後９１時間で生存細胞数は１．７Ｘ１０８個に同 様のエアーリフト発酵器を用いる実験で、高細胞密度発酵を行った。この場合に はＣ，ノルベゲンシスＫＣＣＭＦ−４２の２４時間生細胞ペーストを４．０ｔの 発酵塔内の５Ｍ−１培地（グリシン０．７％およびＬ−ガラクトノ−ガンマラク トン０．７チ含有）に１００　ｆｌ−／ｌの量で分散した。酵母の増殖または生 産性を限定せず阻害しない量（０，１〜０．３％）でエタノールを連続的に供給 し、１：１の酸素−空気比で発酵塔へ酸素富化通気を行った。全混合ガス容量は １．７容量／容量／分でめった。

これらの条件下において、発酵塔の上部区域は３０％の溶存酸素飽和レベルを維 持した。発酵後２０時間でＬ−アスコルビン酸は１．４４５’／４生産された。

実施例■ この実施例は高細胞密度の生物転化条件を用いるＬ−アスコルビン酸の製造につ いて示す。カンデイダノルペゲンシスＭＦ−７８クラフト社の変異株（ＡＴＣ： Ｃｉ　２０７３２　、表Ｉおよび■に示す系図を有する）をＧ−寒天斜面培地（ グルコース０．５％、トリブチカーゼ−ペプトン０．２％、酵母エキス０．５％ 。

コース培地（グルコースｘ、５％、）ウモロコシ浸出液０．５％。

グルタミン酸モノナトリウム塩０２％、塩化アンモニウム０１チ、グリシン０． ０２％、脱ラクトースホエー透過物ｏ、　１％。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、Ｌ−ガラクトノ−１，４ラクトン０．０２係 ）２０ｔを接種するのに使用した。この細胞を３０’Ｃ。

２００　ｒｐｍで培養し、０．５を容量／容量／分で２４時間通気した。

この酵母接種物（２０ｔ）は、第１段階の酵母バイオマス発酵を行ってその後の 高細胞密度生物転化で使用する細胞量を得るために、無菌条件下７で無菌５Ｍ− １グルコース培地４９２Ｌを含む７５０ｔのステンレス鋼ケマップ（Ｃｈｅｍａ ｐ　）発酵器へ移した。発酵条件は３０℃、攪拌速度は２０Ｏｒｐｍ、そして通 気速度は０．５を容量／容量／分であった。培地のｐＨは最初４．０に調節し、 その後生長相の間ｐＨ２，６に降下させた。発酵後１７時間で培養ブロスを４℃ まで冷却し、遠心分離によって細胞を回収した。酵母の増殖は乾燥細胞重量、光 学密度（ｏｐ）６６０ｎｍ、および標準平板回数計算用寒天（５ｔａｎｄａｒｄ 　ＰｌａｔｅＣｉｏｕｎｔ　Ａｇａｒ　）　（オキソイド）上の全コロニーの平 板回数により監視した。細胞ペーストの平均収量は１０．８２Ｋｇであった。

エタノールを炭素基質として増殖させた酵母からの細胞ペーストの収量も同じで あった。これらの細胞は第２段階のＬ−アスコルビン酸製造のための生物転化方 法に２いて使用した。

Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンをＬ−アスコルビン酸へ転化する生物転化方 法は、脱ラクトースホエー透過物０．１％Ｗ／Ｖを添加した無菌グリシン（、０ ，、７％　Ｗ／Ｖ　）培地５．ＯＡを含む７．５ｔＯニユ一ブルンスウイツクガ ラス発酵器（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋｇｌａｓｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ　） 　内で実施した。低温滅菌したエタノール１．５チｗ　／　ｖおよびＬ−ガラク トノ−１，４−ラクトン１．５チの補足分を添加した。その後ｐＨ５，２のこの 無菌培地に培地１を当た’）　冷却束Ｒ７Ｊ胞ペースト（Ｃ，ノルベゲンシス　 ＫｃＣｉＭＦ−７８）１５ｏｇ−を雑菌が混入しないようにして加えた。溶存酸 素濃度はニューブルンスウィック膜プローブで監視した酸素補充空気を用いて飽 和の３０チ程度に維持した。転化反応の期間中は攪拌を：３，５０ｒｐｍに設定 し温度を２８°Ｃに保った。生産過程の間にエタノール濃度が０．２　％　ｗ／ ｖへと低下し、以後は０．２〜０．５チのエタノール濃度を保持するように定期 的に補足した。Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン基質の濃度はその基質を４〜 ８時間の間隔で添加することにより１，２〜１．５％の範囲に保持した。

