JPS61110032A - 生理活性物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫学的検査における生理活性物質の検出方
法に関するものである。さらに詳しくは、粒子状担体に
免疫活性物質を固定化してなる免疫活性粒子を用いてヒ
トまたは動物の体液中成弁の検出、もしくは測定、ある
いは細胞を識別する免疫学的検査法において担体粒子の
凝集状態を光回折技術を用いて定ｍ的に測定する生理活
性物質の検出方法に関するものである。

［従来の技術］ 生体の生理活性に関与する物質は慨して微量であり、し
かも生体に対して非常に重要な役割を演じるものが少な
くない。したがって、このような微量の生理活性物質を
検出することは医学、生化学等の生物関連分野にとって
は重要であり、そのための種々の方法が考案され、実用
化されている。

そのうち、放射性同位元素、化学発光物質、螢光物質な
どを用いて標識する免疫測定は非常に高精度であるが、
装置が大がかりであり測定をするに当り特殊な技術を必
要とする。さらにこの方法は結果を出すのに時間を要し
、臨床現場などで直ちに結果を必要とする目的には不適
当である。

また、簡便な方法として、目的とするｉｎ物質を直接捕
捉するのではなく、生理活性物質の大部分がそれと相補
的な物質を選択性良く検出し、結合してコンプレックス
をつくる事実を利用する方法（例えば、抗原−抗体反応
）がある。この場合、まず相補物質を微小担体に固定化
させたものを適当な媒体中に分散させる。そしてこれに
目的とする物質を含む溶液を混合すると、両物質が選択
的に結合することにより担体が凝集するので、その凝集
状態を観察するのである。

″Ｉｋ集状層状態ｌ察するには、従来からいくつかの方
法が用いられてきた。そのうち、マイクロプレート法は
微小凹部に種々の濃度の目的試薬を入れ、一定時間経過
後の沈降パターンの違いから陰陽の判定をするものであ
る。しかしながら、この方法では定性的な比較判定を行
なうためパターンに中間段階がある場合、その判定の境
界に個人差が生じていた。またスリッピングという一種
の沈降凝集塊の崩れによるパターンの乱れが生じた場合
には判定を誤ったり判定不能となる場合があった。

また、別の方法として顕微鏡で直接ｍｌ察する方法もあ
る。この場合には視野内の凝集塊の状態を見て同じく陰
陽判定を行なう。しかし、この方法に於いても、視野に
よる凝集状態のバラツキや観察者の主観などが入るので
判定に個人差が生じやすい。さらに、従来から一般的に
用いられていた粒子は、慨して０．５μ−以下であり、
可視光変長より短いものが多かつ、た。そのため、粒子
そのものは顕微鏡下では直接見えず、凝集状態は凝集が
相当進行し、可視化できる大きさになって始めて認識で
きるため、弱い凝集の場合は判定が困難であった。また
、これらの方法は熟練を要し、さらには人力によるため
、多数の測定をこなすことが困難でありた。

機器を用いる方法としては、濁度や光散乱強度を測定す
る方法などがある。例えば、凝集状態の変化を濁度の変
化として光学的に見る方法としては、特開昭５７−１４
９９５１号公報に見られる技術や文献（Ｌ　Ａ　−Ｓ　
ｙｓｔｅｍによるＣＲＰ定ｍ測定、Ｊ、Ｊ、Ｃ，Ｌ、Ａ
、　、ＶＯＬ、８、Ｎ００１、ｐ、１６１〜１６５．１
９８３）等を掲げることができる。

これらの方法は装置を用いて結果を客観化できるという
利点はあるものの、用いる試薬が多山であったり、また
、試料を均一にするため撹拌する必要がある等、取扱い
上に問題があった。さらに、これらの方法では、被検液
での透過光や散乱光の強度変化のみを見るというような
散乱源となる凝集塊の情報の一部のみを利用するだけで
あり、例えば、不純物が混入しているような場合、それ
らを除去することが精度の良い測定に不可欠であったり
、場合によっては、そのための複雑な前処理が必要とな
ることがあった。

