JPS61181397A - アルフア−１−アンチトリプシンの発現のための安定なｄｎａ構造物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 組換えＤＮＡ技術を利用する有用なポリペプチド生成物
の生産のための微生物の使用は、工業として確立されて
きている。外来遺伝子物質が微生物の培養菌中に導入さ
れることが出来、適当な細胞内及び細胞外条件を与える
と望む生成物が外来遺伝子から合成されうる。そのよう
な遺伝子物質は一般に、プラスミドの形で微生物中に導
入され、これは自律的に複製する染色体外要素である。

形質転換された細胞培養物内にプラスミドを維持するこ
とを保証するために、これら細胞を特別の条件下で成育
することが必要であった。そのような条件の欠除のもと
では、本質的に不安定であろうプラスミドは維持されず
、細胞群は形質転換されていない状態に戻るであろう。

プラスミド安定性の増大及びコピー数の増大は、プラス
ミドでコードされる蛋白質の生産を富に高いレベルに維
持する手段として生物技術工業にとって！！要である。

プラスミド安定性を増すための従来報告された試みは、
産業的利用のためにＩｌｋ通であるとは見えない。安定
性を高めながらＡＲ５含有プラスミド中に酵母動原体を
導入することは、プラスミドコピー数を著しく低減する
ことが判っている（クラーケ（ｃｌａｒｋｅ）とカーボ
ン（ｃａｒｂｏｎ）　＋ネイチア（Ｎａｔｕｒｅ）　、
　２８７　：　５０４−５０９．１９８０．及びステイ
ンクコム（５ｔｉｎｃｈｃｏａ（ｂ）ら、ジャーナル　
オブ　モレキエラー　バイオロジー（ＪｏＭｏｌｅｃ、
　Ｂｉｏｌ、）　＋　１５８：１５７−１７９．１９８
２）。線形動原体酵母プラスミドは同様に、安定性とコ
ピー数の間の逆比例関係を示す（マリ−（Ｍｕｒｒｙ　
）とスジスタフ（Ｓｚｏｓｔａｋ　）　＋ネイチア、３
０５：１８９−１９３゜１９８３）。

プラスミドは典型的には、選択マーカーとて知られてい
る遺伝子配列を含み、これは宿主細胞の抗生物質耐性又
は補助栄養要求をコードする。そのようなプラスミドの
存在について選択するために、形質転換された細胞は、
選択剤を含む又は特定の栄養素を除かれた特別の培養基
で生育されなければならない。これら培養基要件は高価
であり、かつ大規模醗酵プロセスの間の最適細胞生長速
度を禁止する。そのようなプラスミドの多くが、文献に
報告されている。抗生物質耐性遺伝子を含むこれらとし
ては、ρＢＲ３２２（ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ　）ら
、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２　：　９５−１１３゜１９７
７）及びその誘導体たとえばｐＵｃベクター（ビエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ）とメッインク（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　
ｌジーン、１９１５９−２６８．１９８２）（これはア
ンピシリン耐性を持つ）及びｐＢＲ３２５（プレントキ
（Ｐｒｎｔｋｉ）ら、ジーン、１４：２Ｂ９゜１９８１
）（これはアンピシリン、テトラサイクリン及びクロラ
ムフェニコールに対する耐性遺伝子を持つ）が挙げられ
る。宿主栄養要求を補うプラスミドとしては、酵母ベク
ターＹＥρ１３　（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら、ジー
ン、８：１２１−１３３゜１９７９）（これはＬＥＵ２
遺伝子を持つ）、及びＹｌ？ｐ７’（ステインクコムら
、ネイチア。

２Ｂ２：３９．１９７９）（これはＴＲＰＩ遺伝子を持
つ）が挙げられる。

アルファー１−アンチトリプシンは、プロテアーゼイン
ヒビターであり、その主な機能は幅広いスペクトルのプ
ロテアーゼであるエラスターゼを抑制することである。

哺乳動物の肺組織は、エラスターゼによる攻撃に特に弱
く、従ってα−１−アンチトリプシンの欠損又は不活性
化は肺組織弾性の喪失及び従って気腫を結果しうる。α
−１−アンチトリブシン活性の損失又は減少は、タバコ
の煙を含む環境汚染物によるα−１−アンチトリプシン
の酸化の結果である。α−１−アンチトリプシンの欠損
は、いくつかの遺伝的欠陥の一つから起りうる。ガデッ
ク（Ｇａｄｅｋ　）　＋ジェームス（Ｊａａｅ）　Ｅ　
、及びＲ，Ｄ、クリスタル（Ｃｒｙｓｔａｌ　）　＋「
α−１−アンチトリプシン欠損」、遺伝病の代謝的基礎
、スタンブリー（Ｓｔａｎｂｕｒｙ）　＊　Ｊ　、　Ｂ
　。

ら編、マグロウ−ヒル、ニューヨーク（１９Ｂ２）。

ｐｐ１４５０−１４６７　：及びキャロル（Ｃａｒｒｏ
ｌｌ　）ら。

ネイチア、２９８８．３２９−３３４　（１９８２）参
照。

従って、α−１−アンチトリプシンをコードするＤＮＡ
配列、及び選択マーカーとして、その生成物が複合培養
基上で宿主細胞の生育性又は正常増殖のために必須であ
るところの遺伝子配列を含むＤＮＡ構造物を提供するこ
とが本発明の目的である。

本発明の別の目的は、複合媒体上での増殖により選択で
きかつα−１−アンチトリプシンを発現しうるプラスミ
ドを含む微生物の形質転換株を提供することである。

さらに本発明の別の目的は、必須機能において欠陥を持
ち、これら欠陥的必須機能を補いかつα−１−アンチト
リプシンを発現できる遺伝子配列を持つＤＮＡ構造物の
ための宿主として働きうる微生物株を提供することであ
る。

本発明の別の目的は、形質転換微生物中でα−１−アン
チトリプシンを作る方法において、α−１−アンチトリ
プシンが、選択マーカーとして宿主微生物における必須
遺伝子の欠陥を補う遺伝子配列を含むＤＮＡ構造物上に
含まれる遺伝子の生成物である方法を提供することであ
る。

本発明の別の目的は、当業者にとって明らかであろう。

本発明のまとめ 本発明に従い、α−１−アンチトリプシンを発現できか
つ特別の選択培養基を要せずに高いコピー数で維持され
るＤＮＡ構造物及び適当な宿主細胞が提供される。その
ような条件における増殖は、より速い増殖、より大きい
細胞密度及び低減された生産コストをもたらす。

本発明は更に、複合培養基での正常細胞増殖のために必
要な機能における欠陥を持つ宿主細胞においてα−１−
アンチトリプシンを作る方法であって、この欠陥を補う
遺伝子及びα−１−アンチトリプシンをコードする配列
を含むＤＮＡ分子により宿主細胞を形質転換の段階を含
む方法を提供することである。

本明１［１１Ｆにおいて、ＤＮＡ構造物という言葉は、
分子中のヌクレオチド配列が自然に作られた配列と同じ
でないように人により修飾された任意のＤＮＡ分子を意
味する。ＤＮＡ構造物という言葉はまた、そのように修
飾されたＤＮＡ分子のクローンをも包含する。発現ベク
ターという言葉は、複製の自律部位、転写開始部位及び
宿主生物において発現されるべき蛋白質をコードする少
くとも一つの構造的遺伝子を含むＤＮＡ構造物として定
義される。発現ベクターはまた通常、宿主生物における
蛋白質の発現を制御するプロモーター及びターミネータ
−のような適当な制御領域をも含むであろう。本発明に
従う発現ベクターはまた、本明細書で述べる必須遺伝子
を含む選択マーカーをも含むであろう。

プラスミドという言葉は、その普通に用いられる意味、
すなわち自律的に複製し、通常開じたループのＤＮＡを
意味する。

添付した図面において： 第１図は、プラスミドｐＢ４の構造を示す。

第２図は、プラスミドｐＢ５の構造を示す。

第３図は、プラスミドＰＲ１ＳＬの構造を示す。

第４図は、プラスミドｐＢ５及び９Ｂ１５Ｌで共形質転
換されたＳ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ａ
２．７．ＣからのＤＮＡのサザーンプロットを示す。こ
のプロットは、ゲノムＣＤＣ４座の崩壊についてテスト
するためにＣＤＣ４の５′フランキング領域からの２．
５　ｋｂ　　Ｂａｓ＋　ＨＩ　−Ｈｉｎｄｌ［［フラグ
メントでプローブされた。レーンａは、ｐａ５１１独で
形質転換された細胞からのＤＮＡを含む；レーンｂは形
質転換されていない細胞；レーンＣ〜ｈは共形質転換体
を含む。矢印は、プローブにハイブリットするゲノムフ
ラグメントを示す。

第５図は、Ｓ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ　）　Ｐ　ＯＴ　１
及びＳ、セレビシェＴＰＩＩ遺伝子の配列を、各々の措
定された蛋白質配列とともに示す。Ｓ、ボンベＴＰＩ蛋
白質配列の全体が与えられる。Ｓ、セレビシェ蛋白質の
配列は、それがＳ、ボムベ配列と異る個所のみ示される
。Ｓ、セレビシェ蛋白質配列における位置１におけるメ
チオニンは、天然蛋白質には存在しない。

第６図は、プラスミドｐｃＰＯＴの構造を示す。

第７図は、プラスミドρＦＡＴＰＯＴの構造を示す。

第８図は、プラスｉ　Ｆ　ｐＴＰ　［−ＬＥＵ２の構造
を示す。

詳細な説明 本発明は、必須遺伝子がα−１−アンチトリプシンを発
現できるプラスミドのようなりＮＡ構造物上の選択マー
カーとして用いられうるという発見に部分的に基づく。

必須遺伝子という言葉は、複合培養基での細胞生育又は
正常増殖のために必要な機能をコードする任意の遺伝子
と定義される。

複合培養基は、その中において栄養素が、組成が良く定
義されない生成物たとえば粗細胞エキス、肉エキス、果
汁、血清、蛋白質加水分解物などから導かれる培養基で
ある。従って、本発明に従う望む形質転換体を選択する
ために、選択増殖培養基は単に慣用の複合増殖養基であ
り、非形質転換宿主細胞に致命的な比較的高価な抗生物
質、金属拮抗剤、又は他の剤を含む、又は非形質転換宿
主に必要な一以上の特定の栄養素を欠く特別の培養基で
はない。必須遺伝子としては、細胞分割、膜体合成、細
胞壁生合成、細胞小器官生合成、蛋白質合成、炭素源利
用、ＲＮ八へ写及びＤＮＡ複製のために必要な遺伝子を
包含するがこれらに限定されない。

ＤＮＡ構造物たとえばプラスミド上の選択マーカーとし
て必須遺伝子を用いるために、適当な突然変異宿主細胞
株を提供することが必須である。

ロススティン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　）の一段階遺伝子
崩壊法（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｌｙｍｏｌｏｇｙ　１
０１　：　２０２−２１０．１９８３）又は本明細書で
述べる共形質転換手順を用いて、ゲノムにおい−ご適当
な必須遺伝子の欠失を有する適当な宿主株が構成され・
うる。

