JPS61212287A - 担体―固定化蛋白質複合体及びその製造方法 - Google Patents
担体―固定化蛋白質複合体及びその製造方法Info
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- JPS61212287A JPS61212287A JP5277686A JP5277686A JPS61212287A JP S61212287 A JPS61212287 A JP S61212287A JP 5277686 A JP5277686 A JP 5277686A JP 5277686 A JP5277686 A JP 5277686A JP S61212287 A JPS61212287 A JP S61212287A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はポリアミド類又はセルロース水和物に固定され
た蛋白質類及びそれらの担体−固定化蛋白質類の製造方
法に関する。担体−固定化蛋白質は１例えば、生体触媒
、クロマトグラフィ材料又は試験片の製造に用いること
ができる。試験片の製造のためには、担体は特にフィル
ム又は膜の形であることが適切である。
た蛋白質類及びそれらの担体−固定化蛋白質類の製造方
法に関する。担体−固定化蛋白質は１例えば、生体触媒
、クロマトグラフィ材料又は試験片の製造に用いること
ができる。試験片の製造のためには、担体は特にフィル
ム又は膜の形であることが適切である。
知られているように、試験片は、半一定量的に又は定量
的にある種の化合物、例えば、グルコース、アルブミン
、ビリルビン、ウロビリノーゲン、亜硝酸、ケトン体等
を液体中で簡便かつ迅速な方法で測定するために用いら
れることが多い。一般に前記液体としては生物学的液体
、例えば、尿、血液、血清、プラズマもしくはアルコー
ル飲料だけでなく又飲料もしくは汚水がある。
的にある種の化合物、例えば、グルコース、アルブミン
、ビリルビン、ウロビリノーゲン、亜硝酸、ケトン体等
を液体中で簡便かつ迅速な方法で測定するために用いら
れることが多い。一般に前記液体としては生物学的液体
、例えば、尿、血液、血清、プラズマもしくはアルコー
ル飲料だけでなく又飲料もしくは汚水がある。
試験片の製造に用いられる多数の担体材料が知られてい
る。
る。
例えば、酵素及び他の試薬は含浸により吸収紙に導入さ
れるし、又膨潤しうる、天然のもしくは特に調製された
ポリマーもしくはラテックスが用いられ、複雑な多層状
アセンブリが、影響を受けやすい酵素を層に存在する他
の化学物質の有害な影響から保護するために用いられる
こともある。
れるし、又膨潤しうる、天然のもしくは特に調製された
ポリマーもしくはラテックスが用いられ、複雑な多層状
アセンブリが、影響を受けやすい酵素を層に存在する他
の化学物質の有害な影響から保護するために用いられる
こともある。
それ自身多孔性であるか又は充填材、例えば、石膏、多
孔質珪藻土、シリカゲル等を添加することにより“開孔
”状に製造されている、種々のポリマー、例えば、ポリ
エチレン、ポリ塩化ビニルもしくは高分子化合物又はそ
れらの混合物で構成される微細孔膜も又酵素類のための
吸収材として挙げられる。
孔質珪藻土、シリカゲル等を添加することにより“開孔
”状に製造されている、種々のポリマー、例えば、ポリ
エチレン、ポリ塩化ビニルもしくは高分子化合物又はそ
れらの混合物で構成される微細孔膜も又酵素類のための
吸収材として挙げられる。
試験液を反応面上にできる限り最も均一に分配すること
を目的とするいわゆる分配層もあるいくつかの使用例と
して書き加えられる。これらの分配層は通常、前処理さ
れた特定の大きさのガラス粒子又はポリマー粒子からな
り、それらを次に結合剤で表面に接着する。試験液の吸
収及び分配のだめに必要なキャビティはこのようにして
形成される。不溶性繊維又は不織布からなり従って同一
の目的を達成する分配層も又、粒子からなるものの代り
に挙げることができる。
を目的とするいわゆる分配層もあるいくつかの使用例と
して書き加えられる。これらの分配層は通常、前処理さ
れた特定の大きさのガラス粒子又はポリマー粒子からな
り、それらを次に結合剤で表面に接着する。試験液の吸
収及び分配のだめに必要なキャビティはこのようにして
形成される。不溶性繊維又は不織布からなり従って同一
の目的を達成する分配層も又、粒子からなるものの代り
に挙げることができる。
親水性になっておりしかもその表面に官能基、例えば、
カルボキシル基又はアミ７基を有するポリアミド（ナイ
ロン６６）で構成される特定の膜がヨーロッパ特許出願
第８３３００５１７．８号に記載されている。
