JPS61223559A - フロ−サイトメトリ−用螢光標準粒子 - Google Patents
フロ−サイトメトリ−用螢光標準粒子Info
- Publication number
- JPS61223559A JPS61223559A JP6417885A JP6417885A JPS61223559A JP S61223559 A JPS61223559 A JP S61223559A JP 6417885 A JP6417885 A JP 6417885A JP 6417885 A JP6417885 A JP 6417885A JP S61223559 A JPS61223559 A JP S61223559A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescent
- group
- meth
- acrylate
- flow cytometry
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はフローサイトメトリー用螢光標準粒子。
特に、そこに保有される螢光分子数及び螢光量の決定さ
れたフローサイトメトリー用螢光標準粒子に関する。
れたフローサイトメトリー用螢光標準粒子に関する。
（従来の技術）
フローサイトメトリーとは、（ｌ）細胞を流体とともに
高速で通過させ、これにレーザー光などの単色光を照射
し、（２）細胞から発生する螢光を測定し。
高速で通過させ、これにレーザー光などの単色光を照射
し、（２）細胞から発生する螢光を測定し。
そして、（３）この螢光測定により細胞中の特定物質を
分析する方法である。このフローサイトメトリーを用い
た通常の使用法では、光散乱測定により細胞の大きさを
測定し、螢光測定により特定物質の有無あるいはその量
が測定される。近年、細胞表面抗原の特異的螢光標識法
とレーザー光線による励起技術の進歩により、フローサ
イトメトリーを免疫学分野に応用するための細胞自動分
析装置が開発され９例えば、 Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＥＰ
ＩＣ５−Ｖ 、 Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社
のＦＡＣ３などが市販されている。この装置を用いて、
モノクローナル抗体などによる標準的細胞１例えば、リ
ンパ球の詳細な研究が可能となった。しかし、この装置
により測定される螢光強度は相対螢光強度であるため、
定量分析がなされ得ない、つまり、特定物質の螢光量が
螢光標準粒子の何倍あるいは何％であるといった相対値
が得られるにすぎない。
分析する方法である。このフローサイトメトリーを用い
た通常の使用法では、光散乱測定により細胞の大きさを
測定し、螢光測定により特定物質の有無あるいはその量
が測定される。近年、細胞表面抗原の特異的螢光標識法
とレーザー光線による励起技術の進歩により、フローサ
イトメトリーを免疫学分野に応用するための細胞自動分
析装置が開発され９例えば、 Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＥＰ
ＩＣ５−Ｖ 、 Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社
のＦＡＣ３などが市販されている。この装置を用いて、
モノクローナル抗体などによる標準的細胞１例えば、リ
ンパ球の詳細な研究が可能となった。しかし、この装置
により測定される螢光強度は相対螢光強度であるため、
定量分析がなされ得ない、つまり、特定物質の螢光量が
螢光標準粒子の何倍あるいは何％であるといった相対値
が得られるにすぎない。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的とするところは１粒子の保有する螢光分子数が決定
されたフローサイトメトリー用螢光標準粒子を提供する
ことにある二 （問題点を解決するための手段） 本発明は、互いに反応性のある基を有する球状粒子と螢
光物質とを反応させて螢光標準粒子を合成する過程にお
いて、該標準粒子の螢光分子数が定量的に測定されうる
。との発明者の知見にもとづいて完成された。
目的とするところは１粒子の保有する螢光分子数が決定
されたフローサイトメトリー用螢光標準粒子を提供する
ことにある二 （問題点を解決するための手段） 本発明は、互いに反応性のある基を有する球状粒子と螢
光物質とを反応させて螢光標準粒子を合成する過程にお
いて、該標準粒子の螢光分子数が定量的に測定されうる
。との発明者の知見にもとづいて完成された。
本発明のフローサイトメトリー用螢光標準粒子は、イソ
シアネート基またはチオイソシアネート基と反応し得る
反応性基を少なくとも表面に有する重合体からなる球状
粒子と、イソシアネート基またはチオイソシアネート基
を有する螢光′物質とを反応させて得られ、そのことに
より上記目的が達成される。
シアネート基またはチオイソシアネート基と反応し得る
反応性基を少なくとも表面に有する重合体からなる球状
粒子と、イソシアネート基またはチオイソシアネート基
を有する螢光′物質とを反応させて得られ、そのことに
より上記目的が達成される。
イソシアネート基またはチオイソシアネート基と反応し
得る反応性基としては、−ＮＨｚ基、 −ＣＯＯＨ基、
−〇Ｈ基などがある。これら反応性基を有する重合体は
、一官能性単量体および／もしくは多官能性の不飽和エ
ステル単量体を重合させてなる。
得る反応性基としては、−ＮＨｚ基、 −ＣＯＯＨ基、
−〇Ｈ基などがある。これら反応性基を有する重合体は
、一官能性単量体および／もしくは多官能性の不飽和エ
ステル単量体を重合させてなる。