以上説明した様に、従来技術においては、必ずしも得ら
れたデータの再焼性、客観性は十分であるとは言えなか
った。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、光回折技術を用いてこのような従来の
方法の持つ欠点を改良し、゛観察者の主眼による判定基
準の曖昧さを除去して、凝集状態を客観的に、しかも少
ない試薬量で定量化する生理活性物質の検出方法を提供
することにある。

Ｌ問題点を解決するための手段】 本発明は０．１〜１０μ鋼、より好ましくは０．１〜６
μ綱と光の波長より少し小さいか士数倍の微小粒子がフ
ヒーレントな光によって生じる回折パターンを光学的手
段を用いて検出する。そして、その対象物たる微小粒子
の凝集による外形形状および大きさの変化を回折パター
ンの変化としてとらえることにより、凝集状態に関する
情報を数値化して、それによって凝集の程度まで定ｍ化
することを特徴としている。すなわち、本発明にかかる
方法では、１点での光強度を測定するのではなく、光の
分布状態を測定することによって凝集状態を判別するの
であり、必然的に外来雑音に強く信頼性の高い測定結果
が得られる。なお、回折パターンの認識には通常のパタ
ーン認識で使用される面積差、相互相関、あるいはマツ
チドフィルター等による手段が適応できる。

［作用］ 以下、本発明の原理について詳述する。

光と物体の相互作用において、光の波長に対して物体が
充分小さく近似的に点と見做してよい場合の散乱をレイ
リー（Ｒａｙｌｅｉａｈ　）散乱と言う。

この場合は一般的に散乱体の形状に関する情報は含まれ
ていない。一方、物体が波長より少し小さいか同程度以
上である場合、物体内の各点からの散乱は互いに干渉す
る。これを回折ともいう。この回折パターンは物体内各
点からの散乱光を位相も含めて全体積にわたり積分する
ため、その物体の持つ光学的特性、大きさ、形状などの
情報を反映している。本出願において扱う粒子は丁度後
者の場合に相当している。この様な微小粒子を均一な光
学的な場装置いた場合に得られる光の回折については色
々な場合について論じられている（Ｍｉｅ、　［）ｅｂ
ｌ／１３の理論等）。ここで本出願の意図する所をわか
りやすく説明するために話をごく簡単化して説明する。

すなわち、微小粒子が光学的に不透明で、しかもそれが
球状形状をしており、その断面形状より円形の吸収体で
あるとする。この場合については次に述べるような文献
に詳細に議論されている。

Ｐ　ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　　ｏｆ　　ＯｐｔｉＣ３Ｍ　
ａＸ　　８０ｒｎ＆　　Ｅｍｉｔ　　Ｗｏｌｆ Ｐｅｒｇａｍｏｎ　　Ｐｒｅｓｓ　　ｐ、　３９５以下
第２図を用いて、本発明の原理について説明する。今、
簡単のため、均一な平面光波の場に置かれた粒子Ｓが１
個ある場合を考える。ただし、Ｓは上記のような仮定を
満たし、その直径はＲであるとする。

Ｓがレンズ（焦点距離ｆ）を介して焦点面上に作るフラ
ウンホーファー回折パターンの強度分布は、 と表わせる。ここでｒ＜ｘ＞はレンズＬの焦点面上で、
かつ光軸中心Ｏから距離Ｘにある点Ｐでの強度であり、
Ｊｌは１次のベッセル関数である。

ここでＸ′は、 と表わせる。

なお、λは用いた光の波長、ｆはレンズＬの焦点距離で
ある。もし粒子Ｓが１個だけではなく同じ形状のＮｇの
粒子が分散して存在するのであれば、各々の粒子の回折
波面を無事面上で位相を考處して加算し、それを２乗し
たものが回折パターンの強度分布となる。しかしこの場
合、平行光束により照らされたＮｖＡの粒子の回折光波
の互いの位相関係はランダムであり、回折粒子が十分に
多い時には事実上、統計的に無相関であると考えること
が可能である。この条件は実際上、第２図のような光学
系では十分溝たされている。なぜなら、たとえ、十分コ
ヒーレントな光で照明したとしても、担体粒子を分散さ
せている媒体溶液の屈折率ゆらぎ、粒子表面の微細な反
射率の分布等により、互いの粒子間の回折波の位相関係
は乱れてしまうからである。

