JPS6110599A - 抗糖尿病活性を有する化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は抗糖尿病活性を有する新規な化合物に関するも
のである。本発明の各化合物は、ヒト−プロインシュｌ
片またはヒト−プロ“インシュリンから導かれる中間体
から転換反応により、得ることができる。

発明の目的および構成 ヒト−プロインシュリンは、ヒト−インシュリンに比べ
てはるかに低レベルではあるが、抗糖尿病活性を示すこ
とが知られている。本発明化合物はヒト−プロインシュ
リンよりもかなり高レベルの抗糖尿病活性を有している
。

即ち本発明は、式（Ｉ）： アスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシスティン、
Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、Ｇはグリシノ、Ｈ
はヒスチジン、■はイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋは
リジン、Ｆはフェニル、アラニン、Ｐはプロリン、Ｓは
セリン、Ｔはスレオニン、Ｙはチロシン、■はバリンで
あり、Ｘは存在していないか、あるいは−Ｒ−Ｒまたは
−Ｒ−Ｒ−Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｖ−
Ｅ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｇ−８−Ｌ−Ｑ−Ｐ
−りを表す） で示される化合物またはその塩を提供するものである。

本発明は３種類のペプチドを提供することを目的とする
ものであり、それらは全て、薬学的に許容し得る塩の形
であってもよい。

本発明に係るペプチド配列、および本明細書中で記載す
るのに用いたその省略形を以下に示す（ここに、ＨＰＩ
という語句はヒト−プロインシュリンを表す）； １、（５６−５７スプリツト）ＨＰＩ ２、デス（３３−５６）ＨＰＩ ３、デス（３１−５６）ＨＰＩ 本発明化合物には、以上の化合物の、薬学的に許容し得
る酸付加塩および薬学的に許容し得るカルボン酸塩が包
含される。

本明細書中で“薬学的に許容し得る酸付加塩”という語
句は、有機および無機性両方の酸付加塩を包含し、例え
ば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化
水素酸、ゲルコール酸、クエン酸、マレイン酸、りん酸
、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、
パラ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフ
タレンスルホン酸、プロピオン酸、炭酸等の酸類並びに
重炭酸アンモニウムの如き塩類から構成される装置加塩
を含む。塩酸、酢酸または炭酸から調製される酸付加塩
が好ましい。上記の塩はいずれも常法に従って製造され
る。

“カルボン酸塩”という語句は、例えば、亜鉛塩、アン
モニウム塩、並びにナトリウム、カリウムおよびリチウ
ム等のアルカリ金属の塩を含む。好ましいカルボン酸塩
は、亜鉛およびナトリウム塩である。

本明細書中では、便宜上、ペプチド中のアミノ酸を一字
に省略して表すこととする。その様な一般に認められて
いる表示方法を次に示す：Ａ＝アラニン、Ｒ−アルギニ
ン、Ｎ＝アスベラギン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｃ＝＝シ
スティン、Ｅ−グルタミン酸、Ｑ＝＝グルタミン、Ｇ＝
グリンン、Ｈ−ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｌ＝ロ
イシン、Ｋ−リジン、Ｆ−フェニルアラニン、Ｐ＝ニブ
ロリンＳ−セリン、Ｔ＝スレオニン、Ｙ−チロシン、■
＝バリン。

本発明化合物はペプチド合成の常套手段により、製造す
ることができる。

別法として、本発明化合物はヒト−プロインシュリンか
ら調製することができ、この方法が好ましい。ヒト−プ
ロインシュリンの入手方法は様々であり、有機合成する
方法、ヒトー膵臓応・ら常法通り単離する方法、あるい
は、より最近では組換えＤＮＡ法による方法が含まれる
。

組換えＤＮＡ法によりプロインシュリンを製造する方法
の概要を述べると、単離または組立て、あるいはその併
用、のいずれかの方法によってヒト−プロインシュリン
のアミノ酸配列をコードしているｆ）ＮＡ配列を得る。