そのような欠失突然変異体は、突然変異がプラスミドに
１１１持される遺伝子物質によりコードされる機能によ
って補われるときに増殖する。宿主のゲノムの必須遺伝
子（単数又は複数）における欠失は、コード領域及び／
又はフランキング領域の主要なセグメントを含むことが
好ましい。必須遺伝子における突然変異が点突然変異の
みにより達成される様式で行われるなら、突然宿主細胞
が突然変異父は組換修復メカニズムによって野性種に戻
り、それによりプラスミド担持遺伝子の使用により速成
されうる選択性を低減又は除去することがありうる。

必須遺伝子は、多重コピー（たとえばヒストン又はリポ
ソームＲＮＡ遺伝子）中に及び／又は遺伝子ファミリー
と呼ばれる多重の関連した形（たとえば種々のへキソキ
ナーゼ遺伝子、又は種々のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子）
中にしばしば存する。

そのような場合、これら重複した機能は、所定の必須機
能について多重に欠陥のある宿主細胞を作るために次々
と突然変異されうる。しかし、遺伝子の活性を増すため
に高コピー数プラスミドを用いることによって、プラス
ミド上の単一の必須遺伝子が多重の宿主細胞欠陥を補い
うる。高コピー数プラスミドは、クローニングされた外
来遺伝子のコピー数の増加がこの遺伝子によりコードさ
れる蛋白質生成物の産生の増加を結果するので望ましい
。

必須遺伝子を持つプラスミドの高コピー数を含む形質転
換体の選択は、各プラスミド出持必須遺伝子の発現レベ
ルを低下させることにより及び／又はプラスミド担持選
択マーカーによりコードされる遺伝子生成物の活性を低
下させることにより達成すれうる。一つのアプローチは
、必須遺伝子を突然変異して、遺伝子の転写及び／又は
翻訳速度が低減される又は遺伝子生成物がより低い特異
的活動を持つよう変えられることである。選択マーカー
として用いられる必須遺伝子の発現レベルを下げるため
の別の方法は、宿主細胞における欠陥を補うために別の
生物からの遺伝子を用いることである。そのような外来
遺伝子は、宿主細胞における発現について自然に欠陥的
でありうる。なぜなら転写及び／又は翻訳のためのシグ
ナルは別の種において最適より低いであろうからである
。

又は遺伝子生成物は低減した活性又は安定性を持つかも
知れない。なぜならそれは異質の細胞環境にあるからで
ある。

複合培養基における細胞生育又は正常増殖のために必要
な幅広い範凹の機能が存在する。必要遺伝子における欠
陥又は欠失は、致死、細胞分割の速度の低下、細胞分割
の終止、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白合成の停止、膜合成の
停止、細胞壁合成の停Ｗ、細胞小器官合成の停止、蔗糖
代謝における欠陥などを結果しうる。必須遺伝子の例と
し°ζは、酵母サソカロミケス　セレビシェのｃｏｃ（
！Ｉ胞分割サイクル）遺伝子（プリンゲル（Ｐｒｉｎｇ
ｌｅ　）とハートウェル（Ｈａｒｔ智ｅｌｌ）　、　　
Ｉ”サッカロミケスセレビシエ細胞サイクル」ストラサ
ーン（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ　）ら副の酵母サツ力ロミケ
ス　ライフサイクル及び遺伝の分子生物学、５７−１４
２中、コールド　スプリング　ハーバ−（ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｒｖ　　Ｈａｒｂｏｒ　　）　＋　１９８１）　、
　　Ｓ、セレビシェ及びエシェリヒア　コリ　解糖経路
の機能をコードする遺伝子、及びＳ、セレビシェの５Ｅ
Ｃ（ノビツク（Ｎｏｖｉｃｋ）とシェフマン（Ｓｃｈｅ
ｋｍａｎ）　。

プロシージングズ　オブ　ナショナルアカデミーオブ　
サイエンスＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　ＮａＬ、Ａｃａｄ、
　Ｓｉｃ。

Ｕ　Ｓ　Ａ）　７６　：　１８５Ｇ−１８６２，１９７
９、及びノビツクら、セル（Ｃｅｌｌ）　　２１　二２
０５−２１５゜１９８０）及びｌＮ０（カルバートソン
（Ｃｕ　１ｂｅｒ　ｔｓｏｎ）と−・ンリー（Ｈｅｎｒ
ｙ　）　＋ジエネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　８０
　：　２３−４０　。

１９７５＞遺伝子が挙げられる。

必須遺伝子欠陥の宿主細胞の一つの好ましいクラスは、
ｃｄｃ突然変異として知られるＣＤＣ遺伝子における欠
陥を含み、これは細胞分割サイクルの段階特異的阻止を
もたらす。多くのｃｄｃ突然変異は、特定のＣＯＣ遺伝
子生成物の合成又は機能に影ツすることによって、細胞
サイクルに必須の事象の完全な妨害を起す。そのような
突然変異は、生化学的に又は形態学的に観察され・うる
事象に対する効果によって同定されうる。多くの既知の
ｃｄｃ突然変異は、環境条件的致死性（すなわち温度敏
感な）突然変異であり、これは制限的条件下で増殖され
た突然変異細胞の正常な成長の終止を結果する。しかし
、ｃｄｃ突然変異から生じた主な欠陥は、段階特異的機
能における欠陥自体である必要はない。たとえば、連続
的に合成された遺伝子生成物は段階特異的機能を持ちう
る；酵母解糖遺伝子ＰＹＫ１における（酵素ピルベート
キナーゼに対する）欠陥が細胞分割サイクル突然変）％
ｃｄｃ　１９　（カワツキ。博士論文、ワシントン大学
、１９７９）に対して対立的である。この突然変異は、
典型的酵母複合培養基ＹＥＰＤ　（１％酵母エキス、２
％バタトペプトン、及び２％デキストロース）中でイン
キユベートされた細胞の６１相における細胞サイクル停
止を結果する。すなわち、ｃｄｃ突然変異が段階特異的
機能における欠陥を結果するか又はそれが段階特異的機
能を持つ遺伝子生成物の抑制又は不能化突然変異を起す
かに拘らず、欠陥の効果は、モニターされうる。

プリンゲルとハートウェル（上述）は、いくつかの５Ｉ
ＣＤＣ遺伝子の機能を記述している。本発明を実施する
に用いるために、そのような遺伝子は、望む突然変異を
持つ株における補償によって遺伝子ライブラリーから分
離されうる。遺伝子ライブラリーは、公知の手順で構成
されうる（たとえばナスミス（Ｎａｓｍｙｔｌ＋　）と
リード（Ｒｅｅｄ）　。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ
　Ａ　？　７　：　２１１９−２１２３゜１９８０　；
及びナスミスとタチェル（Ｔａｔｃｈｅｌｌ）　＋セル
１９ニア５３−７６４．１９８０）。望むｃｄｃ突然変
異を持つ株は、本明細署で述べられるように作られ、又
は公共的に入手できる寄託機関たとえばＡＴＣＣ及びパ
ークレー　イースト　ストック　センターから入手でき
る。

必須遺伝子の第二の好ましいクラスは、解糖経路に関係
する生成物をコードするものであり、代謝酵素及び調節
機能をコードする遺伝子を包含する。同定されたＳ、セ
レビシェにおける解糖経路遺伝子の例は、解糖調節遺伝
子Ｃ，ＣＲＩ及び酵素トリオース　ホスフェ−１・　イ
ソメラーゼ、ヘキソキナーゼ１．ヘキソキナーゼ２．ホ
フホグルコース　イソメラーゼ、ホスホグリセラードキ
ナーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、エノラーゼ、フラク
トース１．６−ビスホスフェート　デバイドロゲナーゼ
、及びグリセ　ラルデヒド３−ホスフェ−１−デバイド
ロゲナーゼをコードする遺伝子である。上述したように
、ピルベート　キナーゼ遺伝子は、カワサキにより同定
され、記述された。

酵母ホスホ　グリセラードキナーゼ遺伝子を含み、開部
シグナルを伴うプラスミドは、ヒッツェマン（１！ｉ　
ｔｚｅｎ＋ａｎ）ら、（ジャーナル　オブ　バイオロジ
イー　アンド　ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ
、　）２２５　：　１２０７３−１２０８０　、　１９
８０）により記述された。酵母トリオース　ホスフェー
トの分離及び配列決定は、アルバー（Ａｌｂｅｒ　）と
カヮサキ（ジャーナル　オブ　モレキュラー　アンド　
アプライド　ジェネティクス）　　（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐ
ｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、）１：４１９−４３４．１９８２）及びカ
ワサキとフレンケル（Ｆｒａｅｎｋｅｌ）　　（バイオ
ケムバイオフィズ　リス　コム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、旧ｏ
ｐｌ＋ｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｗｍ、）　　１０８　：　１１０７−１
１１２．　　１９８２）により記述される。

特に好ましい解糖遺伝子は、Ｔ　Ｉ”　Ｉ　１であり、
これは、グリセラルヒドー３−ホスフェート及びジヒド
ロキシアセトン−３−ホスフェートの相互転化を触媒し
従って解糖及びグリコネオゲネシスのために必須の酵素
、酵母トリオース　ホスフェト　イソメラーゼをコード
する。ｓ８セレビシェにおいて、第一遺伝子座ＴＰＩＩ
は、この機能を暗号する。ＴＰＩＩにおける突然変異を
有する細胞は、グルコース上で増殖せず、他の炭素源上
で少ししか増殖しない。

Σエ　セレビシェ　ＴＰ１１ｉ１伝子は、ｔｐｉ　１突
然変異の補償により分離された（アルパーとカワサキ（
上述）、及びカヮサキとフレンヶル（上述））０分裂酵
母シゾサッカロミケス　ボンベからのトリオース　ホス
フェート　イソメラーゼ遺伝子（ＰＯＴＩ）が同じＳ、
　セレビシェ突然変異の補償により分離され、第５図に
示すように配列決定された。ＰＯＴＩと名付けられたＳ
。

ボンベ遺伝子の配列は、Ｓ、　ボンベＴ　Ｐ　Ｉ　蛋白
質がＳ、　セレビシェのＴＰ　ＩＩ白質と相同であるこ
とを示した。

通常の場合、ＤＮＡ構造物（プラスミド）において用い
られる必須遺伝子は宿主種からの野生タイプ遣１云子で
あろうが、ある場合には宿主細胞にとって外来の必須遺
伝子を用いることが好ましい。

なぜなら外来遺伝子は自然に欠陥的であり、それによっ
て高プラスミドコピー数に対して選択可能であるからで
ある。用いられるそのよ・うな外来必須遺伝子の例とし
て、ここでの例の一つは、Ｓ。

ボンベ　ＰＯＴＩ遺伝子がＳ、　セレビシェ宿主におけ
る選択マーカーとして有効に用いられることを示す。

選択マーカーとして必須遺伝子を含む本発明に従うＤＮ
Ａ構造物は、必須遺伝子の機能において欠陥のある突然
変異宿主細胞中に形質転換されよう、ａ当に突然変異さ
れた宿主細胞が作られなければならないか、又は公共寄
託機関から容易に入手できる。適当な突然変異体を得る
ために野生タイプの細胞の突然変異化は、慣用の方法で
達成されうる。たとえば、野生タイプ細胞が、慣用の突
然変異化剤たとえばエタン　メチルスルホネ−１・によ
り処理され、補償が起るコロニーを同定するために必須
遺伝子を含むプラスミドで形質転換される。あるいは、
ゲノムが崩壊されて、特定の突然変異を作る（ロスステ
ィン、上述）。