上述の理由によって、この様なＮ個の粒子がある場合、
それらのＰ点での光強度のフラウンホーファー回折パタ
ーンの強度は粒子の位置によらないので（但し、位相は
粒子の位置によって異なる。

）、 とＮ個の個々の粒子の回折パターンの強度の重ね合せと
して示される。

今、本発明における場合を考えると、凝集反応が生ずる
前には、多数の粒子は互いに同じ形状で各々独立に媒体
中に分散している。これらの粒子の作る回折パターンは
（３）式で示される強度分布を持っており、粒径がそろ
っている場合には、式中のＸに含まれる粒径Ｒが一定の
ため全体のパターンはきわめて規則的なものとなってい
る。凝集が進行し、各々の粒子が互いに結合してくると
、見かけ上の粒径がＲと興なるものが生じてくる。

（３）式で容易に判るようにベッセルで示されるＪｌの
周期パターンの周期がそれぞれの粒径ごとに異なり、そ
れがＰ点上で重ね合されることとなり、最初の規則パタ
ーンが崩れてくることになる。この均一分散の示すパタ
ーンからのずれは生じた凝集塊の程度に忠実に対応して
いる。

ここで、実際に用いられる担体粒子が透明であるような
場合には上述の単なる形状による回折パターンのみでな
く、内部に入る屈折波や、内部での多虫反射波等による
回折パターンへの寄与も厳密には考慮する必要があるが
、本発明における基本パターンからの変化として凝集塊
の生成を判定する場合、各々の粒子が光学的にほぼ同等
と見なぜ、また各々独立に回折パターン強度に寄与する
という条件下では、このような厳密な考察は必要でなく
、結果として、ここで述べたような回折パターンの変化
として凝集生成をとらえられることは明らかである。

本発明における微小担体粒子としては、ヒトを含む咄乳
動物や鳥類の赤血球、カオリン、炭素などの無機物の粒
子、天然ゴムラテックスやポリスチレン、カルボキシル
化スチレン−ブタジェンコポリマー、アクリロニトリル
ポリマー、塩化ビニル−アクリレートコポリマー、メタ
クリル酸ポリマー、さらには、メタクリル醗グリシジル
共重合体などの有機高分子化合物のラテックスなどを用
いることができる。なお、このような担体粒子に固定化
し、免疫学的な生理活性物質の検出に利用することがで
きると思われる物質と、それにより検査できると考えら
れる項目の一例を第１表に掲げる。

第１表、凝集反応検出に使用できる分野また、本発明は
単に生理活性物質を固定化するための微粒子担体として
ではなく、例えば血小板自体の凝集反応の測定や、赤血
球、白血球細胞の形状の変化や分布を測定したり、形状
の異なる異秤細胞の識別にも利用でき、さらには特定の
細胞と選択的に結合する物質を固定化した粒子状担体を
用いて、その粒子が細胞と結合するか否かに本って細胞
を識別するというような手段にも利用可能である。

さらに言及すれば、本発明はこのような生物的分野に限
らず、高分子ラテックスの粒径分布の測定や該ラテック
スの液中での分散状態のモニターにも応用でき、また、
無機物質、例えば金属等の微粒子やセラミック微粉末の
粒径分布の測定等にも用いることができる。あるいは、
微粒子の製造工程での製品の品質管理で本発明の方法に
よる回折パターンを基準パターンとして製品ロフトごと
のパターンと比較し、両者の差が一定の範囲内に収まる
ようにＯット管理に適用するような使用法にも本発明の
原理が適用可能であることは明らかである。

以上詳述した様に、本発明は本質的に周囲と光学的に差
異のある微粒子の形状、大きさ、結合状態やその変化を
光回折技術を用いて検知し、それらの情報を数置化、定
量化する生理活性物質の検出方法であり、以上に述べた
様な微粒子を用いる限り、本発明の目的に対して特に支
障のあるものではない。