次いでヒト−プロインシュリンをコードしているＤＮＡ
を適当なりローニングおよび発現ビヒクルの解読相内に
挿入する。

このビヒクルを用いて適当な微生物を形質転換した後、
形質転換された微生物を発酵条件下に置き、（ａ）ヒト
−プロインシュリン遺伝子−含有ベクターのコピーを生
産せしめ、（ｂ）ヒト−プロインシュリン産物またはヒ
ト−プロインシュリン前駆体産物を発現させる。

発現産物がヒト−プロインシュリン前駆体である場合、
それは、通常、ヒト−プロインシュリンのアミノ酸配列
のアミノ末端に、外来のタンパク質、または、ヒト−プ
ロインシュリン遺伝子が挿入された遺伝子配列の正常な
発現に由来する他のタンパク質、が結合しているアミノ
酸配列である。

ヒト−プロインシュリンのアミノ酸配列は、このタンパ
ク質フラグメントに対し、特異的な開裂部位、例えばメ
チオニンを介して結合している。この産物は普通、融合
遺伝子産物と称される。

臭化シアンを用いてこの融合遺伝子産物からヒト−プロ
インシュリンのアミノ酸配列を切断した後、ヒト−プロ
インシュリンのアミノ酸配列中のシスティンのメルカプ
ト基を対応するＳ−スルホネートに変換することにより
安定化させる。

得られたヒト−プロインシュリンのＳ−スルホネート化
合物を精製し、次いでこの精製ヒト−プロインシュリン
Ｓ−スルホネートを、例えばアメリカ特許第４，４３０
，２６６号の方法に従い、その適切な位置に３つのジス
ルフィド結合を形成させることにより、ヒト−プロイン
シュリンに変換する。次いでこのヒト−プロインシュリ
ン産物を周知の方法で精製する。

本発明化合物はヒト−プロインツユリンの酵素消化によ
り、製造することができる。即ち、ヒト−プロインシュ
リンをキモトリプシンで処理すると、（−５６−５７ス
プリツト）ＨＰＩが生成する。

この生成物を含む混合物を逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）にかけ、純化された（５６−５７スプ
リツト）ＨＰＩを回収する。

本発明に係るデス（３３−５６）ＨＰＩおよびデス（３
１−５６）ＨＰＩは、（’３２−３３スプリツト）ＨＰ
　Ｉ　（ヒト−プロインシュリンを３２および３３アミ
ノ酸残基間でスプリット）から製造する。

この（３２−３３スプリツト）ＨＰ’ｌはヒト−プロイ
ンシュリンから製造する（米国特許出願番号第６２０．
７８２号参照）。即ち、ＨＰＩをトリプシンで処理する
と、他の成分と共に、（３２−３３スプリツト）ＨＰＩ
が生成する。（３２−３３スプリツト）ＨＰＩをキモト
リプシンで処理すると、デス（３３〜５６）ＨＰＩが得
られ、これをカルボキンペプチダーゼＢで処理すると、
デス（３１−５６）ＨＰ　Ｉが得られる。

萌述の如く、本発明化合物はヒト−プロインシュリンよ
りも実質上活性の高い、インシュリン様の抗糖尿病作用
を有する。

本発明化合物群は、そのインシュリン様活性に基づ酋、
糖尿病の治療に有用である。従って、本発明化合物は、
種々の医薬組成物および製剤類に使用し得ると共に、筋
肉内、静脈内、皮下および腹腔内等、通常の様々な投与
経路で投与することができる。

