JPH0815439B2 - アルファ−１−アンチトリプシンの発現のための安定なｄｎａ構造物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 組換えＤＮＡ技術を利用する有用なポリペプチド生成物
の生産のための微生物の使用は、工業として確立されて
きている。外来遺伝子物質が微生物の培養菌中に導入さ
れることが出来、適当な細胞内及び細胞外条件を与える
と望む生成物が外来遺伝子から合成されうる。そのよう
な遺伝子物質は一般に、プラスミドの形で微生物中に導
入され、これは自律的に複製する染色体外要素である。
形質転換された細胞培養物内にプラスミドを維持するこ
とを保証するために、これら細胞を特別の条件下で成育
することが必要であった。そのような条件の欠除のもと
では、本質的に不安定であろうプラスミドは維持され
ず、細胞群は形質転換されていない状態に戻るであろ
う。

【０００２】プラスミド安定性の増大及びコピー数の増
大は、プラスミドでコードされる蛋白質の生産を常に高
いレベルに維持する手段として生物技術工業にとって重
要である。プラスミド安定性を増すための従来報告され
た試みは、産業的利用のために最適であるとは見えな
い。安定性を高めながらＡＲ′Ｓ含有プラスミド中に酵
母動原体を導入することは、プラスミドコピー数を著し
く低減することが判っている（クラーケ（ｃｌａｒｋ
ｅ）とカーボン（ｃａｒｂｏｎ），ネイチア（Ｎａｔｕ
ｒｅ），２８７：５０４−５０９，１９８０，及びステ
ィンクコム（ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ら、ジャーナル
オブ モレキュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．
Ｂｉｏｌ．），１５８：１５７−１７９．１９８２）。
線形動原体酵母プラスミドは同様に、安定性とコピー数
の間の逆比例関係を示す（マリー（Ｈｕｒｒｙ）とスゾ
スタク（Ｓｚｏｓｔａｋ），ネイチア，３０５：１８９
−１９３，１９８３）。

【０００３】プラスミドは典型的には、選択マーカーと
て知られている遺伝子配列を含み、これは宿主細胞の抗
生物質耐性又は補助栄養要求をコードする。そのような
プラスミドの存在について選択するために、形質転換さ
れた細胞は、選択剤を含む又は特定の栄養素を除かれた
特別の培養基で生育されなければならない。これら培養
基要件は高価であり、かつ大規模醗酵プロセスの間の最
適細胞生長速度を禁止する。そのようなプラスミドの多
くが、文献に報告されている。抗生物質耐性遺伝子を含
むこれらとしては、ｐＢＲ３２２（ボリバー（Ｂｏｌｉ
ｖａｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２：９５−１１３，１
９７７）及びその誘導体たとえばｐＵＣベクター（ビエ
イラ（ｖｉｅｉｒａ）とメッシング（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ），ジーン，１９：２５９−２６８，１９８２）（こ
れはアンピシリン耐性を持つ）及びｐＢＲ ３２５（プ
レントキ（Ｐｒｎｔｋｉ）ら、ジーン，１４：２８９，
１９８１）（これはアンピシリン，テトラサイクリン及
びクロラムフェニコールに対する耐性遺伝子を持つ）が
挙げられる。宿主栄養要求を補うプラスミドとしては、
酵母ベクターＹＥｐ １３（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）
ら、ジーン，８：１２１−１３３，１９７９）（これは
ＬＥＵ２遺伝子を持つ）、及びＹＲＤ ７′（スティン
クコムら、ネイチア，２８２：３９，１９７９）（これ
はＴＲＰ１遺伝子を持つ）が挙げられる。

【０００４】アルファ−１−アンチトリプシンは、プロ
テアーゼインヒビターであり、その主な機能は幅広いス
ペクトルのプロテアーゼであるエラスターゼを抑制する
ことである。哺乳動物の肺組織は、エラスターゼによる
攻撃に特に弱く、従ってα−１−アンチトリプシンの欠
損又は不活性化は肺組織弾性の喪失及び従って気腫を結
果しうる。α−１−アンチトリプシン活性の損失又は減
少は、タバコの煙を含む環境汚染物によるα−１−アン
チトリプシンの酸化の結果である。α−１−アンチトリ
プシンの欠損は、いくつかの遺伝的欠陥の一つから起り
うる。ガデック（Ｇａｄｅｋ），ジエームスＪａｍｅ）
Ｅ．及びＲ．Ｄ．クリスタル（Ｃｒｙｓｔａｌ），「α
−１−アンチトリプシン欠損」．遺伝病の代謝的基礎、
スタンブリー（ｓｔａｎｂｕｒｙ），Ｊ．Ｂ．ら編、マ
グロウーヒル，ニューヨーク（１９８２），ｐｐ１４５
０−１４６７；及びキャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）ら，ネ
イチア，２９８８，３２９−３３４（１９８２）参照。

【０００５】従って、α−１−アンチトリプシンをコー
ドするＤＮＡ配列、及び選択マーカーとして、その生成
物が複合培養基上で宿主細胞の生育性又は正常増殖のた
めに必須であるところの遺伝子配列を含むＤＮＡ構造物
を提供することが本発明の目的である。本発明の別の目
的は、複合媒体上での増殖により選択できかつα−１−
アンチトリプシンを発現しうるプラスミドを含む微生物
の形質転換株を提供することである。さらに本発明の別
の目的は、必須機能において欠陥を持ち、これら欠陥的
必須機能を補いかつα−１−アンチトリプシンを発現で
きる遺伝子配列を持つＤＮＡ構造物のための宿主として
働きうる微生物株を提供することである。本発明の別の
目的は、形質転換微生物中でα−１−アンチトリプシン
を作る方法において、α−１−アンチトリプシンが、選
択マーカーとして宿主微生物における必須遺伝子の欠陥
を補う遺伝子配列を含むＤＮＡ構造物上に含まれる遺伝
子の生成物である方法を提供することである。本発明の
別の目的は、当業者にとって明らかであろう。

【０００６】本発明のまとめ 本発明に従い、α−１−アンチトリプシンを発現できか
つ特別の選択培養基を要せずに高いコピー数で維持され
るＤＮＡ構造物及び適当な宿主細抱が提供される。その
ような条件における増殖は、より速い増殖、より大きい
細胞密度及び低減された生産コストをもたらす。本発明
は更に、複合培養基での正常細胞増殖のために必要な機
能における欠陥を持つ宿主細胞においてα−１−アンチ
トリプシンを作る方法であって、この欠陥を補う遺伝子
及びα−１−アンチトリプシンをコードする配列を含む
ＤＮＡ分子により宿主細胞を形質転換の段階を含む方法
を提供することである。本明細書において、ＤＮＡ構造
物という言葉は、分子中のヌクレオチド配列が自然に作
られた配列と同じでないように人により修飾された任意
のＤＮＡ分子を意味する。ＤＮＡ構造物という言葉はま
た、そのように修飾されたＤＮＡ分子のクローンをも包
含する。発現ベクターという言葉は、複製の自律部位、
転写開始部位及び宿主生物において発現されるべき蛋白
質をコードする少くとも一つの構造的遺伝子を含むＤＮ
Ａ構造物として定義される。発現ベクターはまた通常、
宿主生物における蛋白質の発現を制御するプロモーター
及びターミネーターのような適当な制御領域をも含むで
あろう。本発明に従う発現ベクターはまた、本明細書で
述べる必須遺伝子を含む選択マーカーをも含むであろ
う。

【０００７】プラスミドという言葉は、その普通に用い
られる意味、すなわち自津的に複製し、通常閉じたルー
プのＤＮＡを意味する。添付した図面において：第１図
は、プラスミドｐＢ４の構造を示す。第２図は、プラス
ミドｐＢ５の構造を示す。第３図は、プラスミドｐＢ１
５Ｌの構造を示す。第４図は、プラスミドｐＢ５及びｐ
Ｂ１５Ｌで共形質転換されたＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）株Ａ２．７．ＣからのＤＮＡのサザーン
ブロットを示す。このブロットは、ゲノムＣＤＣ４座の
崩壊についてテストするためにＣＤＣ４の５′フランキ
ング領域からの２．５ｋｂ Ｂａｍ Ｈ Ｉ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩフラグメントでプローブされた。レーンａは、ｐ
Ｂ５単独で形質転換された細胞からのＤＮＡを含む；レ
ーンｂは形質転換されていない細胞；レーンｃ〜ｈは共
形質転換体を含む。矢印は、プローブにハイブリットす
るゲノムフラグメントを示す。第５図は、Ｓ．ポンベ
（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セレビシエＴＰＩ １
遺伝子の配列を、各々の推定された蛋白質配列とともに
示す。Ｓ．ポンベＴＰＩ蛋白質配列の全体が与えられ
る。Ｓ．セレビシエ蛋白質の配列は、それがＳ・ポムベ
配列と異る個所のみ示される。Ｓ．セレビシエ蛋白質配
列における位置１におけるメチオニンは、天然蛋白質に
は存在しない。第６図は、プラスミドｐＣＰＯＴの構造
を示す。第７図は、プラスミドｐＦＡＴＰＯＴの構造を
示す。第８図は、プラスミドｐＴＰＩ−ＬＥＵ２の構造
を示す。

【０００８】詳細な説明 本発明は、必須遺伝子がα−１−アンチトリプシンを発
現できるプラスミドのようなＤＮＡ構造物上の選択マー
カーとして用いられうるという発見に部分的に基づく。
必須遺伝子という言葉は、複合培養基での細胞生育又は
正常増殖のために必要な機能をコードする任意の遺伝子
と定義される。複合培養基は、その中において栄養素
が、組成が良く定義されない生成物たとえば粗細胞エキ
ス、肉エキス、果汁、血清、蛋白質加水分解物などから
導かれる培養基である。従って、本発明に従う望む形質
転換体を選択するために、選択増殖培養基は単に慣用の
複合増殖養基であり、非形質転換宿主細胞に致命的な比
較的高価な抗生物質、金属拮抗剤、又は他の剤を含む、
又は非形質転換宿主に必要な一以上の特定の栄養素を欠
く特別の培養基ではない。必須遺伝子としては、細胞分
割、膜生合成、細胞壁生合成、細胞小器官生合成、蛋白
質合成、炭素源利用、ＲＮＡ転写及びＤＮＡ複製のため
に必要な遺伝子を包含するがこれらに限定されない。

【０００９】ＤＮＡ構造物たとえばプラスミド上の選択
マーカーとして必須遺伝子を用いるために、適当な突然
変異宿主細胞株を提供することが必須である。ロスステ
イン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）の一段階遺伝子崩壊法（Ｈ
ｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０２
−２１０．１９８３）又は本明細書で述べる共形質転換
手順を用いて、ゲノムにおいて適当な必須遺伝子の欠失
を有する適当な宿主株が構成されうる。そのような欠失
突然変異体は、突然変異がプラスミドに担持される遺伝
子物質によりコードされる機能によって補われるときに
増殖する。宿主のゲノムの必須遺伝子（単数又は複数）
における欠失は、コード領域及び／又はフランキング領
域の主要なセグメントを含むことが好ましい。必須遺伝
子における突然変異が点突然変異のみにより達成される
様式で行われるなら、突然宿主細胞が突然変異又は組換
修復メカニズムによって野性種に戻り、それによりプラ
スミド担持遺伝子の使用により達成されうる選択性を低
減又は除去することがありうる。

