JPS61234799A - 核酸の定性試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は改良された核酸検出法に関する。

標識された核酸を用いて他の核酸が結合している紙その
他の材料を探査することは標準的な方法である〔ディー
・ティー・デンハルト、バイオケミ、バイオフィシ、リ
プ。コミ（Ｂｉｏｃｈｅｍ　。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｏｏｍｍ、　）　２３　
、６４１−６４６　。

１９６６：］。この方法は通常、ニトロセルロースに一
本鎖状で結合したＤＮＡを使用するが、ＲＮＡを特殊な
紙（すなわちジアゾ化した紙）に付着させる方法も開発
され、他の特別なシート型および円型の材料も入手でき
るようになった。これらの標準法の場合、被験核酸は普
通はこれをフィルターに付着させる前に精製される〔エ
ム・グルンシユタインおよびディー・ニス・ホグネス、
ブロン。

ナショ、アカデ、サイ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、）７２．３９６１−３９６５．１９７５）。

９□ 核酸を微生物コロニーのＤＮＡにハイブリッド形成させ
るだめの特殊な方法も開発された。この方法−では、コ
ロニーを紙に軽く押しつけ、これにより若干の細胞を乾
燥した紙に付着させる。細胞を溶解させ、アルカリを用
いる処理によって核酸を放出させる。こうして放出さｎ
たＤＮＡを次いで標識された核酸により標準的方法で探
査する。

この方法は同様に核酸を含む植物または動物の組織液に
は適用されていない。

他の方法がドクター・ウルリツヒ・メルヘルにより開発
された〔プラント・モレ、バイオ口。

（ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　’）１　、６３−
７３．１９８１）。

この方法では、葉の細胞に含まれる核酸が溶剤により洗
浄されて妨害色素が除去され、プロテアーゼにより消化
されて蛋白質が除去される。この処置により、処理され
た葉に直接にプローブ（ｐｒｏｂｅ　）を施して、ハイ
ブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　）を葉自
体において行うことが可能となる。核酸をハイブリッド
形成前に葉から取出すことは試みられていない。この方
法は、この処置によって葉が巻き上がり、もろくなり、
取扱いがきわめて困難になるという欠点をもつ。さらに
、色素を葉から定量的に除去することがきわめて困難で
ある。

本発明はこれらの欠点を克服し、植物および動物の組織
を核酸ハイブリッド形成法によって試験用（標識さｎた
プローブ）核酸の同族体である核酸（ＤＮＡま九はＲＮ
Ａ）の存在について迅速に定性スクリーニングする方法
を初めて提供する。

本発明は、 １〕　核酸を吸着剤の表面に結合させるために抽出液を
吸着剤と接触させ； ２）核酸を変性させ； ３）吸着剤の表面を洗浄して妨害物質を除去し；４）吸
着剤の表面を不活化し； ５）結合核酸を特異的な標識されたプローブ核酸と共に
インキュベートすることによってハイブリッド形成させ
；そして ６）結合核酸を探査用核酸とのハイブリッド形成につい
て検査する 工程からなる、組織粗抽出液中の核酸を検出するための
改良法であって、組織を直接に吸着剤表面上へ圧潰して
組織粗抽出液を調製する点において改良された方法であ
る。

本方法は植物組織および動物組織の双方に適用できる。

検出すべき核酸が組織自体の、または組織に感染したウ
ィルスもしくは細菌または他の微生物もしくはウィロイ
ドのＤＮＡ　またはＲＮＡである方法も好ましく、また
プローブ核酸が放射性元素で標識され、検査がラジオグ
ラフィー手段により行われる方法、およびプローブ核酸
が酵素により識別できる状態に化学的に修飾されたヌク
レオチドで標識され、検査が酵素手段により行われる方
法も好ましい。

変性が核酸を強塩基（特にＮａＯＨまたはＫＯＨ）と接
触させることにより行われる方法、および洗浄が緩衝塩
溶液に続いて有機溶剤中で行われ、有機溶剤がクロロホ
ルムである方法が好ましい。工程３）の後に、後続工程
を実施する前に吸着剤を真空中で加熱することも好まし
い。