本発明化合物を投与する場合の注射に適した医薬製剤と
しては、滅菌水溶液または分散液、並びに滅菌注射液ま
たは分散液を調製し得る滅菌粉剤等が挙げられる。

滅菌注射液は、本発明化合物と、所望により、種々の他
の成分とを、計算量の適当な溶媒に入れて調製すること
ができる。

以下に実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない
。

実施例１　　（５６−５７スプリツト）ＨＰｒの製造 ヒト−プロインシュリン（Ｉ１１Ｎ９湿重量）を、０．
１ＭＣａＣｌ２ｔ　　０．０８Ｍトリス（ｐＨ７，９）
４０ｘＱに溶解し、ｐＨ７，９で、キモトリプシン８１
μ９を用いて２５℃で１５分間消化した。得られた溶液
を、濃塩酸でＩ）Ｈ２，５まで酸性化することにより消
化を停止させた。この溶液を、２．５Ｘ６０ｃｍ＋のＣ
−１８ＨＰＬＣカラムを用い、カラム溶媒として０．２
Ｍ義酸アンモニウム中の２９％Ｃ８３ＣＮ（ｐＨ４，２
）を使ってクロマトグラフ、イーした。

カラムフラクションをプールすると、精製された（５６
−５７スブリツト）ＨＰ　Ｉ　Ｉ　５．６乾ｙ（ＵＶ９
重量）が得られた。生成物を、２％酢酸で処理した１、
５ｘ１００ｃＲのＧ２５Ｃセフ７デツクスカラムでクロ
マトグラフィーし、極めて純度の高い（５６−５７スブ
リツ！・）ＨＰ　Ｉ　１４．５ｍｇを得た。

寒嵐鯉２　デス（３−３−５６）ＨＰ　Ｉの製造ヒト−
プロインツユリン（湿重量３１２Ｒ９′）を０゜１Ｍト
リス媛衝液５７！Ｉ（！に溶かしく最終ｐＨ７、０）、
この溶液を水浴中で２５℃に加温した。）・リプシ：ｚ
（２５，１μｉ＋）の０．０５Ｍトリス−０，０２ＭＣ
ａＣＱ、（ｐＨ７，０）５７μρ中溶液を加えた。６８
分後、酢酸を加えて溶液のｐＨを２５まで下げることに
より、反応を終了させた。

この酸性溶液（５７尺Ｑ）を、５Ｘ２．００ｃｉＧ５０
スーパーフアイン・セファデックス・カラムにかけ、カ
ラム溶媒としてＩＭモル濃度の酢酸を使用し、６℃でク
ロマトグラフィーした。まず最初に、未反応ＨＰＩ、（
３２−３３スプリツト）ＨＰＩおよび（６５−Ａｌスプ
リット）ＨＰＩを含有する幅広いピークが溶出し、次い
で、かなり明確に分離されてノーＡｒｇ３１　、３１ヒ
トーブロインンユリンを含有する第２のピークが溶出し
た。

以下の要領でカラム分画をプールした。

プールの開始　ＵＶ測定に基づくプールＡ　　　　１７
６８〜　　　ＨＰＩとモノスプリット２１４６仄Ｑ　　
　ＨＰＩとの混合物８３．３ＩＩＩｇＢ　　　　２１４
６〜　　　ＨＰＩとモノスプリット２４６４酎　　ＨＰ
Ｉとの混合物９８．ＩｒｙＣ２４６４〜　　　　ジーＡ
　ｒｇ　Ｉ　、３ｔヒト−イ２８４３酎　　ンンユリン
　３４ｍｇ ※　番屋は、ｏ　Ｄ２？　Ｑおよび計算された吸光係数
に基づいて計算された。

以上のプールを凍結乾燥した。

次いでこれら３つの凍結乾燥したプールを３部に分け、
カラム溶媒として０．５％トリフルオロ酢酸中３４％Ｃ
Ｈ３ＣＮ溶液を用い、２．５ｘ６０ＯＲのＣ，−１８Ｈ
ＰＬＣカラムにかけてクロマトグラフすることにより、
それらの成分を分離した。