【００１０】必須遺伝子は、多重コピー（たとえばヒス
トン又はリボソームＲＮＡ遺伝子）中に及び／又は遺伝
子ファミリーと呼ばれる多重の関速した形（たとえば種
々のヘキソキナーゼ遺伝子、又は種々のＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子）中にしばしば存する。そのような場合、こ
れら重複した機能は、所定の必須機能について多重に欠
陥のある宿主細胞を作るために次々と突然変異されう
る。しかし、遺伝子の活性を増すために高コピー数プラ
スミドを用いることによって、プラスミド上の単一の必
須遺伝子が多重の宿主細胞欠陥を補いうる。高コピー数
プラスミドは、クローニングされた外来遺伝子のコピー
数の増加がこの遺伝子によりコードされる蛋白質生成物
の産生の増加を結果するので望ましい。

【００１１】必須遺伝子を持つプラスミドの高コピー数
を含む形質転換体の選択は、各プラスミド担持必須遺伝
子の発現レベルを低下させることにより及び／又はプラ
スミド担持選択マーカーによりコードされる遺伝子生成
物の活性を低下させることにより達成されうる。一つの
アプローチは、必須遺伝子を突然変異して、遺伝子の転
写及び／又は翻訳速度が低減される又は遺伝子生成物が
より低い特異的活動を持つよう変えられることである。
選択マーカーとして用いられる必須遺伝子の発現レベル
を下げるための別の方法は、宿主細胞における欠陥を補
うために別の生物からの遺伝子を用いることである。そ
のような外来遺伝子は、宿主細胞における発現について
自然に欠陥的でありうる。なぜなら転写及び／又は翻訳
のためのシグナルは別の種において最適より低いであろ
うからである。又は遺伝子生成物は低減した活性又は安
定性を持つかも知れない。なぜならそれは異質の細胞環
境にあるからである。

【００１２】複合培養基における細胞生育又は正常増殖
のために必要な幅広い範囲の機能が存在する。必要遺伝
子における欠陥又は欠失は、致死、細胞分割の速度の低
下、細胞分割の終止、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白合成の停
止、膜合成の停止、細胞壁合成の停上、細胞小器官合成
の停止、蔗糖代謝における欠陥などを結果しうる。必須
遺伝子の例としては、酵母サッカロミケス セレビシエ
のＣＤＣ（細胞分割サイクル）遺伝子（プリングル（Ｐ
ｒｉｎｇｌｅ）とハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ），
「サッカロミケス セレビシエ細胞サイクル」ストラサ
ーン（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ）ら編の酵母サフカロミケス
ライフサイクル及び遺伝の分子生物学、５７−１４２
中、コールド スプリング ハーバー（ｃｏｌｄｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ ），１９８１），Ｓ．セレビシエ
及びエシェリヒア コリ 解糖経路の機能をコードする
遺伝子、及びＳ．セレビシエのＳＥＣ（ノビック（Ｎｏ
ｖｉｃｋ）とシェクマン（Ｓｃｈｅｋｍａｎ），プロシ
ージングズ オブ ナショナルアカデミーオブ サイエ
ンスＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．Ｕ
ＳＡ）７６：１８５６−１８６２，１９７９、及びノビ
ックら、セル（Ｃｅｌｌ）２１：２０５−２１５，１９
８０）及びＩＮＯ（カルバートソン（ｃｕｌｂｅｒｔｓ
ｏｎ）とヘンリー（Ｈｅｎｒｙ），ジェネティクス（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）８０：２３−４０，１９７５）遺伝子
が挙げられる。

【００１３】必須遺伝子欠陥の宿主細胞の一つの好まし
いクラスは、ｃｄｃ突然変異として知られるＣＤＣ遺伝
子における欠陥を含み、これは細胞分割サイクルの段階
特異的阻止をもたらす。多くのｃｄｃ突然変異は、特定
のＣＤＣ遺伝子生成物の合成又は機能に影響することに
よって、細抱サイクルに必須の事象の完全な妨害を起
す。そのような突然変異は、生化学的に又は形態学的に
観察されうる事象に対する効果によって同定されうる。
多くの既知のｃｄｃ突然変異は、環境条件的致死性（す
なわち温度敏感な）突然変異であり、これは制限的条件
下で増殖された突然変異細胞の正常な成長の終止を結果
する。しかし、ｃｄｃ突然変異から生じた主な欠陥は、
段階特異的機能における欠陥自体である必要はない。た
とえば、連続的に合成された遺伝子生成物は段階特異的
機能を持ちうる；酵母解糖遺伝子ｐＹＫ１における（酵
素ピルベートキナーゼに対する）欠陥が細胞分割サイク
ル突然変異ｃｄｃ １９（カワサキ，博士論文，ワシン
トン大学，１９７９）に対して対立的である。この突然
変異は、典型的酵母複合培養基ＹＥＰＤ（１％酵母エキ
ス、２％バクトペプトン、及び２％デキストロース）中
でインキュベートされた細胞のＧ１相における細胞サイ
クル停止を結果する。すなわち、ｃｄｃ突然変異が段階
特異的機能における欠陥を結果するか又はそれが段階特
異的機能を持つ遺伝子生成物の抑制又は不能化突然変異
を起すかに拘らず、欠陥の効果は、モニターされうる。

【００１４】プリングルとハートウエル（上述）は、い
くつかの５１ＣＤＣ遺伝子の機能を記述している。本発
明を実施するに用いるために、そのような遺伝子は、望
む突然変異を持つ株における補償によって遺伝子ライブ
ラリーから分離されうる。遺伝子ライブラリーは、公知
の手順で構成されうる（たとえばナスミス（Ｎａｓｍｙ
ｔｈ）とリード（Ｒｅｅｄ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１１９−２１２３，１
９８０；及びナスミスとタチェル（Ｔａｔｃｈｅｌ
ｌ），セル１９：７５３−７６４，１９８０）。望む
ｃｄｃ突然変異を持つ株は、本明細書で述べられるよう
に作られ、又は公共的に入手できる寄託機関たとえばＡ
ＴＣＣ及びバークレー イースト ストック センター
から入手できる。

【００１５】必須遺伝子の第二の好ましいクラスは、解
糖経路に関係する生成物をコードするものであり、代謝
酵素及び調節機能をコードする遺伝子を包含する。同定
されたＳ．セレビシエにおける解糖経路遺伝子の例は、
解糖調節遺伝子ＧＣＲ１及び酵素トリオース ホスフェ
ート イソメラーゼ，ヘキソキナーゼ１，ヘキソキナー
ゼ２，ホフホグルコース イソメラーゼ，ホスホグリセ
ラートキナーゼ，ホスホフラクトキナーゼ，エノラー
ゼ，フラクトース１，６−ビスホスフェート デハイド
ロゲナーゼ，及びグリセ ラルデヒド３−ホスフェート
デハイドロゲナーゼをコードする遺伝子である。上述
したように、ピルベート キナーゼ遺伝子は、カワサキ
により同定され、記述された。酵母ホスホ グリセラー
トキナーゼ遺伝子を含み、調節シグナルを伴うプラスミ
ドは、ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、（ジャー
ナル オブ バイオロジィー アンド ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２２５：１２０７３−１
２０８０，１９８０）により記述された。酵母トリオー
ス ホスフェートの分離及び配列決定は、アルバー（Ａ
ｌｂｅｒ）とカワサキ（ジャーナル オブ モレキュラ
ー アンド アプライドジェネティクス）（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）１：４１９−４３４，１
９８２）及びカワサキとフレンケル（Ｆｒａｅｎｋｅ
ｌ）（バイオケムバイオフィズ リス コム（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１０
８：１１０７−１１１２， １９８２）により記述され
る。

【００１６】特に好ましい解糖遺伝子は、ＴＰＩ１であ
り、これは、グリセラルヒド−３−ホスフェート及びジ
ヒドロキシアセトン−３−ホスフェートの相互転化を触
媒し従って解糖及びグリコネオゲネシスのために必須の
酵素、酵母トリオース ホスフェト イソメラーゼをコ
ードする。Ｓ．セレビシエにおいて、第一遺伝子座ＴＰ
Ｉ１は、この機能を暗号する。ＴＰＩ１における突然変
異を有する細胞は、グルコース上で増殖せず、他の炭素
源上で少ししか増殖しない。Ｓ． セレビシエ ＴＰＩ
１遺伝子は、ｔｐｉ１突然変異の補償により分離された
（アルバーとカワサキ（上述）、及びカワサキとフレン
ケル（上述））。分裂酵母シゾサッカロミケス ホンベ
からのトリオース ホスフェート イソメラーゼ遺伝子
（ＰＯＴ１）が同じＳ． セレビシエ突然変異の補償に
より分離され、第５図に示すように配列決定された。Ｐ
ＯＴ１と名付けられたＳ． ポンベ遺伝子の配列は、
Ｓ． ポンベＴＰＩ蛋白質がＳ． セレビシエのＴＰＩ
蛋白質と相同であることを示した。

【００１７】通常の場合、ＤＮＡ構造物（プラスミド）
において用いられる必須遺伝子は宿主種からの野生タイ
プ遺伝子であろうが、ある場合には宿主細胞にとって外
来の必須遺伝子を用いることが好ましい。なぜなら外来
遺伝子は自然に欠陥的であり、それによって高プラスミ
ドコピー数に対して選択可能であるからである。用いら
れるそのような外来必須遺伝子の例として、ここでの例
の一つは、Ｓ． ポンベ ＰＯＴ１遺伝子がＳ． セレ
ビシエ宿主における選択マーカーとして有効に用いられ
ることを示す。選択マーカーとして必須遺伝子を含む本
発明に従うＤＮＡ構造物は、必須遺伝子の機能において
欠陥のある突然変異宿主細胞中に形質転換されよう。適
当に突然変異された宿主細胞が作られなければならない
か、又は公共寄託機関から容易に入手できる。適当な突
然変異体を得るために野生タイプの細胞の突然変異化
は、慣用の方法で達成されうる。たとえば、野生タイプ
細胞が、慣用の突然変異化剤たとえばエタン メチルス
ルホネートにより処理され、補償が起るコロニーを同定
するために必須遺伝子を含むプラスミドで形質転換され
る。あるいは、ゲノムが崩壊されて、特定の突然変異を
作る（ロススティン、上述）。