一官能性単量体としては９例えば、（メタ）アクリルア
ミド、 （メタ）アクリル酸、２−ヒドロキシエチル（
メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート
、およびグリセロールモノ （メタ）アクリレートがあ
る。多官能性の不飽和エステル単量体としては、テトラ
メチロールメタントリアクリレート、テトラメチロール
メタンジアクリレート、グリセロールジ、（メタ）アク
リレート、ポリエチレングライコールジグリシジルエー
テルジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングライコ
ールジグリシジルエーテルジ（メタ）アクリレートなど
が挙げられる。これらは単独でもしくは混合して用いら
れる。さらに、多官能性の不飽和エステル単量体であっ
て、一官能性単量体の共単量体としては、テトラメチロ
ールメタンテトラアクリレート、トリメチロールプロパ
ントリアクリレート、グリセロールトリ （メタ）アク
リレート。
ミド、 （メタ）アクリル酸、２−ヒドロキシエチル（
メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート
、およびグリセロールモノ （メタ）アクリレートがあ
る。多官能性の不飽和エステル単量体としては、テトラ
メチロールメタントリアクリレート、テトラメチロール
メタンジアクリレート、グリセロールジ、（メタ）アク
リレート、ポリエチレングライコールジグリシジルエー
テルジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングライコ
ールジグリシジルエーテルジ（メタ）アクリレートなど
が挙げられる。これらは単独でもしくは混合して用いら
れる。さらに、多官能性の不飽和エステル単量体であっ
て、一官能性単量体の共単量体としては、テトラメチロ
ールメタンテトラアクリレート、トリメチロールプロパ
ントリアクリレート、グリセロールトリ （メタ）アク
リレート。
ポリエチレングライコールジ（メタ）アクリレート、ボ
リプロビレングライコールジ（メタ）アクリレートなど
がある。上記多官能性の不飽和エステル単量体は単独で
もしくは混合して使用されうる。一官能性単量体は共単
量体とともに用いられる。
リプロビレングライコールジ（メタ）アクリレートなど
がある。上記多官能性の不飽和エステル単量体は単独で
もしくは混合して使用されうる。一官能性単量体は共単
量体とともに用いられる。
これら単量体は、ラジカル開始剤による水性懸濁重合に
よって球状の重合体となる。ラジカル開始剤には、ベン
ゾイルパーオキサイド、２・２”−アゾビスイソブチロ
ニトリルなど公知のあらゆる開始剤が使用される。
よって球状の重合体となる。ラジカル開始剤には、ベン
ゾイルパーオキサイド、２・２”−アゾビスイソブチロ
ニトリルなど公知のあらゆる開始剤が使用される。
球状の重合体は、イソシアネート基またはチオイソシア
ネート基を有する螢光物質と反応性である。この螢光物
質としては９例えば、フルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミンＢイソチオシアネート等がある。このほ
か尿素またはチオ尿素基をもった螢光物質は、適当な有
機溶媒中で加熱分解させる公知の合成法により、イソシ
アネート基またはイソチオシアネート基を有する螢光物
質となる。この球状の重合体を適当な媒体中に懸濁させ
た懸濁液と、上記螢光物質の溶液とを混合し１両者を反
応させて、螢光標準粒子が得られる。
ネート基を有する螢光物質と反応性である。この螢光物
質としては９例えば、フルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミンＢイソチオシアネート等がある。このほ
か尿素またはチオ尿素基をもった螢光物質は、適当な有
機溶媒中で加熱分解させる公知の合成法により、イソシ
アネート基またはイソチオシアネート基を有する螢光物
質となる。この球状の重合体を適当な媒体中に懸濁させ
た懸濁液と、上記螢光物質の溶液とを混合し１両者を反
応させて、螢光標準粒子が得られる。
この螢光標準粒子の螢光分子数は９次のように決定され
る： 適当な条件の下９球状の重合体の懸濁液と、螢光物質の
溶液とを反応させる０反応液は充分洗浄し、洗液に螢光
が測定されないことを螢光分光光度計により確認する。
る： 適当な条件の下９球状の重合体の懸濁液と、螢光物質の
溶液とを反応させる０反応液は充分洗浄し、洗液に螢光
が測定されないことを螢光分光光度計により確認する。
そのあと１反応液の粒子濃度を自動血球計算装置で求め
１粒子をアルカリに溶解後螢光分光光度計でその螢光強
度を測定する。
１粒子をアルカリに溶解後螢光分光光度計でその螢光強
度を測定する。
他方、この粒子溶解液とは別に、螢光物質だけを種々の
濃度に溶解させた溶液を用意する。この溶液の螢光強度
も同様に測定し、そして螢光強度と螢光物質の濃度との
関係を検量線とする。得られた検量線を用いて９粒子溶
解液の螢光強度に相当する螢光物質の濃度を求める０粒
子溶解液の粒子濃度は測定されているので、この両者か
ら螢光標準粒子−個あたりの螢光分子の分子数が算出で
きる。螢光分子数が決定された螢光標準粒子−は、フロ
ーサイトメトリーにおける螢光量の標準化に利用される
。
濃度に溶解させた溶液を用意する。この溶液の螢光強度
も同様に測定し、そして螢光強度と螢光物質の濃度との
関係を検量線とする。得られた検量線を用いて９粒子溶
解液の螢光強度に相当する螢光物質の濃度を求める０粒
子溶解液の粒子濃度は測定されているので、この両者か
ら螢光標準粒子−個あたりの螢光分子の分子数が算出で
きる。螢光分子数が決定された螢光標準粒子−は、フロ