カルボキシル基又はアミ７基を有するポリアミド（ナイ
ロン６６）で構成される特定の膜がヨーロッパ特許出願
第８３３００５１７．８号に記載されている。
先に化学的修正を行ってからこれらの膜を酵素の固定化
に使用することも又この文献に述べられている。チバク
ロムブルの（登録商標。
に使用することも又この文献に述べられている。チバク
ロムブルの（登録商標。
Ｃｉｂａｃｈｒｏｍ Ｂｌｕｅ）を膜に固定することも
その修正の１つである０文献から判るように、この色素
はＮＡＤに依存する酵素類と極めて特異な方法で結合し
うることが知られている。この出願の実施例５において
はこの固定が単にこの色素により起ることがラクテート
デヒドロゲナーゼを用いて立証されている。
その修正の１つである０文献から判るように、この色素
はＮＡＤに依存する酵素類と極めて特異な方法で結合し
うることが知られている。この出願の実施例５において
はこの固定が単にこの色素により起ることがラクテート
デヒドロゲナーゼを用いて立証されている。
この出願において述べられた第二の方法はアルカリ性ホ
スファターゼを膜へゲルタールアルデヒドを用いること
により共有結合で固定することである。
スファターゼを膜へゲルタールアルデヒドを用いること
により共有結合で固定することである。
驚くべきことに、ポリアミド類及び又セルロース水和物
は、先に化学的修正を施すことなしに蛋白質と結合でき
ることが今や判明している。結合は直接担体に対してお
こる。親木性担体が好ましいが、それらはより容易に湿
潤し、それにより蛋白質を導入することが容易になるた
めである。
は、先に化学的修正を施すことなしに蛋白質と結合でき
ることが今や判明している。結合は直接担体に対してお
こる。親木性担体が好ましいが、それらはより容易に湿
潤し、それにより蛋白質を導入することが容易になるた
めである。
多孔性担体はその表面が大きく、例えば、基質の拡散を
容易にするのでそれらは好ましい。
容易にするのでそれらは好ましい。
本発明による担体のために用いられる出発ポリマーとし
てはアルコールに不溶でありしかもＣＨ２のＮＨＣＯ基
に対する比が５：ｌから７：ｌの範囲内のポリアミド類
である０分子量３０．０００以上のポリへキサメチレン
セバシン酸アミド（す−イロン６１０）、ポリ−ε−カ
プロラクタム（ナイロン６）及びポリへキサメチレンア
ジピン酸アミド（ナイロン６６）が好ましい。
てはアルコールに不溶でありしかもＣＨ２のＮＨＣＯ基
に対する比が５：ｌから７：ｌの範囲内のポリアミド類
である０分子量３０．０００以上のポリへキサメチレン
セバシン酸アミド（す−イロン６１０）、ポリ−ε−カ
プロラクタム（ナイロン６）及びポリへキサメチレンア
ジピン酸アミド（ナイロン６６）が好ましい。
親水性にする方法及び官能基の導入は、ポリアミドと官
能基を含むポリマー（ＭＷ＞ｉｏ、ｏｏｏ）のギ酸混合
溶液に非溶媒（例えば、水）を制御しながら添加して先
ず核を形成しながら前記混合溶液を凝集させることによ
り行う。
能基を含むポリマー（ＭＷ＞ｉｏ、ｏｏｏ）のギ酸混合
溶液に非溶媒（例えば、水）を制御しながら添加して先
ず核を形成しながら前記混合溶液を凝集させることによ
り行う。
次に、この溶液を基板に塗布した後、基板を一定量の溶
媒及び非溶媒からなる沈澱浴に浸漬することにより最終
的沈澱を行う。このようにして調製された膜を水洗しつ
いで乾燥する。
媒及び非溶媒からなる沈澱浴に浸漬することにより最終
的沈澱を行う。このようにして調製された膜を水洗しつ
いで乾燥する。
官能基、例えば、カルボキシル基２アミノ基、スルホン
酸基、イミノ基、チオ基、ヒドロキシル基、ピリジル基
もしくはホスホリル基又はそれらの誘導体は蛋白質の固
定に影響を与えることもある。このことによりある蛋白
質類を選択的に固定する方法を提供することが可能とな
る。
酸基、イミノ基、チオ基、ヒドロキシル基、ピリジル基
もしくはホスホリル基又はそれらの誘導体は蛋白質の固
定に影響を与えることもある。このことによりある蛋白
質類を選択的に固定する方法を提供することが可能とな
る。
官能基はまた“活性化型で存在することもできる。゛°
活性化”基とは、化学的意味で、置換基、例えば、ハロ
ゲン、フェニル、カルボキシル又はスルホニルの導入に
より“活性化”される２（を意味するものと理解される
べきであり、換言すれば、置換基は分子をより積極的に
する効果を有し、これは中心原子に関してα−位に位置
するメチレン又はカルボキシルのＨ原子の酸性度が増加
することからも分る。置換基のα−位への導入は有機化
学において公知の方法により行うことができる。
活性化”基とは、化学的意味で、置換基、例えば、ハロ