第１図は本発明を実施するために用いた測定装置のブロ
ック図である。レーザ等の光源１から出た光ビームはエ
クスパンダ２、アパーチャ３で適当な大きざの平行光束
にされた後、試料セル部４に照射される。試料セル部４
には試料保持殿構部１５が付いており、コントローラ部
１２で温度制御等が可能である。４で回折された光はフ
ーリエ変換レンズ５で広平面６上に回折パターンとして
結像され、その強度分布は光電管７を用いて測定される
。７はスキャン部８によって６上を走査され求める強度
分布パターンを測定する。スキャン部８は走査制御部１
０で制御され、光電管７が検出している６上での位置情
報をコントローラ部１２に与える。一方、７で得た光強
度信号はアンプ・フィルタ部１１で処理され、回折パタ
ーン強１文信号としてコントローラ部１２に与えられる
。

コントローラ部１２は、これらの情報をもとにパターン
分布を再構成する。そしてコントローラ部１２は基準パ
ターンとの差をしかるべき手順で数値化したり、グラフ
、あるいは粒径分布の計算等の処理を行なう。

この様にして得た結果はディスプレイ装置１３に出力さ
れる。

実施例１ 第３図には、本測定法で求められた粒体の回折強度パタ
ーンを示しである。用いた試料の調整方法は次の通りで
ある。メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸２−ヒド
ロキシエチル及びトリエチレングリコールジメタクリレ
ートを　８５．７／９．５／４．８　（モル比）の割合
で、プロピオン酸エチルと四塩化炭素（重回比１：１）
からなる溶媒中で混合し、■−６５を開始剤として４５
℃、１６時間で共重合した。この粒子をアセトン中ビク
トリアブルーを用いて青色に染色した後、８％アンモニ
ア水溶液で４０℃、２．５時間処理してメタクリル酸グ
リシジル由来のエポキシ基をアミン基とした。さらに、
０．１６％希硫酸水溶液中で５０℃、２４時間処理して
残存エポキシ基を加水分解開環した。このように、調整
した粒子を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したアルギン酸
ナトリウムの水溶液で処理し、洗浄し、リン酸バッファ
ー中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と反応させ目的とす
る粒子を得た。以下、この粒子をＢＳＡ固定化粒子と略
す。

このＢＳＡ固定化粒子をざらに洗浄後、ヒト血清アルブ
ミン（Ｈ８Ａ）を１％含むリン酸バッファ中に分散さき
、容積比で０．０６２５％に混ぜたものを用いた。顕微
鏡で均一に分散していることを確認後、試料セル部に注
入し、その回折パターンを光電管を介して測定した。要
した試液量は２２μαであった。

第３図（ａ）は粒径３μｍのＢＳＡ固定化粒子の場合で
あり、焦点距離１２５１１１ｍのレンズを用い、黒率面
上での光軸位置を原点とし、Ｘ軸は原点からの距離、Ｙ
軸は回折パターンの強度に原点からの距離を掛けたちの
を示しである。これは、粒径による周期的な回折パター
ンを強調するために行なった演算処理であり、データ自
体の判定には全く関与しない処理である。

第３図（ｂ　）は同じく６μｍ径のものである。

両者を比較すると、明らかに粒径の違いによる回折パタ
ーンに差が生じている。

第３図（Ｃ）は全体の粒子濃度が同じく０．０６２５％
となるようにし、各々６μｍと３μｍの粒径のものを等
濃度で１：１の割合で混合したものである。（ａ　）と
（ｂ　）の各々の周期性の中間の状態が表われている。

これは両者の粒径のものの混合比を連続的に変えること
により、（ａ　＞から（ｂ　）へと連続的に変わるもの
である。

この様に本発明による測定法に於ては、異なる粒径のも
のが混在することにより回折パターンが変化し、その変
化の程度は混合比により一意的に決る。例えば、凝集に
より均一な粒径の分散系の内に凝集塊が生じた場合、そ
の塊は異なる粒子として回折を生じ、ここでのｔ２１（
ｃ）の様にもとの基本パターンとずれたパターンを与え
る。

実施例２ 第４図は粒径３μｍのＢＳＡ固定化粒子を用いた濃度０
．１２５％の分散溶液に、所定の抗ＢＳＡ抗血清液を倍
々希釈していったものをそれぞれ１：１の容積比で混入
し、最終粒子７１１度を０．０６２５％に調整し、数分
間励振し、２時間静置後、沈降したものを再びごくゆる
やかに震盪させ、スポイトで試料セル部に注入し、本発
明による測定法で回折パターンをとったものである。