ーサイトメトリーにおける螢光量の標準化に利用される
。
同じ種類の螢光分子だけをもった複数の細胞集団の発す
る螢光量をフローサイトメトリーにより測定すれば、各
細胞の螢光量は螢光分子数に比例する０例えば、ある螢
光分子２個をもった細胞だけで構成された集団をサンプ
ルＡとする。同じ螢光分子４個をもった細胞の集団をサ
ンプルＢ、同じ螢光分子８個をもった細胞の集団をサン
プルＣとする。同一条件下でフローサイトメトリー測定
したとき、サンプルへの各細胞が発する螢光量を仮に５
であるとすると、サンプルＢの各細胞が発する螢光量は
１０．サンプルＣのそれは２０となる。
る螢光量をフローサイトメトリーにより測定すれば、各
細胞の螢光量は螢光分子数に比例する０例えば、ある螢
光分子２個をもった細胞だけで構成された集団をサンプ
ルＡとする。同じ螢光分子４個をもった細胞の集団をサ
ンプルＢ、同じ螢光分子８個をもった細胞の集団をサン
プルＣとする。同一条件下でフローサイトメトリー測定
したとき、サンプルへの各細胞が発する螢光量を仮に５
であるとすると、サンプルＢの各細胞が発する螢光量は
１０．サンプルＣのそれは２０となる。
ある螢光量をもった細胞の螢光強度は、フローサイトメ
トリーで測定されるとき、アナログ−デジタル変換回路
を経て、チャンネル番号という数値で表示される。細胞
の集団を螢光測定する場合。
トリーで測定されるとき、アナログ−デジタル変換回路
を経て、チャンネル番号という数値で表示される。細胞
の集団を螢光測定する場合。
各細胞の螢光強度には分散があるため、 （螢光強度−
細胞数）ヒストグラムのモード位置のチャンネル番号が
個々の細胞の平均の螢光量に相当する。
細胞数）ヒストグラムのモード位置のチャンネル番号が
個々の細胞の平均の螢光量に相当する。
細胞のもつ螢光量が多いほど、チャンネル番号は大きい
ものとなる。特に、サンプルＡ、Ｂ、Ｃのように同一螢
光分子だけをもった細胞の集団のチャンネル番号と螢光
量（螢光分子数）とをプロットすれば、ある測定条件に
おいて直線関係が得られる。螢光量とチャンネル番号と
の間に、このような直線性が保証されるならば、チャン
ネル番号は螢光量の尺度になり得る。この場合、どのよ
うな測定条件下で、螢光量とチャンネル番号との間に直
線性が成立するかを検討することが必要である。この検
討の後に、はじめて測定条件の標準化がなされる。その
ためには、螢光分子数の決定された複数の螢光標準粒子
が用いられる。適当な条件下で螢光標準粒子の螢光量（
螢光分子数）とチャンネル番号とをプロットし、これを
検量線とする。この検量線は細胞中の特定物質の定量に
用いられる。
ものとなる。特に、サンプルＡ、Ｂ、Ｃのように同一螢
光分子だけをもった細胞の集団のチャンネル番号と螢光
量（螢光分子数）とをプロットすれば、ある測定条件に
おいて直線関係が得られる。螢光量とチャンネル番号と
の間に、このような直線性が保証されるならば、チャン
ネル番号は螢光量の尺度になり得る。この場合、どのよ
うな測定条件下で、螢光量とチャンネル番号との間に直
線性が成立するかを検討することが必要である。この検
討の後に、はじめて測定条件の標準化がなされる。その
ためには、螢光分子数の決定された複数の螢光標準粒子
が用いられる。適当な条件下で螢光標準粒子の螢光量（
螢光分子数）とチャンネル番号とをプロットし、これを
検量線とする。この検量線は細胞中の特定物質の定量に
用いられる。
（実施例）
以下に本発明を実施例について述べる。
災旌斑土
冷却器、攪拌器、温度針および滴下ロートの鰻重された
５１セパラブルフラスコに、５重量％のポリビニルアル
コール水溶液２．５１と、ベンゾイルパーオキサイド９
．４ｇの溶解したテトラメチロールメタントリアクリレ
ート６２５ｇとを供給した。
５１セパラブルフラスコに、５重量％のポリビニルアル
コール水溶液２．５１と、ベンゾイルパーオキサイド９
．４ｇの溶解したテトラメチロールメタントリアクリレ
ート６２５ｇとを供給した。
混合物を攪拌しながら８０℃に昇温し、１０時間重合反
応させた。反応後、生成物を母液分離し、熱水およびア
セトンで洗浄して９粒子径５〜１５μ■の球状架橋重合
体を得た。得られた球状重合体の粒子種を均一にするた
め、水腹法で湿式分級した。
応させた。反応後、生成物を母液分離し、熱水およびア
セトンで洗浄して９粒子径５〜１５μ■の球状架橋重合
体を得た。得られた球状重合体の粒子種を均一にするた
め、水腹法で湿式分級した。
その結果１球状重合体は平均粒子径６μ−〜１０μ−（
±０．５μ麟）に分級された。粒子径はコールタ−社の
コールタ−カウンターＺＢＩＩ型で測定した。
±０．５μ麟）に分級された。粒子径はコールタ−社の
コールタ−カウンターＺＢＩＩ型で測定した。
得られた球状重合体の平均粒子径（１５Ｎ）と標準偏差
（σ）の−例を以下に示す。
（σ）の−例を以下に示す。
Ｉ５．−６．５３μ醜 σ−０，３４μ園この球状重
合体は、３７℃のＩＮ水酸化ナトリウム溶液に一昼夜放
置したところ、完全に溶解した。
合体は、３７℃のＩＮ水酸化ナトリウム溶液に一昼夜放
置したところ、完全に溶解した。
この球状重合体２ｇを０．０２モルリン酸１カリウム／
リン酸１ナトリウム生理緩衝液（ｐｔ１７．２．以下Ｐ
ＢＳとする）１０ｓｍ！中に懸濁させた。
リン酸１ナトリウム生理緩衝液（ｐｔ１７．２．以下Ｐ
ＢＳとする）１０ｓｍ！中に懸濁させた。
叉施班ｌ
実施例１のテトラメチロールメタントリアクリレ−）
６２５ｇに代えて、テトラメチロールメタンテトラアク
リレ−）５００ｇ、メタアクリル酸１２５ｇを用いたこ
と以外は、すべて実施例１と同様の操作を行い１球状の
重合体を得た。この球状重合体も３７℃でＩＮ水酸化ナ
トリウム溶液に溶解性であった。