Ｌ−アスコルビン酸の生産はＬＣ−４Ｂ電流測定用プローブと共にアミネツクス （Ａｍ１ｎｅｘ　）　ＨＰｘ−８５樹脂を用いるＨＰＬＣ分析によって連続的に 監視した。また、Ｌ−アスコルビン酸は２．６．シクロルーインドフェノールを 用いる酸化還元色素滴定法によっても頻繁に調べた。

生物転化方法の結果は、最初の２時間の遅滞期後に０３２Ｊ／１／時のＬ−アス コルビン酸生産量が得られ１℃ことを示している。１０時間後にその生産量は０ ．２０　ｆｌ−７１７時（１００時間）において７．３５Ｆ／−／ｌであった。

ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１　ｍ９７ｍｌ添加することによシブロス 中に存在する酵母細胞を溶解すると、最終方証が７．５１Ｆｉ−／Ｌに増大した 。

、実施例■ レッドスターベーカ−（Ｒｅｄ　５ｔａｒ　ｂａｋｅｒ　）　のビール酵母（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　；　この酵母はＬ−アスコ ル゛ビン酸過剰生産性でない）９０７Ｆ（２ポンド）をザーゴロフ（Ｔｚａｇｏ Ｌｏｆｆ　）の方法〔ジエイ、バイオロ、ケム　（ｊＢｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ　、）　＋　２４４　＋　５０２０　（１９６９）を参照〕に従ツーｔ Ｃ−破壊した。

この凍結粉末９００Ｊを０．４Ｍ蔗糖、０．０５Ｍ）リス（ヒドロキシメチル） アミノメタン（トリス−ＨＣｌ　）　ｐＨ８，２および１ミリモルのエチレンジ アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる溶液１．５ｔへ移した。この懸濁液のｐＨを 水酸化ナトリウムで７．５に調節し、その後ブレンダーで４５秒間ホモジナイズ した。ホモジネートを４℃において１５分間２５００Ｘｉｉ’で遠心分離し、細 胞破片を捨てた。上清はシャープレス（５ｈａｒｐｌｅｓ　）遠心分離器を使っ て６２０００ｘ７で遠心分離にかけた。沈澱物（ミトコンドリア）を採取して０ ２５Ｍ蔗糖および０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５を含む溶液２５０　ｍ ｌ中に懸濁（〜、そして凍結した。

２ｍＭＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンおよび５０　ｍＭクエン酸Ｎａ　ｐＨ ６，８を含む検定混合物を全量３ｍｌ用意した。この混合物を振と５浴中３７℃ で３０分までインキュベートした。

５０％ＴＣＡ　０．３ｍｌを加えることにより反応を止めた。析出した蛋白質を 遠心分離で除き、上清は電気化学的検出をともなう高性能液体クロマトグラフィ ーおよび２，６．ジクロルインドフェノール滴定を用いてＬ−アスコルビン酸に ついて検定した。

代表的な検定を第２図に示す。この試料の比活性を計算すると２．５Ｘ１０　’ 　ミクロモル／分／尻９（蛋白質）であった。第３図に示すように最適温度は３ ７℃であり、また第４図に示すように最適ｐＨは６８であると決定された。反応 速度定数ＫｍおよびＶ　ｍａｘは０．１−５０ｍＭの範囲のＬ−ガラクトノ−１ ，４−ラクトン基質濃度を用いて決定した。その反応速度定数Ｋｍは１．’６Ｘ １０−３Ｍ　であり、反応速度定数ＶＢａｙ、は０．３４ミクロモル／分であり と決定された（第４．５および６図を参照）。

無傷のミトコンドリア系についてこれらの反応速度定数を決定した後、酵素活性 をミトコンドリアから分離させることにより酵素をさらに精製した。この酵素を 可溶化させるために超音波処理および各種の洗剤を試験した。