プールＡ（７）１部（７９Ｒｇ）を希塩酸（最終１）Ｈ
＝２）に溶かしてカラムにかけ、所望の２つのプール（
ＤおよびＥ）を得た。

プールの開始　ＵＶ測定に基づくプールダニ上　旦よｎ
Ｅｔ４ピら叔　虫のタンｌ（り質含量Ｄ　　　５１９〜
　　精製（３２−３３スプリツ６２７酎　ト）ＨＰ　Ｉ
　　（７９ｘ９の４３％〕 Ｅ　　　７００〜　　純度７０％の（６５−Ａ１８０８
好　スプリット）ＨＰ　Ｉ　１４．７ｘ９ｃ７９ｘｇの
１８．５％〕 プールＤを凍結乾燥して純粋な（３２−３３スプリツト
）ＨＰＩを得た。（３１−３３スプリツト）ＨＰＴ２７
．５ｏを０．０８Ｍ）リス−０，１ＭＣａＣＱｔ（最終
ｐＨ７，８）９．９１畦に溶解し、その混合物を、２５
℃で２６分間、キモトリプシン１９８２μ９で処理した
。ｐ）１３　、０になるまでＩＭＨＣＱを加えて反応を
停止させた。

得られた粗デス（３３−５６）ＨＰ　Ｉを、１Ｍ酢酸で
処理した２、５Ｘ１２５ｃｘのＧ５０ＳＦセフアデツク
スカラムを使ってクロマトグラフィーした。

残存１．ている未反応（３２−３３スブリブｉ−）　Ｈ
ＰＩの大部分がデス（３３−５６）ＨＰ　Ｉの前に溶出
した。デス（３３−５６）ＨＰＩを含んでいるフラクシ
ョンをプールし、凍結乾燥してデス（３３−５６）ＨＰ
　Ｉ　１１．０８灰ｇ（ｕ、Ｖ、で測定）を含んでいる
生成物を得た。

Ｇ５０ＳＦセフアデツクスカラムからの生成物を、７Ｍ
尿素−Ｏｌ酢酸で処理した５Ｘ５０ｍｍのファーマシア
・モノ・Ｓカチオン交換カラムで精製した。Ｏ−０，５
３３ＭＮａＣ１２のりニアー塩グラジェント法により、
４０分間で生成物を溶出した。主要ピーク物質を、０．
９Ｘ４０ｃＩＲのＧ２５Ｍセファデックスカラムでクロ
マトグラフィーし、デス（３３−５６）ＨＰＩ　５．３
７巧（Ｕ、Ｖ重量）を得た。

実施例３　デス（３１−５６）ＨＰＴの製造０．１Ｍト
リス中のデス（３３−５６）ＨＰＩ（最終ｐＨ７、１）
を２５℃に於いて、カルボギンペプチダーゼＢで処理す
る。この混合物に７Ｍ尿素−０，１Ｍ酢酸およびＩＭＨ
ＣＱを加えて酸性化することにより反応を終結させる。

得Ｉンれたデス（３１−５６）ＨＰＩを０５０ＳＦセフ
アデツクスカラムに入れ、１Ｍ酢酸を使って６℃で溶出
した。デス（３１−５６）ＨＰＩを含んでいるフラクシ
ョンをプールして凍結乾燥した。

凍結乾燥した物質を、７Ｍ尿素−０，１Ｍ酢酸で平衡化
したファーマシア・モノ・Ｓカチオン交換カラムを使っ
てクロマトグラフィーした。タンパク質を塩化ナトリウ
ムのリニアーグラジェント法で溶出した。主要ピーク物
質を、２％酢酸で平衡化したＧ２５Ｍセファデックスカ
ラムでクロマトグラフィーし、純粋なデス（３１−５６
）ＨＰ　１を得た。