宿主細胞中に必須遺伝子を含むプラスミドの安定性は、
宿主細胞における相同の必須遺伝子配列の不存在に依存
しうる。宿主における遺伝欠陥は、プラスミドが維持さ
れることを保証する。なぜなら、宿主細胞の増殖は必須
遺伝子機能の欠除により起らず又は厳しく制限されるで
あろうからである。加えて、プラスミド自体の完全性は
、プラスミド担持必須遺伝子と宿主ゲノム中の対応する
座の間の相同性の不存在に依存するであろう。なぜなら
、各プラスミドとゲノム座の間の組換えは突然変異及び
プラスミドの両者の細胞を治ゆするであろうからである
。すなわち、ゲノム必須遺伝子を不活性化する宿主細胞
ゲノム中の突然変異が本質的に自然であること、即ち欠
失が染色体遺伝子のコード留部及び／又はフランキング
領域の　ＤＮＡ配列から成ることが好ましい。これが達
成されると、組換えによるゲノム突然変異の治ゆは、あ
まり起きなくなる。

本発明のフランキングは、適当な突然変異宿主細胞中に
維持されるとき、予期せぬことに安定である。好ましい
宿主細胞は酵母である；しかし他の真核細胞ならびに原
核細胞も用いうる。酵母細胞の場合、本発明に従うフラ
ンキングの安定性は、動原体を含む酵母プラスミドのそ
れをさえ越えるようである。環状勤原体プラスミドは、
酵母について従来報告された最も安定なプラスミドに含
まれるが、しかし極端に低いコピー数が欠点である（ク
ラーケとカーボン、上述、とステインクコムら、１９８
２、上述）。線形動原体酵母プラスミドは、プラスミド
長に依存して、不安定であるか低コピー数で依存する（
バーレイとスジスタフ、上述）。従って、必須遺伝子を
担持するプラスミドの改善された安定性が達成されるこ
とは、予期せぬ利点である。

ＰＯＴＩ及びＣＤＣ４遺伝子は、発現ベクター上の選択
マーカーとしての必須遺伝子の利用の二つの例である。

これら二つの遺伝子は、複合培養基上での細胞増殖のた
めに必要な幅広いクラスの遺伝子に屈する。他の必須遺
伝子の使用は、複合増殖条件を含む植物又は動物組織培
養株におけるプラスミド選択を可能にし、また極端には
、血、血清、又は生きた動物又は植物からの液汁から栄
養を受ける細胞中でのプラスミドの維持を可能にする。

本明細書で述べるプラスミドを用いる実験から得たデー
タは、ヒトα−１−アンチトリプシン（Ａ　Ｔ）産生が
選択マーカーとしてＳ、　ボンベＰＯＴＩ遺伝子の使用
によって、従来の栄養要求性選択マーカーＬＥＵ２を含
む類似のプラスミドにより得られるＡＴ産生に比べて二
倍にされることを示す。これらの結果は、ＰＯＴＩ含有
プラスミドが、これらがそれから誘導されたところの非
ＰＯＴＩプラスミドよりもコピー数において機能的によ
り大きいことを示す。

本発明に従うＤＮＡ構造物すなわち特にプラスミドを作
るために用いられる手法は、慣用の方法を含む。ＤＮＡ
構造物において用いられる必須遺伝子は、もし遺伝子の
構造が知られているなら、ラベルされたＤＮＡブローベ
を用いてライブラリーから分離される、又はＤＮＡライ
ブラリーのセグメントを普通のベクターに結合し、この
ベクターを特定の必須遺伝子において欠陥の突然変異細
胞中に形質転換し、そして補償された株をさがすことに
よって同定される。必須遺伝子を含む適当なりＮＡフラ
グメントが同定されると、それは発現されるであろう構
造的蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターに結
合される。必須遺伝子は、宿主生物内での発現に必要な
それ自身のプロモーター及び他の対照と共に用いられう
る。

あるいは、必須遺伝子の発現を増す又は減らすために、
異種プロモーターが用いられうる。ＤＮＡフラグメント
の結合の方法は、実施するに十分に記載されており、当
業者にとって十分である。

ＤＮＡ構造物の調製後に、それは形質転換条件下に宿主
生物中に形質転換される。原核細胞及び真核細胞（組織
培養棚゛胞を含め）を形質転換するための方法は、文献
で知られている。

上述したように、宿主生物は、プラスミド上の必須遺伝
子の選択のための必須機能において欠陥を持たねばなら
ない。突然変異宿主株は、通常の寄託機関から入手でき
、又は突然変異化及び適当な突然変異を持つ突然変異体
をスクリーニングすることにより野生タイプから慣用の
手段により作られうる。

形質転換された宿主は、次に慣用の複合培養基上での増
殖により選択されうる。酵母の場合、ＹＥＰＤ　（１％
酵母エキス、２％バクトペプチン及び２％デキストロー
ス）のような慣用の培養基が用いられうる。本発明に従
う必須遺伝子を含む選択マーカーが、ＤＮＡ構成に適当
である場合にはいつでもマーカーとして使用でき、そし
て従って本発明に従う必須遺伝子選択マーカーを含む構
造物は多くの用途を持つことが認められよう。下記の実
施例は、そのような用途の例示のための示され、制限の
ためではない。

別記なき限り、標準分子生物学的手法が用いられた。酵
素は、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）研究所、ニューイ
ングランドバイオラプズ、及びボーリンガ−（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ）マンハイム　バイオケミカルズから得ら
れ、製造者により指示されたように又はマニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ら（モレキュラークローニング：Ａ実
験室マニュアル、コールド　スブリング　ハーバ−ラボ
ラトリ−，１９８２）により記載されたように用いられ
た。大腸菌培養物は、マニアナスら（上述）に開示され
るように塩化カルシウム法によって形質転換された。酵
母培養菌は、ベッグズ（Ｂｅｇｇｓ　）の方法を本明細
書で述べるように修正して用いて形質転換された。

実施例　ｌ ドの構成 酵母ゲノム　ライブラリーは、５ａｎ３Ａによる酵母Ｄ
ＮＡの部分的消化、蔗糖勾配によりサイズ選択、及びＢ
ａｗ＋旧で予め消化された酵母ベクターＹＲｐ７中への
選択されたフラグメントの挿入により構成された（ナス
ミス（Ｎａｓ＋＋＋ｙｔｈ　）とリード（Ｒｅｅｄ）　
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　Ｕ
　Ｓ　Ａ。

７７　：　２１１９−２１２３．　１９８０）。ＣＤＣ
４遺伝子を含む組換えプラスミドが、酵母株ＧＥＢ　５
（ＭＡＴＡ　　ｃｄｃ４−４　１ｅｕ２　　ｔｒ旦　１
ｙｓ　１　　ｕｒａｌ）及びＧ　Ｅ　Ｂ　７　（ＭＡＴ
ａ　　ｃｄｃ　４−３　１ｅｕ　２　　ｔｒｐＨｙｓ＋
）をライブラリーによる形質転換により分離された。こ
れらの株は、株Ａ　３６４　Ａｃｄｃ　４−３及びＡ３
６４Ａｃｄｃ　４−４　（ハートウェルら、ジェネティ
クス７４：２６７−２８６．　１９７５）から、高頻度
で形質転換すると知られた株（Ｋ２Ｏ（ＭＡＴａｌｏｕ
　２　　ｔｒｐ　１）　　（ナスミスら、ネイチア２８
９：２４４−２５０．１９８１：タッチエルら、セル２
７：　　２５−３５．１９８１）との交配及び続いての
高形質転換株（Ｋ２Ｏ及びに８０　（ＭＡＴａ　　Ｉｏ
ｕ　２　　ｔｒｐ　１　１ｙｓｌ））への戻し交配によ
り望む遺伝的背景（１ｏｕ２ｔｒｐ　１　）でｃｄｃ　
４−３及びｃｄｃ　４−４突然変異を得ることによって
誘導された。トリプトファン原栄養性及び制限的温度（
３７°）で増殖する能力についての形質転換体の選択は
、ゲノム中に組込まれＣＤＣＪ座にマツプすると判った
一つのそのようなプラスミド（ｐＪＹ３５と名付けられ
た）を同定した。自発的プラスミド組込み体は、それら
の選択的増殖利点に基づいて同定された。この生長利点
は、元のプラスミド上での　ＣＤＣ４を結合された遺伝
子の存在により、これは高コピー数で存在するとき（す
なわちプラスミドが宿主ゲノム中に組込まれなかったと
き）に細胞増殖にとって有害である。組込み体において
、ＴＲＰＩ　　プラスミドマーカーは、５ＵＰＩＩに遺
伝子的に結合されることが見られ、これは染色体■上の
ＣＤＣ４に結合される（モルチマー（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ
）とシルト（Ｓｈｉｌｄ）　、　　ｒサソカロミケス　
セレビシェの遺伝子マツプ」、ストラサーンら編、酵母
サツ力ロミケス　セレビシェ　ライフサイクルと遺伝の
分子生物学、６４１−６５１．コールド　スプリング　
ハーバ−１９８１）、ｃｄｃ４−３補償領域は６、４　
ｋｂＢ　ａｍＨｒフラグメントとして精製され、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用′いて、Ｂａ＋ｍｌ（＋で予め開裂さ
れたベクターＹＲｐ７（ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）ら
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＪ　
Ｓ　Ａ７６　：　１０３５−１０３９．　１９７９）に
結合された。この構造物はｐ　ＪＹ５１として知られ、
第１図に示される。

第１図において、ＣＤＣ４コード領域が下記の方法でフ
ランキング　ゲノムＤＮＡ配列から精製された。プラス
ミドｐＪＹ５１が旧ｎｄＩ［［で開裂され、ＣＤＣ４領
域を含む３．６　ｋ　ｂフラグメントがバクテリア　プ
ラスミドｐＢＲ３２２中でサブクローンされた。この構
造物は、Ｂａｎ　ＨＴで完全に消化され、Ｈｉｎｃｌｌ
で部分的に消化され、約２．３　ｋｂのＣＤＣ４含有フ
ラグメントが精製された。

１（ｉｎｃ″■フラグメント末端は、リンカ−配列（配
列：　５　’　ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３　’　、コラボ
ラティブリサーチから得られた）の付加及び続いて過剰
のリンカ−の除去のためのＲａｍ　ＨＩでの消化によっ
て、ＢａｍＨ１末端に転化された。ＣＤ’Ｃ４遺伝子の
約１．９ｋｂを含む得たフラグメントは、プラスミドｐ
ＪＹ７０を作るためにＹＲｐ７のＲａｍ　Ｈ［部位中に
挿入された。このプラスミドは、上述のｃｄｃ　４−３
突然変異を補うように見えた。この１．９　ｋ　ｂフラ
グメントは　ＣＤＣ４遺伝子の５′−及び３′−コード
領域の両者の小さな部分を欠くが、それは驚ろくことに
温度感性欠陥を補う。たぶん、ＣＤＣ４配列の転写及び
翻訳はプラスミドのｐＢＲ３２２領域中に位置する配列
により制御され、機能的遺伝子生成物の産生を可能にす
る。