６２５ｇに代えて、テトラメチロールメタンテトラアク
リレ−）５００ｇ、メタアクリル酸１２５ｇを用いたこ
と以外は、すべて実施例１と同様の操作を行い１球状の
重合体を得た。この球状重合体も３７℃でＩＮ水酸化ナ
トリウム溶液に溶解性であった。
実施例１と同様にして２球状重合体の平均粒子径（石、
）と標準偏差（σ）を測定した。その−例を以下に示す
。
）と標準偏差（σ）を測定した。その−例を以下に示す
。
万’Ｎ ＝７．１５μ戴 σ＝０．２４μ−ｍ工
実施例１で得られた球状重合体の懸濁液の粒子濃度は、
自動血球計算装置によりｌＸｌ０’個／ｒａβと測定さ
れた。この球状重合体と反応しうる螢光物質としてフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用した
。 ＦＩＴＣの粉末を０．１モル炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，５）に溶解させて２種々の濃度のＰＩＴＣ溶
液を用意した。ＦＩＴＣ溶液の濃度は。
自動血球計算装置によりｌＸｌ０’個／ｒａβと測定さ
れた。この球状重合体と反応しうる螢光物質としてフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用した
。 ＦＩＴＣの粉末を０．１モル炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，５）に溶解させて２種々の濃度のＰＩＴＣ溶
液を用意した。ＦＩＴＣ溶液の濃度は。
０、１０．２０．４０．５０．７０．および１００μｈ
とした。
とした。
このそれぞれのＦＩＴＣ溶液３，５ ｖｂｌと球状重
合体の懸濁液０．５ｗ＋１とを反応させ、７種類の螢光
標準粒子を合成した０反応温度３７℃にて反応時間を１
５゜３０、４５．６０．９０．および１２０分間に変え
、 Ｖ−ｖｉａｌｍｉｃｒｏ ｓ＋ｉｘｉｎｇ ｔｕｂ
ｅ （Ｗｈｅａｔｏｎ 社製）中で反応させた。反応
液の標準粒子の濃度は、先の測定値から１．２５ ｘ
１０”個／−１となる０反応後、 ４００ Ｇにて２分
間の遠心により、標準粒子をＰＢＳを用いて繰り返し洗
浄した。
合体の懸濁液０．５ｗ＋１とを反応させ、７種類の螢光
標準粒子を合成した０反応温度３７℃にて反応時間を１
５゜３０、４５．６０．９０．および１２０分間に変え
、 Ｖ−ｖｉａｌｍｉｃｒｏ ｓ＋ｉｘｉｎｇ ｔｕｂ
ｅ （Ｗｈｅａｔｏｎ 社製）中で反応させた。反応
液の標準粒子の濃度は、先の測定値から１．２５ ｘ
１０”個／−１となる０反応後、 ４００ Ｇにて２分
間の遠心により、標準粒子をＰＢＳを用いて繰り返し洗
浄した。
この標準粒子の螢光強度は、フローサイトメトリー用細
胞自動分析装置１！ＰＩＣ５−Ｖ （Ｃｏｕｌｔｅｒ社
）で測定された。操作電力０．６ Ｗ、 ４８８ｎｓｅ
のレーザーを用い、光散乱による粒子サイズのヒストグ
ラムを作成した。一方、 ５１５ｎｓ ＠収フィルター
と５１５ｎａ＋干渉フイルターで散乱光をカットしたの
ち。
胞自動分析装置１！ＰＩＣ５−Ｖ （Ｃｏｕｌｔｅｒ社
）で測定された。操作電力０．６ Ｗ、 ４８８ｎｓｅ
のレーザーを用い、光散乱による粒子サイズのヒストグ
ラムを作成した。一方、 ５１５ｎｓ ＠収フィルター
と５１５ｎａ＋干渉フイルターで散乱光をカットしたの
ち。
光電子増幅管電圧１６００Ｖで螢光強度の測定を行い。
螢光強度のヒストグラムを作成した。螢光強度のチャン
ネル番号は、螢光信号のパルスを時間に対して積分した
ものをｌｏｇ回路で増幅し、 ＡＤＣで数値化したもの
を用いた。螢光強度ヒストグラム上のモード位置のチャ
ンネル番号が粒子のもつ螢光量に相当し、これが粒子の
ＦＩＴＣ分子数に相当していると考えられる。
ネル番号は、螢光信号のパルスを時間に対して積分した
ものをｌｏｇ回路で増幅し、 ＡＤＣで数値化したもの
を用いた。螢光強度ヒストグラム上のモード位置のチャ
ンネル番号が粒子のもつ螢光量に相当し、これが粒子の
ＦＩＴＣ分子数に相当していると考えられる。
そこで各反応時間における反応液について、チャンネル
番号とＦＩＴＣ濃度とをプロットし、第１図に示した。
番号とＦＩＴＣ濃度とをプロットし、第１図に示した。
縦軸のチャンネル番号はｌｏｇ回路で増幅した信号をも
とにしているので、横軸のパラメーターは対数表示して
いる。第１図から、いずれの反応時間においても、 Ｆ
ＩＴＣ濃度とチャンネル番号とはほぼ直線関係にあるこ
とがわかる。
とにしているので、横軸のパラメーターは対数表示して
いる。第１図から、いずれの反応時間においても、 Ｆ
ＩＴＣ濃度とチャンネル番号とはほぼ直線関係にあるこ
とがわかる。
ｌ胤皿土
実施例３において、 ＦＩＴＣ溶液のｐＨを９．０．９
．５゜１０．０．１１．０に変え、同様の反応を行った
。反応条件はＦＩＴＣ濃度５０μ阿９反応温度３７℃１
粒子濃度１．２５×１０１個／ｙｓｌｌであった０反応
時間とチャンネル番号とをプロットしたところ、 ｐＨ
９，０，９，５では。
．５゜１０．０．１１．０に変え、同様の反応を行った
。反応条件はＦＩＴＣ濃度５０μ阿９反応温度３７℃１
粒子濃度１．２５×１０１個／ｙｓｌｌであった０反応
時間とチャンネル番号とをプロットしたところ、 ｐＨ
９，０，９，５では。
いずれも反応時間９０分まで９両者はほぼ直線関係であ
った。
った。
ヌｍ
実施例３において９反応温度を２２℃、３７℃、７０℃
に変え、同様の反応を行った。 反応条件は。
に変え、同様の反応を行った。 反応条件は。
ＰＩＴＣ濃度５０μＨ１粒子濃度１．２５ ｘ １０”
個／ｌ１ｉｌであ゛った０反応時間とチャンネル番号と
をプロットしたところ１反応温度２２℃、３７℃では、
いずれも反応時間１２０分★で９両者はほぼ直線関係で
あった。