ゲン、フェニル、カルボキシル又はスルホニルの導入に
より“活性化”される２（を意味するものと理解される
べきであり、換言すれば、置換基は分子をより積極的に
する効果を有し、これは中心原子に関してα−位に位置
するメチレン又はカルボキシルのＨ原子の酸性度が増加
することからも分る。置換基のα−位への導入は有機化
学において公知の方法により行うことができる。
官能基の“活性化”は担体の固定特性、特に固定の選択
性に影響を与えることも又判明している。試験片の調製
のためには担体はフィルム又は膜状で用いられるのが好
ましい、担体上に固定される蛋白質は普通生物学的に活
性な蛋白質、例えば、酵素類、受容体類、抗原類又は抗
体類である。蛋白質は好ましくは担体に溶液の状態で施
される。含浸方法、例えば、担体を蛋白質溶液中に浸漬
する方法又は担体に蛋白質溶液を塗布する方法が特に好
ましい。塗布は、フィルム又は膜状の担体を機械的に処
理するのに特に適切である。蛋白質はそれ自身堅固に担
体に固着しもはや洗浄により除去されることはない、蛋
白質が強固に固定されていると、担体Ｅに位置する蛋白
質を洗い流してしまうことなしに複数回の塗布を行うこ
とができるようになる。更に、蛋白質が担体に強固に固
定しているとこれらの蛋白質を生体触媒として用いるこ
とができるようになる。多層アセンブリも又特に試験片
に使用可能である。実施例から判るように、特定の反応
に合った種々の条件が、様々な層において効果をあげる
ような試験片を調製することが可能である。従って、こ
の方法で。
性に影響を与えることも又判明している。試験片の調製
のためには担体はフィルム又は膜状で用いられるのが好
ましい、担体上に固定される蛋白質は普通生物学的に活
性な蛋白質、例えば、酵素類、受容体類、抗原類又は抗
体類である。蛋白質は好ましくは担体に溶液の状態で施
される。含浸方法、例えば、担体を蛋白質溶液中に浸漬
する方法又は担体に蛋白質溶液を塗布する方法が特に好
ましい。塗布は、フィルム又は膜状の担体を機械的に処
理するのに特に適切である。蛋白質はそれ自身堅固に担
体に固着しもはや洗浄により除去されることはない、蛋
白質が強固に固定されていると、担体Ｅに位置する蛋白
質を洗い流してしまうことなしに複数回の塗布を行うこ
とができるようになる。更に、蛋白質が担体に強固に固
定しているとこれらの蛋白質を生体触媒として用いるこ
とができるようになる。多層アセンブリも又特に試験片
に使用可能である。実施例から判るように、特定の反応
に合った種々の条件が、様々な層において効果をあげる
ような試験片を調製することが可能である。従って、こ
の方法で。
米国特許明細書部４，２３１，７５４号に記載されてい
るような、別々の層及び／又は層のＰＨを所望のものに
変化させる物質を含む複雑かつ高価な多層系を用いるこ
となしに、ルミノールを用いてグルコースの測定用試験
片を調製することが可能である。
るような、別々の層及び／又は層のＰＨを所望のものに
変化させる物質を含む複雑かつ高価な多層系を用いるこ
となしに、ルミノールを用いてグルコースの測定用試験
片を調製することが可能である。
試験片を調製するのに担体、特にフィルム又は膜として
の担体の有する重要な利点は引張り強度である。更に、
担体はほとんど膨潤せず、実質的に均一な表面を有する
ので、評価、特に反射光度計を用いる場合の評価を容易
にする。
の担体の有する重要な利点は引張り強度である。更に、
担体はほとんど膨潤せず、実質的に均一な表面を有する
ので、評価、特に反射光度計を用いる場合の評価を容易
にする。
実」１例
実施例１ないし４では酵素の担体への固定を説明する。
このために、各々５Ｘ５ｃｍ（第１表参照）寸法の膜片
を蛋白質溶液に３０分間浸漬して含浸せしめた。次に膜
をそれぞれ３回水５００−で２０分間洗浄して未固定酵
素を除去した。固定酵素をそれらの触媒活性により検出
した。検出は、活性を検出するのに必要な試薬を含有す
る試験溶液を調製しついで酵素をその中に含ませたＩ
Ｘ ｌ ｃｍ寸法の膜片をインキュベーションすること
により行った。３０分模試験溶液の吸光度を分光光度計
（ベックマンの（登録商標、Ｂｅｃｋｗａｎｎ）ＤＵ−
６）で測定した。
を蛋白質溶液に３０分間浸漬して含浸せしめた。次に膜
をそれぞれ３回水５００−で２０分間洗浄して未固定酵
素を除去した。固定酵素をそれらの触媒活性により検出
した。検出は、活性を検出するのに必要な試薬を含有す
る試験溶液を調製しついで酵素をその中に含ませたＩ
Ｘ ｌ ｃｍ寸法の膜片をインキュベーションすること
により行った。３０分模試験溶液の吸光度を分光光度計
（ベックマンの（登録商標、Ｂｅｃｋｗａｎｎ）ＤＵ−
６）で測定した。
対照として、未反応膜をそれぞれ用いて、相当する試験