プラスミドｐＪＹ７０は酵苺ＴＲＰＬ及びＡＲ３Ｉ配列
を除くためのＥｃｏＲｒで開裂され、そして再び結合さ
れてｐＢｉ３２２及びＣＤＣ４配列を含むハイブリッド
　プラスミドを与えた。

このプラスミドはｐ　ＪＹ７１として知られ、第１図に
示される。

１．９ｋｂ酵母配列は、Ｒａｍ　Ｈｌ　−１１ｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントとしてｐＪＹ７１から精製された。こ
のフラグメントは、Ｒａｍ　ｌ（Ｉと１ＩｉｎｄＩＩＩ
での消化により線形化されたｐＢＲ３２２に結合されて
プラスミドｐＢ４を作った。これは第１図に示される。

ＣＤＣ４領域は、高コピー数酵母ベクター中への挿入の
ためにｐＢ４から再び分離された。そのようなベクター
は、酵母２μプラスミドの複製のオリジン、及び興味あ
る外来遺伝子のためのクローニング部位として働く一以
上の制限酵素開裂部位を含むであろう。好ましくは、そ
のような部位はプラスミド上のユニーク部位であろう。

好ましいベクターはＭＷ５であり、これは酵母２μプラ
スミド複製オリジンとユニークＥｃｏＲＩとＢａａ＋Ｈ
ｌクローニング部位を含む。第２図において、プラスミ
ドＭＷ５は、プラスミドＹＲｐ７’（ステインクコムら
、ネイチア２８２：３９−４３．１９７９）から、Ｅｃ
ｏＲＩで部分的開裂により平均分子当り二つのＥｃｏＲ
１部位の一つを開裂することによって誘導された。線形
分子の得た非対末端は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて満
たされ、得られたプラント末端はＴ４　　ＤＮＡリガー
ゼを用いて再結合された。ＡＲ３Ｉ配列に近接するＥｃ
ｏＲ１部位を保持する得たプラスミドを次に選択した。

ＡＲ３１配列はＰｓｔｌと　ＥｃｏＲＩでの消化により
除かれ、酵母２μＤＮＡの複製オリジンを含むプラスミ
ドＹＥｐ１３（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら、ジーン（
Ｇｅｎｅ）　８　：　１２１−１３３゜１９７９＞のＰ
ｓｔＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントで置き代えられた。

ＭＷ５と呼ばれる得たプラスミドを第２図に示す。

ＣＤＣ４領域は、高コピー数酵母ベクター中への挿入の
ためにｐＢ４から再び分離された。そのようなベクター
は、酵母２　プラスミドの複製のオリジン、及び興味あ
る外来遺伝子のためのクローニング部位として働く一以
上の制限酵素開裂部位を含むであろう。好ましくは、そ
のような部位はプラスミド上のユニーク部位であろう。

好ましいベクターはＭ　Ｗ　５であり、これは酵母２　
ラスミド複製オリジンとユニークＥｃｏＲ１と　Ｒａｍ
　ＩＴＩクローニング部位を含む。第２図において、プ
ラスミドＭＷ５は、プシスミｌ”／Ｒ７’（ステインク
コムら、ネイチア２８２：３９−４３．１９７９）から
、Ｅｃｏ　Ｒｌで部分的開裂により平均分子当り二つの
Ｂｃｏ’ＲＩ部位の一つを開裂することによって誘導さ
れた。線形分子の得た非対末端は、ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて満たされ、得られたプラント末端はＴ４　　Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて再結合された。ＡＲ３Ｉ配列に近
接するＥｌｌＲ１部位を保持する得たプラスミドをつぎ
に選択した。ＡＲＳＩ配列はＰｓｔｌとＥＩＩＲＩでの
消化により除かれ、酵母２μＤＮＡの複製オリジンを含
むプラスミドＹＥｐ１３（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら
、ジーン（Ｇｅｎｅ）８：１２１　１３３゜１９７９）
のＰｓｔＲＩフラグメントで置きかえられた。ＭＷ５と
呼ばれる得たプラスミドを第２図に示す 最終的なＣＤＣ４含有安定プラスミドを構成するために
、ＭＷ５はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで開裂された。ＣＤ
Ｃ４フラグメントは、プラスミドｐ８４から、プラスミ
ドをＢａｓ＋ＨＩとＥｃｏＲＩで消化することにより精
製された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて二つのフラグメ
ントを結合し、そのようにして作ったキメラ分子を大腸
菌株ＲＲＩ（ナスミスとリード、上述）中に形質転換し
、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感応性のコロニ
ーについて選択した。一つのそのようなコロニーから分
離されたプラスミドｐＢ５　（第２図に示す）は、酵母
２μ複製オリジン、ｐＢＲ３２２プラスミド配列、選択
マーカーＴＲＰＩ、酵母ＣＤＣ４コード配列の１９　ｋ
ｂ、及びユニーク１ＥｃｏＲクローニング部位を含む。

Ｂ、宿主（′／ＤＣ４遺伝子の崩壊のためのプラスミド
の構成 本発明に従うＣＤＣ４含有プラスミドの、形質転換され
た宿主における安定性は、宿主におけるｆｉｔｌｌ性Ｃ
ＤＣ４遺伝子の欠損に依存する。プラスミドと染色ＤＮ
Ａの間の組換えを除くために、宿主ゲノムとＣＤＣ４含
有安定プラスミドの間に相同性が存在しないことが更に
望ましい。適当に除去されたＣ　Ｄ　Ｃ’４座を持つ酵
素株を得るために、野性型ＣＤＣ４遺伝子を含む酵母宿
主は、崩壊された“ＣＤＣ４遺伝子″　（０スステ・イ
ン、上述）を持つ線形化されたプラスミドフラグメント
により形質転換されうる。線形化されたプラスミドフラ
グメントは、フラグメントの自由末端が　ＣＤＣ領域内
での組換えを高めるであろう故に、好ましい形質転換剤
である。そのようなプラスミドフラグメントは、完全な
ゲノムＣＤＣＪ座との組換えを促進するためにその末端
で完全なＣＤＣ４フランキング領域を持つであろう。プ
ラスミド　フランキングのＣＤＣ４７ランキング領域の
間に挿入された遺伝子物質は、形質転換された宿主中で
選択されうる表型的特徴（ＴＲＰＩ又はＬＥＵ２のよう
な選択マーカー）をコードするであろう。崩壊するプラ
スミドは好ましくはまた、宿主ゲノム中への崩壊された
ＣＤＣ４選択マーカー配列の組込みについて選択するた
めに、複製の酵母オリジンを欠くであろう。線形化され
たプラスミドでの形質転換に続いて、遺伝子組換えは宿
主のゲノム配列の代りに崩壊された配列の置換を結果す
る。

ＣＤＣ４遺伝子が今や除去されたｍ砲は次に、崩壊にお
いて用いられたマーカーに従って選択できる。

宿主ゲノムの一段階崩壊のための方法は、ロススティン
（上述）により記述されている。上述のように、宿主株
を完全な安定プラスミドと線形プラスミドによる共形質
転換の追加的改善により崩壊が行われて、宿主ゲノムの
崩壊の達成に加えて宿主の安定プラスミドの形質転換も
また行われる。

宿主ＣＤＣ４座の崩壊のための好ましいプラスミドは、
ｐＢ１５Ｌであり、第３図に示される。

それは、ＣＤＣ４のフランキング領域とベクターｐＵｃ
１３＜ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）とメッシング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ　）　、　ジーン１９：２５９−２６８゜１９
８２、及びメッシング、メセッド　イン　エンザイモロ
ジ−１０１：２０−７７．１９８３）の間に挿入された
酵母ＬＥＵ２遺伝子・を含む。酵母とベクター配列の結
合点で線形化されそして適当な酵母宿主株中に形質転換
されるとき、プラスミドはＣＤＣ４領域のためのＬＥＵ
２配列の置換から得られた宿主ゲノムにおけるＣＤＣ４
の欠失を作る。宿主株において、ロイシン栄＃要求性の
崩壊された形質転換体は次に、ロイシン原栄養性に基づ
いて選択されうる。

プラスミドｐ　Ｂ　１５　Ｌを構成するために、ＣＤＣ
４遺伝子及びその５′−及び３′−フランキング領域を
含む（ｉ、　４　ｋｂフラグメントが、ｐＪＹ５１の［
ｌａａ＋　ＨＩ消化物から精製された。このフラグメン
トは、プラスミドｐＢ１４を作るためにＲａｍ　ＨＩ消
化されたｐＵＣ１３中に挿入された。ＣＤＣ４コード領
域の多くが、ｐＢ１４をＣ１ａＩで消化し、ｐＵｃ１３
とＣＤＣ４フランキング配列を含む比較的大きなフラグ
メントを精製することにより除去された。フラグメント
末端は、Ｘｈｏ［（Ｂｇｌ　ＩＩ）スマートリンカ−（
ワーシングトン　ダイアゴノスチック（Ｗｏｒｔｈｉｎ
ｇｔｏｎＤｉａｇｏｎｏｓｔｉｃ）の付加により修飾さ
れ、ＹＥｐ　１３の２．８ｋｂＢｇｌ　ＩＩＬＥＵ２フ
ラグメント（ブローチら、ジーン８：１２１−１３３．
１９７９）が得られた粘性末端に結合された。そのよう
に作られたＤＮＡは、大腸菌株ＲＲＩを形質転換するた
めに用いられた。形質転換体は、酵母ＬＥＵ２配列が大
腸菌宿主中のＩｅｕ　Ｂ欠陥を補うぎで、ロイシン原栄
養性に基づいて選択された。プラスミドｐＢ１５Ｌが、
そのような形質転換された一つのコロニーから精製され
た。

プラスミドＰＢ１５Ｌは、５′及び３′フランキング配
列に加えてＣＤＣ４コード配列の５′末端の僅か約５０
塩基対を含む。プラスミドｐＢ５とＰＢ１５Ｌのマツプ
の比較は、それらの各々のＣＤＣ４配列の間の相同性の
欠除を示す。なぜならｐｌ＋１５ＬのＣＤＣ４−ＬＥＵ
２遺伝子融合の結合点がρＢ５中に存在するＣＤＣフラ
グメントの領域の外に位置しているからである。この相
同性の欠除は、ｐＢ５と宿主細胞における崩壊されたＣ
ＤＣＡ　　座の間の組換えを除く。

Ｃ，Ｓ、セレビシェの共形質転換 同時的に、ゲノムＣＤＣ４遺伝子を除去しかつプラスミ
ドｐＢ５を導入するために、酵母細胞がＲａｍ　ＨＩ開
裂されたｐＢ１５Ｌと完全なプラスミドρ８５により共
形質転換された。形質転換において用いられるべき宿主
株は、プラスミドρＢ５とゲノムＣＤＣ４崩壊の同時選
択のために、Ｉ−Ｉ７プトフアンとロイシンについて栄
＃要求性でなげり、メソッド　イン　エンザイモロジ−
１０１：２４５−　２５２．１９８３）の株ＧＥＢ７　
（実施例ＩＡ　　参照）の交配から得られた株Ａ　２．
７．ｃ（ＭＡＴαｃｄｃ　４−３　　ｔｒｐ　１　　ｌ
ｅａ　２−２．１１２Ｉｙｓ　１　　ｈｉｓ　３−１１
＋１５　　ｃａｎ　１　　）が用いられた。