−４の５種の洗剤：すなわち１）ノニルフェノールＰＯＥ−９（ＮＰ−９）、２ ）ポリプツト（Ｐ−４０）、３）オクチルグルコシド、４）（３−（３−コラミ ントプロピル）−ジメチルアンモニオ〕１−プロパンスルホネ−）　（ＣＨＡＰ Ｓ）、およヒ５）（３−（３−コラミントプロピル）−ジメチルアンモニオ〕− ２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）２Ｈ２０（ＣＨＡＰＳＯ）　を試 験した。ＣＨＡＰＳＯが特に効果的であるとわかった。この結果を表■１に要約 する。さらにＣＨＡＰＳＯはミトコンドリアから酵素を選択的に分離させて、こ の段階でＮｉＮ１５ｈｉｋｉ　らの場合よりも１６倍大きい比活性を有する調製 物を与えだアーチ、バイオケム、アンドバイオフィズ　（ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅ ｍ、＆、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　１９１’、　４７ａ（１９７８）を参照〕。各種 の酵母株のオキシダーゼ特性の比較を表■に示す。

表■の各菌株の酵素のための最適温度および最適ｐＨはそれぞれ３７℃およびｐ Ｈ６，８であることがわかった。

酵母ミトコンドリアまたはさらに精製した酵素は、次の実施例に示すように、Ｌ −アスコルビン酸の連続生産用の固定化り一ガラクトノー１，４−ラクトンオキ シダーゼカラムを作る際に用いられる。

実施例■ 実施例■で調製したミトコンドリア懸濁液（蛋白質１．１ｇ−を含む）１０ｍｌ をアルギン酸Ｎａの５チ溶液５０ｍ１と混合した。

この混合物を１８ゲージの針を通して０．２５Ｍ蔗糖、０．１ＭＧａＣ４２およ び１０ｍＭＰ工ＰＥＳ　１）Ｈ６，８からなる溶液１ｔの中に押出して４℃で２ ４時間攪拌した。これにより直径が３Ｈの均質なビーズを得た。

固定化ミトコンドリア酵素を使用する１１バッチ式１１生物転化を説明するため に、蛋白質０．１１Ｐを含むビーズ２１を標準反応四合物３ｍｌ中３７°Ｃで２ ０分間振とうした。検定は上清中にＬ−アスコルビン酸が７７μｆ／ｍｌ　存在 することを示した。

固定化ミトコンドリア酵素を使用する連続生物転化法を説明するために、０９× ３０ｃｒｎのカラムにビーズを充填して３７°Ｃに保持した。２ｍＭＬ−ガラク トノ−１，４−ラクトンおよびｌＱｍＭピペラジン−Ｎ３Ｎ′−ビス〔２−エタ ンスルホン酸〕（ＰＩＰＥＳ）ｐＨ６，８を含む供給流をカラムにポンプ注入し た。

３．２ｍｌ／分の流量で５分後には流出液中のし一アスコルビン酸が５３ρ／ｍ ｌに増加（７た。

実施例Ｘ カンデイダノルベゲンシス　ＣＢＳ　１９１１およびカンデイダウチルス　ＮＲ ＲＬ　Ｙ−９００の２種の酵母株を、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたは Ｄ−ガラクツロン酸メチルエステルの２つの異なる基質のそれぞれを用いる別々 の生物転化実験においてエタノール炭素源でもって利用した。この生物転化実験 は好気的条件下に生物転化用培地５０ｍ１を含む耐化学光線の５００ＴＬｌフラ スコ内で、２００　ｒｐｍ　で運転の振と５器を使ってかきまぜながら３０℃の 温度で４８時間実施した。Ｃ，ノルベゲンシス用の培地はエタノール１．５係お よび基質０．５％を含む前記５Ｍ−１培地であった。Ｃ，ウチルス用の培地はエ タノール１５係および基質０．２％を含む５Ｍ−１培地であった。

結果は次の通りである。

ＣＢ８１９１１　ＣＢ５１９１１　ＮＲＲＬＹ−９００ＮＲＲＬＹ−９００基質 　１＊　２＊＊　１＊　２＊＊ 光学密度　２，０５　２．６０　８．５０　８．５０Ｌ−７スコルビン酸 μ色Δ屁＊＊＊　９２．８　３，５　５０．０　１２．０他の酸化還元 化合物 μＰ／ｍ１１０．１　１７．５　１．８　１．３全アスコルビン酸 μＰ／１００ｍ６　１０，６２５　４７３　１５，９０５　４．３８３＊　Ｌ− ガラクトノ−１，４−ラクトン＊＊　Ｄ−ガラクツロン酸メチルエステル＊＊＊ 　アスコルビン酸は電気化学検出をともなうＨＰＬＣｉ分析で測定した。