【００１８】宿主細胞中に必須遺伝子を含むプラスミド
の安定性は、宿主細胞における相同の必須遺伝子配列の
不存在に依存しうる。宿主における遺伝欠陥は、プラス
ミドが維持されることを保証する。なぜなら、宿主細胞
の増殖は必須遺伝子機能の欠除により起らず又は厳しく
制限されるであろうからである。加えて、プラスミド自
体の完全性は、プラスミド担持必須遺伝子と宿主ゲノム
中の対応する座の間の相同性の不存在に依存するであろ
う。なぜなら、各プラスミドとゲノム座の間の組換えは
突然変異及びプラスミドの両者の細胞を治ゆするであろ
うからである。すなわち、ゲノム必須遺伝子を不活性化
する宿主細胞ゲノム中の突然変異が本質的に自然である
こと、即ち欠失が染色体遺伝子のコード領部及び／又は
フランキング領域の ＤＮＡ配列から成ることが好まし
い。これが達成されると、組換えによるゲノム突然変異
の治ゆは、あまり起きなくなる。

【００１９】本発明のフランキングは、適当な突然変異
宿主細胞中に維持されるとき、予期せぬことに安定であ
る。好ましい宿主細胞は酵母である；しかし他の真核細
胞ならびに原核細胞も用いうる。酵母細胞の場合、本発
明に従うフランキングの安定性は、動原体を含む酵母プ
ラスミドのそれをさえ越えるようである。環状動原体プ
ラスミドは、酵母について従来報告された最も安定なプ
ラスミドに含まれるが、しかし極端に低いコピー数が欠
点である（クラーケとカーボン、上述、とスティンクコ
ムら、１９８２、上述）。線形動原体酵母プラスミド
は、プラスミド長に依存して、不安定であるか低コピー
数で依存する（ハーレイとスゾスタク、上述）。従っ
て、必須遺伝子を担持するプラスミドの改善された安定
性が達成されることは、予期せぬ利点である。

【００２０】ＰＯＴ１及びＣＤＣ４遺伝子は、発現ベク
ター上の選択マーカーとしての必須遺伝子の利用の二つ
の例である。これら二つの遺伝子は、複合培養基上での
細胞増殖のために必要な幅広いクラスの遺伝子に属す
る。他の必須遺伝子の使用は、複合増殖条件を含む植物
又は動物組織培養株におけるプラスミド選択を可能に
し、また極端には、血、血清、又は生きた動物又は植物
からの液汁から栄養を受ける細胞中でのプラスミドの維
持を可能にする。本明細書で述べるプラスミドを用いる
実験から得たデータは、ヒトα−１−アンチトリプシン
（ＡＴ）産生が選択マーカーとしてＳ． ポンベＰＯＴ
１遺伝子の使用によって、従来の栄養要求性選択マーカ
ーＬＥＵ２を含む類似のプラスミドにより得られるＡＴ
産生に比べて二倍にされることを示す。これらの結果
は、ＰＯＴ１含有プラスミドが、これらがそれから誘導
されたところの非ＰＯＴ１プラスミドよりもコピー数に
おいて機能的により大きいことを示す。本発明に従うＤ
ＮＡ構造物すなわち特にプラスミドを作るために用いら
れる手法は、慣用の方法を含む。ＤＮＡ構造物において
用いられる必須遺伝子は、もし遺伝子の構造が知られて
いるなら、ラベルされたＤＮＡプローベを用いてライブ
ラリーから分離される、又はＤＮＡライブラリーのセグ
メントを普通のベクターに結合し、このベクターを特定
の必須遺伝子において欠陥の突然変異細胞中に形質転換
し、そして補償された株をさがすことによって同定され
る。必須遺伝子を含む適当なＤＮＡフラグメントが同定
されると、それは発現されるであろう構造的蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を含むベクターに結合される。必須
遺伝子は、宿主生物内での発現に必要なそれ自身のプロ
モーター及び他の対照と共に用いられうる。あるいは、
必須遺伝子の発現を増す又は減らすために、異種プロモ
ーターが用いられうる。ＤＮＡフラグメントの結合の方
法は、実施するに十分に記載されており、当業者にとっ
て十分である。

【００２１】ＤＮＡ構造物の調製後に、それは形質転換
条件下に宿主生物中に形質転換される。原核細胞及び真
核細胞（組織培養細胞を含め）を形質転換するための方
法は、文献で知られている。上述したように、宿主生物
は、プラスミド上の必須遺伝子の選択のための必須機能
において欠陥を持たねばならない。突然変異宿主株は、
通常の寄託機関から入手でき、又は突然変異化及び適当
な突然変異を持つ突然変異体をスクリーニングすること
により野生タイプから慣用の手段により作られうる。形
質転換された宿主は、次に慣用の複合培養基上での増殖
により選択されうる。酵母の場合、ＹＥＰＤ（１％酵母
エキス、２％バクトペプチン及び２％デキストロース）
のような慣用の培養基が用いられうる。本発明に従う必
須遺伝子を含む選択マーカーが、ＤＮＡ構成に適当であ
る場合にはいっでもマーカーとして使用でき、そして従
って本発明に従う必須遺伝子選択マーカーを含む構造物
は多くの用途を持つことが認められよう。下記の実施例
は、そのような用途の例示のための示され、制限のため
ではない。

【００２２】別記なき限り、標準分子生物学的手法が用
いられた。酵素は、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）研究
所、ニューイングランドバイオラブズ、及びボーリンガ
ー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）マンハイム バイオケミカ
ルズから得られ、製造者により指示されたように又はマ
ニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（モレキュラークロー
ニング：Ａ実験室マニュアル、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー，１９８２）により記載された
ように用いられた。大腸菌培養物は、マニアチスら（上
述）に開示されるように塩化カルシウム法によって形質
転換された。酵母培養菌は、ベッグズ（Ｂｅｇｇｓ）の
方法を本明細書で述べるように修正して用いて形質転換
された。

【００２３】実施例 １ 選択マーカーとしてのＳ・ セレビシエ ＣＤＣ４遺伝
子Ａ安定なＣＤＣ４含有プラスミドの構成 酵母ゲノム ライブラリーは、Ｓａｎ３Ａによる酵母Ｄ
ＮＡの部分的消化、蔗糖勾配によりサイズ選択、及びＢ
ａｍＨＩで予め消化された酵母ベクターＹＲｐ７中への
選択されたフラグメントの挿入により構成された（ナス
ミス（Ｎａｓｍｙｔｈ）とリード（Ｒｅｅｄ）、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７７：２１
１９−２１２３，１９８０）。ＣＤＣ４遺伝子を含む組
換えプラスミドが、酵母株ＧＥＢ５（ＭＡＴＡ ｃｄｃ
４−４ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｌｙｓ １ ｕｒａ１）
及びＧＥＢ７（ＭＡＴａ ｃｄｃ ４−３ ｌｅｕ ２
ｔｒｐ１ ｌｙｉ１）をライブラリーによる形質転換に
より分離された。これらの株は、株Ａ３６４Ａｃｄｃ
４−３及びＡ３６４Ａｃｄｃ ４−４（ハートウエル
ら、ジェネティクス７４：２６７−２８６， １９７
５）から、高頓度で形質転換すると知られた株（Ｋ７９
〔ＭＡＴαｌｏｕ２ ｔｒｐ１〕（ナスミスら、ネイチ
ア２８９：２４４−２５０，１９８１：タッチェルら、
セル２７： ２５−３５，１９８１）との交配及び続い
ての高形質転換株（Ｋ７９及びＫ８０〔ＭＡＴａ ｌｏ
ｕ２ ｔｒｐ１ ｌｙｓ１〕）への戻し交配により望む
遺伝的背景（ｌｏｕ２ ｔｒｐ１）でｃｄｃ４−３及び
ｃｄｃ４−４突然変異を得ることによって誘導された。
トリプトファン原栄養性及び制限的温度（３７°）で増
殖する能力についての形質転換体の選択は、ゲノム中に
組込まれＣＤＣ４座にマップすると判った一つのそのよ
うなプラスミド（ｐＪＹ３５と名付けられた）を同定し
た。自発的プラスミド組込み体は、それらの選択的増殖
利点に基づいて同定された。この生長利点は、元のプラ
スミド上での ＣＤＣ４を結合された遺伝子の存在によ
り、これは高コピー数で存在するとき（すなわちプラス
ミドが宿主ゲノム中に組込まれなかったとき）に細胞増
殖にとって有害である。組込み体において、ＴＲＰ１
プラスミドマーカーは、ＳＵＰＩ１に遺伝子的に結合さ
れることが見られ、これは染色体ＶＩ上のＣＤＣ４に結
合される（モルチマー（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ）とシルド
（Ｓｈｉｌｄ），「サッカロミケス セレビシエの遺伝
子マップ」，ストラサーンら編、酵母サッカロミケス
セレビシエ ライフサイクルと遺伝の分子生物学，６４
１−６５１，コールド スプリング ハーバー１９８
１）。ｃｄｃ４−３補償領域は６．４ｋｂＢ ａｍＨＩ
フラグメントとして精製され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて、Ｂａｍ ＨＩで予め開裂されたベクターＹＲｐ７
（ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−１０
３９，１９７９）に結合された。この構造物はｐＪＹ５
１として知られ、第１図に示される。

【００２４】第１図において、ＣＤＣ４コード領域が下
記の方法でフランキング ゲノムＤＮＡ配列から精製さ
れた。プラスミドｐＪＹ５１がＨｉｎｄｍで開裂され、
ＣＤＣ４領域を含む３．６ｋｂフラグメントがバクテリ
ア プラスミドｐＢＲ３２２中でサブクローンされた。
この構造物は、Ｂａｍ ＨＩで完全に消化され、Ｈｉｎ
ｃＩＩで部分的に消化され、約２．３ｋｂのＣＤＣ４含
有フラグメントが精製された。ＨｉｎｃＩＩフラグメン
ト末端は、リンカー配列（配列：５′ＣＣＧＧＡＴＣＣ
ＧＧ３′、コラボラティブリサーチから得られた）の付
加及び続いて過剰のリンカー除去のためのＢａｍ ＨＩ
での消化によって、Ｂａｍ ＨＩ末端に転化された。Ｃ
ＤＣ４遺伝子の約１．９ｋｂを含む得たフラグメント
は、プラスミドｐＪＹ７０を作るためにＹＲｐ７のＢａ
ｍ ＨＩ部位中に挿入された。このプラスミドは、上述
のｃｄｃ４−３突然変異を捕うように見えた。この１．
９ｋｂフラグメントは ＣＤＣ４遺伝子の５′−及び
３′−コード領域の両者の小さな部分を欠くが、それは
驚ろくことに温度感性欠陥を補う。たぶん、ＣＤＣ４配
列の転写及び翻訳はプラスミドのｐＢＲ３２２領域中に
位置する配列により制御され、機能的遺伝子生成物の産
生を可能にする。

【００２５】プラスミドｐＪＹ７０は酵母ＴＲＰ１及び
ＡＲＳ１配列を除くためのＥｃｏＲＩで開裂され、そし
て再び結合されてｐＢＲ３２２及びＣＤＣ４配列を含む
ハイブリッド プラスミドを与えた。このプラスミドは
ｐＪＹ７１として知られ、第１図に示される。１．９ｋ
ｂ酵母配列は、Ｂａｍ ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントとしてｐＪＹ７１から精製された。このフラグメン
トは、Ｂａｍ ＨＩとＨｉｎｄＩＩＩでの消化により線
形化されたｐＢＲ３２２に結合されてプラスミドｐＢ４
を作った。これは第１図に示される。