個／ｌ１ｉｌであ゛った０反応時間とチャンネル番号と
をプロットしたところ１反応温度２２℃、３７℃では、
いずれも反応時間１２０分★で９両者はほぼ直線関係で
あった。
実施例３，４．５により、どのような測定条件下で、螢
光量とチャンネル番号との間に直線°性が成立するかが
検討された。
光量とチャンネル番号との間に直線°性が成立するかが
検討された。
スｍ
実施例３において、 ＦＩＴＣ溶液の濃度を０，７゜１
０、１５．２０．３０．および５０μＨとし、そのＦＩ
ＴＣ溶液と球状重合体の懸濁液とを反応させた。反応操
作は実施例３と同様に行った。反応条件は反応温度３７
℃９反応時間３０分、そしてｐＨ９，５であった。
０、１５．２０．３０．および５０μＨとし、そのＦＩ
ＴＣ溶液と球状重合体の懸濁液とを反応させた。反応操
作は実施例３と同様に行った。反応条件は反応温度３７
℃９反応時間３０分、そしてｐＨ９，５であった。
ＦＩＴＣ濃度０． ７．１０．１５．２０．３０．およ
び５０μＨに対する反応液をそれぞれＦｓｐ（０）、
Ｆａｐ（７）、 Ｆｓｐ（１０）、 Ｆｓｐ（１５）、
Ｆｓｐ（２０）、 Ｆｓｐ（３０）およびＦｓｐ
（５０）と称する。これらの螢光粒子（反応液）につい
て。
び５０μＨに対する反応液をそれぞれＦｓｐ（０）、
Ｆａｐ（７）、 Ｆｓｐ（１０）、 Ｆｓｐ（１５）、
Ｆｓｐ（２０）、 Ｆｓｐ（３０）およびＦｓｐ
（５０）と称する。これらの螢光粒子（反応液）につい
て。
実施例３と同様の装置でフローサイトメトリーを行い１
表示されたチャンネル番号とｐｔ’ｒｃ濃度とをプロッ
トし、第２図に示した。この図も、実施例３と同様の理
由から、横軸のパラメーターは対数表示している。
表示されたチャンネル番号とｐｔ’ｒｃ濃度とをプロッ
トし、第２図に示した。この図も、実施例３と同様の理
由から、横軸のパラメーターは対数表示している。
球状重合体は、実施例１に示すように、３７℃のＩＮ水
酸化ナトリウム溶液に一昼夜放置すれば完全に溶解する
。したがうて、上記螢光粒子（反応液）を水酸化ナトリ
ウムに溶解させて螢光強度を測定し、この螢光強度とｒ
ｅｆｅｒｅｎｃｅのＦＩＴＣ溶液の螢光強度とから粒子
１個あたりのＦＩＴＣ分子数が算出できる。
酸化ナトリウム溶液に一昼夜放置すれば完全に溶解する
。したがうて、上記螢光粒子（反応液）を水酸化ナトリ
ウムに溶解させて螢光強度を測定し、この螢光強度とｒ
ｅｆｅｒｅｎｃｅのＦＩＴＣ溶液の螢光強度とから粒子
１個あたりのＦＩＴＣ分子数が算出できる。
粒子懸濁液の粒子濃度を、自動血球計算装置により測定
した後、この粒子懸濁液を１．ＯＮ水酸化ナトリウム溶
液とした。これとは別に９種々の濃度のＦＩＴＣの１．
ＯＮ水酸化ナトリウム溶液も用意された。
した後、この粒子懸濁液を１．ＯＮ水酸化ナトリウム溶
液とした。これとは別に９種々の濃度のＦＩＴＣの１．
ＯＮ水酸化ナトリウム溶液も用意された。
これらの水酸化ナトリウム溶液を３７℃にて１７時間イ
ンキエベイトした後、螢光分光光度計により螢光強度を
測定した。この螢光強度とＦＩＴＣ濃度との関係を検量
線とし、螢光粒子の溶解液の螢光強度に相当する螢光物
質の濃度を求めた。螢光粒子懸濁液に入っていた液の粒
子濃度は測定されているので、この両者から螢光標準粒
子１個あたりのＰＩＴＣの分子数が算出できる。
ンキエベイトした後、螢光分光光度計により螢光強度を
測定した。この螢光強度とＦＩＴＣ濃度との関係を検量
線とし、螢光粒子の溶解液の螢光強度に相当する螢光物
質の濃度を求めた。螢光粒子懸濁液に入っていた液の粒
子濃度は測定されているので、この両者から螢光標準粒
子１個あたりのＰＩＴＣの分子数が算出できる。
各Ｆｓｐ（ｎ） （ｎ −０，７，１０，１５，２０，
３０，５０）反応液についてＦＩＴＣ分子数を求め、こ
れとＦＩＴＣ濃度とをプロットし、第３図に示した。第
２図および第３図から９粒子１個当たりのＦＩＴＣ分子
数とチャンネル番号との関係を求め、さらに第４図を作
成した。この第４図は、未知量のＦＩＴＣを有する細胞
の検量線として有用である。
３０，５０）反応液についてＦＩＴＣ分子数を求め、こ
れとＦＩＴＣ濃度とをプロットし、第３図に示した。第
２図および第３図から９粒子１個当たりのＦＩＴＣ分子
数とチャンネル番号との関係を求め、さらに第４図を作
成した。この第４図は、未知量のＦＩＴＣを有する細胞
の検量線として有用である。
（応用例）
このようにして得られた検量線を用いると９例えば、リ
ンパ球表面上に結合した抗体分子数が次のようにして測
定されうる。
ンパ球表面上に結合した抗体分子数が次のようにして測
定されうる。
多重ＪＬＬ
ヒトリンパ球の細胞表面には種々の分化抗原が存在する
。成熟Ｔ細胞の分化抗原の一つをいま仮りにＴ、抗原と
する。このＴ３抗原に対して作製されたモノクローナル
抗体の一つに、 ０ＫＴ−３抗体（Ｏｒｔｈｏｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ社製）がある。この０ＫＴ−３をヒトリ
ンパ球と反応させると、リンパ球表面上のＴｓ抗原に０
ＫＴ−３抗体が結合する。この抗体にはＦＩＴＣが結合
されているので、Ｔ、抗原をもつリンパ球はその表面に
ＦＩＴＣが結合した形になる。このようなリンパ球をフ
ローサイトメト、リーで測定することにより、リンパ球
表面上に結合した抗体分子数を測定した。
。成熟Ｔ細胞の分化抗原の一つをいま仮りにＴ、抗原と
する。このＴ３抗原に対して作製されたモノクローナル
抗体の一つに、 ０ＫＴ−３抗体（Ｏｒｔｈｏｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ社製）がある。この０ＫＴ−３をヒトリ
ンパ球と反応させると、リンパ球表面上のＴｓ抗原に０