吸着剤表面カセルロース、ニトロセルロース、ジアゾベ
ンジルオキシメチルセルロース、ジアゾフェニルチオエ
ーテルセルロース、ジエチルアミノエチルセルロース、
エポキシ活性化セルロース、トリアジニル活性化上ルロ
ースおよびナイロン膜から選ばれる方法が好ましい。工
程４）において不活化がこの表面上の活性結合部位乞非
特異性変性ＤＮＡ　、非特異性ＲＮＡ、蛋白質、エタノ
ールアミン、グリシン、グリシンメチルエステルおよび
グルコサミンから選ばれる物質と接触させることによる
ものである方法、ならびに特にＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡ
および大腸菌ＤＮＡから選ばれる方法も好ましい。

核酸ハイブリッド形成法により組織を試験用（標識され
たプローブ）核酸の同族体である核酸−（ＤＮＡま・た
はＲＮＡ　）の存在について迅速に定性スクリーニング
する方法が案出された。この方法は以下の工程からなる
。１１組織または抽出物を核酸と結合するニトロセルロ
ース片（！ｉたはしばしば“膜”と呼ばれる他のシート
型もしくは円型の材料）上で圧潰または圧搾して液を絞
り出すと紙は液を吸収する。２０紙を乾燥させるか、ま
たはエタノールもしくは酸中で固定する。３０次いで紙
を溶剤で処理して色素その他の妨害物質を除去する。

４、次いで紙をアルカリ溶液で処理してＤＮＡを変性す
る（この工程は組織のＲＮＡを探査する場合には省略で
きる）。５．標識されたプローブ（（１４０１８１Ｐ、
１２ｓ工、ヒオチニル化ナト〕−核酸（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）；インビボ標識法、ニック翻訳、末端標識法など
により調製）を用いて核酸ハイブリッド形成における普
通の方法で紙または膜を処理する。６．標識されたプロ
ーブ核酸の結合を次いで標準的な高感度の手段、たとえ
ばオートラジオグラフィー、フルオロスコヒー、酵素手
段、免疫学的手段（ビオチニル化した核酸プローブなど
について）などにより記録する。前記のように圧潰しな
ければならない固体組織のほかに、天然に液状の材料、
たとえば血液、膿、精液および胚乳、ならびに粉末、た
とえば花粉もフィルターに直接施すことができる。

葉その他の組織から絞り出された核酸は一過材のマトリ
ックス中へ速やかに吸収され、速やかに乾燥または固定
されるので、プローブ核酸の有効な定性的ハイブリッド
形成を妨げるほど分解されることはない。この方法は迅
速であり、かつ信頼性があるので、多数の組織試料を特
定の核酸配列の存在についてスクリーニングすることが
できる（これは遺伝子、ＤＮＡ挿入要素、反復性ＤＮＡ
の断片、調節系配列、ウィルス、その他それらに適した
核酸プローブが得られる核酸断片のいずれであってもよ
い）。本方法は植物の遺伝学的研究に、応用遺伝学（交
配）に、ヒト、動物および植物の病理学（ヒト、動物お
よび植物の疾病の診断、あるいは疾病に対する抵抗のた
めの交配）に、新鮮な組織から、または乾燥した葉もし
くは乾燥した組織液の抽出物から種を同定するため法医
学に、またＤＮＡベクター〔アグロバクテリウム・チュ
ミファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ
ｉｆａｃｉｅｎｓ　）、もしくはリゾゲネス（ｒｈｉｚ
ｏｇθｎｅｓ　）、カリフラワーモザイクウィルス、ま
たは他のＤＮＡもしくはＲＮＡ　ベクター〕などの手段
または他の方法（たとえば細胞融合、核酸形質転換、ト
ランスフェクション、核酸注入など）により高等植物お
よび動物の細胞に挿入される（またはこれらの細胞から
取出される）ＤＮＡの特定の細片の存在を認識すること
が重要な遺伝子工学的実験に有用であろう。また本方法
は広範なハイブリッド形成の研究に、またそれらの活性
が優性遺伝子の存在のため発現しない劣性遺伝子の存在
の認識などに有用であろう。特異な試験用遺伝子を植物
の特定の変種中へ組込むことも可能であり、この方法は
従って変種の識別試験法として採用できるであろう。