典型的な共形質転換実験において、対数増殖用のＳ、セ
レビシェＡ２．７．ｃの培養物の１０ｍ１が、約６ｐｇ
の口ａｍ　ＨＩ消化されたｐＢ１５Ｌ、１μｇｐＢ５及
び担体としての１０μｇ子ウシ胸腺ＤＮＡにより形質転
換された。形質転換条件は、ペソグズ（上述）に記述さ
れた通りである。細胞は、ロイシンとトリプトファンを
欠く培地上に置かれた。それらは、２２°で一夜増殖さ
れ、３７°に移された。約３０のコロニーが得られた。

ｐＢ５１ｉ独での対照の形質転換及びトリプトファン原
栄養性についての選択は、約１０００の形質転換体を作
った。

六つの共形質転換されたコロニーは、ＣＤＣＡ座の崩壊
を検糺し、そしてｐＢ５プラスミドの安定性をテストす
るために分析された。ゲノムＤＮＡは、アブラハム（Ａ
ｂｒａｈａｍ　）ら（コールド　スプリング　ハーバ−
シンポジング　クオンクムバイオロジ−４７：９８９−
９９８．１９８３）による方法により共形質転換体から
分離され、１Ｅｃｏ　ＲＩとＢａａ　ＨＩで消化され、
アガロースゲル上で電気泳動され、二１−ロセルロース
に移された（サザーン、　　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉ（Ｊｌ
、　９８　：　５０３−５１７．１９７５）、プロット
は、ｐＢ１５Ｌに存在しｐＢ５に存在しないＣＤＣ４の
５′フランキング領域からの２．５　ｋｂ　　ｌ５ａｎ
＋　Ｈ［−旧ｎｄｌＩｌフラグメン１−によりプローベ
された。第４図は、プローベが非形質転換細胞からのＤ
ＮＡの６．４　ｋｂフラグメントにハイブリッドしたこ
とを示す。（レーンｂ）　；この６．４　ｋｂ　　Ｒａ
ｍ　ＨＩフラグメント内にＥｃｏ　Ｒ１部位はない。Ｌ
ＥＵ２　　配列がＥｃｏ　Ｒ１部位を含むので、ＣＤＣ
ｄ　　座の崩壊はハイブリッド化帯のサイズの減少を結
果する（第４図で矢印で示す）。これは、レーンｃ、ａ
、（＊　　ｇ及びｈにおい°ζ示された形質転換体の場
合である。レーンｅは、いく分界るパターンを示し、ゲ
ノムサイズ帯を保持し、ゲノムＣＤＣ４の欠失が起きな
かったことを示す。（レーンｃ　ｗ　ｈに見られる比較
的小さな帯は、レーンａとｂにおける対照のパターンに
より示されるように、ゲル精製されたプローベの汚染に
よる。） 六つの共形質転換体が、複合培地（Ｙ　Ｅ　Ｐ　Ｄ）上
で増殖することによりプラスミド安定性をテストされる
。細胞は、液状ＹＥＰＤ中で２５°で３０世代に亘って
増殖され、次にＹＥＰＤ上で２５°でプレートされ、そ
して３７°のＹＥＰＤ。

１−リブトファン欠除培地及びロイシン欠除培地上にレ
プリカ　プレートされた。表１にまとめた結果は、＃３
を除く総ての共形質転換体は、複合培地上でプラスミド
マーカーについて１００％安定であったことを示す。（
分離番号３は、第４図のレーンｅに示された間じ共形質
転換体である。）二つの共形質転゛換体、番号１及び２
．についてさらに安定性テストが実施された。テストは
、各々６６３と６８１のコロニーについて行われた。

３０°でＹＥＰＤ上での３０世代の増殖後に、総てのコ
ロニーはトリプトファンとロイシンに対して原栄養性で
あった。

共形質転換体＃１は、２２°で増殖速度をテストされ、
非形質転換のＡ２．７．ｃ対照と同じ速度で増殖するこ
とが判った。

共形質転換体＃ｌは、Ｂ　Ｅ　Ｌ　Ｌ　１と名付けられ
た。それは、ＡＴＣＣに寄託番号２０６’ｌ１８として
寄託された。

実施例　２ ンゾサッ力ロミケス　ポンベＰＯＴＩ遺伝子Ａ１選択マ
ーカーとしてのＳ、ポンベＰＯＴＩ遺伝子 サノ力ロミケス　セレビシェ　Ｔ　Ｐ　Ｉ　１　遺伝子
は、トリオースホスフェート　イソメラーゼ蛋白質をコ
ードし、　ｔｐｉ　ｌ　　欠陥を補うことにより得られ
た（カワサキとフレンケル、上述；アルバーとカワサキ
、上述）。驚くべきごとに、Ｓ。

ボンへ　からの相同遺伝子は、同じＳ、セレビシェｔｐ
ｆ　ｌ　　突然変異を補うことにより分離された。

Ｐ　ＯＴ　１　　　（ｐｏｍｂｅ　　ｔｒｉｏＳｅ　ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ　）と名付けられ
たＳ、ボンベ　ＴＰＩ遺伝子は、５ａｕ３Ａにより部分
的に消化されベクターＹＥｐ１３中に挿入されたゲノム
Ｓ、ボンベＤＮＡを含むところの、ラッセル（Ｒｕｓｓ
ｅｌｌ　）とホール（Ｈａｌｌ）　、　　（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８　：１４３−１４９．１９８
３）により記述されたライブラリーからクローンされた
。予備的ＤＮＡ配列（マキサム（Ｍａｘａｍ）とギルバ
ート（Ｇｉｌｂｅｒｔ　）Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　　６５　：　４９７−５５９゜１９８
０　の方法による）は、ＰＯＴＩ　　遺伝子がＴＰＴ蛋
白質をコードし、該蛋白質は他の生物からのＴＰＩ蛋白
質と相同であることを示した（アルバーとカワサキ、上
述）。このＰＯＴＩＤＮＡ配列は、Ｓ、セレビシェ　７
’Ｐ　Ｉ　Ｉ　ＤＮＡ配列及び各蛋白質配列と共に第５
図に示される。

Ｓ、ボンベ　ＰＯＴ１遺伝子は、Ｓ、セレビシェにおけ
る選択マーカーとしてＳ、セレビシェＴＰＩＩ　　遺伝
子よりも、この実施例で好まれる。

Ｓ、セレビシェにおけるＰＯＴＩ　　のような外来遺伝
子は、異る宿主細胞中では良好に機能せず、従って宿主
細胞欠陥を補うためにより高いコピー数を必要とするか
も知れない。また酵母プラスミド上の選択しうるＰＯＴ
Ｉ　　遺伝子は、同じベクター上の産業上重要な遺伝子
の発現のために内在ＴＰｒｌ　　プロモーター及びＴＰ
ｒｌターミネータ−（ＰＯＴＩ　　との相同性を示さな
い対照領域）の使用を可能にする。ＰＯＴｌ、及びＴＰ
ＩＩのフランキング領域は相同性を示さないので、分子
内組換え及び結果としてのプラスミド不安定性が低減さ
れる。最後に、ＰＯＴＩ遺伝子はＳ、セレビシェ染色体
ＤＮＡと組換わらないようである。

なぜなら、それは、ＴＰＩＩ配列とＤＮＡレベルで少し
しか相同性を共有せず、ＴＰＩ遺伝子の多くは宿主株に
おいて除去された。ずなわち、ＰＯＴＩ　　含有プラス
ミドは、酵母において産業的に興味ある外来遺伝子の高
められた発現のために望ましい高いコピー数を保持しう
る。

ＰＯＴＩ　　遺伝子を含むプラスミドは、Ｓ、セレビシ
ェ株Ｎ５８７−２Ｄ　（カヮサキとフレンケル、上述）
におけるｔｐｉ　ｌ　　突然変異の補償によりラッセル
とホール（上述）のＳ、ボンベ　から同定された。

このプうスミドｐＰＯＴの制限地図を第６図に示す。ｐ
ＰＯＴはベクターＹＥｐ　１３を含むので、それは本来
的に不安定である。なぜなら、それは酵母において２μ
プラスミドの維持のために必要な複製機能を欠くからで
ある。従って、ＰＯＴＩ遺伝子は、より有能なベクター
たとえばＣ１／１及び完全な２μプラスミド配列を含む
関連ベクター中に動かされうる。プラスミドＣ１／１は
、ｐＪＤ８２４８　　（ベッグズ、ネイチア２７５：１
０４−１０９．１９７８）及びｐＢＲ３２２から木切ｌ
ｌ１ｌ書の実施例３に記載されるように誘導された。そ
れは、酵母２μプラスミドＤＮＡ、選択しうるＬＥＵ２
遺伝子及びｐＲＲ３２２配列の総てを含む。

ＰＯＴＩ遺伝子は、約３４００塩基対の８ａｍＨＴ　−
ＸｂａＩ制限フラグメントとしてｐｐｏ’ｒから分離さ
れ、ｐＵＣ１３の対応するポリランカ一部位中に挿入さ
れた。得たプラスミドは、ｐＵＣＰＯＴであり、その部
分的制限地図を第６図に示す。

ｐＵＣＰＯＴプラスミドは、Ｓ、ボンへとＳ。

セレビシよりＮＡの約１８００塩基対を除去するために
５ａｌｌで切断され、そして再すゲートされる。

この得たｐＵｃＰＯＴ　　Ｓａｌプラスミドは、第６図
に示される。

ＰＯＴＩ遺伝子は、以下の方法でＣ１／１中に入れられ
た。Ｃ１／１及びｐＵｃＰＯＴ−３ａｌの両者は、アン
ピシリン耐性遺伝子中にＢｇ１１部位、及びどこか他の
位置にユニークＲａｍ　ＨＴを有すので、ｐＵｃＰＯＴ
−５ａｌのＰＯＴＩフラグメントは、Ｃ１／１のｐＢＲ
３２２領域の一部に置き１ｔわりうる。Ｃ１／１はＢｇ
ｌｌ及びＢａｍ　Ｈ＋で切断され“ζ、ａｍｐ　Ａ遺伝
子の一部、２μＤＮＡの総て、及びＬ　Ｅ　Ｕ　２遺伝
子を含む約７７００塩基対の大きなフラグメントを遊離
した。同様に、ｐＵｃＰＯＴ−５ａｔはＢｇｌｌ及びＢ
ａｍ　ＨＩで切断され、ａｍｐ几遺伝子の別の一部及び
ＰＯＴＩ遺伝子を含む約３４００塩基対のフラグメント
を遊離した。これら二つのフラグメントをリゲートして
ｐｃＰＯＴを形成し、これは回復された選択しうるａｍ
ρ八遺へ子、ＰＯＴＩ遺伝子、Ｌ　Ｆ、　ＬＪ　２遺伝
子、総ての２μＤＮＡ、及びｐＵｃ１３からの複製領域
のバクテリアオリジンを含む（ｐ　ＵＣ１３がらのバク
テリアオリジン領域は、ｐＢＲ３２２のオリジン領域が
行うよりもより高いプラスミドコピー数を可能にする）
。