【００２６】ＣＤＣ４領域は、高コパー数酵母ベクター
中への挿入のためにｐＢ４から再び分離された。そのよ
うなベクターは、酵母２μプラスミドの複製のオリジ
ン、及び興味ある外来遺伝子のためのクローニング部位
として働く一以上の制限酵素開裂部位を含むであろう。
好ましくは、そのような部位はプラスミド上のユニーク
部位であろう。好ましいベクターはＭＷ５であり、これ
は酵母２μプラスミド複製オリジンとユニークＥｃｏＲ
ＩとＢａｍ ＨＩクローニング部位を含む。第２図にお
いて、プラスミドＭＷ５は、プラスミドＹＲｐ７′（ス
ティンクコムら、ネイチア２８２：３９−４３、１９７
９）から、ＥｃｏＲＩで部分的開裂により平均分子当り
二つのＥｃｏＲＩ部位の一つを開裂することによって誘
導された。線形分子の得た非対末端は、ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて満たされ、得られたプラント末端はＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて再結合された。ＡＲＳ１配列に
近接するＥｃｏＲＩ部位を保持する得たプラスミドを次
に選択した。ＡＲＳ１配列はＰｓｔＩと ＥｃｏＲＩで
の消化により除かれ、酵母２μＤＮＡの複製オリジーン
を含むプラスミドＹＥｐ１３（ブローチ（Ｂｒｏａｃ
ｈ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）８：１２１−１３３，１９
７９）のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントで置き代え
られた。ＭＷ５と呼ばれる得たプラスミドを第２図に示
す。

【００２７】ＣＤＣ４領域は、高コピー数酵母ベクター
中への挿入のためにｐＢ４から再び分離された。そのよ
うなベクターは、酵母２ プラスミドの複製のオリジ
ン、及び興味ある外来遺伝子のためのクローニング部位
として働く一以上の制限酵素開裂部位を含むであろう。
好ましくは、そのような部位はプラスミド上のユニーク
部位であろう。好ましいベクターはＭＷ５であり、これ
は酵母２ ラスミド複製オリジンとユニークＥｃｏＲＩ
と Ｂａｍ ＨＩクローニング部位を含む。第２図にお
いて、プラスミドＭＷ５は、プラスミドＹＲ７′（ステ
ィンクコムら、ネイチア２８２：３９−４３、１９７
９）から、ＥｃｏＲＩで部分的開裂により平均分子当り
二つのＥｃｏ ＲＩ部位の一つを開裂することによって
誘導された。線形分子の得た非対末端は、ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて満たされ、得られたブラント末端はＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて再結合された。ＡＲＳ１配列
に近接するＥｌｌ ＲＩ部位を保持する得たプラスミド
をつぎに選択した。ＡＲＳ１配列はＰｓｔ１とＥｌｌ
ＲＩでの消化により除かれ、酵母２μＤＮＡの複製オリ
ジンを含むプラスミドＹＥｐ１３（ブローチ（Ｂｒｏａ
ｃｈ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）８：１２１−１３３，１
９７９）のＰｓｔＲＩフラグメントで置きかえられた。
ＭＷ５と呼ばれる得たプラスミドを第２図に示す。

【００２８】最終的なＣＤＣ４含有安定プラスミドを構
成するために、ＭＷ５はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで開裂
された。ＣＤＣ４フラグメントは、プラスミドｐＢ４か
ら、プラスミドをＢａｍＨＩとＥｃｏ ＲＩで消化する
ことにより精製された。Ｔ４ＤＮＡ リガーゼを用いて
二つのフラグメントを結合し、そのようにして作ったキ
メラ分子を大腸菌株ＲＲＩ（ナスミスとリード、上述）
中に形質転換し、アンピシリン耐性、テトラサイクリン
感応性のコロニーについて選択した。一つのそのような
コロニーから分離されたプラスミドｐＢ５（第２図に示
す）は、酵母２μ複製オリジン、ｐＢＲ３２２プラスミ
ド配列、選択マーカーＴＲＰ１、酵母ＣＤＣ４コード配
列の１９ｋｂ，及びユニークＥｃｏＲクローニング部位
を含む。Ｂ．宿主ＣＤＣ４遺伝子の崩壊のためのプラス
ミドの構成

【００２９】本発明に従うＣＤＣ４含有プラスミドの、
形質転換された宿主における安定性は、宿主における機
能性ＣＤＣ４遺伝子の欠損に依存する。プラスミドと染
色ＤＮＡの間の組換えを除くために、宿主ゲノムとＣＤ
Ｃ４含有安定プラスミドの間に相同性が存在しないこと
が更に望ましい。適当に除去されたＣＤＣ４座を持つ酵
素株を得るために、野性型ＣＤＣ４遺伝子を含む酵母宿
主は、崩壊された“ＣＤＣ４遺伝子”（ロスステイン、
上述）を持つ線形化されたプラスミドフラグメントによ
り形質転換されうる。線形化されたプラスミドフラグメ
ントは、フラグメントの自由末端が ＣＤＣ領域内での
組換えを高めるであろう故に、好ましい形質転換剤であ
る。そのようなプラスミドフラグメントは、完全なゲノ
ムＣＤＣ４座との組換えを促進するためにその求端で完
全なＣＤＣ４フランキング領域を持つであろう。プラス
ミド フランキングのＣＤＣ４フランキング領域の間に
挿入された遺伝子物質は、形質転換された宿主中で選択
されうる表型的特徴（ＴＲＰ１又はＬＥＵ２のような選
択マーカー）をコードするであろう。崩壊するプラスミ
ドは好ましくはまた、宿主ゲノム中への崩壊されたＣＤ
Ｃ４選択マーカー配列の組込みについて選択するため
に、複製の酵母オリジンを欠くであろう。線形化された
プラスミドでの形質転換に続いて、遺伝子組換えは宿主
のゲノム配列の代りに崩壊された配列の置換を結果す
る。ＣＤＣ４遺伝子が今や除去された細胞は次に、崩壊
において用いられたマーカーに従って選択できる。宿主
ゲノムの一段階崩壊のための方法は、ロスステイン（上
述）により記述されている。上述のように、宿主株を完
全な安定プラスミドと線形プラスミドによる共形質転換
の追加的改善により崩壊が行われて、宿主ゲノムの崩壊
の達成に加えて宿主の安定プラスミドの形質転換もまた
行われる。

【００３０】宿主ＣＤＣ４ 座の崩壊のための好ましい
プラスミドは、ｐＢ１５Ｌであり、第３図に示される。
それは、ＣＤＣ４のフランキング領域とベクターｐＵＣ
１３（ビエイラ（ｖｉｅｉｒａ）とメッシング（ｈｅ
ｓｓｉｎｇ），ジーン１９：２５９−２６８，１９８
２，及びメッシング，メセッド イン エンザイモロジ
ー１０１：２０−７７，１９８３）の間に挿入された酵
母ＬＥＵ２遺伝子を含む。酵母とベクター配列の結合点
で線形化されそして適当な酵母宿主株中に形質転換され
るとき、プラスミドはＣＤＣ４ 領域のためのＬＥＵ２
配列の置換から得られた宿主ゲノムにおけるＣＤＣ４の
欠失を作る。宿主株において、ロイシン栄養要求性の崩
壊された形質転換体は次に、ロイシン原栄養性に基づい
て選択されうる。

【００３１】プラスミドｐＢ１５Ｌを構成するために、
ＣＤＣ４ 遺伝子及びその５′−及び３′−フランキン
グ領域を含む６．４ｋｂフラグメントが、ｐＪＹ５１の
ＢａｍＨＩ消化物から精製された。このフラグメント
は、プラスミドｐＢ１４を作るためにＢａｍＨＩ消化さ
れたｐＵＣ１３中に挿入された。ＣＤＣ４ コード領域
の多くが、ｐＢ１４をＣｌａＩで消化し、ｐＵＣ１３と
ＣＤＣ４ フランキング配列を含む比較的大きなフラグ
メントを精製することにより除去された。フラグメント
末端は、ｘｈｏＩ（Ｂｇｌ ＩＩ）スマートリンカー
（ワーシングトンダイアゴノスチック（ｗｏｒｔｈｉｎ
ｇｔｏｎ Ｄｉａｇｏｎｏｓｔｉｃ）の付加により修飾
され、ＹＥｐ １３の２．８ｋｂＢｇｌ ＩＩＬＥＵ２
フラグメント（ブローチら、ジーン８：１２１−１３
３．１９７９）が得られた粘性末端に結合された。その
ように作られたＤＮＡは、大腸菌株ＲＲＩを形質転換す
るために用いられた。形質転換体は、酵母ＬＥＵ２配列
が大腸菌宿主中のｌｅｕ Ｂ欠陥を補うきで、ロイシン
原栄養性に基づいて選択された。プラスミドｐＢ１５Ｌ
が、そのような形質転換された一つのコロニーから精製
された。

【００３２】プラスミドｐＢ１５Ｌは、５′及び３′フ
ランキング配列に加えてＣＤＣ４コード配列の５′末端
の僅か約５０塩基対を含む。プラスミドｐＢ５とｐＢ１
５Ｌのマップの比較は、それらの各々のＣＤＣ４配列の
間の相同性の欠除を示す。なぜならｐＢ１５ＬのＣＤＣ
４−ＬＥＵ２遺伝子融合の結合点がｐＢ５中に存在する
ＣＤＣフラグメントの領域の外に位置しているからであ
る。この相同性の欠除は、ｐＢ５と宿主細胞における崩
壊されたＣＤＣ４ 座の間の組換えを除く。Ｃ．Ｓ．セ
レビシエの共形質転換同時的に、ゲノムＣＤＣ４ 遺伝
子を除去しかつプラスミドｐＢ５を導入するために、酵
母細胞がＢａｍＨＩ開裂されたｐＢ１５Ｌと完全なプラ
スミドｐＢ５により共形質転換された。形質転換におい
て用いられるべき宿主株は、プラスミドｐＢ５とゲノム
ＣＤＣ４ 崩壊の同時選択のために、トリプトファンと
ロイシンについて栄養要求性でなければならない。株Ａ
２（ＭＡＴα ｌｅｕ２−２， １１２ ｈｉｓ ３−１
１，１５ ｃａｎ １；スゾスタク，メソッド インエ
ンザイモロジー１０１：２４５− ２５２，１９８３）
の株ＧＥＢ７（実施例１Ａ 参照）の交配から得られた
株Ａ２．７．ｃ（ＭＡＴα ｃｄｃ４−３ｔｒｐ１ ｌ
ｅｕ２−１，１１２ ｌｙｓ１ ｈｉｓ３−１１，１５
ｃａｎ１）が用いられた。