ＫＴ−３抗体が結合する。この抗体にはＦＩＴＣが結合
されているので、Ｔ、抗原をもつリンパ球はその表面に
ＦＩＴＣが結合した形になる。このようなリンパ球をフ
ローサイトメト、リーで測定することにより、リンパ球
表面上に結合した抗体分子数を測定した。
螢光標準粒子Ｆｓｐ（５０）をＰＢＳに懸濁し、ｌＸ１
０’個／ｍｊ！の粒子濃度とした。既知量のＦＩＴＣを
０．１Ｎ−ＮａＯＨに溶かした溶液をｒｅｆｅｒｅｎｃ
ｅとして、このＦｓｐ（５０）懸濁液の螢光量を測定す
ると、 １０ｎＭのＦＩＴＣ溶液に相当するものであっ
た。この結果からＦｓｐ （５０）の標準粒子１個あた
りのもつ螢光量が計算された（ １．０Ｘ１０−＠ｎＭ
ＦＩＴＣ溶液に相当）。Ｆｓｐ（５０）は。
０’個／ｍｊ！の粒子濃度とした。既知量のＦＩＴＣを
０．１Ｎ−ＮａＯＨに溶かした溶液をｒｅｆｅｒｅｎｃ
ｅとして、このＦｓｐ（５０）懸濁液の螢光量を測定す
ると、 １０ｎＭのＦＩＴＣ溶液に相当するものであっ
た。この結果からＦｓｐ （５０）の標準粒子１個あた
りのもつ螢光量が計算された（ １．０Ｘ１０−＠ｎＭ
ＦＩＴＣ溶液に相当）。Ｆｓｐ（５０）は。
実施例６で算出したように、標準粒子１個あたり。
３．５ Ｘｌｏｈ個のＦＩＴＣ分子を持っている。それ
ゆえ、ＦＩＴＣＩ分子がこの粒子に結合し、 ＰＢＳ中
で発する螢光量は１．０Ｘ１０−”／３．５Ｘ１０’
＝２．８６Ｘ１０−１ＳｎＭのＦＩＴＣ溶液（０，ｌＮ
−Ｎａ０Ｈ）に相当する。ところで実施例６の第４図の
結果から、 Ｆｓｐ（７）〜Ｆｓｐ（５０）の各螢光標
準粒子では、結合したＦＩＴＣ分子数とチャンネル番号
で表示される螢光強度との間には直線関係が保証されて
いるから、 Ｆｓｐ（７）〜Ｆｓｐ （５０）の各々が
ＰＢＳ中で示す螢光量は、 ＦＩＴＣ分子数に２．８６
Ｘ １０− ” ｎＭをかけた量のＦＩＴＣ溶液の濃度
（０，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ）に相当することになる。
ゆえ、ＦＩＴＣＩ分子がこの粒子に結合し、 ＰＢＳ中
で発する螢光量は１．０Ｘ１０−”／３．５Ｘ１０’
＝２．８６Ｘ１０−１ＳｎＭのＦＩＴＣ溶液（０，ｌＮ
−Ｎａ０Ｈ）に相当する。ところで実施例６の第４図の
結果から、 Ｆｓｐ（７）〜Ｆｓｐ（５０）の各螢光標
準粒子では、結合したＦＩＴＣ分子数とチャンネル番号
で表示される螢光強度との間には直線関係が保証されて
いるから、 Ｆｓｐ（７）〜Ｆｓｐ （５０）の各々が
ＰＢＳ中で示す螢光量は、 ＦＩＴＣ分子数に２．８６
Ｘ １０− ” ｎＭをかけた量のＦＩＴＣ溶液の濃度
（０，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ）に相当することになる。
一方、 ＦＩＴＣで標識された０ＫＴ−３抗体の一定量
をＰＢＳで希釈し、 ＦＩＴＣの０． ｌＮ−ＮａＯＨ
溶液をｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして螢光量を測定すると、
標識０ＫＴ−３の１１００ｎ／−！溶液は１３ｎＭのＦ
ＩＴＣ溶液の螢光量に相当するものであった。０ＫＴ−
３抗体（マウスＩｇＧｇａ）の分子量を１５０．０００
とすれば、その分子数が算出される。
をＰＢＳで希釈し、 ＦＩＴＣの０． ｌＮ−ＮａＯＨ
溶液をｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして螢光量を測定すると、
標識０ＫＴ−３の１１００ｎ／−！溶液は１３ｎＭのＦ
ＩＴＣ溶液の螢光量に相当するものであった。０ＫＴ−
３抗体（マウスＩｇＧｇａ）の分子量を１５０．０００
とすれば、その分子数が算出される。
ソレユえ、 ＦＩＴＣ８［ｍ ０ＫＴ−３抗体１分子の
発する螢光量は３．２５Ｘ１０−−４ｎＭのＦＩＴＣ溶
液（０，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ）に相当する。
発する螢光量は３．２５Ｘ１０−−４ｎＭのＦＩＴＣ溶
液（０，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ）に相当する。
ヒト末梢血より比重遠心法でリンパ球を集め。
抗体過剰の条件下で０ＫＴ−３抗体と反応させる。洗浄
後にこのリンパ球をフローサイトメーターで測定して、
螢光強度のヒストグラム上のモードの位置を求めるとチ
ャンネル番号３５であった。測定条件は実施例６の第４
図と同一である。この第４図の検量線から、チャンネル
番号３５のときのＦＩＴＣ分子数がわかる（５Ｘ１０’
個） 、 ＦＩＴＣＩ分子の螢光量は２．８６Ｘ１０−
”ｎＭのＦＩＴＣ溶液（０，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ）に相当す
るから、そのリンパ球１個のもつ螢光量はく５ ＸＩＯ
’ ） Ｘ （２，８６Ｘ１０−” ）−１４，３Ｘ１
０−＠ｎＭ。
後にこのリンパ球をフローサイトメーターで測定して、
螢光強度のヒストグラム上のモードの位置を求めるとチ
ャンネル番号３５であった。測定条件は実施例６の第４
図と同一である。この第４図の検量線から、チャンネル
番号３５のときのＦＩＴＣ分子数がわかる（５Ｘ１０’
個） 、 ＦＩＴＣＩ分子の螢光量は２．８６Ｘ１０−
”ｎＭのＦＩＴＣ溶液（０，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ）に相当す
るから、そのリンパ球１個のもつ螢光量はく５ ＸＩＯ
’ ） Ｘ （２，８６Ｘ１０−” ）−１４，３Ｘ１
０−＠ｎＭ。
ｐＩｒｃｆｓ液（０，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ） ニ相当する。