なお、各試料は、従来法と比較するため、マイクロプレ
ート法でも同じ濃度で測定し凝集の有無を判定した。さ
らには必要に応じて顕微鏡下でも観察した。データに見
られる周期性は主に（３）式でのベッセル関数Ｊ１から
出ている。データ処理として、個数Ｎのバラツキによる
寄与をなくするため、各々第２番目のピークで規格化し
、さらには強度Ｉｋ：原点からの距離Ｘの２乗をかけて
対数をとり、縦＠　Ｉ　ｎｏｒｍａｌハ となるように計陣処理を施した。

第４（ａ）図は抗ＢＳＡ抗血清原液を３２０倍希釈した
もので、■は比較基！４（以下、コントロールと称す。

）用に抗血清を含まない液、◎は含む液を用いたもので
ある。以下、■、◎の意味は全て同じである。（ｂ）は
１２８０倍希釈、（Ｃ）は２５６０倍、（ｄ　’）は５
１２０倍希釈である。

希釈度が増すに従い、抗血清濃度が下がるため、マイク
ロプレート、顕微鏡でいずれも凝集反応は生じにくくな
っている。本発明の方式の結果では■のコントロールに
対する回折パターンの変化は３２０．１２８０倍は大体
同じであるが、２５６０倍では違いは少なくなり、５１
２０倍希釈では■のコントロールと◎との差は殆どなく
なっている。マイクロプレート法では５１２０倍は陰性
、３２０．１２８０倍は陽性で１２８０倍は判定の境界
であった。両者を比べて陰陽判定ではマイクロプレート
法と同じ結果となった。

また、顕微鏡観察では２５６０倍は凝集しているものの
、３２０，１２８０倍に比べ、凝集塊が視野内で少く、
塊の大きさもかなり小さかった。

定遣的な判定をするため、−例として、このグラフ上で
の■と◎の両者の面積差をＸ−２５ｍａ＋がら７５ｍｍ
の間で比べて見ることとすると、第２表に示すように５
１２０倍に比べ３２０倍と１２８０倍は共におよそ８倍
程度の差があった。

第２表 また、中間である２５６０倍では値も中間の値を示し、
顕微鏡観察とよく対応して定量性もあることが明らかで
ある。

他の判定法としては例えば、周期パターンの山と谷との
差の大小をもとることができる。この方法でも上述の様
な判定が正しく行なえることは図を見ても明らかである
。

実施例３ 第５図は粒径６μｍのＢＳＡ固定化粒子を、濃度０．１
２５％の分散溶液に調整し、抗ＢＳＡ抗血清液原液を所
定の倍率に希釈したものと、コントロール用として抗Ｂ
ＳＡ抗体を含まない血清液を同倍率に希釈したものとを
用い、両者を比較したものである。

混合比は共に１＝１とし、コントロール、試料共、粒子
の最終濃度は０．０６２５％に調整した。

また、凝集状態の比較検証のため、同希釈度でのマイク
ロプレート法測定、顕微鏡下での観察も同時に行なった
。ここでは、６４０倍と１２８０倍に希釈した２例につ
いて掲げである。マイクロプレート、顕微鏡共にコント
ロール用試料では凝集は観察されず、抗体含有血清を用
いたものでは６４０倍は凝集（陽性）、１２８０倍は未
凝集（陰性）となっていた。

ここでは、測定における光学系からの反射、迷光等の測
定データへの影響を除くため、試料セル部にブランクデ
ータ測定用として蒸溜水を注入し、無事面での強度パタ
ーンデータをとり、それをバックグラウンドデーターと
して利用した。

目的とする試液、コントロール液を用いて各々回折強度
パターンデータを測定後、バックグラウンドデータを引
き、次いで原点からの距離の２乗を掛けることにより、
演算後の強度データｆ　ｎｏｒｍａ＋を得た。