溶液の吸光度を空試験値として算出する際取り入れた。
溶液の吸光度を空試験値として算出する際取り入れた。
実施例５ないし９では試験片の調製について述べる。
第１表
酵素溶液：水２〇−中にペルオキシダーゼ（４７Ｕ７’
ｎ＋ｇ、マイルス、アメリカ合衆国（Ｍｉｌｅｓ。
ｎ＋ｇ、マイルス、アメリカ合衆国（Ｍｉｌｅｓ。
ＵＳＡ） １５ ｍｇ
試験溶液：
Ｈ２Ｏ２（１３％強度） ２．２．ａ／
４−７ミノアンチピ１リン ６．２ｍｇジク
ロロベンゼン スルホン酸ナトリウム １１５．０ｍｇ水
９０
．ａＪロリン塩緩衝液 （０、５ｍｏｕ ／Ｌ、、 ｐＨ７、０）
１０ｔｔＪ結果： ５０５ｎｍに ′（るｐ １ ＋０．０６３ ２ ＋０．０８８ ３ ＋０．１１７ ４ ＋０．０４８ ５ ＋０．７２８ ６ ＋Ｏ，１４０ ７＋０．０４３ ８ ＋０．０２５ ９ ＋０．０３２ 支上刻」 酵素溶液二本２〇−中にグルコースオキシダーゼ（２５
０Ｕ／ｍｇ、ビューリンゲル、マンハイム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ、 Ｍａｎｎｈｅｉｍ）） ５ｍｇ試験溶液
ニ ゲルコース ５４０ｍｇペルオ
キシダーゼ（４７Ｉ Ｕ／ｍｇ） ｌ ０ｍｇ４−
アミノアンチピリン ６．２＋ａｇジクロロ
ベンゼン スルホン酸ナトリウム １１５．２ｍｇ水
９〇−
結果： ’、 ５０５ ｎｔａに け ｐｌ
＋０．０１３ ２ −０．０７１ ３ −０．０１６ ４ −０．０８４ ５ ＋Ｏ，１８ ６＋０．２２１ ７ ＋０．０６３ ８ ＋０．５９４ ９ ＋０．５７４ 裏嵐遣」 上記膜から選択されたものが以後の試験に用いられた。
４−７ミノアンチピ１リン ６．２ｍｇジク
ロロベンゼン スルホン酸ナトリウム １１５．０ｍｇ水
９０
．ａＪロリン塩緩衝液 （０、５ｍｏｕ ／Ｌ、、 ｐＨ７、０）
１０ｔｔＪ結果： ５０５ｎｍに ′（るｐ １ ＋０．０６３ ２ ＋０．０８８ ３ ＋０．１１７ ４ ＋０．０４８ ５ ＋０．７２８ ６ ＋Ｏ，１４０ ７＋０．０４３ ８ ＋０．０２５ ９ ＋０．０３２ 支上刻」 酵素溶液二本２〇−中にグルコースオキシダーゼ（２５
０Ｕ／ｍｇ、ビューリンゲル、マンハイム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ、 Ｍａｎｎｈｅｉｍ）） ５ｍｇ試験溶液
ニ ゲルコース ５４０ｍｇペルオ
キシダーゼ（４７Ｉ Ｕ／ｍｇ） ｌ ０ｍｇ４−
アミノアンチピリン ６．２＋ａｇジクロロ
ベンゼン スルホン酸ナトリウム １１５．２ｍｇ水
９〇−
結果： ’、 ５０５ ｎｔａに け ｐｌ
＋０．０１３ ２ −０．０７１ ３ −０．０１６ ４ −０．０８４ ５ ＋Ｏ，１８ ６＋０．２２１ ７ ＋０．０６３ ８ ＋０．５９４ ９ ＋０．５７４ 裏嵐遣」 上記膜から選択されたものが以後の試験に用いられた。
酵素溶液二本２〇−中にジアホラーゼ（５３Ｕ／ｍｇ、
ビューリンゲＪｌｚ、’７７ハイム（Ｂａｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ。
ビューリンゲＪｌｚ、’７７ハイム（Ｂａｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ。
Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ） ５ ｍｇ
試験溶液二
２−ｐ−ヨードフェニル−３−ｐ−ニトロフェニル−５
−フェニルテトラゾリウムクロリド×８２０ （ＩＮＴ
）０．０５ｇを加熱して２０％強度のポリビニルピロリ
ドン水溶液（ＰＶＰ）５ｇに溶解した。
−フェニルテトラゾリウムクロリド×８２０ （ＩＮＴ
）０．０５ｇを加熱して２０％強度のポリビニルピロリ
ドン水溶液（ＰＶＰ）５ｇに溶解した。
ＮＡＤ” ０．０５ｇグル
コース １８０＋ａｇ水
６
〇−結果： ５００ｎｍに ける［ ９ ＋０．１９５ ５ ＋０．３３３ ６ ＋０．３２ 支施遣」 酵素溶液：水２〇−中にグルコースデヒ１０ゲナーゼ（
６１、５Ｕ／ｌｎｇ） １００＋ｇ試験溶液
：加熱することによりＩＮＴ Ｏ，０５ｇを２０％強
度のＰＶＰ溶液５．０ｇ中に溶解した。
コース １８０＋ａｇ水
６
〇−結果： ５００ｎｍに ける［ ９ ＋０．１９５ ５ ＋０．３３３ ６ ＋０．３２ 支施遣」 酵素溶液：水２〇−中にグルコースデヒ１０ゲナーゼ（
６１、５Ｕ／ｌｎｇ） １００＋ｇ試験溶液
：加熱することによりＩＮＴ Ｏ，０５ｇを２０％強
度のＰＶＰ溶液５．０ｇ中に溶解した。
グルコース １８０Ｉ１ｇＮＡ
Ｄ” ０ 、０５ ｇジア
ホラーゼ（５３Ｕ／ｍｇ） ０ 、０１ ｇ水
６