既に述べたように、 ＦＩＴＣ［識ＯＫ？−３抗体１分
子は、 ３．２５Ｘ１０−１４ｎＭのＦＩＴＣ溶液（０
，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ）に相当する螢光量をもっているので
、このリンパ球１個に結合シタ０ＫＴ−３抗体の分子数
は１４．３ Ｘ １０− ” ／３．２５ＸＩＯ−１４
＝ ４．４Ｘ１０’個となる。この数値は放射性同位元
素口Ｉｔ％）をラベルした０ＫＴ−３抗体を用いて行っ
た実験結果（Ｖａｎ Ｗａｕ賀ｅ、 ｅｔ ａｌ＋ Ｊ
−ｒｍｍｕｎｏｌ １２８ ： ２７０８．１９８０）
とほぼ同じものである。
子は、 ３．２５Ｘ１０−１４ｎＭのＦＩＴＣ溶液（０
，ｌＮ−Ｎａ０Ｈ）に相当する螢光量をもっているので
、このリンパ球１個に結合シタ０ＫＴ−３抗体の分子数
は１４．３ Ｘ １０− ” ／３．２５ＸＩＯ−１４
＝ ４．４Ｘ１０’個となる。この数値は放射性同位元
素口Ｉｔ％）をラベルした０ＫＴ−３抗体を用いて行っ
た実験結果（Ｖａｎ Ｗａｕ賀ｅ、 ｅｔ ａｌ＋ Ｊ
−ｒｍｍｕｎｏｌ １２８ ： ２７０８．１９８０）
とほぼ同じものである。
（発明の効果）
本発明のフローサイトメトリー用螢光標準粒子は、この
ように、そこに保有される螢光分子数が合成過程で簡単
に決定されるため、螢光分子数とチャンネル番号との検
量線が容易に得られる。その結果、細胞中の特定物質の
定量が可能である。
ように、そこに保有される螢光分子数が合成過程で簡単
に決定されるため、螢光分子数とチャンネル番号との検
量線が容易に得られる。その結果、細胞中の特定物質の
定量が可能である。
４、 の な
第１図は、実施例３において１本発明の螢光標準粒子を
フローサイトメトリー測定したときの。
フローサイトメトリー測定したときの。
ＦＩＴＣ濃度とチャンネル番号との関係を示す片対数グ
ラフである。第２図は、実施例６において同様の測定を
したときの、 ＦＩＴＣ濃度とチャンネル番号との関係
を示す片対数グラフである。第３図は。
ラフである。第２図は、実施例６において同様の測定を
したときの、 ＦＩＴＣ濃度とチャンネル番号との関係
を示す片対数グラフである。第３図は。
実施例６において算出された螢光分子数とＦＩＴＣ濃度
との関係を示すグラフである。第４図は、第２図および
第３図をもとに作成されたグラフであり。
との関係を示すグラフである。第４図は、第２図および
第３図をもとに作成されたグラフであり。
螢光分子数とチャンネル番号との関係を示す片対数グラ
フである。
フである。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、イソシアネート基またはチオイソシアネート基と反
応し得る反応性基を少なくとも表面に有する重合体から
なる球状粒子と、イソシアネート基またはチオイソシア
ネート基を有する螢光物質とを反応させて得られるフロ
ーサイトメトリー用螢光標準粒子。 ２、前記重合体がアルカリ溶解性であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載のフローサイトメトリー
用螢光標準粒子。 ３、前記螢光物質がフルオレセインイソチオシアネート
である特許請求の範囲第１項に記載のフローサイトメト
リー用螢光標準粒子。 ４、前記重合体が、一官能性単量体および／もしくは多
官能性の不飽和エステル単量体を重合させてなる特許請
求の範囲第１項に記載のフローサイトメトリー用螢光標
準粒子。 ５、前記一官能性単量体が、（メタ）アクリルアミド、
（メタ）アクリル酸、２−ヒドロキシエチル（メタ）ア
クリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、および
グリセロールモノ（メタ）アクリレートのうちの少なく
とも一種である特許請求の範囲第４項に記載のフローサ
イトメトリー用螢光標準粒子。 ６、前記多官能性の不飽和エステル単量体が、テトラメ
チロールメタントリアクリレート、テトラメチロールメ
タンジアクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレ
ート、ポリエチレングライコールジグリシジルエーテル
ジ（メタ）アクリレート、およびポリプロピレングライ
コールジグリシジルエーテルジ（メタ）アクリレートの
うちの少なくとも一種である特許請求の範囲第４項に記
載のフローサイトメトリー用螢光標準粒子。 ７、前記多官能性の不飽和エステル単量体が、テトラメ
チロールメタンテトラアクリレート、トリメチロールプ
ロパントリアクリレート、グリセロールトリ（メタ）ア
クリレート、ポリエチレングライコールジ（メタ）アク
リレート、およびポリプロピレングライコールジ（メタ
）アクリレートのうちの少なくとも一種であって、一官
能性単量体の共単量体として使用されるフローサイトメ
トリー用螢光標準粒子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6417885A JPS61223559A (ja) | 1985-03-28 | 1985-03-28 | フロ−サイトメトリ−用螢光標準粒子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6417885A JPS61223559A (ja) | 1985-03-28 | 1985-03-28 | フロ−サイトメトリ−用螢光標準粒子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61223559A true JPS61223559A (ja) | 1986-10-04 |
| JPH0518061B2 JPH0518061B2 (ja) | 1993-03-10 |