第５図の（ａ　）、（ｂ　）共に■はコントロール、◎
は試液での■ｎｏｒｍａｌ　　対　Ｘを示す回折パター
ンである。

結果は明らかに６４０倍＜ａ　＞では凝集によるパター
ン変化（コントラスト低下）が観測され、１２８０倍（
ｂ　）ではその差は小さい。マイクロプレート法、顕微
ｌＩ観察と一致した結果となっている。

Ｘが２５ｍｍ〜７５ａ＋ｇｌでの■と◎の本グラフでの
面積差は＜ａ　＞では１０．８ｏ＋ｆ、（ｂ）では２．
９０ｔｉと約３．７倍の差があった。

実施例４ 第６図は試料セル部において、試料注入後の凝集の進行
を経時的に観測したものである。３μｍ粒径のＢＳＡ固
定化粒子を用い、粒子担体１度は０．１２５％に調整し
、抗体としては抗ＢＳＡ抗血清液を１２８０倍に希釈し
たものを粒子含有液と同容量用意した。測定に先たち、
コントロール用として、抗体を含まない血清液を同じく
１２８０倍に希釈し、粒子含有液と１：１に混合し、熾
終粒子濃度を０．０６２５％に調整した。

実施例３の場合と同じようにして、バックグラウンドデ
ータをとり、上記コントロール液での測定パターンデー
タから減算し、次いで原点からの距離の２乗を掛けたも
のを第６図＜ａ　＞、（ｂ　）の■のコントロールデー
タとした。経時変化測定のデータ第６図（ａ　）、（ｂ
）の◎についてもデータ処理はこれと同様に行なった。

前記の粒子含有液と抗体含有希釈血清を１−０で１：１
に混合し、Ｒ終粒子濃度を０．０６２５％として【−８
分経時後に測定したものが第６図（ａ　）の◎であり、
ｔ−１７１分後が第６図（ｂ　）の◎である。この測定
と同時に試験管内にこの混合液の一部をとり、本発明に
よる測定法での測定と同時間後（８分、１７１分後）に
顕微鏡下で直接凝集状態を観察した。

その結果、この実施例における試料では８分経過では非
常に凝集が弱く、１７１分後も凝集が進行するが、凝集
程度は低く、凝集塊もあまり大きくならなかった。

ここで＜ａ　＞、（ｂ　）共にコントロールと比較し、
その回折パターンの変化を定量化するにあたり、原点か
らの距離Ｘにおけるのと◎の両者の強度の差の絶対値を
求め、グラフ上で両者の差が３ＩＩＩＩｇ以上ある部分
のみの強度差に対応するところでの面積のみを求めた（
　３　ｉｎ＋にスレッシュホールドを設定）。これはコ
ントロールと測定データとの差が小さい場合、全体とし
てパターンに差が無くても、両者は完全に重なることは
あり得ず、実施例１〜３のように面積を求めた場合、こ
の僅かな違いも積算の内に入り、パターンの差の有無判
定における本方式での定量化のダイナミックレンジを下
げるためである。このことを示したのが（ａ　’）、（
ｂ）での下部でのパターンであり、これは両者のと◎の
差を約３倍拡大したものであり、１点鎖線は３ｉ＋ｍ差
に対応するスレッシュホールドレベルを示す。これより
大きい差の出ている部分のみが面積差算出に於いて寄与
する部分である。計算にあたってはＸ−２５１１１１ｎ
から７５１１ＩＩ１１の範囲を用いた。この方法で算出
した面積は（ａ）では０．７０ａ＋ｒ、（ｂ）では３．
７４ｏｄと約５倍の差を示した。

両者■と◎の差を示す各図下部のパターンでは、１７１
分後のものの方がスレッシュホールドレベルを越すもの
が圧倒的に多く、顕微鏡観察での弱い凝集ながら、経時
的に凝集が進行することと良く対応している。なお、ス
レッシュホールドレベルは本発明に於いて、ここで述べ
た方法に限定されるものではなく、例えば測定系に合せ
て上下させたり、またＸに対応して適当に重み付けした
りしても何ら差支えがないことは言うまでもない。

実施例５ 次に市販のラテックス試薬を本発明に適応した例につい
て述べる。第７図は、リューマチ因子（ＲＡ因子）検出
用試薬キットを用いて得た凝集度と希釈度の対応結果で
ある。使用ラテックスの粒径は０．５μｍ以下であるた
め、光学顕微鏡では粒子形状を明瞭に１察できない。