ｐＣＰＯＴで形質転換された大腸閑株ＨＢＩＯＩは、寄
託番号３９６８５としてＡＴＣＣに寄託された。

ＰＯＴＩ遺伝子はまた、同様の構成によりＣ１／１誘導
ベクター中に挿入されうる。たとえば、プラスミドｐＦ
ＡＴ５　（第７図）は、Ｃ１／１に挿入されたヒトα−
１−アンチトリプシン（Δ１゛）の産生のための発現ユ
ニットを含む。この発現ユニットは、実施例４で述べる
ように作られ、ＴＰＩＩプロモーター、ＡＴｃＤＮＡ配
列、及びＴＰ１１転写ターミネータ−より成る。ｐ　Ｆ
ＡＴ　５の制限地図は、第７図に示される。

ｐＦ八へ５は、Ｂｇｌ　ｌ　ａＢａｍ　ＨＩにより切断
され、ＡＴ遺伝子とＴＰＩＩターミネータ−を含むフラ
グメント（２２００塩基対）を遊離した。また、上述し
たようにＣＩ／　Ｉ　Ｂｇｌ　Ｉ　−８，１＋１１　Ｈ
Ｉフラグメントと同一のＢｇｌ　Ｉ　−Ｒａｍ　Ｈ］フ
ラグメントが遊離される。但し、ｐＦＡＴ５からのフラ
グメントは、ＴＰ１１プロモーターを含むさらに９００
の塩基対を含む。この後者のｐＦＡＴＳ片及びｐＵＣＰ
ＯＴ−Ｓａｌ　３４００ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉ　−Ｒａｍ　
　ＨＩフラグメント−（上述した）は、プラスミドｐＦ
ＰＯＴを形成するためにリゲートされ、これは第７図に
示す制限地図を持つ。

ベクターｐＦＡＴＳはユニーク［ｌａｍ　Ｈ１部位で切
断され、２２００塩基対ＡＴ遺伝子及びｐＦＡＴ５から
のＴＰ１１ターミネータ−フラグメントの挿入を可能に
する。ｐＦＰＯＴ中への適当な定位の２２００ｂｐフラ
グメントのクローニングは、この酵母ベクター中のヒ１
−ＡＴの発現を許す。適当にリゲートされた生成物は、
ｐ　ＦＡＴＰＯＴと名付けられ、その制限地図を第７図
に与える。

Ｂ　宿主ＴＰＩ　　遺伝子の崩壊 サツ力ロミケス　セレビシェ　ＴＰＩＩ　　遺伝子がク
ローンされ、配列決定された（カヮサキとフレンケル、
上述、及びアルバートカヮサキ、上述）。ＴＰＩ蛋白質
のための構造遺伝子を含むプラスミドｐＴｐｒｃｔｏは
、アルバーとカヮサキ（上述）に記載されている。Ｂｇ
ｌｌＩ部位が、ＴＰＩＩ　　コード領域のＤＮＡ位置２
９５に存在し、もう一つのＢｇＩｎ部位が５′フランキ
ング領域において約１２００塩基対離れて位置する。こ
れらＢｇｌ　■部位は、ＴＰＩＩ　　遺伝子の一部を除
去するため及び別の遺伝子たとえば酵母ＬＥＵ２遺伝子
を挿入するために慣用のクローニング部位である。その
ような構造物は、形質転換された宿主におけるゲノムＴ
ＰＩＩ　　座の崩壊を作るために用いられうる。

′ｒＰｒｌの５′フランキング領域における約−１８０
０は、Ｐｓｔ　１部位である。従ってｐ’ｒｐｒｃ１０
においてＴＰ　［１遺伝子が、５′側でＰｓｔ１部位に
よりそして３′側で５ａｌｔ部位（ｔｅｔ八遺へ子にお
ける）によりフランクされる。

ＴＰＩＩを含むｑのＰｓｔ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｔフラグメ
ントが、Ｐｓｔ　Ｉ及び５ａｌ１部位でｐＵｃ１３に挿
入されてｐＵｃＴＰＩを作った。Ｐｓｔ　ｒ　−３ａｌ
　ｒｉｆｔ入物（ｐＵｃ１３への）の制限マツプを、第
８図に示す。

次にプラスミドにｐｕｃ’ｒｐｒがＢｇｌ　ＩＩで切断
され、二つのＤＮＡフラグメントが電気泳動により分離
された。比較的大きなプラスミドが精製され、自己結合
を防ぐためにホスホアターゼ分解された。このＤＮＡの
８ｇｌ■部位中に酵母り、ＥＵ２遺伝子がリゲートされ
、これはＢｇｌｆｌフラグメントとしてプラスミドＹＨ
ｐ　１３　　（ブローチら、ジーン８：１２１−１３３
．１９７９）から除去されたものである。得られたプラ
スミドは、ｐ　ＵＣＴＰ　Ｉ−ＬＥＵＺであり、これは
ＴＰｌｌの部分的欠失及びＬＥＵＺ　　の挿入を有する
。

ｐ　ＵＣＴＰ　［−ＬＥＵＺを第８図に示す。

プラスミドｐＵＣＴＰ　Ｉ−ＬＥＵＺは、ＤＮＡを線形
化するためにＰｓｔ　１とＲａｍ　Ｈ１で切断された。

次に酵母配列が、電気泳動及びゲル精製によりｐＵｃ１
３配列から分離された。第８図に示される酵母ＤＮＡ部
分は、ＴＰＩＩ染色体遺伝子（ロススティン、上述）を
「崩壊する」ために、ＬＥＵＺ　　について欠陥のある
Σエ　セレビシェ株Ｅ２−７８　（ＡＴＣＣ隘２０６８
９）を形質転換するために用いられる。Ｉｅｕ＋形質転
換体は、３％グリセロール、１％ラクテート（ｐＨ７に
中和された）、ＩＭソルビ］・−ル及びロイシン不合の
合成（修正ライフケラムの）培地（１−ルチマーとホー
ソーン著、ローズとハリソン編、ヂ　イーストｖｏ１．
１．３８５−４６０．アカデミツクプレス、１９６９）
上で選択された。形質転換体は、ＹＥＰ−デキストロー
ス上でのその増殖不能によりＴＰ［欠陥についてスクリ
ーンされた。川めの　９９のスクリーンされた形質転換
体のうち一つのｔｐｉ−性質転換対が見い出された。こ
の株は、Ｅ２−７８へｔｐｉ＃２９（以下、△　ｔρｉ
＃２９と云う）と名付けられた。△ｔｐｉ＃２９は、Ｙ
ＥＰ−３％グリセロール−１％ラクテート上で増殖した
が、ＹＥＰ−デキストロース上で増殖しなかった。粗細
胞抽出物で酵素評価（クリフトン（ｃｌｉｆｔｏｎ　）
ら、ジエネティクス　ａａ：ｔ−１１，１９８０）か行
われ、Δｔｐｉ　＃　２９が、検出できるレベルのトリ
オースホスファ−トイツメラーゼ活性を欠くことが確認
された。

Δｔｐｉ　＃　２９は、ｔｐｉ−欠失についてヘテロ接
合性である二倍体を形成するために、他の酵母株に交配
され・うる、そのような二倍体は、トリロース　ホスフ
ェート　イソメラーゼについて欠陥的な他の株が発生さ
れうるように、胞子形成されうる。たとえば、Δｔｐｉ
　＃　２９は、Ｅ８−１０Ａ（Ｍａｔｃｒ　　Ｉｅｕ２
）（雑種Ｅ２−７ＢＸＧＫ１００　（ＡＴＣＣ２０６Ｇ
９　）の胞子分離体）に交配されζ、二倍体Ｅｌｌを形
成した。この二倍体は、胞子形成されて、半数体子孫Ｅ
ｌ　１−３Ｇを発生した。これは次のゲッタイブを持つ
：Ｍａｔα９ｅｐ・１−３　　Ｌ　ｐ　ｉｌ。Ｅｌ　１
−３ＧかΔｔｐｉ＃２９に戻し交配されて二倍体Ｅ１８
を形成した。これはｔｐｉ　１欠失についてホモ接合性
である。Ｅｌ８、アミノ酸要求を持たず、より大きな細
胞を持ち、より速く増殖するので、プラスミドのための
宿主株としてΔｔｐｉ＃２９より好ましい。これらｔｐ
ｉ−株は、解糖Ｖ＆能をコードする遺伝物質について欠
失しており、従って戻らない（すなわち安定な）突然変
異体であると考えられる。

Ｃ，Ｓ、セレビシェ　ｔｐｉ−欠失株へのＰＯＴ１遺伝
子の形質転換 プラスミドｐＦＰＯＴ及びｐＦＡＴＰＯＴが、Δｔｐｉ
　＃　２９及び関連するｔｐｉ欠失欠失形質転換された
。この酵母突然変異体は、３０°でＹＥＰ−２％ガラク
ト−ス中で対数相後期まで一夜好気的に増殖された。形
質転換条件は、ベッグズ（上述）により記載された通り
であったが、但し細胞は、上部寒天にプレートされる前
にＹＥＰ−デキストロースの代りにＩＭソルビト−ルを
含むＹＥＰ−３％グリセロール−１％ラクテート又はＹ
ＥＰ−２％ガラクト−ス中で１〜２時間３０゜で回復す
るのを許された。上部寒天及びプレートは、１Ｍソルビ
トール及び２％デキストロースを含む合成の、修正ウィ
ソカラム培地を含んだ。

３０”で３日後に、形質転換体は見え、ＹｆＦ、ＰＤへ
のレブートのために寒天から取り離された。その後、形
質転換体は、ＹＥＰＤ又はデキストロースを含む他の複
合培地上で維持された。

ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換された株Ｅ１８は、ＺＹＭ−
３と名付けられた。それは、寄託番号２０６９９でＡＴ
ＣＣに寄託された。

複合培地上でのｐＦＰＯＴ及びｐ　ＦＡＴＰＯＴの安定
性 プラスミド安定性を研究するために、単一細胞からのコ
ロニーを、ＹＥＰＤを含む試験管に接種し、合計１０９
細胞（約３０分裂）まで増殖を許した。酵母細胞を音波
処理して塊を破壊し、適当倍希釈し、ｔｐｉ　”細胞（
ＰＯＴＩ遺伝子を担持するプラスミドあり又はなし）の
増殖を許すＹＥＰ−２％ガラクトース又はＹＥＰ−２％
グリセロール−１％ラクテート上にプレートされた。Ｙ
ＥＰ−ガラクトース上で生じたコロニーは次に、プラス
ミドの欠損についてスクリーンするためにＹＥＰＤ上に
レプリカプレートされた（すなわち、Ｐ　ＯＴ　１含有
プラスミドを失ったｔｐｉ　’″細胞デキストロース上
で増殖しないであろう）。表２にまとめた結果は、ｐＦ
ＰＯＴとｐＦＡＴＰＯＴプラスミドが、酵母ｔｐｉ−欠
失株において安定であることを示す。それらは驚ろくべ
きことに、動原体を含む酵母プラスミドよりはるかに安
定である動原体を持つプラスミド（これはコピー数が小
さい）は、酵母について報告された最も安定なプラスミ
ドの一つであり、複合培地での一回の分裂当り約１％の
細胞の確率で一般に失われる（マーレイとスジスタフ、
上述、を動原体プラスミド安定性の総説として参照され
たい）。表２に示すように、ここで述べるＰＯＴＩプラ
スミドは、ｔｐｉ　−欠失株において複合培地での３０
回分裂後に１％未満の確率で失われる。