Family
ID=13250546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6417885A Granted JPS61223559A (ja) | 1985-03-28 | 1985-03-28 | フロ−サイトメトリ−用螢光標準粒子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61223559A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002084290A1 (fr) * | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede permettant de quantifier l'expression d'antigenes |
-
1985
- 1985-03-28 JP JP6417885A patent/JPS61223559A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002084290A1 (fr) * | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede permettant de quantifier l'expression d'antigenes |
| US7776612B2 (en) | 2001-04-13 | 2010-08-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of quantifying antigen expression |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0518061B2 (ja) | 1993-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100215348B1 (ko) | 다중분석물을 동시 검정하는 입자 응집 반응법 및 이를 위한 광학 유동입자 분석기 | |
| CA1248873A (en) | Particles and procedures for the determination of antigens and/or antibodies using the particles | |
| US5567627A (en) | Method and composition for the simultaneous and discrete analysis of multiple analytes | |
| US11726031B2 (en) | Fluorescent spectrum correcting method and fluorescent spectrum measuring device | |
| JP2638085B2 (ja) | 生物特異的な多重分析物アッセイ法 | |
| EP1558934B1 (en) | A method for assessment of particles | |
| JP3623513B2 (ja) | 免疫蛍光法による調査のための走査毛細管におけるサンプルの調製方法 | |
| US5776711A (en) | Simultaneous human ABO and RH(D) blood typing or antibody screening by flow cytometry | |
| US3853987A (en) | Immunological reagent and radioimmuno assay | |
| JPS61228349A (ja) | 染色細胞をシミユレ−トする螢光検定ミクロビ−ド | |
| JPS61225656A (ja) | 検体検査装置 | |
| CN1449495A (zh) | 重现性良好的凝聚免疫分析法及其试剂 | |
| Sankova et al. | Spectrally encoded microspheres for immunofluorescence analysis | |
| JPH0572113A (ja) | 微粒子計測方法及び微粒子を使用した定量方法 | |
| JPS61223559A (ja) | フロ−サイトメトリ−用螢光標準粒子 | |
| US20090246805A1 (en) | Method for classifying and counting basophils | |
| JPH02170053A (ja) | 微生物の検出方法及び装置 | |
| US20220155308A1 (en) | Lyophilized antibody panel | |
| KR101424720B1 (ko) | 신규한 혈소판 활성 측정 방법 및 그를 이용한 장치 | |
| JPS61110032A (ja) | 生理活性物質の検出方法 | |
| Deutsch et al. | Fluorescence polarization as an early measure of T-lymphocyte stimulation | |
| JP4054500B2 (ja) | 抗原、抗体及びｄｎａ等の核酸を検出用のプローブとして用いた多項目検査方法 | |
| US20050175979A1 (en) | Methods for absolute cell counting | |
| CN111239029A (zh) | 时间分辨流式荧光检测分析装置及其使用方法 | |
| JPS61290362A (ja) | 微粒子測定法 |