【００３３】典型的な共形質転換実験において、対数増
殖相のＳ．セレビシエＡ２．７．ｃの培養物の１０ｍｌ
が、約６μｇのＢａｍＨＩ消化されたｐＢ１５Ｌ，１μ
ｇｐＢ５及び担体としての１０μｇ子ウシ胸腺ＤＮＡに
より形質転換された。形質転換条件は、ベッグズ（上
述）に記述された通りである。細胞は、ロイシンとトリ
プトファンを欠く培地上に置かれた。それらは、２２°
で一夜増殖され、３７°に移された。約３０のコロニー
が得られた。ｐＢ５単独での対照の形質転換及びトリプ
トファン原栄養性についての選択は、約１０００の形質
転換体を作った。六つの共形質転換されたコロニーは、
ＣＤＣ４座の崩壊を検証し、そしてｐＢ５プラスミドの
安定性をテストするために分析された。ゲノムＤＮＡ
は、アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら（コールド スプ
リング ハーバー シンポジングクオンタムバイオロジ
ー４７：９８９−９９８，１９８３）による方法により
共形質転換体から分離され、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで
消化され、アガロースゲル上で電気泳動され、ニトロセ
ルロースに移された（サザーン，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．９８：５０３−５１７，１９７５）。ブロットは、
ｐＢ１５Ｌに存在しｐＢ５に存在しないＣＤＣ４ の
５′フランキング領域からの２．５ｋｂ ＢａｍＨＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントによりプローベされた。第
４図は、プローベが非形質転換細胞からのＤＮＡの６．
４ｋｂフラグメントにハイブリッドしたことを示す。
（レーンｂ）；この６．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメン
ト内にＥｃｏＲＩ部位はない。ＬＥＵ２ 配列がＥｃｏ
ＲＩ部位を含むので、ＣＤＣ４ 座の崩壊はハイブリッ
ド化帯のサイズの減少を結果する（第４図で矢印で示
す）。これは、レーンｃ，ｄ．ｆ，ｇ及びｈにおいて示
された形質転換体の場合である。レーンｅは、いく分異
るパターンを示し、ゲノムサイズ帯を保持し、ゲノムＣ
ＤＣ４ の欠失が起きなかったことを示す。（レーンｃ
〜ｈに見られる比較的小さな帯は、レーンａとｂにおけ
る対照のパターンにより示されるように、ゲル精製され
たプローベの汚染による。）

【００３４】六つの共形質転換体が、複合培地（ＹＥＰ
Ｄ）上で増殖することによりプラスミド安定性をテスト
される。細胞は、液状ＹＥＰＤ中で２５°で３０世代に
亘って増殖され、次にＹＥＰＤ上で２５°でプレートさ
れ、そして３７°のＹＥＰＤ．トリプトファン欠除培地
及びロイシン欠除培地上にレプリカ プレートされた。
表１にまとめた結果は、＃３を除く総ての共形質転換体
は、複合培地上でプラスミドマーカーについて１００％
安定であったことを示す。（分離番号３は、第４図のレ
ーンｅに示された同じ共形質転換体である。）二つの共
形質転換体、番号１及び２．についてさらに安定性テス
トが実施された。テストは、各々６６３と６８１のコロ
ニーについて行われた。３０°でＹＥＰＤ上での３０世
代の増殖後に、総てのコロニーはトリプトファンとロイ
シンに対して原栄養性であった。共形質転換体＃１は、
２２°で増殖速度をテストされ、非形質転換のＡ２．
７．ｃ対照と同じ速度で増殖することが判った。共形質
転換体＃１は、ＢＥＬＬ１と名付けられた。それは、Ａ
ＴＣＣに寄託番号２０６９８として寄託された。

【００３５】実施例 ２ シゾサッカロミケス ポンベＰＯＴ１遺伝子 Ａ．選択マーカーとしてのＳ．ポンベＰＯＴ１遺伝子 サッカロミケス セレビシエ ＴＰＩ１遺伝子は、トリ
オースホスフェートイソメラーゼ蛋白質をコードし、ｔ
ｐｉ１ 欠陥を補うことにより得られた（カワサキとフ
レンケル，上述；アルバーとカワサキ，上述）。驚くべ
きことに、Ｓ． ポンベ からの相同遺伝子は、同じ
Ｓ．セレビシエｔｐｉ１ 突然変異を補うことにより分
離された。ＰＯＴ１ （ｐｏｍｂ ｔｒｉｏｓｅ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）と名付けられた
Ｓ．ポンベ ＴＰＩ遺伝子は、Ｓａｕ３Ａにより部分的
に消化されベクターＹＥｐ１３中に挿入されたゲノム
Ｓ．ポンベ ＤＮＡを含むところの、ラッセル（Ｒｕｓ
ｓｅｌｌ）とホール （Ｈａｌｌ），（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５８；１４３−１４９，１９８３）により
記述されたライブラリーからクローンされた。予備的Ｄ
ＮＡ配列（マキサム（Ｍａｘａｍ）とギルバート（Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ）Ｍｅｔｈ，ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
６５；４９７−５５９，１９８０ の方法による）は、
ＰＯＴ１ 遺伝子がＴＰＩ蛋白質をコードし、該蛋白質
は他の生物からのＴＰＩ蛋白質と相同であることを示し
た（アルバーとカワサキ、上述）。このＰＯＴ１ ＤＮ
Ａ配列は、Ｓ．セレビシエ ＴＰＩ１ＤＮＡ配列及び各
蛋白質配列と共に第５図に示される。

【００３６】Ｓ．ポンベ ＰＯＴ１遺伝子は、Ｓ．セレ
ビシエにおける選択マーカーとしてＳ．セレビシエ Ｔ
ＰＩ１ 遺伝子よりも、この実施例で好まれる。Ｓ．セ
レビシエにおけるＰＯＴ１ のような外来遺伝子は、異
る宿主細胞中では良好に機能せず、従って宿主細胞欠陥
を補うためにより高いコピー数を必要とするかも知れな
い。また酵母プラスミド上の選択しうるＰＯＴ１ 遺伝
子は、同じベタター上の産業上重要な遺伝子の発現のた
めに内在ＴＰＩ１ プロオーター及びＴＰＩ１ターミネ
ーター（ＰＯＴ１ との相同性を示さない対照領域）の
使用を可能にする。ＰＯＴ１，及びＴＰＩ１のフランキ
ング領域は相同性を示さないので、分子内組換え及び結
果としてのプラスミド不安定性が低減される。最後に、
ＰＯＴ１遺伝子はＳ．セレビシエ染色体ＤＮＡと組換わ
らないようである。なぜなら、それは、ＴＰＩ１配列と
ＤＮＡレベルで少ししか相同性を共有せず、ＴＰＩ遺伝
子の多くは宿主株において除去された。すなわち、ＰＯ
Ｔ１ 含有プラスミドは、酵母において産業的に興味あ
る外来遺伝子の高められた発現のために望ましい高いコ
ピー数を保持しうる。

【００３７】ＰＯＴ１ 遺伝子を含むプラスミドは、
Ｓ．セレビシエ株Ｎ５８７−２Ｄ（カワサキとフレンケ
ル、上述）におけるｔｐｉ１ 突然変異の補償によりラ
ッセルとホール（上述）のＳ．ポンベ から同定され
た。このプラスミドｐＰＯＴの制限地図を第６図に示
す。ｐＰＯＴはベクターＹＥｐ１３を含むので、それは
本来的に不安定である。なぜなら、それは酵母において
２μプラスミドの維持のために必要な複製機能を欠くか
らである。従って、ＰＯＴ１遺伝子は、より有能なベク
ターたとえばＣ１／１及び完全な２μプラスミド配列を
含む関連ベクター中に動かされうる。プラスミドＣ１／
１は、ｐＪＤＢ２４８（ベッグズ，ネイチア２７５：１
０４−１０９，１９７８）及びｐＢＲ３２２から本明細
書の実施例３に記載されるように誘導された。それは、
酵母２μプラスミドＤＮＡ，選択しうるＬＥＵ２遺伝子
及びｐＢＲ３２２配列の総てを含む。

【００３８】ＰＯＴ１遺伝子は、約３４００塩基対のＢ
ａｍＨＩ−ＸｂａＩ制限フラグメントとしてｐＰＯＴか
ら分離され、ｐＵＣ１３の対応するポリソンカー部位中
に挿入された。得たプラスミドは、ｐＵＣＰＯＴであ
り、その部分的制限地図を第６図に示す。ｐＵＣＰＯＴ
プラスミドは、Ｓ．ポンベとＳ．セレビシエＤＮＡの約
１８００塩基対を除去するためにＳａ１Ｉで切断され、
そして再リゲートされる。この得たｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ
１プラスミドは、第６図に示される。ＰＯＴ１遺伝子
は、以下の方法でＣ１／１中に入れられた。Ｃ１／１及
びｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１の両者は、アンピシリン耐性遺
伝子中にＢｇｌＩ部位、及びどこか他の位置にユニーク
ＢａｍＨＩを有すので、ｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１のＰＯＴ
１フラグメントは、Ｃ１／１のｐＢＲ３２２領域の一部
に置き代わりうる。Ｃ１／１はＢｇｌＩ及びＢａｍＨＩ
で切断されて、ａｍｐｒ遺伝子の一部、２μＤＮＡの総
て、及びＬＥＵ２遺伝子を含む約７７００塩基対の大き
なフラグメントを遊離した。同様に、ｐＵＣＰＯＴ−Ｓ
ａ１はＢｇ１Ｉ及びＢａｍＨＩで切断され、ａｍｐｒ遺
伝子の別の一部及びＰＯＴ１遺伝子を含む約３４００塩
基対のフラグメントを遊離した。これら二つのフラグメ
ントをリゲートしてｐＣＰＯＴを形成し、これは回復さ
れた選択しうるａｍｐｒ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＬＲ
Ｕ２遺伝子、総ての２μＤＮＡ、及びＤＵＣ１３からの
複製領域のバクテリアオリジンを含む（ｐＵＣ１３から
のバクテリアオリジン領域は、ｒＢＲ３２２のオリジン
領域が行うよりもより高いプラスミドコピー数を可能に
する）。

【００３９】ｐＣＰＯＴで形質転換された大腸菌株ＨＢ
１０１は、寄託番号３９６８５としてＡＴＣＣに寄託さ
れた。ＰＯＴ１遺伝子はまた、同様の構成によりＣ１／
１誘導ベクター中に挿入されうる。たとえば、プラスミ
ドｐＦＡＴ５（第７図）は、Ｃ１／１に挿入されたヒト
α−１−アンチトリプシン（ＡＴ）の産生のための発現
ユニットを含む。この発現ユニットは、実施例４で述べ
るように作られ、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＴｃＤＮＡ
配列、及びＴＰＩ１転写ターミネーターより成る。ｐＦ
ＡＴ５の制限地図は、第７図に示される。ｐＦＡＴ５
は、Ｂｇｌ ＩとＢａｍＨＩにより切断され、ＡＴ遺伝
子とＴＰＩ１ターミネーターを含むフラグメント（２２
００塩基対）を遊離した。また、上述したようにＣ１／
１ＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと同一のＢｇｌＩ
−ＢａｍＨＩフラグメントが遊離される。但し、ｐＦＡ
Ｔ５からのフラグメントは、ＴＰＩ１プロモーターを含
むさらに９００の塩基対を含む。この後者のｐＦＡＴ５
片及びｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１ ３４００ｂｐ Ｂｇｌ
Ｉ−Ｂａｍ ＨＩフラグメント（上述した）は、プラス
ミドｐＦＰＯＴを形成するためにリゲートされ、これは
第７図に示す制限地図を持つ。