０ｍ／結果： ５００ｎ■に ける ９ ＋０．２３ ５ ＋０．０６１ ６ ＋０．１６３ 実施例工ないし４はポリアミド又はセルロース水和物で
構成される担体は蛋白質の直接固定に適切であることを
示している。この点に関連して。
Ｄ” ０ 、０５ ｇジア
ホラーゼ（５３Ｕ／ｍｇ） ０ 、０１ ｇ水
６
０ｍ／結果： ５００ｎ■に ける ９ ＋０．２３ ５ ＋０．０６１ ６ ＋０．１６３ 実施例工ないし４はポリアミド又はセルロース水和物で
構成される担体は蛋白質の直接固定に適切であることを
示している。この点に関連して。
表面特性が異なる膜は、酵素との固定においである選択
性を示す。
性を示す。
実」１江ｊ
実施例５及び６では公知法により調製された多層グルコ
ース試験片について説明する。
ース試験片について説明する。
単一層写真材料及び多層写真材料の製造に用いられるよ
うな適切な塗布具及び乾燥具の助けを借りて次の塗布液
をポリエステルフィルム製の担体に塗布した： 水２５４中に０．１Ｍエチレンジアミノ四酢酸四ナトリ
ウム（トリロンＢＯ（登録商標、ＴｒｉｌｏｎＢ））
と共にルミノール（メルク（Ｍｅｒｃｋ）製）０．２５
ｇを溶解し、 水３５〇−中の２０％強度ゼラチンゲル１２５ｇを４０
’Ｃ！で融解しついで得られた溶液のｐＨ値を、適量
（約２０−）の５０％強度のトリロンＢ＠溶液を用いて
９．７にした。湿温時の塗布厚は１７０ｇＭであったが
、これは約７．０ｇ／ｍ”のゼラチン量及び約０．０７
ｇ／ｒｎ”のルミノール量に相当する。
うな適切な塗布具及び乾燥具の助けを借りて次の塗布液
をポリエステルフィルム製の担体に塗布した： 水２５４中に０．１Ｍエチレンジアミノ四酢酸四ナトリ
ウム（トリロンＢＯ（登録商標、ＴｒｉｌｏｎＢ））
と共にルミノール（メルク（Ｍｅｒｃｋ）製）０．２５
ｇを溶解し、 水３５〇−中の２０％強度ゼラチンゲル１２５ｇを４０
’Ｃ！で融解しついで得られた溶液のｐＨ値を、適量
（約２０−）の５０％強度のトリロンＢ＠溶液を用いて
９．７にした。湿温時の塗布厚は１７０ｇＭであったが
、これは約７．０ｇ／ｍ”のゼラチン量及び約０．０７
ｇ／ｒｎ”のルミノール量に相当する。
乾燥後、第二層を第一層の上に塗布した；次の塗布液を
用いて塗布した。
用いて塗布した。
７５％強度のドデシルベンゼンスルホネート（ＤＢＳペ
ースト）０．３ｇをクロロホルム３−及びクロロホルム
を含有する７、５％強度のポリカーボネート（マクロ口
ｙ（Ｍａｋｒｏｌｏｎ））溶液に溶解し；グルコースオ
キシダーゼ（２５Ｉ Ｕ／ｍｇ）０゜１２３ｇ及びペル
オキシダーゼ（４７Ｕ／ｍｇ）０．６１６ｇを水３．６
−に溶解し激しく攪拌しながら先に調製した溶液に分散
させた。
ースト）０．３ｇをクロロホルム３−及びクロロホルム
を含有する７、５％強度のポリカーボネート（マクロ口
ｙ（Ｍａｋｒｏｌｏｎ））溶液に溶解し；グルコースオ
キシダーゼ（２５Ｉ Ｕ／ｍｇ）０゜１２３ｇ及びペル
オキシダーゼ（４７Ｕ／ｍｇ）０．６１６ｇを水３．６
−に溶解し激しく攪拌しながら先に調製した溶液に分散
させた。
クロロホルム中のポリアクリルアミド水溶液の１３．２
％強度の分散物２３ＩＩｈｔを７．５％強度のマクロロ
ンのクロロホルム溶液と合せ、ついで酵素含有分散物と
混合した。
％強度の分散物２３ＩＩｈｔを７．５％強度のマクロロ
ンのクロロホルム溶液と合せ、ついで酵素含有分散物と
混合した。
この溶液を厚さ７０−でルミノール含有ゼラチン層に塗
布しついで室温で乾燥した。グルコース２５０ｍｇの水
（１００ａｚ）溶液３０マイクロリツトルの試料を完成
した層アセンブリに施すと公知反応に従って化学ルミネ
ッセンスが現れる。
布しついで室温で乾燥した。グルコース２５０ｍｇの水
（１００ａｚ）溶液３０マイクロリツトルの試料を完成
した層アセンブリに施すと公知反応に従って化学ルミネ
ッセンスが現れる。
層アセンブリを約１４日間室温で貯蔵した後には、グル
コースオキシダーゼは、少量のグルコースオキシダーゼ
溶液をグルコース溶液を添加する前に試験片に塗布した
時にのみ現われる化学ルミネッセンスの程度まで崩壊し
ている。
コースオキシダーゼは、少量のグルコースオキシダーゼ
溶液をグルコース溶液を添加する前に試験片に塗布した
時にのみ現われる化学ルミネッセンスの程度まで崩壊し
ている。
この試験系においてはグルコースオキシダーゼは第二層
に強固に固定されていない。
に強固に固定されていない。
更に化学ルミネッセンスをおこす反応は塗布試料がろ紙
又は同様の吸収材を用いることにより分配された場合の
みにおこる。
又は同様の吸収材を用いることにより分配された場合の
みにおこる。
支施１」
操作は実施例５と同様であったが、次の塗布液を第二酵
素含有層として用いた： ２０％強度のゼラチンゲル１２５ｇを水１００ａｔに４