本発明方法は、より強いハイブリッド形成物質によって
非ハイブリッド形成物質が交差汚染され、これにより偽
りの陽性ハイブリッド形成信号が生じるのを避けるため
に一貫して注意を払うならば、きわめて満足すべき結果
を与える。以下の操作法がこの要件を満たすことが認め
られた。

１．材料の採取：　操作全体にわたって有効な操作法と
して、・・イプリツ「゛を形成しないかまたはハイブリ
ッド形成の弱い物質は常に、ハイブリッド形成の強い物
質よりも先きに採取されなければならない。細断器具ま
たは手袋を慎重に清浄化または交換し、各型の試料毎に
別個のバッグを使用すべきである。

２、圧潰：　圧潰に際しては試料を硬い器具（たとえば
刃先のない探針またはスラップ（金属片））でニトロセ
ルロースフィルターに押しつけることにより組織から液
を放出させ、ニトロセルロースフィルターに吸収させ、
乾燥させる。試料毎に別個のフィルターディスクを用い
ることにより一試料からの液が他の交差汚染する機会が
少なくなるであろう。あるいは適切な溶剤を用いて、ま
たは溶剤を用いずに組織をホモジナイズし、フィルター
に施すこともできる。手袋および器具を慎重に清浄化し
、または交換し、新しいペーハータオルその・池のニト
ロセルロースフィルター用支持材を使用すべきである。

した２層のワットマン３ＭＭ　Ｐ紙またはこれに類する
もの（ただし飽和よりも過剰の溶液があってはならない
。これは３ＭＭ　Ｐ紙の表面上を流れて、隣接するニト
ロセルロース紙と交差汚染す°る可能性をもつ）に、ニ
トロセルロースフィルターを乗せる（試料面を上にして
）ことによって行われる。一部のＤＮＡがフィルターを
通して、また端から出て下層の３ＭＭ２Ｆ紙上へ移動す
るので注意を要する。一部のＤＮＡがこのようにフィル
ターから外へ移動するため、隣接するフィルターを互い
に近づけすぎないこと、および３ＭＭＦ紙上のフィルタ
ーを他のフィルターが先きに置かれていた位置に決して
置かないことも望ましい。フィルターを溶液間で移すた
めに用いた鉗子は清浄化しなければならない。

試料についての一般的な溶液および処理時間は下記のと
おりである。

溶　　液　　　　　　　　　　　　　　　分０．５Ｍ　
ＮａＯＨ−７ １Ｍ）リス−〇！’ｌ、ｐＨ７，５１ １Ｍトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５１ ０，５Ｍ）リス−０１ｐＨ７，５＋１．５ＭＮａＣ１５
ルターをブフナーろうと上で（２枚の１紙を敷いて）洗
浄する。クロロホルムがすべてニトロセルロースフィル
ターから蒸発するまで真空を持続させる。ろうとを清浄
化し、次回の試料のために１紙を交換する。

５、ＮａＣ１リンス：　各試料を０．３　Ｍ−Ｍａｉｌ
　Ｉｃ短時間浸漬し、次いで３７″′ｆ風乾する。

６、ベーキング＝７８°の真空炉内で３％時間ベーキン
グする。

１０　ｍＭ、、ＮａＰｉ　１．５ｍＭ、および０．１ｍ
Ｍ・ＦｌｉＤＴＡ　）　ｐＨ７，０および剪断したウシ
胸腺ＤＮＡ１岬／　１００　ｍｌを１０分間煮沸してＤ
ＮＡを変性させる６次いで試料をこの溶液中で６５にお
いて３０分間、交差汚染を防止するために別個のパウチ
中で予備ハイブリッド形成する。

記のハイブリッド形成液に添加し、１０分間変性させて
プローブＤＮＡおよびウシ胸腺ＤＮＡを双方とも変性さ
せた。次いで試料を６５″で各型の試料につき別個のパ
ウチ内で１２．５時間ハイブリッド形成させる。