【００４０】ベクターｐＦＡＴ５はユニークＢａｍＨＩ
部位で切断され、２２００塩基対ＡＴ遺伝子及びｐＦＡ
Ｔ５からのＴＰＩ１ターミネーターフラグメントの挿入
を可能にする。ｐＦＰＯＴ中への適当な定位の２２００
ｂｐフラグメントのクローニングは、この酵母ベクター
中のヒトＡＴの発現を許す。適当にリゲートされた生成
物は、ｐＦＡＴＰＯＴと名付けられ、その制限地図を第
７図に与える。

【００４１】Ｂ 宿主ＴＰＩ 遺伝子の崩壊サッカロミケース セレビシエ ＴＰＩ１ 遺伝子がク
ローンされ、配列決定された（カワサキとフレンケル、
上述、及びアルバートカワサキ、上述）。ＴＰＩ蛋白質
のための構造遺伝子を含むプラスミドｐＴＰＩＣ１０
は、アルバーとカワサキ（上述）に記載されている。Ｂ
ｇｌＩＩ部位が、ＴＰＩ１ コード領域のＤＮＡ位置２
９５に存在し、もう一つのＢｇｌ ＩＩ部位が５′フラ
ンキング領域において約１２００塩基対離れて位置す
る。これらＢｇｌ ＩＩ部位は、ＴＰＩ１ 遺伝子の一
部を除去するため及び別の遺伝子たとえば酵母ＬＥＵ２
遺伝子を挿入するために慣用のクローニング部位であ
る。そのような構造物は、形質転換された宿主における
ゲノムＴＰＩ１ 座の崩壊を作るために用いられうる。
ＴＰＩ１の５′フランキング領域における約−１８００
は、Ｐｓｔ１部位である。従ってｐＴＰＩＣ１０におい
てＴＰＩ１ 遺伝子が、５′側でＰｓｔ１部位によりそ
して３′側でＳａ１ Ｉ部位（ｔｅｔｒ遺伝子におけ
る）によりフランクされる。ＴＰＩ１を含むこのＰｓｔ
Ｉ−Ｓａ１ Ｉフラグメントが、ＰｓｔＩ及びＳａ１
Ｉ部位でｐＵＣ１３に挿入されてｐＵＣＴＰ１を作っ
た。ＰｓｔＩ−Ｓａ１ Ｉ挿入物（ｐＵＣ１３への）の
制限マップを、第８図に示す。

【００４２】次にプラスミドにｐＵＣＴＰＩがＢｇｌ
ＩＩで切断され、二つのＤＮＡフラグメントが電気泳動
により分離された。比較的大きなプラスミドが精製さ
れ、自己結合を防ぐためにホスホァターゼ分解された。
このＤＮＡのＢｇｌ ＩＩ部位中に酵母ＬＥＵ２遺伝子
がリゲートされ、これはＢｇｌ ＩＩフラグメントとし
てプラスミドＹＥｐ １３（ブローチら、ジーン８：１
２１−１３３，１９７９）から除去されたものである。
得られたプラスミドは、ｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２であ
り、これはＴＰＩ１の部分的欠失及びＬＥＵ２ の挿入
を有する。ｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２を第８図に示す。プ
ラスミドｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２は、ＤＮＡを線形化す
るためにＰｓｔ１とＢａｍＨＩで切断された。次に酵母
配列が、電気泳動及びゲル精製によりｐＵＣ配列から分
離された。第８図に示される酵母ＤＮＡ部分は、ＴＰＩ
１染色体遺伝子（ロスステイン、上述）を「崩壊する」
ために、ＬＥＵ２ について欠陥のあるＳ． セレビシ
エ株Ｅ２−７Ｂ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０６８９）を形質
転換するために用いられる。ｌｅｕ＋形質転換体は、３
％グリセロール、１％ラクテート（ｐＨ７に中和され
た）、１Ｍソルビトール及びロイシン不含の合成（修正
ウィッケラムの）培地（モルチマーとホーソーン著、ロ
ーズとハリソン編、ザ イーストｖｏｌ．１、３８５−
４６０、アカデミックプレス、１９６９）上で選択され
た。形質転換体は、ＹＥＰ−デキストロース上でのその
増殖不能によりＴＰＩ欠陥についてスクリーンされた。
初めの ９９のスクリーンされた形質転換体のうち一つ
のｔｐｉ−性質転換対が見い出された。この株は、Ｅ２
−７ＢΔｔｐｉ＃２９（以下、Δ ｔｐｉ ＃２９と云
う）と名付けられた。Δｔｐｉ＃２９は、ＹＥＰ−３％
グリセロール−１％ラクテート上で増殖したが、ＹＥＰ
−デキストロース上で増殖しなかった。粗細胞抽出物で
酵素評価（クリフトン（ｃｌｉｆｔｏｎ）ら、ジェネテ
ィクス ８８：１−１１，１９８０）か行われ、Δｔｐ
ｉ ＃２９が、検出できるレベルのトリオースホスファ
ートイソメラーゼ活性を欠くことが確認された。

【００４３】Δｔｐｉ ＃２９は、ｔｐｉ−欠失につい
てヘテロ接合性である二倍体を形成するために、他の酵
母株に交配されうる。そのような二培体は、トリロース
ホスフェート イソメラーゼについて欠陥的な他の株
が発生されうるように、胞子形成されうる。たとえば、
Δｔｐｉ ＃２９は、Ｅ８−１０Ａ（Ｍａｔα ｌｅｕ
２）（雑種Ｅ２−７ＢＸＧＫ１００〔ＡＴＣＣ２０６６
９〕の胞子分離体）に交配されて、二培体Ｅ１１を形成
した。この二培体は胞子形成されて、半数体子孫Ｅ１１
−３Ｃを発生した。これは次のゲノタイプを持つ：Ｍａ
ｔα ｐｅｐ４ −３ ｔｐｉ１。Ｅ１１−３ＣがΔｔｐ
ｉ ＃２９に戻し交配されて二培体Ｅ１８を形成した。
これはｔｐｉ１欠失についてホモ接合性である。Ｅ１
８、アミノ酸要求を持たず、より大きな細胞を持ち、よ
り速く増殖するので、プラスミドのための宿主株として
Δｔｐｉ ＃２９より好ましい。これらｔｐｉ−株は、
解糖機能をコードする遺伝物質について欠失しており、
従って戻らない（すなわち安定な）突然変異体であると
考えられる。 Ｃ．Ｓ．セレビシエ ｔｐｉ−欠失株へのＰＯＴ１遺伝
子の形質転換

【００４４】プラスミドｐＦＰＯＴ及びｐＦＡＴＰＯＴ
が、Δｔｐｉ ＃２９及び関連するｔｐｉ欠失株に形質
転換された。この酵母突然変異体は、３０°でＹＥＰ−
２％ガラクトース中で対数相後期まで一夜好気的に増殖
された。形質転換条件は、ベッグズ（上述）により記載
された通りであったが、但し細胞は、上部寒天にプレー
トされる前にＹＥＰ−デキストロースの代りに１Ｍソル
ビトールを含むＹＥＰ−３％グリセロール−１％ラクテ
ート又はＹＥＰ−２％ガラクトース中で１〜２時間３０
°で回復するのを許された。上部寒天及びプレートは、
１Ｍソルビトール及び２％デキストロースを含む合成
の、修正ウィッカラム培地を含んだ。３０°で３日後
に、形質転換体は見え、ＹＥＰＤへのレプートのために
寒天から取り離された。その後、形質転換体は、ＹＥＰ
Ｄ又はデキストロースを含む他の複合培地上で維持され
た。ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換された株Ｅ１８は、ＺＹ
Ｍ−３と名付けられた。それは、寄託番号２０６９９で
ＡＴＣＣに寄託された。

【００４５】複合培地上でのｐＦＰＯＴ及びｐＦＡＴＰ
ＯＴの安定性 プラスミド安定性を研究するために、単一細胞からのコ
ロニーを、ＹＥＰＤを含む試験管に接種し、合計１０９
細胞（約３０分裂）まで増殖を許した。酵母細胞を音波
処理して塊を破壊し、適当倍希釈し、ｔｐｉ−細胞（Ｐ
ＯＴ１遺伝子を担持するプラスミドあり又はなし）の増
殖を許すＹＥＰ−２％ガラクトース又はＹＥＰ−２％グ
リセロール−１％ラクテート上にプレートされた。ＹＥ
Ｐ−ガラクトース上で生じたコロニーは次に、プラスミ
ドの欠損についてスクリーンするためにＹＥＰＤ上にレ
プリカプレートされた（すなわち、ＰＯＴ１含有プラス
ミドを失ったｔｐｉ−細胞はデキストロース上で増殖し
ないであろう）。表２にまとめた結果は、ｐＦＰＯＴと
ｐＦＡＴＰＯＴプラスミドが、酵母ｔｐｉ−欠失株にお
いて安定であることを示す。それらは驚ろくべきこと
に、動原体を含む酵母プラスミドよりはるかに安定であ
る動原体を持つプラスミド（これはコピー数が小さい）
は、酵母について報告された最も安定なプラスミドの一
つであり、複合培地での一回の分裂当り約１％の細胞の
確率で一般に失われる（マーレイとスゾスタク、上述、
を動原体プラスミド安定性の総説として参照された
い）。表２に示すように、ここで述べるＰＯＴ１プラス
ミドは、ｔｐｉ−欠失株において複合培地での３０回分
裂後に１％未満の確率で失われる。

【００４６】Ｄ．ＰＯＴ１プラスミドを用いるＳ． セ
レビシア におけるヒトα−１−７ンチトリプシンの発
現 形質転換された酵母における異種蛋白質の発現を高める
ためのＰＯＴ１プラスミドの使用をテストするために、
プラスミドｐＦＡＴＰＯＴ及びｐＦＡＴ５を、各々Ｓ．
セレビシア株Δｔｐｉ ＃２９及びＥ２−７Ｂを形質
転換するために用いた。形質転換された細胞は、デキス
トロースを含むロイシン不含培地で選択された。培養菌
は、３０°で３〜４のＯ．Ｄ．６００まで増殖された細
胞抽出物を調製し、実施例５記載のようにＡＴについて
評価した。ｐＦＡＴＰＯＴ／Δｔｐｉ ＃２９により作
られたとき４〜６％の合計可溶蛋白質を示した。ｐＦＡ
Ｔ５／Ｅ２−７Ｂにより作られたとき２〜３％の合計可
溶蛋白質を示した。

