JPS61107160A - アミノ酸定量用ニンヒドリン試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なアミノば定量用ニンヒドリン試薬に関
する。

アミノ酸分析方法としてはこれまで裡々の方法が開発さ
れ、実施されているが、多棟類のアミノ酸混合物の分別
定量法としては、カラムクロマトグラフィーと比色定量
法を組み合せ庭自動分析戦を用いる方法が最も広く普及
している。このうち比色定量法にはニンヒドリン法と螢
光法が多く採用されているが、ニンヒドリン法は最も古
くから用いられており殆ど全てのアミノ酸が発色し定量
性も良い為、最も多く自動分析法に採り入れられている
。

ニンヒドリン法は、溶媒としてメチルセロンルブ又はジ
メチルスルホキシド（以下、ＤＭＳ　Ｏと略称する。）
或いはこれらの混合物を用い、それにニンヒドリンとニ
ンヒドリンからヒドリンダンチンを生成させる還元剤（
或いはヒドリンダンチンそのもの）と酢酸塩緩衝液とを
溶解したニンヒドリン溶液にンヒドリン試薬）を、カラ
ムクロマトグラフィーにより分離溶出してきたアミノ酸
含有溶離液と混合加熱してアミノ酸を発色させ、その吸
光度を測定して溶離液中のアミノ酸ａ度を求める方法で
ある。これに用いる還元剤としては、シアン化カリウム
、塩化第一スズ、三塩化チタン等があり、この内環化第
−スズ、三塩化チタンが多く用いられているが、最近で
は更に水素化ホウ素ナトリウムを使用する方法が普及し
てさている。

又酢酸塩緩衝液としては、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液
、酢酸カリウム−酢酸緩衝液、酢酸カリウム−酢酸ナト
リウム−酢酸緩衝液、酢Ｍ　ＩＪチウム−酢酸緩衝液等
が用いられている。

即ち、いずれにしてもアミノ酸定量用ニンヒドリン試薬
は、ニンヒドリン、ニンヒドリンカラヒドリンダンチン
を生成させる還元剤（又はヒドリンダンチンそのもの）
、緩衝剤及びこれらを溶解する溶媒から構成されている
。従ってニンヒドリンの濃度、還元剤の種類、ヒドリン
ダンチンの濃度、緩衝剤の組成及びｐＨ等を変えること
によって種々のニンヒドリン試薬が考えられ、。又、実
際に自動分析機の機種に応じて等種々の目的に応じたニ
ンヒドリン試薬が各種提案され、用いられている。

これらニンヒドリン試薬に共通していることは、その大
部分が溶媒にメチルセロソルブを単独で若しくはＤＭＳ
　Ｏと併用して用いている点である。

即チ、メチルセロソルブは、化学構造式％式％ で表わ嘔れる沸点１２４．６℃、凝固点−８５，１’Ｃ
の常温で液体（粘度１．７２　ｃｐｓ（２０℃））の化
合物であり、主としてその水及びニンヒドリン法に於け
る各種反応試薬、並びに反応生成物に対する溶解性の点
から、ニンヒドリン法の溶媒に用いて特に優れているの
で、従来より同法の溶媒として極めて汎用されている。

しかしながら、最近、メチルセロソルブに血液障害、精
巣委縮、催奇形性等の作用があることが動物実験で判明
し、多方面で大キナ問題となっている。これは次式、 に従う代謝経路に於て、メチルセロソルブでは一級アル
コール基がアルコール脱水素酵素及び酸化酵素の作用を
受けてアルデヒドを経て毒性の大きなメトキシ酢酸に移
行するので、これに起因するものであろうと考えられて
おり、これらセロソルブ類に代わり得る安全性が高い溶
媒の探索に関し、早急の対応が必要な現状にある。