５　　　　１０×デンハルト溶液 ７．５　　　　２０ＸＳＳＣ １０５０％硫酸デキストラン ０．２　　　　２５％５ＤＳ ２４水 適量　　　煮沸したプローブ ド形成用パウチかも取出し、別個の容器内でｌｘ　ｓｓ
ｃ　＋　ｏ、ｓ％ＳＤＳ中においてリンスする。

次いで同一溶液中で６５°において％時間ずつ４回洗浄
する。風乾する。

１０、増強スクリーンを用いてＸ線フィルムに向けて配
置し、−７０°で適宜な時間露光する。

実施例１ 直径１３．７副の純ニトロセルロースディスク（ニス・
アンド・ニス、Ｂｉ１２型）２枚にソフトペンシルで５
×５の格子線を引いた。これらのフィルターの各方形に
３種の植物ジー・メイク（Ｚｅａ　ｍａｙｓ、トウモロ
コシの一種）、グリシン・マックス（ｇｌｙｃｉｎｅ　
ｍａｘ　％メイクの一種）およびツルガム・バイカラー
（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ。

モロコシの一種）の葉を絞って得た粗液性を下記により
施した。

新鮮な葉を温室から持って来て適宜な寸法の細片（長さ
約１０　ｃｍ　）に切断した。硬貨を用いて葉組織を各
方形の中央領域上で粉砕し、こうして組織液を沈着させ
た（各方形につき新たな断片の葉を用いた）。組織の粉
砕は葉を硬貨の端で前後にこすり、ニトロセルロース紙
が置かれている清浄な硬い表面に強く押しつけることに
よって行われた。その結果絞り出された液がフィルター
上へ流れ出し、方形の中央部を覆い、これを緑色および
褐色に着色した。液が一方形から他の方形へ流れ出さな
いことを保証するために注意を払った。次いで液は紙に
吸収され、３７℃で風乾された。葉液は各列につき１種
の葉、および各ディスクにつきそれぞれの種を少なくと
も４個の方形の割合で施された。次いでフィルターな種
線の１本に沿ってそれぞれの種の列に直角に半切した。

従って半分の各フィルターはそれぞれの種のスポットを
少なくとも２個含んでいた。

フィルターの各半切を下記の溶液で飽和した重ねた２枚
の吸取紙に順次乗せた。ＮａＯＨ（０，５Ｎ、７分）、
トリス・ＨＯｌ（１，０Ｍ、　ｐＨ７，４，１分）、ト
リス−ＨＣＩ（１，０Ｍ、　ｐＨ７，４，１分）　、Ｍ
ａｉｌ（１，５Ｍ）＋トリス・ＨＣＩ　（０，５Ｍ、　
ｐＨ７，４，５分）、そして風乾した。すべて室温で行
われた。

吸取紙は、フィルターの半切を溶液で飽和するのに十分
であるがＤＮＡＹフィルターに固定される前に洗い流す
のに十分なほどではない量でこれらの溶液それぞれを含
んでいた。次いでフィルターの半切をほとんどすべての
緑色色素が除かれるまでクロロホルムで抽出し、再び風
乾した。次いでフィルターの半切を７８℃の真空炉内で
３時間４５分ベーキングし、０．Ｉ　Ｘ　８ＣＰ（ｌＸ
５ＣＰ　＝１００　ｍＭ−Ｎａｉｌ　、ｌ　５　ｍＭリ
ン醗ナナトリウム１　ｍＭ−ＥＤＴＡ％ｐＨ７，０）十
剪断された未標識の純粋な非特異性ＤＮＡ　（大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌ：）プローブに対してはサケ本丸ＤＮＡ、ジ
ー・メイクおよびツルガム・バイカラーの１０−プに対
しては大腸菌ＤＮＡ）中で６５℃において３０分間予備
ハイブリッド形成した。これによりフィルター表面の非
特異的反応基がブロックされた。こうしてフィルターは
ハイブリッド形成の用意ができた。