本発明により、アスコルビン酸製造のための有用かつ新規な方法、微生物および 培地が提供されたことは先の記述より認められるであろう。本発明の種々の面を 特定の実施態様に関して詳細に述べてきたが、いろいろな変更ならびに改良が本 明細書の記述から明らかＫなるであろうし、これらもまた本発明の精神および範 囲内に含まれかつ次の請求の範囲に包含されるものである。

纂Ｉ；Ｌ回 燵ＰＨ ，０１２３今　５　６　７　８　９　ｔ。

Ｈ 旧 輔 国際調査報告 ｍ１ｍｍｍ１１ａ−＾ｅｐ’＝ＩＩｏｎ’ｏ　ＰＣＴ／ＵＳ８１＋１０１ｇｑ５

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−ガラクトン酸、Ｌ−ガラクトン酸低級アルキルエステル、Ｌ−ガラク トノーガンマラクトンおよびこれらの混合物よりなる群から選択されるＬ−ガラ クトン酸系基質、ならびにエタノール、グリセロールおよびこれらの混合物より なる群から選択される炭素エネルギー源を含む生物転化用水性培地を用意し；前 記発酵培地に、該基質からＬ−アスコルビン酸を過剰生産しかつ該炭素エネルギ ー源を利用できる微生物を加え；そして好気的条件下に前記微生物を培養して該 炭素エネルギー源を消費させかつＬ−アスコルビン酸を蓄積させる；ことからな るＬ−アスコルビン酸の製造方法。
2. （２）炭素エネルギー源がエタノールであり、Ｌ−ガラクトン酸系基質がＬ−ガ ラクトノーガンマラクトンである請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）生物転化用の水性培地が該微生物の増殖に必要な窒素源および適当な無機 物質を含み、さらにＬ−アスコルビン酸の生産を高めるのに十分な量のグリシン を含む請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）生物転化用水性培地が該培地の全重量を基準にして少なくとも約０．５重 量％のグリシンを含み、該培地のｐＨが約２．５〜６．５の範囲である請求の範 囲第３項記載の方法。
5. （５）前記生物転化を少なくとも約２０％の酸素飽和度の好気的条件下で行う請 求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）前記微生物がカンデイダ属酵母であるか、あるいは突然変異原（例えば紫 外線、亜硝酸、ニトロソグアニジン、カフエイン、アクリフラビンもしくはその 他の化学的または輻射線突然変異原）または組換えＤＮＡ技術によつて誘導され る突然変異株である請求の範囲第１項記載の方法。
7. （７）エタノールおよびＬ−ガラクトン酸系基質が酪農副産物のラクトース源ま たは柑橘類のペクチンから誘導される請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）ホエー、ホエー透過物またはミルク透過物をＤ−ガラクトースおよびエタ ノールに転化し、該Ｄ−ガラクトースを酸化してＤ−ガラクツロン酸となし、該 Ｄ−ガラクツロン酸を還元してＬ−ガラクトン酸基質を得る請求の範囲第７項記 載の方法。
9. （９）Ｄ−ガラクツロン酸がペクチンの酵素的加水分解により誘導され、該Ｄ− ガラクツロン酸を還元してＬ−ガラクトン酸基質を得る請求の範囲第７項記載の 方法。
10. （１０）Ｄ−ガラクツロン酸をラネーニツケル、白金またはパラジウム触媒およ び水素で還元してＬ−ガラクトン酸を得る請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）Ｌ−ガラクトン酸を脱水してＬ−ガラクトノーガンマラクトンを形成す る請求の範囲第７項記載の方法。
12. （１２）前記発酵をバツチ法、連続法、半連続法、フエドーバツチ法（ｆｅｄ− ｂａｔｃｈ）、透析法または他の再循環法で行つてＬ−アスコルビン酸を生産す る請求の範囲第１項記載の方法。
13. （１３）前記微生物を適当な支持体を用いて固定するかまたは封じ込める請求の 範囲第１項記載の方法。