【００４７】プラスミドコピー数は正確に測定し平均個
体数を表わすことが困難であるが、遺伝子生成物量の経
験的観察は、相対的プラスミドレベルの指標を与え、発
現ユニット（プロモーター、興味の遺伝子、ターミネー
ター）は変わらないことを示す。従ってｐＦＡＴＰＯＴ
は、これがそれから誘導されたところのｐＦＡＴ５より
も機能的に数がより大きいようである。二つの形質転換
株は遺伝的にほぼ同一であり（Δｔｐｉ ＃２９はプラ
スミドに向けられた突然変異化によりＥ２−７Ｂから誘
導された）、同じ条件下で増殖されたので、これらの結
果は従来記載されるベクターを上向る本明細書記載の安
定なプラスミド発現系の値を示す。

【００４８】

【表１】 ａ 細胞は、２５°で３０世代、液状複合培養基（ＹＥ
ＰＤ）中で増殖され、次に２５°でＹＥＰＤ上にプレー
トされた。 ｂ 細胞は、３７°でＹＥＰＤにレプリカプレートされ
た。完全なＣＤＣ４遺伝子を欠く細胞は、この（制限
的）温度で増殖しなかった。 ｃ 細胞は、トリプトファンを欠く培地にレプリカプレ
ートされた。 ｄ 細胞は、ロイシンを欠く培地にレプリカプレートさ
れた。

【００４９】

【表２】 ａ プラスミド／株組合せは、約１０^４〜１０^５細胞の
容易に見えるコロニーが見られるまで、ＹＥＰＤプレー
ト上で増殖された。これらコロニーは、ＹＥＰＤ液状培
養基の６ｍｌを接種するために用いられた。培養菌は、
１〜３×１０^８細胞／ｍｌの細胞密度まで好気的に一夜
増殖され、ＹＥＰ−２％グリセロール−１％ラクテート
又はＹＥＰ−２％ガラクトース上へプレートされた。こ
れら培地の各々は、ｔｐｉ⁻株の増殖を許すが、得られ
たｔｐｉ⁻コロニーはｔｐｉ^＋コロニーよりもゆっくり
増殖した。各コロニー（ｔｐｉ⁻又はｔｐｉ^＋）がカウ
ントできるように、僅か１００〜３００細胞が各プレー
ト上に分布された。 ｂ コロニーは、２％の最終濃度でデキストロースを含
む合成培地上にレプリカプレートされた。プラスミド上
のトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子を失った
細胞は、増殖できなかった。 ｃ 損失％は、ＹＥＰＤ中で約３０分裂後にプラスミド
を失った細胞の頻度を示す。実験２〜６のプールされた
データは、ＰＯＴ１プラスミドがこれら多くの分裂に亘
って極めて安定であり、３０回の細胞分裂において１％
より小さい組合わされた頻度で失われることを示す。

【００５０】実施例 ３ プラスミドＣ１／１の調整 Ｃ１／１が、プラスミドｐＪＤＢ２４８（ベッグズ、
Ｊ．，ネイチア２７５、１０４−１０９、１９７８）か
ら作られた。ｐＭＢ９配列が、ＥｃｏＲＩによる部分的
消化によってｐＪＤＢ２４８から除かれ、ＥｃｏＲＩで
切断されたｐＢＲ３２２ＤＮＡにより置代えられた。Ｃ
１／１の制限地図を第６図に示す。Ｃ１／１プラスミド
は、ＥｃｏＲＩ部位でのｐＢＲ３２２挿入を伴い、酵母
（Ｓ．セレビシエ）からの全２μＤＮＡを含む。それは
また、ＬＥＵ２ 遺伝子を含む。

【００５１】実施例 ４ プラスミドｐＦＡＴ５の調整 ヒトα−１−アンチトリプシン（ＡＴ）の主な形をコー
ドする遺伝子が、ＤＮＡハイプリダイゼーションプロー
ベとしてヒヒ配列を用いる慣用の方法によりヒト肝臓ｃ
ＤＮＡライブラリーから分離された（クラチら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６８２
６−６８３０、１９８０；及びチャンドラら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１０３：
７５１−７５８、１９８１）。このライブラリーは、ヒ
ト肝臓ｃＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部
位に挿入することにより構造された（ボリバーら、ジー
ン２：９５−１１３．１９７７）。ＡＴ遺伝子は、１５
００塩基体（ｂｐ） ＰｓｔＩフラグメントとしてライ
ブラリーから分離された。このフラグメントは、プラス
ミドｐＵＣα１を作るために、ｐＵＣ１３のＰｓｔＩ部
位に挿入された。ｐＵＣα１において、ＡＴ配列は、ポ
リリンカーにおいてＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ部位により
３′末端でフランクされた。ＴＰＩターミネーターが、
約７００ｂｐのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとし
てプラスミドｐＦＧ１（アルバーとカワサキ、上述）か
ら精製され、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで開裂されたｐＵＣ
α１中に挿入された。この構造物は次に、ＥｃｏＲＩで
切断され、オリゴヌクレオチド リンカー（配列：ＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＧＡＧ ＧＴＡＣＣＴＣＣＴＡＧ）が多重
リンクされたコピーで付加されて、ＴＰＩターミネータ
ーの３′末端にＢａｍＨＩ部位を与える。得たプラスミ
ドはＢＡＴ５として知られる。

【００５２】ＴＰＩプロモーターフラグメントがプラス
ミドｐＴＰｌＣ１０（アルバーとカワサキ、上述）から
得られた。このプラスミドは、ユニークＫｐｎＩ部位で
切断され、ＴＰＩコード領域をＢａ１３１エキソヌクレ
アーゼにより除去し、ＥｃｏＲＩリンカー（配列：ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣ）がプロモーターの３′末端に付加され
た。ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩでの消化は、ＢｇｌＩＩ
及びＥｃｏＲＩ粘性末端を持つＴＰＩプロモーターフラ
グメントを与えた。このフラグメントは次に、ＢｇｌＩ
ＩとＥｃｏＲＩで切断したプラスミドＹＲｐ７′（ステ
ィンクコムら、ネイチア２８２：３９−４３、１９７
９）に結合された。得たプラスミドＴＥ３２を、テトラ
サイクリン耐性遺伝子の一部を除去するためにＥｃｏＲ
ＩとＢａｍＨＩで開裂した。線形化されたプラスミドは
次に、プラスミドＴＥＡ３２を作るために、上述のＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩリンカー付加により再線形化され
た。次にＴＥＡ３２は、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで開裂
され、ＴＰＩプロモーターは約９００ｂｐのフラグメン
トとして精製された。

【００５３】プラスミドｐＦＡＴ５を構造するために、
プラスミドＣ１／１をＢａｍＨＩで線形化し、ＴＥＡ３
２からの９００ｂｐＴＰＩプロモーターフラグメントに
結合した。プラスミドＦとして知られる得た構造物は、
ＴＰＩプロモーターの３′末端に位置するユニークＢａ
ｍＨＩ部位を持つ。このプラスミドはＢａｍＨＩで切断
され、ＡＴコード領域とＴＰＩターミネーターを含む２
２００ｂｐＢａｍＨＩフラグメントがＢＡＴ５から精製
され、ＢａｍＨＩ部位中に挿入された。ｐＦＡＴ５とし
て知られる得たプラスミドは、第７図に示される。

【００５４】実施例 ５ α−１−アンチトリプシンについての評価 対照として、１００μｇ／ｍｌトリプシン溶液の１０μ
ｌ（１μｇ）、ウシ血清アルプミンの１００μｇ（１０
０μｌ）及び１ｍＭベンゾイルアルギニフイル−ｐ−ニ
トロアニリドを含むｐＨ８．０の緩衝液０．０５Ｍ Ｔ
ＲＩＳの１００μｌを混合し、４０５ｎｍでの吸光度の
増加を分光光度計で経時測定した。この溶液の吸光度値
は、１００％トリプシン活性の標準として用いられた。
総ての評価されだサンプルは、同じ濃度の基質及びウシ
血清アルブミンを含む。

【００５５】実施例 ６ 選択マーカーとしてのアスペルギルスニジュランスＴＰ
Ｉ 機能性ＴＰＩ ｃＤＮＡを、Ｓ．セレビシエ株Δｔｐｉ
２９（マックナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）等、Ｃｅｌｌ
４６：１４３−１４７、１９８６）中のＴＰＩ欠失を
補足する為に、その能力でＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ）から単離した。１．１５ｋｂのＴＰＩ
ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとし
てｐＵＣ９１に挿入した。このｃＤＮＡを、ＳｓｔＩで
の部分的消化後に得られたプラスミドから切り取り、Ｂ
ａｍＨＩで消化を完結し、プラスミドｐＭ１４４を造る
為に、Ｓｓｔ Ｉ−Ｂｇｌｌｌ消化ｐｌＣ１９Ｒ（マー
シュ（Ｍａｒｓｈ）等、Ｇｅｎｅ３２：４８１−４８
６、１９８４）に挿入した。ＢａｍＨＩ部位を、Ｅｃｏ
ＲＶでプラスミドを線状化し、ＢａｍＨＩ リンカーシ
ークエンスを添加し、そして再接合する事により、ｐＭ
１４４に導入した。得られた構造物を、ｐＭ１４７と命
名した。ＴＰＩ ｃＤＮＡを、次いでＳａｌｌ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントとして、ｐＭ１４７から単離した。こ
のＳａｌｌ−ＢａｍＨＩ Ａ．ニジュランスＴＰＩを、
次いで、同じ酵素での消化で線状化されたＣ１／１に挿
入した。ベクターからのＣ１／１を、ｐＣＴＩＰと命名
した。プラスミドｐＴＩＰを、次いで酵母形質転換での
安定性試験にかけた。Ｓ．セレビシエ株ＧＡ１８−１ｃ
（ＭＡＴ α１ｃｕ２−３、１１２ ｕｒａ３ ｂａｒ
ｌ Δｔｐｉ ＩＩＬＥＵ２）を、ｐＴＩＰで形質転換
し、グルコース培地で培養した。このプラスミドは、宿
主でのＴＰＩ欠失を補足する事を示し、エチジウムブロ
マイド染色ゲルのリボソマールＤＮＡバンドとの比較
で、高いコピー数（細胞当り２００コピー）で存在する
事が示された。これらの結果は、又ベクター上のプロモ
ーターシークエンスが、ＴＰＩシークエンスの発現に、
偶然向けられている事を示す。更に分析は、ｐＤＰＯＴ
のｐＵＣ１３部分のＥ ｃｏｌｉ ｌａｃｚ プロモー
ターは、応答可能であった事を示した。