０℃で溶解した。グルコースオキシダーゼ（１００ＯＩ
Ｕ／ａＺ）水溶液１２．５−及びペルオキシダーゼ１．
２ｇの水（１０ａＪ）溶液を上記ゼラチン溶液に添加し
ついで４％強度の湿潤剤溶液１．５−を添加した。
素含有層として用いた： ２０％強度のゼラチンゲル１２５ｇを水１００ａｔに４
０℃で溶解した。グルコースオキシダーゼ（１００ＯＩ
Ｕ／ａＺ）水溶液１２．５−及びペルオキシダーゼ１．
２ｇの水（１０ａＪ）溶液を上記ゼラチン溶液に添加し
ついで４％強度の湿潤剤溶液１．５−を添加した。
この溶液を湿潤時の塗布厚７０ｆｉｔＩＭでルミノール
を含有する乾燥ゼラチン層に塗布しついで２〇−２５℃
で乾燥した。
を含有する乾燥ゼラチン層に塗布しついで２〇−２５℃
で乾燥した。
この試験においてはグルコース溶液で湿潤させてもルミ
ネッセンスは全く観察されなかった。
ネッセンスは全く観察されなかった。
ここではグルコースオキシダーゼは直ちに不活性化され
る。実施例５及び６に述べた方法は従ってこのタイプの
試験片を製造するのには不適当である。
る。実施例５及び６に述べた方法は従ってこのタイプの
試験片を製造するのには不適当である。
実施例７ないし９では試験片を製造するために本発明に
よる担体が適切であることを説明する。
よる担体が適切であることを説明する。
実」１殊ｌ
巾１６ｃｍのウェブ４．５ｍの膜９に７〇−厚さで次の
溶液を塗布しついで室温で乾燥した：ルミノール０．１
６ｇを５０％強度のトリロンＢＯ溶液１１．３−を用い
て溶解し、この混合物を水２４２−中に注ぎ、次にグル
コースオキシダーゼ２．３４７ｇ及びペルオキシダーゼ
１．２４６ｇの水（２３，５ｓＪ）溶液を添加した。こ
の溶液のｐＨ値を５０％強度のトリロンＢ０溶液で９．
７に調整した。
溶液を塗布しついで室温で乾燥した：ルミノール０．１
６ｇを５０％強度のトリロンＢＯ溶液１１．３−を用い
て溶解し、この混合物を水２４２−中に注ぎ、次にグル
コースオキシダーゼ２．３４７ｇ及びペルオキシダーゼ
１．２４６ｇの水（２３，５ｓＪ）溶液を添加した。こ
の溶液のｐＨ値を５０％強度のトリロンＢ０溶液で９．
７に調整した。
グルコース水溶液１０−２０マイクロリツトルを施すと
、強い化学ルミネッセンスが観察され、これは適当に感
度のよい光度計により測定することができた。
、強い化学ルミネッセンスが観察され、これは適当に感
度のよい光度計により測定することができた。
グルコース溶液の代りに、グルコースを含有する血液試
料も又調製された膜に施したが、この際にも又ルミネッ
センスは現われたがしかし強度は落ちていた。
料も又調製された膜に施したが、この際にも又ルミネッ
センスは現われたがしかし強度は落ちていた。
支施１Ｊ
実施例７において述べたようなウェブ片に２つの溶液を
塗布した：第１に７０戸厚で次の溶液を塗布したニ ゲルコースオキシダーゼ２．３４７ｇ及びペルオキシダ
ーゼ１．２４６ｇを水２９６．４ｗＪに溶解した。
塗布した：第１に７０戸厚で次の溶液を塗布したニ ゲルコースオキシダーゼ２．３４７ｇ及びペルオキシダ
ーゼ１．２４６ｇを水２９６．４ｗＪに溶解した。
室温で乾燥を行った後に、第二の塗布をこれも又７０−
厚に次の溶液を用いて行った：ルミノール０．１６ｇを
５０％強度のトリロンＢ・の水（２０、６ａＪ）溶液１
１．３−を用いて溶解し、ついでこの混合物を２０％ゼ
ラチンゲル１５０ｇの水（ｌ１７．５ｇ）溶液に添加し
た。
厚に次の溶液を用いて行った：ルミノール０．１６ｇを
５０％強度のトリロンＢ・の水（２０、６ａＪ）溶液１
１．３−を用いて溶解し、ついでこの混合物を２０％ゼ
ラチンゲル１５０ｇの水（ｌ１７．５ｇ）溶液に添加し
た。
この溶液のｐＨ値をトリロンＢ０溶液で９．７に調整し
た。
た。
乾燥後、このようにして製造した膜をグルコース溶液又
はグルコース含有血液で実施例７において述べたように
処理し、ついで得られた化学ルミネッセンスを測定した
。実施例７と比較してずつと強い化学ルミネッセンスが
グルコース溶液及びグルコース含有血液の両者について
現れ、実施例７の場合も又同様であるが、このルミネッ
センスは、膜を数ケ月室温で貯蔵した後でさえその強さ
がほとんど減少しなかった。
はグルコース含有血液で実施例７において述べたように
処理し、ついで得られた化学ルミネッセンスを測定した
。実施例７と比較してずつと強い化学ルミネッセンスが
グルコース溶液及びグルコース含有血液の両者について
現れ、実施例７の場合も又同様であるが、このルミネッ
センスは、膜を数ケ月室温で貯蔵した後でさえその強さ
がほとんど減少しなかった。
支流１」
実施例７において用いた塗布液３−をドクターブレード
を用いて長さ約２０ｃ腸の膜９の試験片の各々に塗布し