14. （１４）前記発酵培地がＬ−アスコルビン酸の生産を最大限に増加させかつその 他のアスコルビン酸類似体の発酵を最小限に抑えるような組合せで主炭素源とし てのエタノール、Ｌ−ガラクトノーガンマラクトンおよび他の有機成分ならびに 無機成分を含む、請求の範囲第１項記載の方法。
15. （１５）イオン遅延型樹脂を用いて発酵ブロスまたは緩衝溶液からＬ−アスコル ビン酸を回収する請求の範囲第１項記載の方法。
16. （１６）Ｌ−アスコルビン酸過剰生産性でありかつ細胞膜およびミトコンドリア 膜を横切つてＬ−アスコルビン酸を輸送することができる微生物。
17. （１７）カンデイダノルベゲンシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ ）ＣＢＳ２１４５の変異株よりなる群から選択される請求の範囲第１６項記載の 微生物。
18. （１８）該微生物がカンデイダノルベゲンシスＭＦ−５６（ＡＴＣＣ２０６８６ ）およびその変異株または誘導株よりなる群から選択される請求の範囲第１７項 記載の微生物。
19. （１９）エタノールおよびＬ−ガラクトノーガンマラクトンを含む生物転化用培 地を用意し；該発酵培地でカンデイダノルベグンシスＭＦ−５６株（ＡＴＣＣ２ ０６８６）、カンデイダノルベゲンシスＭＦ−７８株（ＡＴＣＣ２０７３２）ま たはこれらの誘導株もしくは変異株の酵母を好気的に培養して、エタノールを消 費させかつＬ−ガラクトノーガンマラクトンをＬ−アスコルビン酸へ転化させる ；ことからなるＬ−アスコルビン酸の生産方法。
20. （２０）該微生物がカンデイダノルベゲンシスＭＦ−７８（ＡＴＣＣ２０７３２ ）およびその変異株または誘導株よりなる群から選択される請求の範囲第１８項 記載の微生物。
21. （２１）約０．０１〜２．０重量％のエタノール、約０．１〜０．７重量％のＬ −ガラクトノーガンマラクトン、約０．１〜０．８重量％のグリシンと共に窒素 源および必須無機質混合物を含み、約６．５〜２．６のｐＨを有するＬ−アスコ ルビン酸生産用水性発酵培地。
22. （２２）少なくとも約１．５×１０−３ミクロモル／分／ｍｇ（蛋白質）の活性 を有する固定化したＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ酵素を用意 し；該固定化酵素を、少なくとも約２．０ミリモルのＬ−ガラクトノ−１，４− ラクトンを含む生物転化用水性培地と接触させ；固定化酵素と接触している該水 性培地中の酸素濃度を少なくとも約３．０ｐｐｍに保つてＬ−ガラクトノー１， ４−ラクトンをＬ−アスコルビン酸へ転化させ、そして該Ｌ−アスコルビン酸を 回収する；ことからなるＬ−アスコルビン酸生産のための生物転化方法。
23. （２３）前記生物転化用培地のｐＨが約６．０〜７．５である請求の範囲第２２ 項記載の方法。
24. （２４）前記固定化酵素をビーズの形で処理カラムに加え、そして該カラムに前 記培地を通す請求の範囲第２３項記載の方法。
25. （２５）Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸低級アルキルエステルおよび これらの混合物よりなる群から選択されるＤ−ガラクツロン酸系基質、ならびに エタノール、グリセロールおよびこれらの混合物よりなる群から選択される炭素 エネルギー源を含む生物転化用水性培地を用意し；該発酵培地に、該基質からＬ −アスコルビン酸を生産しかつ該炭素エネルギー源を利用できる微生物を加え； そして該微生物を好気的条件下に培養して炭素エネルギー源を消費させかつＬ− アスコルビン酸を蓄積させる；ことからなるＬ−アスコルビン酸の製造方法。
26. （２６）炭素エネルギー源がエタノールであり、Ｄ−ガラクツロン酸系基質がＤ −ガラクツロン酸低級アルキルエステルである請求の範囲第２５項記載の方法。
27. （２７）前記微生物がカンデイダウチルス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｕｓ）Ｎ ＲＲＬ　Ｙ−９００およびその変異株または遺伝的誘導株よりなる群から選択さ れる請求の範囲第２５項記載の方法。