次イで大腸菌、ジー・メイクおよびツルガム・バイカラ
ーから得たＤＮＡ試料を、標識としてのα−［３２ｐ］
デオキシ−ＡＴＰを用いてニック翻訳した。次いでこれ
らの８２Ｐ標識ＤＮＡ試料をハイブリッド形成用プロー
ブとして用いて圧搾式ハイブリッド形成法の効率を試験
した。これを行うためには、フィルター半切３枚を別個
に３個のプラスチックバッグのうち１個に上記ＤＮＡプ
ローブのうちの１種と共に封入した。基本的なハイブリ
ッド形成溶液は１０×デンハルト液５ｄ、２０ＸＳＳＣ
７，５ｓｔ／、５０％（Ｗ／Ｖ）硫酸デキストラ：／　
１０．ｔｔｌ、　２５％（ｗ／　ｖ　）　ＥｔＤＳ　０
．２＃！／、滅菌水２４ゴ、および２ｑ／ｍｌの煮沸し
た剪断キャリヤーＤＮＡ　（上記に述べた予備ハイブリ
ッド形成工程に用いたものに対応する型のもの）２．５
１／を含有していた。この溶液に特異性プローブＤＮＡ
（バッグ当たり１５０万個のＤＰＭ）を添加した。

ハイブリッド形成はバッグ当たり５ｄの上記溶液中で６
５℃において一夜行われた。次いでフィルターをバッグ
から取出し、１　ｘ　ｓｓｃ　＋　ｏ、ｚ％ＳＤＳ中で
１回リンスし、次いで同一溶液中で６５℃においてさら
に４回（各回につき３０分間）、緩和に振とうしながら
洗浄した。次いでフィルタ−を風乾した。

フィルターン支持紙にテープで止め、コダックＸ−ＯＭ
ＡＴフィルムを用いるオートラジオグラフィーによりハ
イブリッド形成を視覚化した（デュポン、クロネツラス
（０ｒｏｎｅｘ　）″Ｉ長寿命型、照明付き”の増強ス
クリーンを用いて一７０℃で一夜露光）。フィルムを現
像し、写真ン得た。ニトロセルロースフィルター上に現
われた、組織液により生じた位置および形状に対応する
位置および形状のスポットがフィルム上で黒色となった
場合、陽性の結果を採点した。

結果を次表に示す。

表１ 反応結果 １、グリシン・マックス　　　　　　　　−−−２、ジ
ー・メイク　　　　　　　　　　　　−　　　　　＋　
　　　−３、ツルガム・バイカラー　　　　　　　−＋
−実施例２ 表■に示した種の葉材料をセントラル・リサーチ・プラ
ント・グロース・ファシリティ−（グロントン、ＣＴ）
周辺の野原で採取し、上記実施例に記載したようにニト
ロセルロースフィルター上に組織液を絞り出した。こう
してそれぞれの種または組織型の液をフィルター上の特
異的スポット上に絞り出し、次いでこれを７１イブリツ
ド形成につき定性的に採点することができた。フィルタ
ーの処理およびハイブリッド形成も上記実施例の記載に
従って行われた、［”Ｐ）標識プローブＤＮＡは標準ニ
ック翻訳法により精製プラスミドｐｓＨＩを用いて製造
された。プラスミドｐｓＨ工は標準クローニング法によ
りツルガム・バイカラーのゲノムＤＮＡからベクターｐ
ＢＲ３２２を用いて単離された。ｐＢＲ工はｐＢＲ３２
２のヒント（Ｈｌｎｄ）１部位にリグ−）　（ｌｉｇａ
ｔｅ　）　シた２、７ｋｌ）のツルガムＤＮＡを含む。

このクローンのＤＮＡを得るための操作はＤＮＡクロー
ニングの分野における一専門家には周知である。

上記実施例に記載したように、フィルター上の種々のス
ポットのプローブＤＮＡに対する陽性のハイブリッド形
成は、Ｘ線フィルム上の対応する位置に黒色のスポット
が現われた場合にのみ採点された。結果を表■に示す。

表■ バイカラー 胚　　　＋　　　　４ ホワイト・カフイル　葉　　　　＋　　　　　　２Ｈｏ
１６２　　　　　　葉　　　　　　＋　　　　　　　３
ジー・メイク　　　Ａ１８８　　　　葉　　　　　　　
　　　　３７２７７　　　葉　　　　　　　　　３（Ｚ
ｅａ　ａｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｅ）上記の実験は、本
方法により被験ツルガム・ノ（イカジーのすべての変種
から得た１）ＮＡを検出したがジー属は全く検出されな
かったことを示す。