た。それぞれの試験において、ペルオキシダーゼの量を
実施例７において用いた量の１３４だけ増加させまた％
、掻及び％まで減少させた。
を用いて長さ約２０ｃ腸の膜９の試験片の各々に塗布し
た。それぞれの試験において、ペルオキシダーゼの量を
実施例７において用いた量の１３４だけ増加させまた％
、掻及び％まで減少させた。
グルコース溶液により生じた化学ルミネッセンスを評価
すると化学ルミネッセンスの強度が、実施例７における
量よりペルオキシダーゼの量が高いところ及び低いとこ
ろの両方で大幅に減少したことが判明した。
すると化学ルミネッセンスの強度が、実施例７における
量よりペルオキシダーゼの量が高いところ及び低いとこ
ろの両方で大幅に減少したことが判明した。
グルコースオキシダーゼの量も又同じように変化させた
。ペルオキシダーゼとは対照的に、使用量の範囲内では
酵素量と化学ルミネッセンスの強度との間に直線関係が
グルコースオキシダーゼについては観察された。
。ペルオキシダーゼとは対照的に、使用量の範囲内では
酵素量と化学ルミネッセンスの強度との間に直線関係が
グルコースオキシダーゼについては観察された。
支凰■ユ」
次に、担体への固定の特性及び強度についての情報を得
るために次の実験が行われた。
るために次の実験が行われた。
５ Ｘ ５ ｃｍ寸法の膜片（膜Ｎｏ、９）を３０分間
グルコースオキシダーゼ５Ｉ１ｇの水（２０ａＪ）溶液
に浸漬しついでそれを含浸せしめた０次に過剰の酵素を
除去するために膜片を２０分間３回木本００−で洗浄し
た。
グルコースオキシダーゼ５Ｉ１ｇの水（２０ａＪ）溶液
に浸漬しついでそれを含浸せしめた０次に過剰の酵素を
除去するために膜片を２０分間３回木本００−で洗浄し
た。
Ｉ Ｘ １ ｃｍ寸法の含浸膜片のそれぞれを１５分間
それぞれ種々の濃度（０，１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ
、１．０Ｍ及び３．０Ｍ）の塩化ナトリウム溶液１０ｍ
１で洗浄した。
それぞれ種々の濃度（０，１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ
、１．０Ｍ及び３．０Ｍ）の塩化ナトリウム溶液１０ｍ
１で洗浄した。
活性を測定するために実施例２において述べた試験溶液
を用い、膜片を除去してから塩化ナトリウム溶液及び膜
片をそれぞれに試験した。
を用い、膜片を除去してから塩化ナトリウム溶液及び膜
片をそれぞれに試験した。
この評価によれば、種々の塩化ナトリウム溶液では酵素
活性は全く検出されなかったが、一方適切な膜片におい
て観察しうる色強度は膜の酵素活性の有意の減少を示さ
なかった。この試験は酵素の固定がイオンの相互反応に
基づくものではないことを明らかに示している。
活性は全く検出されなかったが、一方適切な膜片におい
て観察しうる色強度は膜の酵素活性の有意の減少を示さ
なかった。この試験は酵素の固定がイオンの相互反応に
基づくものではないことを明らかに示している。
ここに述べた発明の多くの他の修正及び変更が、本発明
の精神及び範囲を逸脱することなく行われることは明ら
かである。
の精神及び範囲を逸脱することなく行われることは明ら
かである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ポリアミド担体又はセルロース水和物担体上の担体
−固定化蛋白質であって、上記蛋白質が直接上記担体に
結合していることを特徴とする担体−固定化蛋白質。 ２、上記担体が官能基を有する特許請求の範囲第１項記
載の担体−固定化蛋白質。 ３、上記官能基がカルボキシル基、アミノ基、スルホン
酸基、イミノ基、チオ基、ヒドロキシル基、ピリジル基
もしくはホスホリル基又はそれらの誘導体である特許請
求の範囲第２項記載の担体−固定化蛋白質。 ４、上記担体が膜である特許請求の範囲第１項記載の担
体−固定化蛋白質。 ５、上記担体が親水性である特許請求の範囲第４項記載
の担体−固定化蛋白質。 ６、上記担体が多孔性である特許請求の範囲第１項記載
の担体−固定化蛋白質。 ７、上記担体−固定化蛋白質が酵素である特許請求の範
囲第１項記載の担体−固定化蛋白質。 ８、上記担体−固定化蛋白質がペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、ジアホラーゼ又はグルコースデヒ
ドロゲナーゼである特許請求の範囲第７項記載の担体−
固定化蛋白質。 ９、ポリアミド担体又はセルロース水和物担体上の担体
−固定化蛋白質であって、上記蛋白質が直接上記担体に
結合している担体−固定化蛋白質の製造方法において、
上記蛋白質の上記担体への結合が蛋白質溶液に含浸させ