【００５６】実施例 ７ 選択マーカーとしてのＰＧＩ遺伝子 Ａ．ＰＧＩのクローン化 シャトルベクターＹＥｐ１３中の酵母ＤＮＡライブラリ
ーを、ナスミス（Ｎａｓｍｙｔｈ）とターチェル（Ｔａ
ｔｃｈｅｌｌ）（ｃｅｌｌ １９：７５３−７６４、１
９８０）の記述通りに調製した。ホスホグルコース イ
ソメラーゼ（ＰＧＩ）遺伝子を運ぶプラスミドとして
は、グルコースでの培養の為の同時選択及びロイシン原
栄養株（Ｋａｗａｓａｋｉ ａｎｄ Ｆｒａｅｎｌｅ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ．１０８：１１０７−１１１２、１９８２）を使用し
て、ｐｇｉ⁻酵母株の補完で同定され、ｐＰＧＩ１９−
７と命名した。ｐＰＧＩ１９−７の制限エンドヌクレア
ーゼ地図は、ＰＧＩ１遺伝子を含む５．７ｋｂのＢａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを同定した。ｐＰＧ
Ｉ１９−７からのＰＧＩ１含有インサートを、次いで、
ｐＵＣ１３にサブクローニングした。ＢａｍＨＩ及び部
分的にＨｉｎｄＩＩＩで補足する為に、プラスミドを切
断する事に依り、次いでアガローゼゲルでの単離に依
り、５．３ｋｂのフラグメントを得た。精製フラグメン
トを、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵ
Ｃ１３に接合した。こノクローンの同定は、ＤＮＡシー
クエンスで確認した。得られたクローンは、ｐＵＣＰＧ
Ｉと命名した。

【００５７】Ｂ．ＰＧＩ欠失株の構成 酵母宿主株中のゲノムＰＧＩ１遺伝子座を崩壊するのに
使用する為のプラスミドを構成した。これは、ｐＵＣＰ
ＧＩのＰＧＩ１遺伝子にＬＥＵ２の挿入を含み、ｐＧＤ
１０４０と命名した。プラスミドｐＧＤ１０４０を、次
いでＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＬＥＵ２
シークエンスを含むフラグメントを、Ｓ．セレビシエ株
Ｅ２−７Ｂの形質転換に使用した。形質転換体は、１ｃ
ｕ⁻合成培地含有フルクトース上で選択した。ＬＥＵ^＋
形質転換体は、次いでＹＥＰＤプレート上で培養の可能
性に対しスクリーニングされた。突然変異株は、ＰＧＩ
においては欠陥のあるものである事を確認する為に、マ
イトラ（Ｍａｉｔｒａ）及びローボ（Ｌｏｂｏ）（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：４７５−４８８、１９７
１）及びＫａｗｓａｋｉ及びＦｒａｅｎｋｅｌ（ｉｂｉ
ｄ）の記述通りに、酵素評価を、粗細胞抽出物で行っ
た。欠失突然変異株は、酵素活性を示さなかった。ｔｒ
ｐ１⁻表現型を運ぶｐｇｉ欠失株が、更に構成された。
これを、＃５１ａ（ＭＡＴα １ｃｕ２ ｔｒｐＩ−２
８９ ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ１Δｐｇｉ１ＩＩ
ＬＥＵ２）と命名した。

【００５８】Ｃ．ＰＧＩ ｃＤＮＡの単離 プラスミドｐＹｃＤＥ８（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａ
ｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３−２０９９，１９８
５）にプールされている酵母ｃＤＮＡをマクナイト及び
マッコノーギー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８０：４４１２−４４１６，１９８３）に
記載の方法に準じて調製し、株＃５１ａの形質転換に用
いた。形質転換体をトリプトファンを含まない合成グル
コース培地上で選択し、１つの形質転換体を得た。この
形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＲＲ１を形質転換するのに用いた。ｐＰＧＩｃＤＮ
Ａと称するこのプラスミドの制限地図から、２．０ ｋ
ｂ Ｓｓｔ Ｉ−Ｂａｍ ＩＩＩフラグメント上に含ま
れるＰＧＩｃＤＮＡが５．４ｋｂのゲノムフラグメント
の一部に相当し、かつ遺伝子分裂においてすでに使用し
たｐＧＤ１０４０の欠失部分と大部分重複することがわ
かった。このｃＤＮＡをＭ１３ファージベクター中でサ
ブクローニングし、常法により配列した。この配列は、
酵母ホスホグルコース イソメラーゼ（Ｋｅｍｐｅ ｅ
ｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２４９：４６２５
−４６３３，１９７４）のアミノ酸組成に合致した。

【００５９】Ｄ．発現ベクターとしてのＰＧ１プラスミ
ドの使用 プラスミドｐＰＧＩｃＤＮＡをＳｓｔＩ及びＢａｍＨＩ
で消化し、ＰＧＩ ｃＤＮＡを含む２．０ｋｂフラグメ
ントをゲルで精製した。このｃＤＮＡを、ＳｓｔＩ及び
ＢａｍＨＩで予め消化したｐＺＵＣ１３に結び付けた
（ｐＺＵＣ１３はＳ．セレビシエ染色体ＬＥＵ２遺伝子
及びｐＵＣ１３に挿入されたＳ．セレビシ エ２μｍプラ
スミドからの複製源を含んでいる。ＥＰ公開公報１６
３，５２９に記載のプラスミドｐＭＴ２１２を用いて、
ＥＰ公開公報１９５，６９１に記載のｐＺＵＣ１３に類
似の方法で構築した。）。ｐＡ１と称する得られたプラ
スミドは、従って、ｌａｃＺプロモーターに融合したＰ
ＧＩ ｃＤＮＡ、ＬＥＵ２配列、２ミクロン複製源及び
アンピシリン耐性マーカーを含んでいる。ｐＡ１を株＃
５１ａに形質転換すると、この形質転換体はｌｅｕ⁻グ
ルコースプレート上で成育し、酵母細胞中でｌａｃＺプ
ロモーターが機能していることを示した。

【００６０】Ｅ．ＰＧＩ選択を用いたα−アンチトリプ
シンの発現 ｐＡ１中にＴＰＩプロモーター−−α−１−アンチトリ
プシンをコードすに配列−−ＴＰ１ターミネーターの発
現ユニットを挿入してなるプラスミドｐＡ１−Ｂを構築
した。この発現ユニットは次の方法で構築した。プラス
ミドＴＥＡ３２（実施例４）をＢｇｌＩＩＨ及びＥｃｏ
ＲＩで消化し、９９０ｂＰの部分的なＴＰＩプロモータ
ーフラグメントをゲルで精製した。プラスミドｐｌｃ１
９ＨをＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ベクターフ
ラグメントをゲルで精製した。ついで、ＴＰＩプロモー
ターフラグメントを直線化したｐｌＣ１９Ｈに繋ぎ、該
混合物を用いてＥ．ＣｏｌｉＲＰ１を形質転換した。プ
ラスミドＤＮＡを調製し、９００ｂｐ ＢｇｌＩＩ−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントの存在をスクリーニングした。正
しいプラスミドを選択しｐｌＣＴＰＩＰと命名した。

【００６１】次いでプラスミドｐＭＶＲ１を構築した。
プラスミドｐＩＣ７（Ｍａｒｓｈｅｔ ａｌ．同上）を
ＥｃｏＰＩで消化し、フラグメントの末端をＤＮＡポリ
メラーゼ１（クレノーフラグメント）でプラントしＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いてこの直線状ＤＮＡを再び環状に
した。得られたプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉＲＲ１
を形質転換した。プラスミドＤＮＡをこの形質転換体か
ら調製し、ＥｃｏＲ１部位の欠失をスクリーニングし
た。正しい制限パターンを有するプラスミドをｐＩＣ７
Ｒ１＊と命名した。プラスミドｐＩＣ７Ｒ１＊をＨｉｎ
ｄＩＩＩ及びＮａｒＩで消化し、２５００ｂｐフラグメ
ントをゲルで精製した。部分的ＴＰ１プロモーターフラ
グメント（約９００ｂｐ）をＮａｒ１及びＳｐｈ１を用
いてｐｌＣＴＰＩＰから除き、ゲルで精製した。ｐＦＡ
ＴＰＯＴをＳｐｈ１及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、部分
的なＴＰＩプロモーター、ＡＴｃＤＮＡ及びＴＰＩター
ミネーターを含む１７５０ｂｐフラグメントをゲルで精
製した。このｐＩＣ７Ｒ１＊フラグメント、部分的なＴ
ＰＩプロモーター、及びｐＦＡＴＰ０Ｔからの部分的な
ＴＰ１プロモーター−ＡＴ−ＴＰＩターミネーターフラ
グメントを３つの繋ぎ目で繋いでｐＭＶＲ１を製造し
た。

【００６２】次にα−１−アンチトリプシンの発現ベク
ターを構築した。プラスミドｐＭＶＲ１をＢｇｌ ＩＩ
で消化し、２．３ｋｂ発現ユニットフラグメント（ＴＰ
ＩＩプロモーター−ＡＴｃＤＮＡ−ＴＰＩＩターミネー
ター）をゲルで精製し、ｐＡ１のＢａｍＨＩ 部位に挿
入した。得られたプラスミドをｐＡ１−Ｂと命名した。
ｐＡ１−ＢをＳ．セレビシエ株＃５１ａに形質転換し、
形質転換体をＴＥＰＤ液体培地で１リットルのＯ．Ｄ．
６００まで増殖させた。この形質転換体は、α−１−ア
ンチトリプシンを全可溶性蛋白２．５−４．０％で発現
した。このレベルは、ＰＯＴＩ選択を用いて得られたレ
ベルに匹敵する。ｐＡ１−Ｂのコピー数は約１００／細
胞であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＢ４の構造を示す。

【図２】プラスミドｐＢ５の構造を示す。

【図３】プラスミドｐＢ１５Ｌの構造を示す。

【図４】プラスミドｐＢ５及びｐＢ１５Ｌで共形質転換
されたＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ａ
２．７．ｃからのＤＮＡのサザーンブロットを示す。

【図５】Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セ
レビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された蛋
白質配列とともに示す。

【図６】Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セ
レビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された蛋
白質配列とともに示す。

【図７】Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セ
レビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された蛋
白質配列とともに示す。

【図８】Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セ
レビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された蛋
白質配列とともに示す。

【図９】プラスミドｐＣＰＯＴの構造を示す。

【図１０】プラスミドｐＦＡＴＰＯＴの構造を示す。

【図１１】プラスミドｐＴＰＩ−ＬＥＵ２の構造を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 グレン カワサキ アメリカ合衆国 ワシントン州 98112 シアトル イースト シックスティーンス アベニュー 1547 (72)発明者 レスリー ベル アメリカ合衆国 ワシントン州 98102 イースト シアトル ボイアー アベニュ ー 2518

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵母細胞における欠陥を補う遺伝子を
   含むＤＮＡ構造物において、該欠陥が複合培養基での正
   常細胞増殖のために必要な機能にあり、該欠陥を補う遺
   伝子がＣＤＣ遺伝子及び解糖酵素遺伝子からなる群から
   選ばれ、ＤＮＡ配列がα−１−アンチトリプシンをコー
   ドするＤＮＡ構造物。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡ構造物を含む酵
   母。