従って本方法は適切な標識プローブＤＮＡｔｔ施した場
合には種特異性となりうる。

実施例３ この場合、ナイロンフィルターな実施例１のニトロセル
ロースフィルターと同様に調製した。カブラから葉の新
鮮な試料を得た。これらの植物のうちあるものはカリフ
ラワーモザイクウィルスに感染していることが知られて
おり、あるものは感染していないことが知られており、
他は感染している疑いがあった。これらの試料を実施例
１の場合と同様にフィルター上に描かれた方形に向けて
圧搾して液を絞り出した。フィルターを乾燥させ、次い
で実施例１の場合と同様に処理した。ただし予備ハイブ
リッド形成工程？、溶液に１０％ウシ血清アルブミンを
添加し、かつ予備ハイブリッド形成を１２時間に延長す
ることによって改変１−た。

精製したカリフラワーモザイクウィルスＤＮＡの試料を
実施例１の場合と同様にニック翻訳し、同実施例に詳述
した方法に従ってこのニック翻訳したウィルスＤＮＡを
使用して、フィルターをハイブリッド形成について探査
した。フィルターを実雄側１に記載したように洗浄し、
Ｘ線フィルムに露光した。

次いでこの方法によって、組織液によりフィルター上に
沈着させたスポットがカリフラワーモザイクウィルスを
実際に含む場所のＸｍフィルム上に黒色スポットが生じ
た。こうして、どの植物がカリフラワーモザイクウィル
スに感染していたかがわかる。感染していることがわか
っている植物の葉からの液はこの方法によりフィルム上
に黒色のスポットを生じるが、感染していない植物に対
応する領域のフィルムは黒色化しないからである。

実施例４ この場合、タバコの葉の新鮮な試料を得た。これらの植
物のうちあるものはタバコモザイクウィルスに感染して
いることがわかっており、あるものは感染していないこ
とがわかっており、他は感染している疑いがあった。こ
れらの試料を実施例１の場合と同様にフィルター上に描
かれた方形に向けて圧搾し、液を絞り出した。フィルタ
ーを乾燥させ、次いで実施例１の場合と同様に非特異性
（大腸菌）ＤＮＡ？：用いる予備ハイブリッド形成の工
程により、ただしＮａＯＨによる変性の工程を除いて処
理した。精製されたタバコモザイクウィルスＲＮＡの試
料を、当業者に既知の方法であるポリヌクレオチドキナ
ーゼにより１２ｐで標識した。

次いでこの標識されたウィルスＲＮＡを用いて、実施例
１に詳述した方法によりフィルターｔハイブリッド形成
について探査した。フィルター乞洗浄し、実施例１に記
載したようにＸ線フィルムに露光した。

この処理によって、組織液によりフィルター上に沈着し
たスポットがタバコモザイクウィルス乞実際に含む場所
のＸ線フィルム上に黒色スポットが生じた。こうして、
どの植物がタバコモザイクウィルスに感染していたかが
わかる。感染していることがわかっている葉はこの処理
によってフィルム上に黒色スポットを生じ、一方感染し
ていなかった植物に対応する領域のフィルムは黒色化し
ないからである。

実施例５ この場合、ニトロセルロースフィルターン実施例１の場
合と同様に調製した。カナビス・サテイーバ（Ｃａｎｎ
ａｂｉｓ　５ａｔｉｖａ　、アサの一種）を含むと思わ
れる未知の種の葉その他の植物組織の試料を最小量の０
．５　Ｎ−ＮａＯＨ中で再水和したのちフィルターに施
した。真のカナビス・サテイーパの葉組織からの試料（
陽性対照として用いる）もフィルターに施した。これら
の試料を実施例１の場合と同様にフィルター上に描かれ
た方形に向けて圧搾し、吸収されていた０、５　Ｎ−Ｎ
ａＯＨ（組織内のＤＮＡ　ｇ溶解しているであろう）を
絞り出した。