Ｄ、ＰＯＴＩプラスミドを用いるＳ、　セレビシア　に
おけるヒトα−１−アンチトリプシンの発現 形質転換された酵母における異種蛋白質の発現を高める
ためのＰＯＴＩプラスミドの使用をテストするために、
プラスミドｐＦＡＴＰＯＴ及びｐＦＡＴＳを、各々Ｓ、
　セレビシア株Δｔｐｉ＃２９及びＥ２−７Ｂを形質転
換するために用いた。形質転換された細胞は、デキスト
ロースを含むロイシン不合培地で選択された。培養菌は
、３０°で３〜４のＯ，Ｄ、６００まで増殖された。

細胞抽出物を調製し、実施例５記載のようにＡＴについ
て評価した。

ｐＦＡＴＰＯＴ／△ｔｐｉ　＃　２９により作られたと
き４〜６％の合計可溶蛋白質を示した。

ｐＦＡＴＳ／Ｅ２−７Ｂにより作られたとき２〜３％の
合計可溶蛋白質を示した。

プラスミドコピー数は正確に測定し平均個体数を表わす
ことが困難であるが、遺伝子生成物量の経験的観察は、
相対的プラスミドレベルの指標を与え、発現ユニット（
プロモーター、興味の遺伝子、ターミネータ−）は変わ
らないことを示す。

従ってｐＦＡＴＰＯＴは、これがそれから誘導されたと
ころのｐＦＡＴＳよりも機能的に数がより大きいようで
ある。二つの形質転換株は遺伝的にほぼ同一であり（△
ｔｐｉ＃２９はプラスミドに向けられた突然変異化によ
りＥ２−７Ｂから誘導された）、同じ条件下で増殖され
たので、これらの結果は従来記載されるベクターを上向
る本明細書記載の安定なプラスミド発現系の値を示す。

表Ｉ　　　ＣＤＣ４ 分離番号　　合計コロニー“１ １　　（ＲＥＬｌ、ｌ　　）　　　　ｌ　　２　３６　
　　　　　　　　１　ｌ　５ ａ　♀■胞は、２５°で３０世代 増殖され、次に２５°でＹＥ ｂ　細胞は、３７°でＹＥＰＤ ＣＤＣ４遺伝子を欠く細胞 かった。

Ｃ細胞は、トリプトファンを ｄ　細胞は、ロイシンを欠く培 プラスミドの安定性 ＣＤＣ４”　　　　Ｔｒｐ　”　　　　　Ｌｅｕ　′ｄ
、液状複合培養基（ＹｌコＰＤ）中で ＰＤ上にプレートされた。

にレプリカプレートされた。完全な は、この（制限的）温度で増殖しな 欠く培地にレプリカプレートされた。

地にレプリカプレートされた。

表２　　　ＰＯＴＩ　　プラスミド対ｐＴＰ実　験　　
　　ゲラスミ１フ株　　　　　　合計コロニー１　　　
ρＴＰＴＣＩＯ／△ｔｐｉ　＃２９　　　　　　２３４
２　　　　ｐＦＰＯＴ　　／△ｔｐｉ　＃２９　　　　
　　３０８３　　　　ｐｌ？ＡＴＰＯＴ　／△ｔｐｉ　
ｔｔ２９　　　　　　４７１４　　　　　　　　ｐｌ’
ＡＴＰＯＴ　　／Ｅ　　１Ｂ　　（ＺＹＭ　　−３）　
　　　　　　　　１　１　０　４５　　　　ｐＦＡＴＰ
ＯＴ　／Ｅ　１８　（ＺＹＭ　−３）　　　　　６３４
６　　　　ｐＦＡＴＰＯＴ　／△ｔｐｉ＃２９　　　　
　　４２６２−６　　プールされたデータ　　　　　　
２９４３ａ　ゲラスミ１フ株組合せは、約１０’〜１０
５細胞の容プレート上で増殖された。これらコロニーは
、ＹＥＰＤ培養菌は、１〜３Ｘ１０’ｌＢ胞／ｍｌの細
胞密度まで好気−１％ラクテート又はＹＥＰ−２％ガラ
クトース上ヘブの増殖を許すが、得られたｔｐｉ−コロ
ニーはｔｐｉ＋コロ（ｔｐｉ”又はｔｐｉ　”　）がカ
ウントできるように、僅か１ｂ　コロニーは、２％の最
終濃度でデキストロースを含むミド上のトリオースホス
ファ−トイツメラーゼ遺伝子をｃ　損失％は、ＹＥＰＤ
中で約３０分裂後にプラスミドをされたデータは、ＰＯ
ＴＩ　　プラスミドがこれら多くの分裂において１％よ
り小さい組合わされた頻度で失われＩＣｌ０の安定性 ’　　　　ＴＰＩ”　　　　　　　損失％Ｃ１６３３０
，３ ６３２０，３２ ２９４１０、０７ 易に見えるコロニーが見られるまで、ＹＥＰＤ液状培養
基の６ｍｌを接種するために用いられた。

的に一夜増殖され、ＹＥＰ−２％グリセロールレートさ
れた。これら培地の各々は、ｔｐｉ−株二一よりもゆっ
くり増殖した。各コロニー００〜３００細胞が各プレー
ト上に分布された。

合成培地上にレプリカプレートされた。プラス失った細
胞は、増殖できなかった。

失った細胞の頻度を示す。実験２〜６のプール分裂に亘
って極めて安定であり、３０回の細胞ることを示す。

実施例　３ プラスミドＣ１／１の調製 Ｃ１／１が、プラスミドｐＪＤ８２４８　　（ベッグズ
、Ｊ８．ネイチア２７５．１０４−１０９．１９７８）
から作られた。ｐＭＢ９配列が、ｆ！ｃｏ　ＲＴによる
部分的消化によってｐ　Ｊ　Ｄ　Ｂ　２４８から除かれ
、Ｅｃｏ　Ｒｒで切断されたｐＢＲ３２２ＤＮＡにより
１代えられた。Ｃ１／１の制限地図を第６図に示す。Ｃ
１／１プラスミドは、Ｅｃ。

Ｒ１部位でのｐＢＲ３２２挿入を伴い、酵母（Ｓ、セレ
ビシェ）からの全２μＤＮＡを含む。

それはまた、ＬＥＵ２　　遺伝子を含む。

実施例　４ プラスミドｐＦＡＴＳの調製 ヒトα−１−アンチトリプシン（ＡＴ）の主な形をコー
ドする遺伝子が、ＤＮＡハイプリダイゼーションプロー
ベとしてヒヒ配列を用いる慣用の方法によりヒト肝臓ｃ
　ＤＮＡライブラリーから分離された（クラチら、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａ目、Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ。

Ｕ　Ｓ　Ａ　７８　：　６Ｂ２６−　６８３０．１９８
０；及びチャンドラら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　　１０３：１５１−１５
８．１９８１）。このライブラリーは、ヒト肝臓ｃＤＮ
Ａをプラスミドｐ１３　Ｒ３２２のＰｓｔ　Ｔ部位に挿
入することにより構造されたくポリバーら、ジーン２：
９５−１１３゜１９７７）。ＡＴ遺伝子は、１５００塩
基体（ｂｐ）Ｐｓｔ　ｒフラグメントとしてライブラリ
ーから分離された。このフラグメントは、プラスミドｐ
ＵＣα１を作るために、ｐＵｃ１３のＰｓｔｒ部位に挿
入された。ｐＵＣα１において、ＡＴ配列は、ポリリン
カーにおいてＸｂａ　Ｉ及びＥｃｏ　Ｒｒ部位により３
′末端でフランクされた。

ＴＰ［ターミネータ−が、約７００　ｂｐのＸｂａ　Ｉ
−ＥｃｏＲｒフラグメントとしてプラスミドｐＦＧ１　
（アルパーとカヮナキ、上述）から精製され、Ｘｂａ　
ＩとＥｃｏ　ＲＩで開裂されたｐＵＣα１中に挿入され
た。この構造物は次に、［！ｃｏ　Ｒ［で切断され、オ
リゴヌクレオチド　リンカ−（配列：ＡＡＴＴＣＡＴＧ
ＧＡＧ　　ＧＴＡＣＣＴＣＣＴＡＧ）が多重リンクされ
たコピーで付加されて、ＴＰＴターミネータ−の３′木
端にＢａｍ　０１部位を与える。得たプラスミドは１３
　Ａ　Ｔ　５として知られる。

ＴＰＩブロモ−ターフラグメントがプラスミドｐＴＰＩ
ｃ１０（アルパーとカヮサキ、上述）がら得られた。こ
のプラスミドは、ユニークＫｐｎ　１１１μ位で切断さ
れ、ＴＰ［コード領域をＢａ１３１エキソスクレアーゼ
により除去し、Ｅｃｏ　Ｒｒリンカ−（配列：　ＧＧＡ
ＡＴＴＣＣ）がプロモーターの３′末端に付加された。

Ｂｇｌ　■及びＢｃｏ　ＲＩでの消化は、Ｂｇｌ　１１
及びＥｃｏ　ＲＩ粘性末端を持っＴＰＩプロモーターフ
ラグメントを与えた。このフラグメンｉ・は次に、Ｂｇ
ｌ　■とＥｃｏ　ＲＩで切断したプラスミドＹＲｐ７’
　　（ステインクコムら、ネイチア２８２：３９−４３
．１９７９）に結合された。得たプラスミドＴＥ３２を
、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部を除去するために
ｆ！ｃｏ　ＲＩとＢａｎ　ＩＩ　Ｉで開裂した。線形化
されたプラスミドは次に、プラスミドＴＥＡ３２を作る
ために、上述のＥｃｏ　Ｒ１−Ｂａ＋ｎｒ（Ｉリンカ−
付加により再線形化された。

次にＴＥＡ３２は、Ｂｇｌ　ＩＩとＲａｍ　ＨＩで開裂
され、ＴＰＩプロモーターは約９００　ｂｐのフラグメ
ントとして精製された。

プラスミドｐＦＡＴ５を構造するために、プラスミドＣ
１／１をＢａｍ　ＨＩで線形化し、ＴＥＡ３２からの９
００ｂｐＴＰＩプロモーターフラグメントに結合した。

プラスミドＦとして知られる得た構造物は、ＴＰＩプロ
モーターの３′末端に位置するユニークＢａＩＩＩＨ１
部位を持つ。このプラスミドはＢａｍ　ＨＩで切断され
、ＡＴコート領域とＴＰＩターミネータ−を含む２２０
０ｂｐＢａｍ　Ｈ＋フラグメントがＢＡＴ５から精製さ
れ、Ｂａｎ＋　ＨＩ部位中に挿入された。ｐＦＡＴＳと
して知られる得たプラスミドは、第７図に示される。

実施例　５ α−１−アンチトリプシンについての評価対照として、
１００μｇＺＩＩｌｌトリプシン溶液の１０μｌ　　（
１μｇ）、ウシ血清アルブミンの１００μｇ　（１００
ｊり及び１ｍＭベンゾイルアルギニフィル−ｐ−二Ｉ・
ロアニリドを含むｐＨ８，０の緩衝液０．０５Ｍ　　Ｔ
Ｒｌ５の１００μｌを混合し、４０５　ｎｍでの吸光度
の増加を分光光度針で経時測定した。この溶液の吸光度
値は、１００％トリプシン活性の標準として用いられた
。