本発明者らは、このような現状に鑑みメチルセロソルブ
に代ｆ）得る肩壁溶媒について鋭意研究し、代謝経路に
於てプロビレ／グリコール（食品添加物に指定されてい
るンに移行する安全性が高い１−メトキシ−２−プロパ
ノール（プロピレングリコールモノメチルエーテル）及
びそ、の、類似化合物に着目、これら一般式（Ｉ） Ｒ’−ＣＨ−ＣＨ，０Ｒ２ Ｈ （式中、Ｒ１、Ｒ２は夫々独立して炭素数１〜４の低級
アルキル基を表わす。）で示される、１−アルコキシ−
２−アルカノールがそのような目的を達成する優れた化
合物であることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は溶媒として下記一般式（Ｉ）で示される
１−アルコキシ−２−アルカノールヲ単独で若シクはジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）°と併用して用いるこ
とを特徴とするアミノ酸定量用ニンヒドリン試薬である
。

Ｈ （式中、Ｒ１、Ｒ２は夫々独立して炭素数１〜４の低級
アルキル基を表わす。） 本発明によれば、安全性が高い肩壁溶媒をニンヒドリン
試薬の溶媒に用いて目的のニンヒドリン反応を効果的に
進行させることができる。又、本発明で用いる上記一般
式（Ｉ）で示される化合物は、水及びニンヒドリン法に
於ける各種反応試薬並びに反応生成物に対する溶解性０
点に於ても優れているので、自動分析装置に於けるライ
ンの詰ν等の問題を生じる恐れも極めて少ない。

本発明に於ては、ニンヒドリン試薬の溶媒に一般式（Ｉ
）で示される１−アルコキシ−２−アルカノールを単独
で若しくはＤＭＳＯと併用して用いることが必須構成要
件であり、そのような一般式（Ｉ）Ｈ で示される１−アルコキシ−２−アルカノールの炭素数
１〜４の低級アルキル基の例としては、メチル基、エチ
ル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基
、イソブチル基、第二級プチル基、第三級ブチル基など
が挙げられる。

これら、一般式（Ｉ）で示される°ニーアルコキシー２
−アルカノール例えば１−メトキシ−２−プロパツール
、ｌ−エトキシ−２−プロパツール、及ヒ１−　ｎ−プ
ａポキシー２−プロパノ−＃　１１　トハ、アミノ酸定
量用の種々のニンヒドリン試薬の溶媒に用いて充分に満
足できるものであり、従来、メチルセロソルブを用いて
いた部分は全て、これに置き換え得る。

以下に実施例を挙げて本発明の実施態様を示すが、本発
明はこれらの実施例によって何ら制約を受けるものでは
ない。

実施例　１ ニンヒドリン試′ｔＬＡ （３，０８％ニンヒドリン・１−メトキシ−２−プロパ
ツール液）　　　　　　　　　　　　ｅｓｏｍＪニンヒ
ドリン試液　Ｂ （０，３８％塩化第一スズ・１−メトキシ−２−プロパ
ツール液）　　　　　　　　　　　　１００ゴニンヒド
リン試液　Ｃ （４Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５，５４１±０．０２ａｔｚ５
℃）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２５ｏｒｔｔｌニンヒドリン試薬 上記ニンヒドリン試ｉＡにニンヒドリン試ｇ、Ｂ及びＣ
を加えて、高純度Ｎ２ガスを導入しつつ約２０分間攪拌
混合する。

アミノ酸の定量 上記ニンヒドリン試薬を用い市販のアミノ酸自勲分析計
でアミノ酸の定量を行ったところ、メチルセロソルブを
用いた場合の従来の分析結果と四オ革の結果が得られた
。

実施例　２ ニンヒドリン試液　Ａ ＤＭＳ　Ｏ６００ｄと１−メトキク−２−プロパツール
ｘｓｏｍＡ’の混合液に窒素ガスを約１０分間導入し、
ニンヒドリンｌｏｆを加え窒素ガスを導入しつつ溶解す
る。ついで水素化ホウ素ナトリウム７５■を加え窒素ガ
スを導入しつつ溶解する。