生物学的活性 Ａ、ＩＭ−９ラジオレセプター分析 ２ｍＭグルタミン、２５ＭＨＥＰＥＳおよび１０％ウシ
胎児血清を含有しているＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ￥地で１Ｍ−９
細胞を増殖させた。遠心して細胞を収集し、洗浄しまた
後、ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ分析用緩衝液（ｐＨ７、６）に懸
濁した〔デマ、イソ、Ｐ、インシュリン・アンド・グロ
ース・ホル化ン・レセブターズ・イン・ヒユーマン・カ
ルチヤード・リンホサイッ・アンド・ペリフェラル・モ
ノサイツ（Ｉ　ｎ５ｕｌｉｎ　　ａｎｄＧｒｏｗｔｈ　
　Ｈｏｒｍｏｎｅ　　Ｒｅｃｅｒ）ｔｏｒｓ　　ｉｎ　
　ＨｕｍａｎＣｕｌｔｕｒｅｄ　　ＬｙｍｐｈｏｃｙＬ
ｅｓ　　ａｎｄ　　ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＭｏｎｏｃｙ
ｔｅｓ）ブレッチーｊ−−、Ｍ、編、ニューヨーク、マ
ースル・デツカ−・インコーホレイテッド、３０１〜３
３０（Ｉ９７６））。トリパン・プル・−の排除に基づ
いて測定した細胞の生存率は、各実験において９０％以
上であった。３本−組の試験管を用意し、それぞれに１
００μρの分析用緩衝液、ヒトーインシコリン、ヒト−
プロインソユリノまたは本発明化合物、並びに５００μ
ｅの′Ｊ　　インシュリン（終濃度１〜２×ＩＯ−目Ｍ
）、並びに２００μρの細胞（約５００．０００細胞）
を入れた。

１．５Ｒρのミクロフコージ・デユープ内で１５℃にお
いて２時間インキュベートした。二の結合実験に用いた
、インシュリン、プロインンコリンまたは本発明化合物
を含有するストック溶液の濃度は、アミノ酸分析と２７
６ｎｍにおける吸収に基ついて求めた。実験中、３０分
毎にチューブを数個転倒させることにより、細胞をｖ濁
さ且る様＋（、シた。インキュよ−ション終了後、ベッ
クマン・ミクロフユージ（Ｍ　１ｃｒｏｆ　ｕｇｅ）に
よって１分間遠心した後、上澄液を吸引し、細胞ベレッ
トを含むチューブの先端を切除し、放射活性を測定した
。

以上の実験結果を次の表Ｉに示す。

表１　１Ｍ−９ラジオレセプター分析 化合物　　　　　　　　Ｅ　Ｄ　ｓ。（Ｍ−）相対効力
ヒト−インシュリン　　４，２７±０．３Ｘ　１０−’
°７０ヒトープロインシュリン２．９７±０．２Ｘ１０
−’　　１（５６−５７スブリツト）ＨＰｌ　　１．３
９±０．ｌＸ１０−’　　２デス（３ａ　−５６）ＨＰ
　１’　２．６り±０．５Ｘ１０−”　　１１Ｂ、単離
した脂肪細胞によるラジオレセプター分析 ロッドベル（Ｒｏｄｂｅｌｌ）、Ｍ、の方法（ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイー（ＪＢｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、　）２３９−１３７５−３８０（Ｉ９
６４））の改良法〔ツーバー（Ｈｕｂｅｒ）、Ｃ，Ｔ、
　、ソロモン（Ｓ　ｏｌｏｍｏｎ）、　Ｓ　、　Ｓ　、
、およびダックワース（Ｄ　ｕｃｋｗｏｒｔｈ）、Ｗ、
　ｃ　、、ジャーナル・クリニカル・インベスティゲー
ション（Ｊ、Ｃ１１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、）、６５．
４６１−４６８（Ｉ９８０））により、単離脂肪細胞を
調製した。インキュベーションは、全て、４％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）を含有するクレブス−リンゲル−
へベス（Ｋ　ｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　−Ｈｅｐｅｓ、
　ＫＲＨ）緩衝液（ｐＨ７，４）中、全量を２峠にして
行った。脂肪細胞を、１ｔＪ−標識インシュリン（Ｉ−
２Ｘ１０−’ＩＭ）、および選択された濃度の緩衝液、
またはヒト−インシュリンまたはヒト−プロインシュリ
ンまたは本発明化合物、と−緒に１５℃で２時間インキ
ュベートした。選択した時間の経過後、３００μρづつ
、３試料をとり、１００μＱのジノニル・フタレートを
入れたマイクロフユージ・チョーブに加えた〔グリ−マ
ン（Ｇｌｉｅｍａｎｎ）、　Ｊ　、オスターリント（Ｏ
５ｔｅｒｌｉｎｄ）　、　Ｋ　、、ヴインテン（Ｖ　１
ｎｔｅｎ）、　Ｊ　、およびガメルトフト（Ｇａｍｍｅ
ｌｔｏｆｔ）、　Ｓ　、　、ビオシミ力・工・ビオフィ
ジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｇ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ａｃｔａ、　）２８６．１−９（Ｉ９７２）参照〕。