フィルターを乾燥させ、次いで実施例１の場合と同様に
非特異的（大腸菌）ＤＮＡを用いる予備ハイブリッド形
成工程により処理した。ＤＮＡの種特異性クローンの試
料（実施例２で用いたＤＮＡの種特異性クローンの場合
と同じ方法でカナビス属からクローン化されたもの）ｔ
ニック翻訳により＋２Ｐで標識した。次いでこの標識さ
れたＤＮＡを用いて実施例１に詳述した方法によりフィ
ルターをハイブリッド形成について探査した。フィルタ
ーを洗浄し、実施例１に記載したようにＸ線フィルムに
露光した。

この処理によって、組織抽出液によりフィルター上に沈
着したスポットが真のカナビス・サテイーバ由来のＤＮ
Ａを実際に含む場所のＸ線フィルム上に黒色スポット？
生じた。こうしてどの植物が確かにカナビス・サティー
パであるかがわかる。

カナビス・サテイーバであることがわかっている植物の
葉はこの処理によりフィルム上に黒色スポット？生じ、
−万他の種の植物に対応する領域のフィルムは黒色化し
ないからである。

実施例に の場合、ニトロセルロースフィルターを実施例１の場合
と同様に調製した。ウシ肝臓の試料を屠殺場から得た。

他の肝臓試料を店から得た。これらの試料を実験室用プ
レスにより、フィルター上に描かれた方形に向けて圧搾
し、こうして組織液を絞り出した。組織液から得られる
スポットがフィルターの他の方形中へ流れ出すことのな
いように注意乞払った。フィルターを乾燥させ、次いで
実施例１の場合と同様に非特異性（大腸菌）ＤＮＡを用
いて予備ハイブリッド形成工程により処理した。精製さ
れたＤＮＡの種特異性クローン（実施例２で用いたＤＮ
Ａの種特異性クローンと同じ方法でウシＤＮＡからクロ
ーン化されるものを実施例１に詳述した方法に従ってニ
ック翻訳により！ｔＰで標識した。このニック翻訳した
ＤＮＡＹ用いてフィルタービハイブリッド形成により探
査した。フィルターを洗浄し、実施例１に記載したと同
様にＸ線フィルムに露光した。

この処理によって、組織液によりフィルター上に沈着し
たスポットがウシＤＮＡを実際に含む場所のＸ線フィル
ム上に黒色スポット２生じた。こうしてどの肝臓が真の
ウシ肝臓であったかがわかる。真のウシ肝臓から得た液
のみがこの処理に工りフィルム上に黒色のスポット乞生
じ、−万他の種の肝臓に対応する領域のフィルムは黒色
化しないからである。

実施例７ この場合、黄色ブドウ球菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓａｕｒθｕｓ　）の純ＤＮＡの試料を調製し、当業
者に既知の方法に工りこのＤＮＡの制限断片から一連の
クローンを調製した。これらのクローンをそれらの種特
異性について検査した。あるクローンが黄色ブドウ球菌
に対して高度に種特異性であり、ヒトＤＮＡに交差ハイ
ブリッド形成を示さないことが確認された。

ニトロセルロースフィルターを実施例１の場合と同様に
調製した。黄色ブドウ球菌による感染が疑われる患者か
ら膿の試料？得た。黄色ブドウ球菌に感染していること
がわかっている患者から、他の膿試料を得た。これらの
試料をフィルター上に描かれた方形上で乾燥させた。膿
のスポットがフィルターの他の方形内へ流れ込まないよ
うに注意を払った。フィルターを乾燥させ、次いで実施
例１の場合と同様に非特異性（ウシ胸腺）ＤＮＡで予備
ハイブリッド形成工程により処理した。このクローンの
ＤＮＡ試料を精製し、ビオチン結合したヌクレオチドで
ニック翻訳して、ビオチンで標識されたＤＮＡプローブ
χ得た。このニック翻訳されたＤＮＡを用いてフィルタ
ーをハイブリッド形成について探査した。フィルターを
洗浄し、ＤＮＡプローブ中に含まれるビオチン標識ヌク
レオチド、すなわちビオチン結合ヌクレオチドを認識し
うる・適宜な抗体に暴露した（キット製造業者により供
給され、推奨されている）。次いでフィルターに結合し
ている抗体を酵素反応により視覚化した（市販品による
）。