緩衝液 酢酸リチウム２６４ｆを蒸留水６００ｍｌに溶解し、さ
らに酢ｗ１．２００ｒｌＬｌを加え、蒸留水を加えて全
量を１４とする。

ニンヒドリン試薬 ニンヒドリン試液Ａに緩衝液２５０ｄを加えて窒素ガス
を導入しつつ混合する。

アミノ酸の定量 ・上記ニンヒドリン試薬を用いてＪＬＣ−８ＡＨ型日本
電子アミノ酸分析計でアミノ酸の定量を行ったところ、
上記ニンヒドリン試液Ａに於ける溶媒としてＤＭＳ　Ｏ
とメチルセロソルブとを用いた従来法の場合と同様の測
定結果が得られた。又、本発明のニンヒドリン試薬は、
上記ニンヒドリン試液Ａに於ける溶媒にＤＭＳ　Ｏとメ
チルセロソルブとを用いた従来法のニンヒドリン試薬同
様、冷蔵庫保管中結晶析出が認められなかった。

実施例　３ ニンヒドリン試薬 ＤＭＳ０３００ｍｌに窒素ガスを約１０分間導入した後
、水素化ホウ素ナトリウム１５０〜を刃口え、窒素ガス
を導入しつつ溶解する。別にニンヒドリン８０？を、予
め約１０分間窒素ガスを導入したＤＭＳＯ３００ｍｌ、
　　１−メトキシ−２−プロパツール４０　ｏｉの混合
液に、窒素ガスを導入しつつ溶解し、ついで、これに前
記の水素化ホウ素ナトリウムのＤＭＳＯ溶液を加える。

別に４Ｍの酢酸リチウムと４Ｍの酢酸から成る緩衝液１
０００　ｍｌにＤＭＳＯ１２００ｒｎｌ、１−メトキシ
−２−プロパツール８００　ｍｌを混合し、窒素ガスを
約１０分間導入した後、前記のニンヒドリン試液を、窒
素ガスを導入しつつ全量加えて混和する。

アミノ酸の定量 かくして得られたニンヒドリン試薬を用いて、８３５型
日立高速アミノば分析計でアミノ酸の定量を行ったとこ
ろ、上記ニンヒドリン試薬に於ける溶媒にＤＭＳＯとメ
チルセロソルブとを用いた従来法の場合と同様の測定結
果が得られ、又、本ニンヒドリン試薬を１０日間連続使
用しても呈色度の低下は認められなかった。

実施例　４ ニンヒドリン試薬 ニンヒドリン２０２、水素化ホウ素ナトリウム３５■、
ＤＭＳ　Ｏ４５０ｒｎｌ、　　１−メトキシ−２−プロ
パツール３００ｍＪ、酢酸リチウム１モル、酢ｖ８０　
ｍｌおよび蒸留水９７．５　ｍｌからなるニンヒドリン
試薬を常法に従って調製する。

アミノ酸の定量 上記ニンヒドリン試薬を用いて、日本電子ＪＬＣ−２０
０Ａ型萬速アミノ酸自動分析計でアミノ酸の定量を行っ
たところ、上記ニンヒドリン試薬に於ける溶媒にＤＭＳ
Ｏとメチルセロソルブとを用いた従来法の場合と同様の
測定結果が得られ、ドリフトの発生もなく、又発色感度
も良好であった。

実施例　５ ニンヒドリン試薬 １−メトキシ−２−グロパノール７５０　ｒｎｌに窒素
ガスを導入しながら、ニンヒドリン１５１を溶解する。

これに、別に調製した４Ｍ酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム
３水沌物２７２２を蒸留水に溶解し、酢ｒｉｆｔ　５０
　ｒｕｌを加えて蒸留水で全量を５００罰にしたもの）
２５０ｍｌを窒素ガスを導入しつつ加えて混和した後、
１５％（Ｎ量／容童〕三塩化チタン溶液２　ｍｌを加え
て混和する。

アミノ酸の定量 上記ニンヒドリン試薬を用い、テクニコンオートアナラ
イザーでアミノ酸の定量を行ったところ、メチルセロソ
ルブを用いた場合の従来の分析結果と同様の結果が得ら
れた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 溶媒として下記一般式（ I ）で示される１−アルコキ
   シ−２−アルカノールを単独で若しくはジメチルスルホ
   キシド（ＤＭＳＯ）と併用して用いることを特徴とする
   アミノ酸定量用ニンヒドリン試薬▲数式、化学式、表等
   があります▼（ I ） （式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２は夫々独立して炭素数１〜４の
   低級アルキル基を表わす。）