ミクロフユージ内で１分間遠心した後、このチューブを
油層から切断し、ガンマ・カラ２ターで細胞ベレットを
計数し、結合を調べた。′！５Ｉ−標識インシュリンの
分解は、ミクロフユージ・チューブから得た緩衝液の層
を水冷下のＫＲＨ緩衝液に加え、即座＋；：十分量のト
リクロロ酢酸を終濃度５％になる様ｌこ加えることによ
り、調べた。

上記の実験の結果を次の表■に示す。

表−１単離脂肪細胞のラジオレセプター分析化合物　　
　　　　　　Ｅ　Ｄ　５゜（秩）相対効力ヒト−インシ
ュリン　　１．４３±０．２ｘｌＯ−８１７８ヒト−プ
ロインシュリン２．５５±０．６Ｘ　１０−’　　１（
５６−５７スブリツト）ＨＰｌ　　１．８１±１．０Ｘ
１０−’　　３デス（３ａ’−５６）ＨＰ　Ｉ　　９．
５ｏ±０．４Ｘ１０−＠２７Ｃ４単離−ラット・アジボ
サイトにおける生物学的活性 アジボサイト（脂肪細胞）は、ロッドベルのコラ−ゲナ
ーゼ消化法（前掲）の改良法（ツーバー、前掲）により
、副畢丸脂肪褥（パッド）から調製した。

単離およびインキュベーションの全工程には、４６／　
＾、’、ｋ＋濾マｎ、−／　：　・ｔ　Ｌ　ｎ　　Ｃ，
ｃ；＃ＵＷ　ＩＬ”’Ｉ−マ志金含有るタレブスーリン
ゲルーヘペス（ＫＲＨ）ＩＩ衝液（ｐＨ７，４）を用い
た。

約２Ｘ１０’のアジボサイトを、”Ｊ　−（Ａ　１４）
ブタ−インシュリン、および種々の濃度の標識されてい
ないヒト−インシュリン、ヒト−プロインシュリンまた
は本発明化合物と一緒に、緩衝液Ｌｘ（ｌ中でインキュ
ベートした。インキュベーションは１５℃で４．５時間
行った。インキュベーション期間の最後に、フランク（
Ｆｒａｎｋ）、Ｂ、　Ｈ，、ピービイ（Ｐｅａｖｙ）、
Ｄ、Ｅ、、フッカ−（Ｈｏｏｋｅｒ）。

Ｃ，Ｓ、、お上びダックワース（Ｄ　ｕｃｋｗｏｒｔｈ
）　、　Ｗ　、　Ｃらの記載（ダイアペッツ（Ｄ　１ａ
ｂｅｔｅｓ）　３２．７０５−７１１（Ｉ９８３））に
従って結合（細胞関与の放射活性）を測定するために３
つの試料を採取した。