この処理により、フィルター上に沈着した膿が黄色ブド
ウ球菌を実際に含む場所のフィルターに着色領域を生じ
た。こうしてどの患者が黄色ブドウ球菌に感染していた
かがわかる。黄色ブドウ球菌に感染した患者から採取し
た膿のみがこの処理によりメンズレインフィルター上に
着色領域乞生じるからである。

実施例８ この場合、ニトロセルロースフィルター乞実施例１のフ
ィルターの場合と同様に調製した。モモの葉の新鮮な試
料を得た。これらの植物のうちあるものはモモＸ病乞ひ
き起こすマイコプラスマに感染していることがわかって
おり、あるものは感染していないことがわかっており、
他は感染している疑いがあった。これらの葉の試料を実
施例１の場合と同様にフィルター上に描かれた方形に向
けて圧搾し、液を絞り出した。フィルターン乾燥させ、
実施例１の場合と同様に処理した。モモＸ病から真のＤ
ＮＡ試料を調製し、実施例１の場合と同様にニック翻訳
した。実施例１に詳述した方法に従って、このニック翻
訳したマイコプラスマＤＮＡ　ｔｌ用いてフィルターを
ハイブリッド形成について探査した。フィルターを洗浄
し、実施例１に記載したと同様にＸ線フィルムに露光し
た。

この処理によって、組織液にエリフィルター上に沈着し
たスポットが実際にモモＸ病のマイコプラマスな含む場
所のＸ線フィルム上に黒色のスボツＩ＋’生じた。こう
して、どの植物がこの疾病に感染しているかがわかる。

感染していることがわかっている植物の葉から得た液は
この処理によりフィルム上に黒色のスポットを生じ、一
方感染していない植物に対応する領域のフィルムは黒色
化しないからである。

（外手名］

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）１）核酸を吸着剤の表面に結合させるために組織
   粗抽出液を吸着剤と接触させ； ２）核酸を変性させ； ３）吸着剤の表面を洗浄して妨害物質を除去し； ４）吸着剤の表面を不活化し； ５）結合核酸を特異的な標識されたプローブ核酸と共に
   インキュベートすることによつてハイブリッド形成させ
   ；そして ６）結合核酸をプローブ核酸とのハイブリッド形成につ
   いて検査する工程からなる、組織粗抽出液中の核酸を検
   出するための方法において、組織を直接に吸着剤表面上
   へ圧潰して組織粗抽出液を調製することを特徴とする改
   良された方法。
2. （２）組織が植物組織である、特許請求の範囲第（１）
   項に記載の方法。
3. （３）組織が動物組織である、特許請求の範囲第（１）
   項に記載の方法。
4. （４）検出される核酸がＤＮＡである、特許請求の範囲
   第（１）項に記載の方法。
5. （５）検出される核酸がＲＮＡである、特許請求の範囲
   第（１）項に記載の方法。
6. （６）プローブ核酸が放射性元素で標識され、検査がラ
   ジオグラフィー手段により行われる、特許請求の範囲第
   （１）項に記載の方法。
7. （７）酵素または抗体により識別できる状態に化学的に
   修飾されたヌクレオチドでプローブ核酸が標識され、検
   査が酵素手段により行われる、特許請求の範囲第（１）
   項に記載の方法。
8. （８）工程３）の後に、残りの工程を行う前に吸着剤を
   真空中で加熱する、特許請求の範囲第（１）項に記載の
   方法。
9. （９）工程３）の後に、残りの工程を行う前に吸着剤を
   不活性雰囲気中で加熱する、特許請求の範囲第（１）項
   に記載の方法。
10. （１０）工程４）において、不活化が表面の活性結合部
    位を非特異性変性ＤＮＡ、非特異性ＲＮＡ、蛋白質、エ
    タノールアミン、グリシン、グリシンメチルエステルお
    よびグルコサミンから選ばれる物質と接触させることに
    より行われる、特許請求の範囲第（１）項に記載の方法
    。