ることにより行われることを特徴とする製造方法。 １０、ポリアミド担体又はセルロース水和物担体上の担
体−固定化蛋白質であって、上記蛋白質が直接上記担体
に結合している担体−固定化蛋白質の生体触媒としての
使用方法。 １１、ポリアミド担体又はセルロース水和物担体上の担
体−固定化蛋白質であって、上記蛋白質が直接上記担体
に結合している担体−固定化蛋白質の試験片調製のため
の使用方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3508908 | 1985-03-13 | ||
| DE3508908.3 | 1985-03-13 | ||
| DE3529094.3 | 1985-08-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61212287A true JPS61212287A (ja) | 1986-09-20 |
| JPH0311759B2 JPH0311759B2 (ja) | 1991-02-18 |
Family
ID=6265034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5277686A Granted JPS61212287A (ja) | 1985-03-13 | 1986-03-12 | 担体―固定化蛋白質複合体及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61212287A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009080106A (ja) * | 2000-10-10 | 2009-04-16 | Biotrove Inc | アッセイ、合成、および保存用の器具、ならびに、その作製、使用、および操作の方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103333350B (zh) * | 2013-06-09 | 2015-05-20 | 浙江大学 | 一种丝胶微球的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54154595A (en) * | 1978-05-22 | 1979-12-05 | Unitika Ltd | Novel carrier for fixing physiologically active substance |
| JPS58212786A (ja) * | 1982-06-04 | 1983-12-10 | Daicel Chem Ind Ltd | 高活性固体化生体触媒の製造方法 |
| JPS59151050A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-08-29 | Matsushita Electric Works Ltd | 生体触媒電極の製法 |
-
1986
- 1986-03-12 JP JP5277686A patent/JPS61212287A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54154595A (en) * | 1978-05-22 | 1979-12-05 | Unitika Ltd | Novel carrier for fixing physiologically active substance |
| JPS58212786A (ja) * | 1982-06-04 | 1983-12-10 | Daicel Chem Ind Ltd | 高活性固体化生体触媒の製造方法 |
| JPS59151050A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-08-29 | Matsushita Electric Works Ltd | 生体触媒電極の製法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009080106A (ja) * | 2000-10-10 | 2009-04-16 | Biotrove Inc | アッセイ、合成、および保存用の器具、ならびに、その作製、使用、および操作の方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0311759B2 (ja) | 1991-02-18 |
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