総ての評価されたサンプルは、同じ濃度の基質及びウシ
血清アルブミンを含む。

【図面の簡単な説明】 第１図は、プラスミドρＢ４の構造を示す。 第２図は、プラスミドρ８５の構造を示す。 ′ｌｉ３図は、プラスミドρＢ１５Ｌの構造を示す。 第４図は、プラスミドｐＢ５及びｐＢ１５Ｌで共形質転
換されたＳ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　１ａｅ）
株Ａ２．７．ｃからのＤＮＡのサザーンプロットを示す
。 第５図は、Ｓ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ　）　Ｐ　ＯＴ　１
及びＳ、セレビシェＴＰ１１ｉｊ！を転子の配列を、各
々の推定された蛋白質配列とともに示す。 第６図は、プラスミドｐｃｐｏ’ｒの構造を示す。 第７図は、プラスミドｐＦＡＴＰＯＴの構造を示す。 第８図は、プラスミドｐＴＰ　Ｉ−ＬＥＵ２の構造を示
す。 図面の浄３（内容に変更なし） ↓Ｂａｍ川−Ｑ用ＩＦＩＩＹＲｐ７へ好計↓ａｏｍ？Ｈ ＦＩＧ、−３ ＝、：ｍγ〉６ざ≧　　　ＴＴＴ　　（ＴＣＧＣＴ　Ｃ
ＣＴ　ＡＡＣＴＴＴ　　ＡＡＡ　　丁子Ａ　ＡＡＣＧＣ
Ｔ　　丁ＣＣＡＡＡ　　ＣＭ　　ＴＣＣＡ丁Ｔｓ−ｍ二
’：／：ＣＡＡＣ；　　にＡＡ　ＡＴｒ　　ＧＴＴ　Ｇ
ｋＡ　ＡＣＡ　ＴｒＣＡＡＣＡＣＴ　ＣＣｒ　丁ＣＴ　
Ａｒｃ　　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡ丁丁、　Ｅｌ工ＬＹＳ
　７８１１１ＬＥ　ｘｕ　にＬＬ＋　ｃＬｙ　１５Ｊ　
Ａｓ）ｌ　ｒｓ＊　ｒｎ　ＬＹＳ　ＬＥＬＩ　ＡＳＮ　
ＶＡＬ　ＣＬＹ＠、ｊづ」こ（こ二６１−　　　　　　
Ｃ１ｕ　　　　　Ｖａｌ　　　　　Ａｒｇ　　　　　　
　　　　　　　Ａｌａ　　Ｓａｒ　　Ｉｌａ　　Ｐｒｏ
　　Ｃ１ｕ　　＾５ｎＦＩＧ、−５Ａ Ｓ−、工匹ンムにＴＣＴＣＴ　ＴＴＣ（Ｔｒ　ＡＡＩＳ
　ＡＡに　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＣＴＣＡＣＴ　にＴＣ１１
７（ｉＣＴ　ＣＡＡ　ＡＡＣ５，ボンベ　　　ＴＨＲＡ
ＲＣｃＬＮｃＬ８　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　
ＩＬＥ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　ａＹ　ＡＬＡ　にＬＪ＋＾Ｓ
８互、Ｃし６′ンエ　　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａ
ｎ　Ｌｙｅ　　　　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＶａＩＴｈｒｓｒ
ｓ’ン＜　　　　ＶＡＬ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＬＹＳＬＹ
Ｓ　ＡＳＮ　Ｃ；ＬＹ　ＡＬＡ　ＴＹＩ　ＴＨＲｃｔ−
ｒ　ＣＬＬＩ　＾ｓｘ　ＳＩＲＡＡＡ互、でしＣクエ　
　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　　　　ｕｓ　Ｓａｔ　　　
　　　Ｉ’ｈａ　　　　　　　　　　　　　　ＶｄＳ、
ｆｆｉ二’ｚｌ　　　　にＡＣＣＡＡ　　ＡＴＣＡＡＧ
　　ＣＡＴ　　ｃｒｒ　ｃａｒ　　ＧＣＴ　ＡＡＧ　　
Ｔｃｃ　　ｃ丁子　ＡＴｒ　　丁子ｃｃｃ丁　ＣＡＣＨ
，；Ｋ　ｖＲＴＣＣｃＡｃ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＡＣＣＡ
ＴＣＴＴＣＭに　ｃｈｃ　ＴＣＴ　ＧＡＣＧＡＧ　ｒｒ
ｃ　ｃｒｒ　ｃｃｃ互、」にｕ　　　ＴｅＣＧＡＡ　Ａ
ＣＡ　Ａ（、Ａ　ＴＣ丁丁ＡＣＴＴＣＣＡＣにｋＡ　Ｃ
ＡＴ　（ＡＣＡＡＧ　ＴＴＣＡＴＴ　ＣＣＴＳ、ｒンベ
゛　　　ＳＥＲＣＬＬＩ　ＡＲに　ＡＪＩＧ　ＴＨＲＩ
ＬＥ　ＰＩＫＥ　ＬＹＳ　にＬＬＩ　ＳＩＲＡＳＰ　Ｃ
ＬＬＩ　Ｐ）Ｉｔ　ＶＡＬ　ＡＡＡ互、じレビ・′シｆ
−５ｅｒＴｙｒ　　　　　Ｈｌｍ　　　　Ａｓｐ　　　
　Ｌｙｓ　　　　　！１ｅ３５０　　　’　　　３６０ ｓ、ｉ’ン＜　　　　　　ＧＡＣＡＡに　　ＡＣＣＡＡ
に　ｒｒｒ　ｃｃｃ　　ｃｒｆ　ＣＭ　　ＣＡＡ　ｃａ
ｒ　　ｃｒｒ　ＡＣＴ　　ＣＴＣｃｒｒ　　ｃｃｃｓ−
、ｇ　　　ｃＡｃ　　ＡＡＩ：　　Ａｃｅ　ＡＡＣＴＴ
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　　ｃａｒ　ｃＴＣＡＴＣ７０丁、、　ｙ、ａ≧’＜’
　　　　　　ＴＣＣＡＴＴ　　Ｃ（Ｔ　にＡｌｌ；　　
ＡＣＴ　’ｎＧ　　ＧＣＣＣＡＣＣＧＴ　＋Ａｌｌ；　
　ＣＣＴ　　ＡＡＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣ５，でレグ７ゴ
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Ｔｃ　ｌ：ＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡ（：　ＧＣＣＣ
ＣＴ　ＭＣＡＣＴ　Ｔ丁ＧＦＩＧ、−５Ｂ ４３０　　　　　　　＆＆ＯＡ５０　　　　　　　４６
０ｓ、ｒ：ンヘ゛　　　ＡＣＣ（Ｔｒ　ＣＴｒ　ＣＴｒ
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Ｔ　ＣＡＣＡＭ；　ＣＴＣＣＡＣ３，益匹エトＣＡＴ　
ＣＴＴ　（ＴＴ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＴＴＣＡＡ
ＣＧＣＴ　ＣＴＣＴＴＣＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＡＡ
ＧＬ、Ｅヱ’（ＴＲＩＩ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＷＡＬ　Ａ
釦０１％　ＬＥＤ　ＡＳＷ　Ａｕ　ＩＬＥ　ＡＬＡ　Ａ
ＳＰ　ＬＹＳ　ＶＡＬ　乙ＭＸ−ＢＶＣ’Ｊ　Ｉ　　　
　Ａｓｐ　　　　　　　　　にｌｕ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｖａｌ　　Ｌ＠ｕ　Ｃ１ｕ　Ｃ
１ｕ　　　　　Ｌｙｅｓ、ｅｖｔ’シブ−ｃｃｒ　丁Ｃ
ＣＡ丁ＣＡにＡ　　ＡＡＧ　ＴＴＣＴＴＧ　　ＧＣＴ　
　ＴＣＣＡＡＧ　ＴＴＧ　　ＧＣ：Ｔ　　ＣＡＣＡＡＧ
　　にＣ丁丁、　Ｋ：　：／　＜　　　ＡＬＡ　ＧＬＵ
　ＩＬＥ　Ａ１１ｌ：　ＬＹＳ　ＴＲＰ　’ＡＬＡ　Ｔ
）ＩＲＡＳＷ　ＬＹＳ　ＬＥＬＩ　にＬＹ　ＡＬＡ　Ｓ
ＥＲＶＡＬＳ、ゼレジシ工ｓａｒ　　　　　　　　ｔｈ
ｅしｒｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　　　　　　　　Ａｓｐ　Ｌ
ｙｅ　ＡｌａＦＩＧ、−５Ｇ ７００　　　　　　７１０　　　　　　７２α　　　　
７３０！、　ｉｒ！　’Ｊ　＜’　　　ｃＴＴＧｃｃＧ
ＧＴ　ＧＣＴ　ＴＣｒ　ＣＴＣＡＡに　ＣＣＴ　ＧＡＡ
　ＴＴＣＣＣＴ　ＡＣＴ　ＡＡＣＡＴｒ　Ｇｒｒｉ、」
乏ｊ１２二２−≦２　　にＴＣＧＣＴ　ＧＧＴ　ＣＣＴ
　ＴＣＴ　ＴＴＧ　　ＡＡＣＣＣＡ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　
にＴＴ　ＣＡＴ　＾τＣＡ丁ＣＡＡＣ互、（レビ′シエ
４　　　ＴＣＴＴＴＡ丁ＡＴＣＴＡＩ；ＴｃＴＴＡＴに
’ＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴｒにＡＴＩ：ＡＣｒＡＣＧにＡ
ＡＡＩＩ；ＣｒＴＴＴＴＴＡＴＡＴｒＣＦＩＧ、−５Ｄ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）複合培養基での正常細胞増殖のために必要な機能
   における欠陥を持つ宿主細胞においてα−１−アンチト
   リプシンを生産する方法において、（ａ）該欠陥を補う
   遺伝子及びα−１−アンチトリプシンをコードする配列
   を含むＤＮＡ分子により上記宿主細胞を形質転換するこ
   と； （ｂ）段階（ａ）からの形質転換体を、抗生物質又は重
   金属を含むことを必要とせずかつ特定の栄養素の欠除を
   必要としない増殖培養基において培養すること の段階を含む方法。
2. （２）複合培養基での正常細胞増殖のために必要な機能
   における欠陥を持つ宿主細胞おいてα−１−アンチトリ
   プシンを生産する方法において、（ａ）該欠陥を補う遺
   伝子及びα−１−アンチトリプシンをコードする配列を
   含むＤＮＡ分子により上記宿主細胞を形質転換すること
   ； （ｂ）段階（ａ）からの細胞を、上記遺伝子が形質転換
   体細胞のために選択マーカーとして機能する条件下で培
   養すること の段階を含む方法。
3. （３）宿主細胞における欠陥を補う遺伝子を含むＤＮＡ
   構造物において、該欠陥が複合培養基での正常細胞増殖
   のために必要な機能にあり、ＤＮＡ配列がα−１−アン
   チトリプシンをコードするＤＮＡ構造物。
4. （４）特許請求の範囲第３項に従うＤＮＡ構造物を含む
   形質転換体株。
5. （５）特許請求の範囲第１項の方法に従い作られたα−
   １−アンチトリプシン活性を持つ生成物。