コントロールとしてキット内同封の対照陰性血清を用い
、さらに同封の対照陽性血清をグリシン食塩緩衝液で倍
々希釈してＲＡ囚子濃度を変え、実施例４と同様なデー
タ処理によりコントロールでの回折パターンとの面積差
として１ｍ度を筒出し縦軸とした。横軸は希釈倍率であ
る。希釈によるＲＡ因子ｍ度の減少と凝集度が良く対応
しているのが判る。なお、陰性血清でも同様に希釈し、
測定の再現性を見たのが図中の目印である。これから希
釈倍率を変えても陰性血清では凝集度は変化けず、ラテ
ックスの分散状態が変らないことが判る。この結果は顕
微鏡観察と良く一致し、本発明が粒子の分散状態を再現
性良く測定し得ることを示している。この試薬はガラス
板上での凝集の有無を単に肉眼で定性的に判定するよう
開発されたものであるため、定Ｍ性は保証されていない
が、本発明によれば、この様な試薬でもある程度の定ｍ
測定ができることを示している。なお、測定は試薬をマ
イクロプレート上で混合攪拌後試料セル部に注入して行
なった。

実施ＰＡ６ 第８図は、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）用の定色分
析ラテックス試薬を用いて同様な測定を行なった結果で
ある。ラテックス粒径は約０．２μｍである。データの
処理や測定試薬セル作成方法等は実施例５の場合と同じ
である。この試薬は定量用として凝集度がＡＦＰ用に対
して連続的に変化するように調整されである。縦軸が凝
集度、横軸が△ＦＰ１１度を示す。この結果から、ＡＦ
Ｐ濃度約１２．５ｎ９／ｎ＋α以上で凝集し始め、その
濃度増加と共に凝集度が向上することが判る。なお、コ
ントロールとしては凝集を生ぜしめないウマ血清を用い
た。複数のコントロール試液間での回折パターンの相違
、すなわち、凝集度データのバラツキは十分小さく、再
現性の有ることは第８図の場合と同様であった。

実施例５および実施例６は、本発明に係る方法が、波長
よりも小さい粒子を用いる凝集試薬にも適用でき、かつ
その結果も定量的な評価が出来ることを示している。前
述した様に従来市販されている粒子は０．５μｌ以下の
ものが多く、それらがそのまま本発明の方法に適応でき
ることは有意義であると言える。

［発明の効果］ 本発明によれば、従来人力で行なっていた凝集判定法と
よい対応をする測定が人手を介さず、また定量化させて
行ない得る。さらには、経時的な凝集状態変化も、定量
的に容易に自動化し得る形で１１なうことができる。

さらに言及すれば、回折強度パターンをさらに詳細に検
討することにより、凝集塊分布、凝集塊形状についての
解析にも利用可能であり、さらには箕なる粒子径を持つ
分散液での粒子分布についての解析にも利用できること
は言うまでもない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実施するのに用いた測定装置の構成を
示すブロック図、第２図は本発明における測定原理を説
明するための図である。 第３図は、３μｍと６μｍの粒子とそれらの混合粒子を
用いて、測定された回折パターンデータで、粒径による
違いを示す図、第４図、第５図は、それぞれ本発明の実
施例であって抗ＢＳＡ抗血清濃度による凝集程度の違い
を測定した回折パターンデータの差として示した図、第
６図は、本発明の実施例において凝集反応の経時変化を
回折パターンの変化として測定した結果を示す図、第７
図は本発明の実施例としてリューマチ因子検出用試薬キ
ットを用いた場合の凝集度と希釈度の対応を示す図、第
８図は本発明の実施例としてＡＦＰ用の定量分析ラテッ
クス試薬を用いた場合の凝集度と濃度の対応を示す図で
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 微小粒子の凝集反応を利用して生理活性物質を検出する
   方法において、媒液中に分散する該微粒子にコヒーレン
   トな光を照射し、その回折パターンを測定して、それと
   未凝集試料の回折パターンとの比較から該微小粒子の凝
   集状態を定量化することを特徴とする生理活性物質の検
   出方法。