インキュベーション温度１５℃においては、トレーサー
・インシュリンの分解は検出されなかった。

試料の計数はトレーサー・アナリティック・モデル１２
８５ガンマ・シンチレーション・分光器を使用し、計数
効率８５％で行った。

スタン（Ｓｔａｎ）、Ｍ、Ａ、、スタン（Ｓｔａｎ）、
Ｍ、およびグリ−マン（Ｇ　ｌｌｅｍａｎ）、　Ｊ　、
の方法（ホルモン・アンド・メタポリツクリサーチ（Ｈ
ｏｒｍ、　　ＭｅｔａｂＲｅｓ、）６．１２−１６（Ｉ
９７４））に従い、２−３Ｈ−グルコースの全脂肪細胞
内への取り込みを観察することにより、行った。細胞を
種々の濃度のコールド・ヒト−インシュリン、ヒト−プ
ロインシュリンまたは本発明化合物と共に３７℃で１時
間インキュベートした後、リキフラワー（Ｌｉｑｕｉｆ
ｌｕｏｒ）にューイングランド・ヌクレアー）１０ｘＣ
を加えて反応を終結させた。放射活性は、ジアール・ア
イソキャップ（Ｓ　ｅａｒｌｅ　　Ｉ　５ｏｃａｐ）　
３００液体シンチレーション・カウンター中、効率的３
０％で測定した。ブランクは、細胞が添加される前にン
ンチレーション液をとり、バイエルに入れて調製した。

これらの各バイエルから得たカウント数の平均値を、他
の全試料について観察された値から差し引いた。

競合的な結合曲線および生物学的活性の用量一応答曲線
を、プレフィツト（ＰＲＥＦ　ＩＴ）およびアルフィツ
ト（ＡＬＬＦＩＴ）プログラム〔ドウレーン（ＤｅＬｅ
ａｎ）、Ａ、、ムンソン（Ｍ　ｕｎｓｏｎ）　、　Ｐ　
。

Ｊ　およびｏ−７ドバード（Ｒｏｄｂａｒｄ）、　Ｄ　
　アメリカン・ジャーナル・オブ・フィノオロジイ（Ａ
ｍＪ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　）２３５．　Ｅ９７−Ｅ　
Ｉ　０２（Ｉ９７８）〕を使用し、４−パラメータ・ロ
ジスティック・モデルに基づいて解析した。これらの解
析の結果から、最大応答の１／２の応答を得るのに必要
なインシュリンまたはプロインシュリンの濃度、並びに
最大および最小値がわかった。値は全て平均±ＳＥＭで
示した。

以上の結果を次の表■に示す。

Ｌ−」　　単離−ラット・アー叱ボサイトにおける生物
学的活性

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラ
   ギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｅはグル
   タミン酸、Ｑはグルタミン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチ
   ジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、
   Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔ
   はスレオニン、Ｙはチロシン、Ｖはバリンであり、Ｘは
   存在していないか、あるいは−Ｒ−Ｒまたは−Ｒ−Ｒ−
   Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｇ
   −Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｌ−Ｑ−Ｐ−Ｌを表す
   ） で示される化合物またはその塩。 ２、Ｘが−Ｒ−Ｒである第１項に記載の化合物。 ３、Ｘが−Ｒ−Ｒ−Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｇ−
   Ｑ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｌ
   −Ｑ−Ｐ−Ｌである第１項に記載の化合物。 ４、Ｘが存在しない第１項に記載の化合物。 ５、第１項〜第４項のいずれかに記載の化合物またはそ
   の塩を有効成分とする抗糖尿病薬。 ６、第１項に記載の化合物の製造方法であって、（Ａ）
   ヒト−プロインシュリンをキモトリプシンで処理してＸ
   が−Ｒ−Ｒ−Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｖ
   −Ｅ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｌ−Ｑ−
   Ｐ−Ｌである式（ I ）の化合物を製造するか、 （Ｂ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物をキモトリプシンで処理してＸがＲ−
   Ｒである式（ I ）の化合物を製造するか、または （Ｃ）ＸがＲ−Ｒである式（ I ）の化合物をカルボキ
   シペプチダーゼＢで処理してＸが存在していない式（
   I ）の化合物を製造する、ことを特徴とする方法。